一种分离免疫球蛋白抗体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取免疫球蛋白抗体的方法。所述方法包括如下步骤：步骤1，用pH值4.0～8.0的缓冲液和去离子水稀释含有免疫球蛋白的原料得到上样液；步骤2，将预处理过的上样液以0.1～20cm/min流速上样到晶胶柱，进行吸附；步骤3，以去离子水或pH值4.0～8.0的缓冲液为冲洗液，冲洗掉晶胶柱内未被吸附的杂质；步骤4，用含有0.01～4M碱金属盐的pH值4.0～8.0缓冲溶液为洗脱液，进行梯度洗脱，收集含免疫球蛋白的洗脱峰，得到所述的免疫球蛋白。本发明提供的免疫球蛋白分离方法，所用的阴离子交换型晶胶介质具有超大孔隙，孔内对流扩散，传质效率高，实现了高纯度IgG的分离，工艺过程简单，适应性好，提取成本低。
【专利说明】一种分离免疫球蛋白抗体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离免疫球蛋白抗体(IgG)的方法，尤其是一种利用阴离子晶胶吸附层析技术从牛奶中分离免疫球蛋白抗体的方法。
【背景技术】
[0002]IgG普遍存在于动物的血液、组织液及外分泌液中，其中动物乳汁是IgG的重要来源，具有重要的免疫和生理调节作用。牛奶作为生产原料优势在于原料丰富、廉价且牛乳清中IgG的含量较高(约9.6%~10.8% )。从乳清中提取IgG工业过程主要包括离心、盐析、超滤、浓缩和阴离子交换层析等多个结合的步骤，工业过程复杂，生产周期长。常规阴离子交换树脂层析从乳清中提取IgG时，由于孔隙尺寸在纳米级范围内，在层析多组分蛋白时对于大分子的IgG较难吸附。本发明所用的阴离子交换型晶胶介质具有超大孔隙，其传质利用对流扩散，实现了高纯度IgG的分离。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种用晶胶柱吸附层析技术快速高效提取免疫球蛋白抗体的新分离方法。
[0004]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
[0005]一种IgG的层析分离方法，包括如下步骤:
[0006](I)用pH值4.0~8.0的缓冲液和水稀释含有IgG的混合液得到上样液，以0.1~20cm/min的流速上样晶胶柱,进行吸附；
[0007](2)以去离子水或pH值4.0~8.0的缓冲液为冲洗液，冲洗掉晶胶柱内未被吸附的杂质；
[0008](3)用含有0.01~4M碱金属盐的pH值4.0~8.0的缓冲溶液为洗脱液，进行梯度洗脱，收集含IgG的洗脱峰，得到所述的IgG ；
[0009]在所述的晶胶吸附层析分离过程中，通常在上样前，先以pH值4.0~8.0的缓冲溶液平衡晶胶柱。
[0010]进一步，步骤(1)所述晶胶柱床中的晶胶介质优选为阴离子交换型，其功能基团为胺基。
[0011]进一步，步骤(1)中所述的含有IgG的混合液为牛奶或预处理后的乳清。
[0012]进一步,步骤(2)中所述冲洗液的流速在0.1~20cm/min。
[0013]进一步,步骤(3)中的洗脱优选梯度洗脱,洗脱液流速0.1~20cm/min,先用含碱金属盐0.01~0.2M的pH值4.0~8.0的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属盐含量相应更高
0.2~4M的pH值4.0~8.0的缓冲溶液进行洗脱，收集含IgG的洗脱峰，得到所述的IgG。
[0014]进一步,步骤(3)所述的碱金属盐优选为NaCl或KC1。
[0015]本发明在步骤(3)洗脱完毕后，依次用0.1M HC1、1~2M NaCl和去离子水对使用过的晶胶柱床进行再生。[0016]本发明具体推荐所述方法按照如下步骤进行:
[0017](a)以pH值4.0~8.0的缓冲溶液平衡晶胶床柱；所述晶胶柱的基础柱制备体系为AAm或HEMA，得到的晶胶介质为阴离子交换型，其功能基团为胺基；
[0018](b)用pH值4.0~8.0的缓冲溶液稀释牛奶或预处理后的乳清得到上样液，以0.1~20cm/min的流速上晶胶柱,进行吸附；
[0019](c)以去离子水或pH值4.0~8.0的缓冲液为冲洗液，以0.1~20cm/min的流速冲洗掉晶胶柱内未被吸附的杂质；
[0020](d)用含有0.01~4M碱金属盐的pH值4.0~8.0的缓冲溶液为洗脱液，进行梯度洗脱，先用含碱金属盐0.01~0.2M的pH值4.0~8.0的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属含量相应更高的pH值4.0~8.0的缓冲溶液进行洗脱，洗脱液流速0.1~20cm/min，收集含IgG的洗脱峰，得到所述的IgG ;所述的碱金属盐为NaCl或KCl ；
[0021](e)依次用0.1M HC1、1~2M NaCl和去离子水对晶胶柱进行再生。
[0022]与现有IgG分离技术相比，本发明提供的方法特色是利用晶胶层析实现了 IgG的直接分离。晶胶层析分离方法是一种新型的层析分离技术，晶胶介质内嵌有许多尺寸在数十至数百微米的超大孔隙 ，可从含目标生物分子的复杂料液中直接分离生物物质。IgG在分离介质内的吸附传质主要依靠对流，具有吸附容量大，吸附分离迅速和层析分离效率高等优点。本方法将现有IgG分离工艺过程中的离心、盐析、超滤、浓缩和阴离子交换层析等多个结合或复杂的步骤简化为通过晶胶吸附层析一步实现。
[0023]本发明方法的价值主要体现在:工艺过程简单，处理量大。得到的IgG纯度高，且晶胶介质再生方便，可重复使用，是一种低成本的IgG分离纯化方法。
【具体实施方式】
[0024]以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此:
[0025][实施例1]取5mL的牛乳清，用20mM的磷酸盐缓冲液(PBS，pH= 5.8)和去离子水稀释6倍，以lcm/min流速进行晶胶连续床层析，然后用PBS缓冲液冲洗，并用含NaCl分别为40mM、100mM、200mM、300mM、IM的洗脱液(缓冲液配置)进行梯度洗脱，收集40mM洗脱液对应的洗脱峰，得到免疫球蛋白抗体IgG ;经SDS~PAGE电泳检测纯度约大于95%，总蛋白吸附容量达0.259mg/mL床层。
【权利要求】
1.一种适于免疫球蛋白抗体(IgG)的层析分离方法，包括如下步骤: (1)用pH值4.0~8.0的缓冲液和水稀释含有IgG的混合液得到上样液，以0.1~20cm/min的流速上样吸附； (2)以去离子水或pH值4.0~8.0的缓冲液为冲洗液，冲洗掉柱子内未吸附的杂质； (3)用含有0.01M~4M碱金属盐的pH值4.0~8.0的缓冲液为洗脱液，进行洗脱，收集含IgG的洗脱峰，得到所述的IgG。
2.如权利要求1所述的IgG的层析分离方法中的分离介质为晶胶柱，其基础柱由AAm或HEMA体系制备。
3.如权利要求1所述的IgG的层析分离方法，柱床中的晶胶介质为阴离子交换型，其功能基团为胺基。
4.如权利要求1所述的IgG的层析分离方法，其特征在于步骤(1)中所述的含有IgG的混合液为牛奶或预处理后的乳清。
5.如权利要求1所述的IgG的层析分离方法，其特征在于步骤(2)中所述冲洗液的流速在 0.1 ~20cm/min。
6.如权利要 求1所述的IgG的层析分离方法，其特征在于步骤(3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速为0.1~20cm/min，先用含碱金属盐0.01~0.2M的pH值4.0~8.0的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属盐含量相应更高的pH值4.0~8.0的缓冲溶液进行洗脱，收集含IgG的洗脱峰，得到所述的IgG。
7.如权利要求1所述的IgG的层析分离方法，其特征在于所述的碱金属盐为NaCl或KCl。
8.如权利要求1~7之一所述的IgG的层析分离方法，其特征在于依次用0.1M HCl、I~2MNaCl和去离子水对步骤(3)使用过的晶胶柱床进行再生。
9.如权利要求1所述的IgG的层析分离方法，其特征在于所述方法按照如下步骤进行: (1)以pH值4.0~8.0的缓冲溶液平衡晶胶床柱；所述晶胶柱的基础柱制备体系为AAm或HEMA，得到的晶胶介质为阴离子交换型，其功能基团为胺基； (2)用pH值4.0~8.0的缓冲溶液稀释牛奶或预处理后的乳清得到上样液，以0.1~20cm/min的流速上晶胶柱,进行吸附； (3)以去离子水或pH值4.0~8.0的缓冲液为冲洗液，以0.1~20cm/min的流速冲洗掉晶胶柱内未被吸附的杂质； (4)用含有0.01~4M碱金属盐的pH值4.0~8.0的缓冲溶液为洗脱液，进行梯度洗脱，先用含碱金属盐0.01~0.2M的pH值4.0~8.0的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属含量相应更高的pH值4.0~8.0的缓冲溶液进行洗脱，洗脱液流速0.1~20cm/min，收集含IgG的洗脱峰，得到所述的IgG ;所述的碱金属盐为NaCl或KCl ； (5)依次用0.1M HClU~2M NaCl和去离子水对晶胶柱进行再生。
【文档编号】C07K1/22GK103936851SQ201410142237
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】代斌, 贠军贤, 陈良, 张海燕, 董莎莎 申请人:石河子大学