一种快速提取高分子量丝素蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速提取高分子量丝素蛋白的方法，从成熟昆虫体内取出一对丝腺体，除去其外层的上皮组织，可得到一段清澈透明的条带，将条带蛋白浸渍在去离子水或PBS中漂洗去除丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白等等，本发明操作简单，生产周期短，提取工艺简单、高效，没有复杂繁琐的提取材料过程，时间上大为节省。提取过程中未使用其它有毒性的化学试剂，制备条件温和，成本显著降低，不产生其它废弃物，对环境零污染。
【专利说明】一种快速提取高分子量丝素蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种丝素蛋白溶液及丝素粉的提取方法，属于天然高分子领域。
【背景技术】
[0002]来源于家蚕、野蚕(如柞蚕、天蚕、蓖麻蚕)和蜘蛛等吐丝昆虫的丝蛋白具有优良的生物相容性、无免疫排斥、可生物降解性以及本质是天然蛋白质的特点，在纺织、化妆品、食品、环境保护、生物材料、组织工程等领域受到高度的关注。天然丝蛋白在昆虫体内合成、分泌，并且以高浓度(家蚕中部丝腺蛋白可达30wt%)的丝蛋白溶液的形式贮存在各种丝腺中。
[0003]然而，昆虫吐出丝蛋白便立即凝固成丝纤维，此时很难再将丝纤维溶于普通的缓冲溶剂中，使得提取和加工丝蛋白变得很困难。在相关技术和方法中，只能在条件苛刻(如:高温条件)的环境下将丝蛋白纤维溶于强酸、强碱、CaCl2、LiBr、LiSCN等化学溶剂中，这些化学溶剂都属于强腐蚀性溶液，溶剂的成本高，不仅对生物体有毒副作用，腐蚀生产设备，带来试剂残留的风险，有违于相应的生物安全标准，而且废弃的溶剂对环境有很大的危害；在生产、制备丝素蛋白的过程中，经过化学试剂处理得到的再生丝蛋白，因为其分子量大为下降，也不能满足生产上的需要。综上所述，目前还没有一种提取工艺简单，加工成本低廉，对环境无污染，最大限度保存丝素蛋白分子量的制备方法。如何消除生物材料中残留的化学试剂以及如何有效保留丝素蛋白的分子量，是提取、制备丝素蛋白中亟待解决的关键难题，对拓展丝素蛋白在各领域的应用具有重要推动的作用。
[0004]于同隐等(丝素蛋白的构象转变，《高等学校化学学报》，第17卷第2期，1996年2月28日，第323-325页)研究发现，解剖五龄熟蚕，取出丝腺体，可得到凝胶状的丝素蛋白。然而该方法只简单地阐述了如何从中部丝腺提取丝腺体的方法，该方法得到的丝素蛋白实际上为丝素凝胶，而非丝素溶液。凝胶状态下的丝素蛋白直接干燥可以得到丝素蛋白粉，然而丝素凝胶制备具有高强度力学性能以及形貌规则的支架材料还远远不够，因此不具备加工性。如何从家蚕体内提取出具有高浓度的丝蛋白溶液，是现在急需解决的问题之
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【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种提取工艺简单，加工条件温和、快速，成本低廉，对环境无污染的原位提取高分子量丝素蛋白的方法。本专利中使用的不同缓冲溶液能够溶解丝素蛋白凝胶并最大限度保存丝素蛋白的内部结构和分子量。这种方法可用于家蚕、野蚕(含柞蚕、天蚕、蓖麻蚕)和蜘蛛等丝蛋白的提取。为纺织、化妆品、食品、环境保护、生物材料、组织工程等领域提供新方法，具有广阔的应用前景。
[0006]本课题组研究发现:在成熟昆虫丝腺里(如5龄家蚕第七天)，丝素蛋白在丝腺体中合成和分泌达到最高峰，而且丝胶蛋白可以通过清洗去除，所以，本发明提出通过从丝腺中提取丝素凝胶并溶解成溶液的快速方法，本发明具体是通过以下技术方案实现的:
[0007]本发明公开了一种快速提取高分子量丝素蛋白的方法，所述的制备方法包括如下步骤:
[0008](I)从成熟昆虫体内取出一对丝腺体，除去其外层的上皮组织，可得到一段清澈透明的条带；
[0009](2)将步骤(1)中的条带蛋白浸溃在去离子水或PBS中漂洗去除丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白；
[0010](3)将步骤(2)中的丝素蛋白收集到缓冲溶剂中，然后置于摇床上，在0-100度的温度范围内振摇0.5-12个小时得到丝素蛋白溶液；
[0011](4)将步骤(3)中的丝素蛋白溶液干燥成粉或者直接用于其它材料的制备。
[0012]作为进一步地改进，本发明所述步骤(1)中，所述的含有丝素蛋白的昆虫包括家蚕、野蚕或蜘蛛。
[0013]作为进一步地改进，本发明所述步骤(3)中，将丝素蛋白胶状物收集到不同的缓冲溶剂中，缓冲剂是SBF、CaCl2、NaCl、KCl,Na2HPO4、(NH4) 2S04、Tris、磷酸、柠檬酸、碳酸盐、硼酸盐、弱酸、弱碱中的任意一种或几种的组合。
[0014]作为进一步地改进，本发明所述步骤(3)中的丝素蛋白溶液的浓度为15wt % -30wt %。
[0015]作为进一步地改进，本发明所述步骤(4)中的丝素溶液的干燥方法包括冷冻干燥、烘干、自然干燥或喷雾干燥。
[0016]作为进一步地改进，本发明所述步骤(4)中的丝素蛋白溶液通过加工成型以膜、多孔支架、微粒和纤维形式存在，替代步骤(4)中的以粉状的形式存在。
[0017]由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有以下突出特点:
[0018](I)丝素蛋白具有良好的生物相容性:丝素蛋白或者降解物对细胞或组织无毒性反应；在提取过程中，因为没有化学试剂的污染，丝素蛋白表现出较高的细胞粘附率和增殖率，具有良好的生物相容性，生物安全性高。
[0019](2)操作简单，生产周期短:提取工艺简单、高效，没有复杂繁琐的提取材料过程，时间上大为节省。
[0020](3)经济环保:提取过程中未使用其它有毒性的化学试剂，制备条件温和，成本显著降低，不产生其它废弃物，对环境零污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为实施例1中得到的丝素蛋白的SDS-PAGE电泳图，分子量高于250kDa
【具体实施方式】
[0022]下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
[0023]实施例1
[0024]本实施例中丝素蛋白的提取方法包括如下步骤。
[0025](I)用医用钳将五龄熟蚕丝腺拉出，除去上皮组织，可得到一条带状蛋白；
[0026](2)将步骤⑴中的蛋白浸溃在去离子水中漂洗去除丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白；
[0027](3)将步骤(2)中的丝素蛋白放置于0.5wt%碳酸钠水溶液中，50rpm的转速下振摇溶解，即得到质量分数为20%的丝素蛋白溶液，电泳结果显示，得到的丝素蛋白分子量高于 250KDa。
[0028]实施例2
[0029]本实施例中丝素蛋白的提取方法包括如下步骤。
[0030](I)用医用钳将五龄熟蚕的丝腺拉出，除去前部、后部丝腺以及中部丝腺外层的上皮组织，可得到一段清澈透明的条带状蛋白，该条带即为丝腺蛋白；
[0031](2)将步骤(1)中的丝腺蛋白浸溃在去离子水中漂洗去除丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白凝胶；
[0032](3)将步骤⑵中的丝素蛋白放置于凝胶收集到0.2wt% Na2HPO4缓冲溶液当中，置于摇床上先在200rpm的转速下振摇1min,再50rpm的转速下振摇I小时得到溶液；
[0033](4)将步骤(3)中的丝素蛋白溶液添加到细胞培养基中，进行细胞培养，能够显著促进人MSC细胞的粘附和增殖。
[0034]实施例3
[0035]本实施例中丝素蛋白的提取方法包括如下步骤。
[0036](I)用医用钳将五龄熟蚕的丝腺拉出，除去前部、后部丝腺以及中部丝腺外层的上皮组织，可得到一段清澈透明的条带状蛋白，该条带即为丝腺蛋白；
[0037](2)将步骤⑴中的丝腺蛋白浸溃在去离子水中漂洗去除丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白凝胶；
[0038](3)将步骤⑵中的丝素蛋白放置于凝胶收集到0.2wt% Na2HPO4缓冲溶液当中，置于摇床上先在200rpm的转速下振摇1min,再50rpm的转速下振摇I小时得到溶液；
[0039](4)将步骤(3)中的丝素蛋白溶液添加到细胞培养基中，进行细胞培养，能够显著促进MC-3T3-E1细胞的粘附和增殖。
[0040]实施例4
[0041 ] 本实施例中丝素蛋白的提取方法包括如下步骤。
[0042](I)用医用钳将五龄熟蚕的丝腺拉出，除去丝腺外层的上皮组织，可得到条带状蛋白；
[0043](2)将步骤(1)中的蛋白用去离子水中漂洗去除丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白；
[0044](3)将步骤(2)中的丝素蛋白放置于0.5界七％的NaCl水溶液中，振摇溶解得到质量分数为20%的丝素蛋白溶液；
[0045](4)将步骤(3)中的1mL质量分数为20 %的丝素溶液滴在聚乙烯板上自然干燥成膜得到丝素蛋白膜
[0046]本实施例制备而成的丝素蛋白膜具有很好的透光性好。
[0047]实施例5
[0048]本实施例中丝素蛋白的提取方法包括如下步骤。
[0049](I)用医用钳将五龄熟蚕的丝腺拉出，除去丝腺外层的上皮组织，可得到条带状蛋白；
[0050](2)将步骤⑴中的蛋白用去离子水中漂洗去除丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白；
[0051](3)将步骤(2)中的丝素蛋白放置于0.5界七％的(NH4)2SO4水溶液中，振摇溶解得到质量分数为20%的丝素蛋白溶液；
[0052](4)将步骤(3)中的1mL质量分数为20%的丝素溶液滴在聚乙烯板上自然干燥成膜得到丝素蛋白膜。
[0053](5)将步骤(4)中的丝素蛋白膜浸泡在90%的甲醇中处理12小时，得到后处理的丝素蛋白膜；
[0054](6)后处理的丝素蛋白膜表面富有弹性，能够随意弯曲而不折断，而传统LiBr方法提取的丝素，经过同样的后处理方法，得到的丝素蛋白膜一折即断，非常脆。力学性能测试表明，延展性和弹性模量都比传统方法得到的丝素蛋白膜高。
[0055]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种快速提取高分子量丝素蛋白的方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤: (1)从成熟昆虫体内取出一对丝腺体，除去其外层的上皮组织，可得到一段清澈透明的条带； (2)将步骤(1)中的条带蛋白浸溃在去离子水或PBS中漂洗去除丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白； (3)将步骤(2)中的丝素蛋白收集到缓冲溶剂中，然后置于摇床上，在0-100度的温度范围内振摇0.5-12个小时得到丝素蛋白溶液； (4)将步骤(3)中的丝素蛋白溶液干燥成粉或者直接用于其它材料的制备。
2.根据权利要求1所述的提取丝素蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述的含有丝素蛋白的昆虫包括家蚕、野蚕或蜘蛛。
3.根据权利要求1所述的提取丝素蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将丝素蛋白胶状物收集到不同的缓冲溶剂中，缓冲剂是SBF、CaCl2、NaCl、KCl，Na2HPO4, (NH4)2SO4,Tr i s、磷酸、柠檬酸、碳酸盐、硼酸盐、弱酸、弱碱中的任意一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的提取丝素蛋白的方法，其特征在于:所述步骤(3)中的丝素蛋白溶液的浓度为15wt% -30wt%。
5.根据权利要求1所述的提取丝素蛋白的方法，其特征在于:所述步骤(4)中的丝素溶液的干燥方法包括冷冻干燥、烘干、自然干燥或喷雾干燥。
6.根据权利要求1所述的提取丝素蛋白的方法，其特征在于:所述步骤(4)中的丝素蛋白溶液通过加工成型以膜、多孔支架、微粒和纤维形式存在，替代步骤(4)中的以粉状的形式存在。
【文档编号】C07K14/435GK104163860SQ201410327653
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】杨明英, 帅亚俊 申请人:浙江大学