肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法及使用方法

肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法及使用方法
【专利摘要】本发明公开了肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法及使用方法。本发明从肺炎衣原体CpnAR39株基因中获取cHSP60的序列，设计引物序列；用RT-PCR法扩增cHSP60的cDNA，并将cHSP60与原核表达载体pET28a连接，构建pET28a-cHSP60重组质粒；经过克隆、酶切鉴定及核苷酸测序证实，获得重组的表达载体pET28a-cHSP60，经过IPTG的诱导在E.coliBL21菌株中产生cHSP60-His融合蛋白，获得的cHSP60-His融合蛋白进行体内外实验。得到的cHSP60融合蛋白有生物活性，可进行与衣原体相关感染的研究，不局限于以病人进行研究。
【专利说明】肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，具体涉及肺炎衣原体热休克蛋白60即CHSP60融合蛋白的制备方法及使用方法。
【背景技术】
[0002]肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae, Cpn)是一种常见的引起呼吸道疾病的病原体。首次分离于一名患急性眼结膜炎的台湾儿童的眼结膜，暂命名为TW-183 ;1983年，研究人员在美国西雅图一位急性呼吸道感染病人的咽部分离出另一株衣原体，将其命名为AR3。1989年,该病原体被认定为衣原体属的一个新种，即肺炎衣原体。Cpn主要引起包括肺炎，支气管炎，咽炎，鼻窦炎，中耳炎等在内的急性呼吸道感染，其中肺炎占50%以上，急性支气管炎占25%。此外，越来越多的证据表明，Cpn感染还可能造成哮喘、慢性阻塞性肺病、冠心病、心肌梗死、动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)等疾病的发生。但是目前人们对其中的机制尚未完全了解。尽管如此，来自实验室和临床的证据表明，Cpn引起的呼吸道及其他心血管疾病与宿主免疫应答关系密切，即机体产生的抗感染免疫在清除病原体的同时，有可能诱导免疫病理反应，其中过度的炎症应答是导致局部组织损伤和病变的最重要因素。
[0003]衣原体热休克蛋白60 (Chlamydia Heat Shock Protein60, cHSP60)为肺炎衣原体的主要抗原成分，具有较强的免疫刺激能力。CHSP60蛋白在由肺炎衣原体所引起的免疫和炎症反应中起着重要的媒介作用。已有研究表明，病原微生物来源的CHSP60蛋白与机体自身CHSP60蛋白分子之间存在高度同源性，由此形成与宿主之间的免疫交叉反应，引起超敏反应和炎症的发生。临床资料显示，CHSP60蛋白大量表达于动脉粥样硬化斑块和相应实验动物的病变组织中。相关研究表明，CHSP60蛋白反复、持续感染血管内皮细胞，可引起内皮细胞和巨噬细胞分泌一系列生长因子、细胞因子和粘附因子，导致炎症性细胞的聚集、浸润和粘附，进而造成对血管内皮细胞的损伤作用，这可能是引起衣原体相关AS发生的一个重要机制。在慢性感染中，CHSP60蛋白可以活化血管内皮细胞，平滑肌细胞以及巨噬细胞，其所产生的炎症反应和免疫病理应答与心血管疾病密切相关。有研究证实衣原体感染机体后，血清抗CHSP60蛋白效价和冠心病发生呈正相关关系。在某些肺炎衣原体感染过程中，血清中出现的抗CHSP60蛋白抗体(IgG)会诱导免疫系统产生自身抗IgG抗体，从而诱发自身免疫应答。此外，CHSP60蛋白反复、持续感染血管内皮细胞，导致内皮细胞分泌一系列生长因子，炎症因子以及粘附因子，由此产生了单核巨噬细胞对内皮细胞的聚集，粘附以及向内皮下的迁移，而炎症因子的持续存在并且损伤组织是发生慢性炎症性疾病的根本原因。一些炎症性疾病包括AS，冠心病，心肌炎等都与Cpn的反复感染和CHSP60蛋白的持续存在相关。最近有研究显示CHSP60蛋白可引起肺部炎症的发生，其主要原因是激活了骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs),引起 DCs 的活化、分化和免疫应答。另外有研究显示cHSP60蛋白能活化抗原提呈细胞(antigen presentingcell，APC)，诱导细胞因子的释放；也有研究显示该蛋白可起到免疫佐剂和细胞因子的作用。这些证据都显示CHSP60蛋白与Cpn感染引起的免疫和炎症应答存在密切关系。
[0004]迄今为止，大部分关于Cpn的研究都是基于病人的样本的研究，而且大部分研究是探究CHSP60蛋白与心血管疾病之间的关系，并没有将CHSP60蛋白与肺炎关联研究。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法及使用方法。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:
[0007]一种肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法，肺炎衣原体热休克蛋白60即CHSP60，该方法构建CHSP60的原核表达系统pET28a_cHSP60，制备cHSP60_组氨酸标签即cHSP60-His融合蛋白，SEQ ID NO:1，显示本发明cHSP60_His融合蛋白的核苷酸序列；所述肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法包括以下步骤:
[0008]步骤(1)
[0009]从肺炎衣原体Cpn AR39株基因中获取cHSP60的序列，设计引物序列；
[0010]引物序列:上游引物，5’-CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3’;下游引物，5’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3，
[0011]步骤(2)
[0012]用RT-PCR法扩增CHSP60的cDNA，并将cHSP60与原核表达载体pET28a连接，构建pET28a-cHSP60 重组质粒。
[0013]RT-PCR法扩增体系为:模板cDNA为2.5 μ I，5’引物与3’引物各加0.4 μ I，2xTaqPlus PCR MasterMix为10 μ 1，最后加双蒸水补足至Ij 20 μ I。
[0014]反应条件为:95°C预变性5分钟；95°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸90秒，进行30个循环；72°C延伸5分钟。
[0015]步骤(3)
[0016]经过克隆、酶切鉴定及核苷酸测序证实，获得重组的表达载体pET28a-cHSP60，经过异丙基硫代半乳糖苷即IPTG的诱导在E.coli BL21菌株中产生cHSP60_His融合蛋白。
[0017]一种肺炎衣原体热休克蛋白60 (CHSP60)的可溶性蛋白的使用方法:按照诱导剂IPTG的浓度为1.0mM，诱导温度30°C，诱导时间6小时进行大规模诱导表达cHSP60-His融合蛋白，鉴定cHSP60-His融合蛋白纯度，将纯化的cHSP60-His融合蛋白加入培养的小鼠巨噬细胞中。经观察发现，CHSP60能够诱导小鼠巨噬细胞产生炎症因子IL-6和TNF-α，其表达具有浓度依赖性以及时间依赖性；同时，此发明显示CHSP60能够激活核因子K B亚基即NF-kB的活化和促分裂素原活化蛋白激酶即MAPK通路；将野生型Β6小鼠用3%戊巴比妥钠麻醉后，于气管内给予多粘菌素B(polymyCin B, PMB)处理过的cHSP60-His融合蛋白，小鼠保持直立位，以 确保液体全部被吸入肺部，6小时后处理小鼠肺部细胞，证实CHSP60能够有效激发小鼠肺部炎症反应。
[0018]本发明的有益效果:本发明得到的CHSP60融合蛋白具有生物活性，可以用来进行与衣原体相关感染的研究，而不局限于以病人进行研究，此外，本发明还可研究CHSP60蛋白与肺炎之间的关系。【专利附图】

【附图说明】
[0019]图1为不同浓度CHSP60对小鼠巨噬细胞产生白介素-6(IL_6)和肿瘤坏死因子α (TNF-α )mRNA水平的影响；
[0020]图2为CHSP60作用不同时间对小鼠巨噬细胞IL-6和TNF-a mRNA表达水平的影响；
[0021]图3为CHSP60作用不同时间对小鼠巨噬细胞IL-6和TNF-α的蛋白表达水平的影响；
[0022]图4为小鼠肺组织的苏木精一伊红染色法；
[0023]图5为小鼠气管肺泡灌洗液中的细胞数；
[0024]图6为小鼠气管肺泡灌洗液中炎症因子水平。
【具体实施方式】
[0025]下面对本发明作进一步的分析。
[0026]本发明中所用的缓冲液为本领域常规用于基因克隆表达的常规试剂，TaqDNAPolymerase, dNTP Mixture, T4DNA 连接酶,NdeI,XhoI 限制性内切酶，DNA Marker 以及Trizol,PrimerScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit, SYBR Premix Ex Taq?等均购自Takara公司。2xTaq Plus PCR MasterMix购自天根生化科技有限公司；磷酸缓冲液干粉即PBS干粉，IPTG，琼脂糖均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。所有实验结果均是由独立的三次重复实验得到，采用不配对的t检验分析数据，均用士 sEM表示。P值≤0.05为显著性差异标准。
[0027]实施例1:CHSP60融合蛋白基因的克隆与表达载体的构建
[0028]1.细胞总RNA的提取与浓度测定
[0029]将人喉癌细胞系H印-2细胞以2xl05/孔的密度铺于12孔板内，加入Iml含有10%体积的胎牛血清(FBS)的新鲜培养液，将细胞置于细胞培养箱内继续培养24小时；吸弃原有培养基，用PBS洗2遍，加入500 μ I含有10%FBS以及I μ g/ml的放线菌酮的新鲜培养液，用500 μ I的上述Cpn上清感染！fep-2细胞，置于细胞培养箱内继续培养72小时；吸弃原有培养基，PBS洗2遍，加入500 μ I RNA提取试剂Trizol试剂，反复吹打细胞，以保证细胞完全裂解，将其转移至已高压灭菌的1.5ml离心管中；按Trizol:氯仿为5:1的比例加入氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟，4°C，12000rpm,离心15分钟，离心后，混合液体分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层，RNA被分配于无色的水相上层；将无色水相上层转移至一干净无RNA酶的离心管中，加入等体积的异丙醇混合，以沉淀其中的RNA，室温孵育10分钟,4°C, 12000rpm,离心10分钟；吸弃掉上清，每Iml Trizol的样品加入至少Iml用去RNA酶水配制的75%的乙醇，清洗RNA，混匀后，4°C，12000rpm，离心5分钟；吸去大部分乙醇溶液，将无RNA酶的离心管倒置于超净台内，彻底的弃掉乙醇溶液，正置离心管使RNA沉淀在室温干燥5-10分钟使乙醇完全挥发掉；加入无RNA酶的水10 μ 1，放置于40C，溶解30分钟，使其完全溶解；测定RNA的浓度，并做好记录，_80°C保存所抽提的RNA。
[0030]2.cHSP60基因全长序列通过互联网从GenBank获得,该序列的GenBank序列号为G1:7189880。根据cHSP60蛋白已知序列，对照原核表达载体pET28a_c (+)上的多克隆酶切位点，设计CHSP60基因的特异性扩增引物，上游引物在5’端加入限制性酶切位点Ndel，下游引物在5’端加入限制性酶切位点Xhol，并加上保护性碱基。引物如下，下划线为酶切位点:上游引物5’ -CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3’ (下划线为NdeI酶切位点);下游引物5’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3> (下划线为XhoI酶切位点)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0031 ] 3.CHSP60 基因的 PCR 扩增
[0032]按照Takara 公司的逆转录试剂盒 PrimerScript II 1st Strand cDNA SynthesisKit说明书，进行反转录，得到cDNA，进行PCR扩增目的基因。PCR反应体系及反应过程如表1所示:
[0033]表1.PCR反应体系及反应过程
【权利要求】
1.一种肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法，肺炎衣原体热休克蛋白60即CHSP60，该方法构建CHSP60的原核表达系统pET28a_cHSP60，制备cHSP60_组氨酸融合蛋白，SEQ ID NO:1，显示CHSP60-组氨酸融合蛋白的核苷酸序列；其特征在于:所述肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法包括以下步骤: 步骤(1) 从肺炎衣原体Cpn AR39株基因中获取cHSP60的序列，设计引物序列； 引物序列:上游引物，5 ’ -CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3 ’;下游引物，5 ’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3’ ； 步骤(2) 用RT-PCR法扩增CHSP60的cDNA，并将cHSP60与原核表达载体pET28a_c (+)连接，构建pET28a-cHSP60重组质粒； RT-PCR法扩增体系为:模板cDNA为2.5μ 1，5’引物与3’引物各加0.4μ l，2xTaq PlusPCR MasterMix为10 μ 1，最后加双蒸水补足至Ij 20 μ I ； 反应条件为:95°C预变性5分钟；95°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸90秒，进行30个循环；72°C延伸5分钟； 步骤(3) 经过克隆、酶切鉴定及核苷酸测序证实，获得重组的表达载体pET28a-cHSP60，经过IPTG的诱导在E.coli BL21菌株中产生cHSP60_His融合蛋白。
2.一种肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的使用方法:其特征在于:按照诱导剂IPTG的浓度为1.0mM,诱导温度30°C，诱导时间6小时进行大规模诱导表达cHSP60_组氨酸标签融合蛋白鉴定CHSP60-组氨酸融合蛋白纯度，将纯化的CHSP60-组氨酸融合蛋白纯度加入观察细胞中，CHSP60诱导观察细胞产生炎症因子IL-6和TNF- α，其表达具有浓度依赖性以及时间依赖性，除此之外，CHSP60能够激活核因子K B亚基的活化和促分裂素原活化蛋白激酶通路；将野生型Β6小鼠用3%戊巴比妥钠麻醉后，于气管内给予多粘菌素B处理过的CHSP60-组氨酸融合蛋白；小鼠保持直立位，以确保液体全部被吸入肺部，6小时后处理小鼠肺部细胞，证实CHSP60能有效激发小鼠肺部炎症反应。
【文档编号】C07K19/00GK103789336SQ201410056510
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】史丽云, 康艳华, 卢哲 申请人:杭州师范大学