腹水型禽流感单克隆抗体的制备方法和杂交瘤细胞株以及禽流感免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了腹水型禽流感单克隆抗体的制备方法和杂交瘤细胞株以及禽流感免疫检测试剂盒。本发明制备了腹水型禽流感单克隆抗体，成功筛选了一株能稳定分泌效价高、特异性强的禽流感病（H9）亚型单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC?No.8010；用其分泌的腹水型禽流感单克隆抗体为基础，制备了一种禽流感免疫检测试剂盒。该试剂盒的主要特点是特异性强、准确率高；采集样本只需采集口、鼻、泄殖腔的粘液，无需抽血，不给动物带来损害及应激反应；操作简便，可同时对批量样本进行检测，2个半小时可报结果；不需任何附加设备可在现场对禽流感病进行早期检测诊断。
【专利说明】腹水型禽流感单克隆抗体的制备方法和杂交瘤细胞株以及禽流感免疫检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽用生物制品领域，尤其涉及的腹水型禽流感单克隆抗体的制备方法和杂交瘤细胞株以及禽流感免疫检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]禽流感全名是鸟禽类流行性感冒，是由病毒引起的动物传染病。通常只传染鸟类和禽类，但在罕有情况下也会传染猪，甚至传染人。
[0003]禽流感可分为非致病性、低致病性和高致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽、鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸症状，食量减低，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感很严重，发病率、死亡率均很高。家禽感染高致病性禽流感死亡率几乎是100% ;人类感染禽流感死亡率达60%。
[0004]禽流感的传播途径有三条，一是通过空气传播，二是通过食物经消化道传播，三是通过损伤的皮肤和眼结膜传播。
[0005]禽流感感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌肉酸痛等，严重者伴有肺炎，心、肾等多器官功能衰竭，导致死亡。
[0006]禽流感病毒变异较频繁，所以人类至今仍未找到特异的防治禽流感的手段。在治疗方面至今未找到特异性杀死禽`流感病毒的新药，只是采取一些对症治疗的方法，如用解热药降低体温，用缓解鼻粘膜充血药减轻呼吸困难，用止咳祛痰药舒缓呼吸道等。在预防方面，虽然产生了疫苗，但因禽流感病毒变异很快，往往逃脱了疫苗产生抗体的扑杀。
[0007]禽流感的诊断试剂有琼脂扩散(AGP)试剂，ELISA免疫检测试剂，PCR基因诊断试剂。琼脂扩散检测试剂灵敏度较低，其检测对象是抗体，不能做早期诊断，因为感染后10天左右才能产生可检测抗体，检测到抗体也不能判定为当次感染所致，因为历次感染产生抗体在体内可存留半年时间。PCR检测试剂灵敏而准确，但需要较昂贵的PCR仪和较专门的技术人才，不便于推广应用。ELISA免疫检测试剂不需要附加设备，可在现场进行检测，免疫反应比较精准，操作简便而不需要专门人才。ELISA免疫检测试剂可分两种，一种是查抗体的，另一种是查抗原的。查抗体最大的缺点是不能做早期诊断，也不能判定为是当次感染所致，所以其检测结果对指导治疗意义不大。我国迄今生产的畜禽病ELISA检测试剂盒，绝大部分都是查抗体的，禽流感ELISA检测试剂盒也不例外。用单克隆抗体建立禽流感ELISA免疫检测试剂盒更是未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在畜禽类禽流感检测中存在的不足，提供了腹水型禽流感单克隆抗体的制备方法和杂交瘤细胞株以及禽流感免疫检测试剂盒。
[0009]本发明的技术方案如下:
[0010]杂交瘤细胞株，其分类命名为禽流感病(H9)亚型单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2013年07月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8010。
[0011]腹水型禽流感单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤:
[0012](I)免疫脾细胞的制备
[0013]①取雌性8周龄的Balb/C小鼠10只，以每只0.2mlH9亚型禽流感疫苗腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合；
[0014]②取盛有5ml不完全培养液的平皿，将①中免疫小鼠脾脏一个置200目的不锈钢网上，使脾细胞全部通过网孔挤压到平皿中，得到脾细胞悬液；
[0015]③将②所得脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀后，经1000rpm离心5分钟，弃上清；再用不完全培养液30ml倒入有沉淀脾细胞的离心管内，轻轻震动，使脾细胞重新变成悬液，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清；用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调为IxlO8个；
[0016](2) SP20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备
[0017]①将SP20小鼠骨髓瘤细胞进行扩增培养，培养液为含体积浓度为20%小牛血清的RPM1-1640培养液，在C02孵箱中培养，温度为37°C，C02体积浓度为5%。
[0018]②将4瓶扩增 培养的骨髓细胞收集到50ml离心管内，1000rpm离心5分钟，弃去上清；然后加入30ml不完全培养液，轻轻震动，使细胞重新垂悬于液体中，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清；最后用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调至2~3xl07个；
[0019](3)细胞融合
[0020]①分别吸取含IxlO8个脾细胞悬液和2~3xl07个小鼠骨髓瘤细胞悬液各10ml，加到50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇匀；然后1000rpm离心7分钟，弃去上清；加体积浓度50%的PEG4000融合剂0.7ml，再加入25ml不完全培养液，使聚乙二醇溶液稀释而失去促融作用；最后800rpm离心7分钟，弃去上清，再加入20mlHAT培养液，轻轻吸取沉淀细胞，使其垂悬并混匀；其中HAT培养液为含体积浓度20%小牛血清的RPM1-1640培养液中加入体积浓度2%的由次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷组成的选择性培养液；
[0021]②将①中制得的细胞悬液加到辅有小鼠腹腔巨噬细胞的96孔培养板中，每孔
0.1ml，将培养板放到37°C含CO2的体积浓度为5%的孵箱中培养；
[0022](4)阳性孔的检测及克隆化
[0023]用ELISA法检测各孔的培养上清，找出抗体阳性反应孔，将确定为阳性的孔的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆化；然后将克隆的杂交瘤细胞冻存；
[0024](5)腹水型禽流感单克隆抗体的制备
[0025]将步骤(4)中冻存的杂交瘤细胞复苏扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清作亚型实验；加入RPM1-1640培养液到沉淀的杂交瘤细胞中，调整细胞浓度为lxl06/ml，以每只小鼠0.5ml的量腹腔注射接种到小鼠体内，接种后7~14天，观察到小鼠腹部胀大后，处死小鼠，收取腹水，离心取上清，即为腹水型禽流感单克隆抗体。
[0026]所述的不完全培养液为不加小牛血清的1640培养液。[0027]禽流感免疫检测试剂盒，其包括24孔培养板，一块；采样管，22只；滴管，25只；棉拭子，22只；样本稀释液:0.85M、pH9.6的碳酸盐缓冲液，25ml ;阳性对照液:含有H9亚型疫苗的样本稀释液，0.5ml~Iml ;阴性对照液:含有非相关蛋白的样本稀释液，0.5ml~Iml ；禽流感单克隆抗体液体:含有体积浓度1:3000至1:5000腹水型禽流感单克隆抗体的PBS，
2.5ml~3ml ;酶标抗体液:含有体积浓度1:1000的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体的PBS，2.5ml~3ml ;显色剂A:有体积浓度0.045%过氧化氢的pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，2.5ml~3ml ;显色剂B:含有质量浓度0.5%邻苯二胺的葡萄糖粉，0.2~0.4g ;洗涤液:含有体积浓度0.05%Tween-20的ρΗ7.4的PBS液，35ml X 4。
[0028]免疫原及Sp20小鼠骨髓瘤细胞株:选用H9亚型禽流感疫苗(兽药生字(2011)150132066)作免疫原。购入Sp20小鼠骨髓瘤细胞株，由第四军医大学细胞工程中心提供。
[0029]1、禽流感免疫检测试剂盒的使用方法
[0030]①样本采集
[0031 ] 用棉拭子采集病禽的分泌物(口、鼻、泄殖腔分泌物)，放入采样管内，加入20滴样本稀释液，充分搅动棉拭子，使样本充分游离到稀释液中，然后按后续操做步骤操作。(如无条件进行后续步骤操作，可将样本置于2-8°C冷藏保存，24小时可用，或是-20°C冷冻保存，4周内可用)。
[0032]②ELISA反应操作步骤
[0033]a.将采集有样本的 小管按顺序从I到22写上编号。
[0034]b.取出24孔培养板，用滴管将样本管的样本液按顺序分别加到培养板的小孔内，每个小孔分别加两滴样本液，从I~22小孔，一次可加22个样本。第23号小孔加入阳性对照液两滴，第24号小孔加阴性对照液两滴。在常温下静置40~60分钟，甩去孔内液体。
[0035]c.向培养板各小孔加入洗涤液，每孔5滴，静置2~3分钟，甩去孔内液体，再重复两次，最后拍干孔内残留液体。
[0036]d.向各小孔加禽流感单克隆抗体液体两滴，在常温下静置20~40分钟，甩去孔内液体。
[0037]e.重复c步骤。
[0038]f.向各小孔加酶标抗体液各两滴，在常温下静置30~40分钟，甩去孔内液体。
[0039]g.同c步骤，但共重复5次。
[0040]h.将显色剂A倒入显色剂B管，拧紧盖子，震荡管，待粉剂(含有0.5%邻苯二胺的葡萄糖粉)完全溶解后，加到培养板各小孔内，每孔两滴。加液后，常温下避光静置15~20分钟。
[0041]③结果判定
[0042]在白色背景下，观察小孔颜色。第23号小孔为阳性对照孔应呈橙黄色，第24号小孔为阴性对照孔，应呈无色或接近无色。第I~22号小孔，如呈橙黄色，表明样本为禽流感阳性反应，若为无色或接近无色，表明样本为阴性反应。
[0043]本发明制备的禽流感免疫检测试剂盒的检测结果是通过免疫反应来实现的，所以其结果特异性强、准确率高；采集样本只需采集口、鼻、泄殖腔的粘液，无需采血，不给动物带来损害及应激反应；操作简便，可同时对批量样本进行检测，2个半小时可报结果；不需任何附加设备可在现场进行检测。【具体实施方式】
[0044]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0045]实施例1腹水型禽流感单克隆抗体的制备
[0046]1、免疫原及Sp20小鼠骨髓瘤细胞株
[0047]选用H9亚型禽流感疫苗(兽药生字(2011)150132066)作免疫原。购入Sp20小鼠骨髓瘤细胞株，由第四军医大学细胞工程中心提供。
[0048]2、免疫动物及免疫
[0049]取雌性8周龄的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml禽流感疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合。
[0050]3、细胞融合及培养
[0051](I)免疫脾细胞的制备
[0052]①取免疫小鼠的脾脏一个，放入盛有5ml不完全培养液(不加小牛血清的1640培养液)的平皿中，置200目的不锈钢网上，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
[0053]②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀后，经1000rpm离心5分钟，弃上清。
[0054]③用不完全培养液30ml倒入有沉淀脾细胞的离心管内，轻轻震动,使脾细胞重新变成悬液，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清。用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调为lxlO8。
[0055](2) SP20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备
[0056]①将SP20小鼠骨髓瘤细胞进行扩增培养。培养液为含体积浓度为20%小牛血清的RPM1-1640培养液，在CO2孵箱中培养，温度为37°C，CO2体积浓度为5%。
[0057]②将4瓶扩增培养的骨髓细胞收集到50ml离心管内。
[0058]③1000rpm离心5分钟，弃去上清。
[0059]④加入30ml不完全培养液,轻轻震动，使细胞重新垂悬于液体中，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清。用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调至2~3xl07。
[0060](3)细胞融合
[0061]①分别吸取含IxlO8个脾细胞悬液和2~3xl07个小鼠骨髓瘤细胞悬液各10ml，加到50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇匀。
[0062]②1000rpm离心7分钟，弃去上清。
[0063]③加体积浓度50%的融合剂聚乙二醇(PEG)溶液0.7ml。
[0064]④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
[0065]⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
[0066]⑥加20ml的HAT培养液，轻轻吸取沉淀细胞，使其垂悬并混匀。其中HAT培养液为含体积浓度20%小牛血清的RPM1-1640培养液中加入体积浓度2%的由次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)组成的选择性培养液；
[0067]⑦将细胞悬液加到辅有饲养细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔培养板中，每孔
0.1ml，将培养板放 到37°C含CO2的体积浓度为5%的孵箱中培养。[0068]4、抗体阳性孔检测(采用间接ELISA法)
[0069]①用禽流感H9亚型疫苗包被。
[0070]②加入3中有克隆生长的孔中的培养上清100 μ I。
[0071]③加入酶标抗鼠IgG抗体(从北京中杉金桥生物科技有限公司购入)100 μ I。
[0072]④加底物液(含质量浓度0.05%邻苯二胺溶液)100μ I,室温避光显色10~20分钟。
[0073]⑤结果判定:在酶联免疫检测仪492波长下测定OD值，空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔OD值2.1倍，则可判定为阳性孔，孔内生长有阳性克隆。
[0074]5、克隆化(采用有限稀释法)
[0075]将96孔培养板中被检测为抗体阳性的孔标记出来。用加样器将孔内杂交瘤细胞反复吹打均匀后计数，然后用有限稀释法进行逐级稀释，再加到96孔板进行培养，观察克隆生长，记录单克隆孔。并及时进行阳性检测。将阳性单克隆孔的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞培养瓶中进行扩大培养(克隆化过程中每一步骤的培养条件相同:培养液为含体积浓度20%小牛血清的RPM1-1640培养液，在CO2孵箱中培养，温度为37°C，体积CO2浓度为5%)。
[0076]6、杂交瘤细胞的冻存
[0077]将呈对数生长期的杂`交瘤细胞收集于离心管，1000rpm离心10分钟，弃去上清，加入Iml冻存液(含有体积浓度30%小牛血清，体积浓度60%RPM1-1640培养液，体积浓度10%二甲基亚砜)混匀，然后加到冻存管，在-70°C低温冰箱过夜后转入液氮罐长期保存。
[0078]7、腹水型禽流感单克隆抗体的制备
[0079]将冻存的杂交瘤细胞复苏扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清作亚型试验。加RPM1-1640培养液到沉淀的杂交瘤细胞中，调整细胞浓度为I X 106/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml，接种杂交瘤细胞后，7—14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水离心，收集上清，即为腹水型禽流感单克隆抗体，分装后置于-20°C冰箱，冻存备用。
[0080]8、单克隆抗体的鉴定(采用ELISA法)
[0081]我们共获得了 3株能稳定分泌禽流感单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1H7UA7和1G6，经效价检测，以上3种腹水型单克隆抗体的效价为I X 10 _ 4~I X 10 _ 6。特异性检测显示，1A7杂交瘤细胞产生的腹水型禽流感单克隆抗体除了禽流感病毒外，不和新城疫、鸡传染性支气管炎、鸭瘟、鸡支原体病的病原体发生交叉反应。说明其具有较强的特异性，可用其建立禽流感病的ELISA检测试剂盒。结果见表1、表2。
[0082]表1杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体效价的检测结果表
[0083]
细胞株分泌的单抗I效价检测方法 I检测结果
1H7ELISAT0"3
1Α7ELISAΤ?"1
1G6ELISAΤ?"1[0084]表2杂交瘤细胞株分泌单抗的交叉试验结果
【权利要求】
1.杂交瘤细胞株，其特征是，其保藏编号为CGMCCN0.8010。
2.腹水型禽流感单克隆抗体的制备方法，其特征是，包括以下步骤: (1)免疫脾细胞的制备 ①取雌性8周龄的Balb/C小鼠10只，以每只0.2mlH9亚型禽流感疫苗腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合； ②取盛有5ml不完全培养液的平皿，将①中免疫小鼠脾脏一个置200目的不锈钢网上，使脾细胞全部通过网孔挤压到平皿中，得到脾细胞悬液； ③将②所得脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀后，经1000rpm离心5分钟，弃上清；再用不完全培养液30ml倒入有沉淀脾细胞的离心管内，轻轻震动，使脾细胞重新变成悬液，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清；用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调为IxlO8个； (2)SP20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备 ①将SP20小鼠骨髓瘤细胞进行扩增培养，培养液为含体积浓度为20%小牛血清的RPM1-1640培养液，在CO2孵箱中培养，温度为37°C，CO2体积浓度为5%。 ②将4瓶扩增培养的骨髓细胞收集到50ml离心管内，1000rpm离心5分钟，弃去上清；然后加入30ml不完全培养液，轻轻震动，使细胞重新垂悬于液体中，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清；最后用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调至2~3xl07个； (3)细胞融合 ①分别吸取含IxlO8个脾细胞悬液和2~3xl07个小鼠骨髓瘤细胞悬液各10ml，加到50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇匀；然后1000rpm离心7分钟，弃去上清；加体积浓度50%的PEG4000融合剂0.7ml，再加入25ml不完全培养液，使聚乙二醇溶液稀释而失去促融作用；最后800rpm离心7分钟，弃去上清，再加入20mlHAT培养液，轻轻吸取沉淀细胞，使其垂悬并混匀；其中HAT培养液为含体积浓度20%小牛血清的RPM1-1640培养液中加入体积浓度2%的由次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷组成的选择性培养液； ②将①中制得的细胞悬液加到辅有小鼠腹腔巨噬细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml,将培养板放到37°C含CO2的体积浓度为5%的孵箱中培养； (4)阳性孔的检测及克隆化 用ELISA法检测各孔的培养上清，找出抗体阳性反应孔，将确定为阳性的孔的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆化；然后将克隆的杂交瘤细胞冻存； (5)腹水型禽流感单克隆抗体的制备 将步骤(4)中冻存的杂交瘤细胞复苏扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清作亚型实验；加入RPM1-1640培养液到沉淀的杂交瘤细胞中，调整细胞浓度为lxl06/ml，以每只小鼠0.5ml的量腹腔注射接种到小鼠体内，接种后7~14天，观察到小鼠腹部胀大后，处死小鼠，收取腹水，离心取上清，即为腹水型禽流感单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述不完全培养液为不加小牛血清的1640培养液。
4.禽流感免疫检测试剂盒，其特征是，其包括24孔培养板，一块；采样管，22只；滴管，25只；棉拭子，22只；样本稀释液:0.85M、pH9.6的碳酸盐缓冲液，25ml ;阳性对照液:含有H9亚型疫苗的样本稀释液，0.5ml~Iml ;阴性对照液:含有非相关蛋白的样本稀释液，0.5ml~Iml ;禽流感单克隆抗体液体:含有体积浓度1:3000至1:5000腹水型禽流感单克隆抗体的PBS，2.5ml~3ml ;酶标抗体液:含有体积浓度1:1000的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体的PBS, 2.5ml~3ml ;显色剂A:有体积浓度0.045%过氧化氢的pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，2.5ml~3ml ;显色剂B:含有质量浓度0.5%邻苯二胺的葡萄糖粉，0.2~0.4g ;洗涤液:含有体积浓度0.05%Tween-20的ρΗ7.4的PBS液，35ml X 4。
【文档编号】C07K16/10GK103805571SQ201410055936
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】黄威权, 赵锋, 朱秋融, 吕葆真, 李丹青 申请人:西安天星生物药业股份有限公司, 西安纳优商贸有限公司