一种苦荞麦凝集素的制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种苦荞麦凝集素(Tartaty?Buckwheat?Lectin，TBL)的制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。其制备方法是将苦荞麦种子粉碎，加入蛋白提取液低温提取，随后加入硫酸铵沉淀蛋白，再经过脱盐,离子交换层析等步骤获得纯的苦荞麦凝集素蛋白。本发明提供的苦荞麦凝集素，可以特异性地杀伤结直肠癌细胞，并且抑制肿瘤的增殖和转移，可以应用在抗肿瘤药物中。
【专利说明】一种苦荞麦凝集素的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物功能蛋白制备和应用，具体属于一种苦荞麦凝集素的制备方法， 以及制备的苦荞麦凝集素在制备抗结肠癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 荞麦属双子叶寥科植物，有2个栽培种，即甜荞麦和苦荞麦。荞麦作为一种传统作 物在全世界广泛种植。《本草纲目》记载，荞麦"实肠胃、益气力、续精神、利耳目、炼五脏滓 秽"，"降气宽肠、磨积滞、消热肿风痛"等功能。尤其苦荞麦在国外视为野生植物，只在我国 云贵高原，喜马拉雅地区以及华北北部有栽培和食用习惯。近年来农业、医学及食品营养 学等方面的研究表明，荞麦其营养价值居所有粮食作物之首，不仅营养成分丰富、营养价值 高，而且含有其它粮食作物所缺乏和不具有的特种微量元素及药用成分。现代医学研究表 明，荞麦中所含的黄酮类物质（主要为芦丁），具有多方面的生理功能，能维持毛细血管的 抵抗力，降低其通透性及脆性，促进细胞增生和防止血细胞的凝集，还具有抗炎、抗过敏、利 尿、解痉、镇咳、降血脂等方面的作用。国家二类抗癌新药"威麦宁"胶囊是以金荞麦干燥块 根有效部位提取开发的药物，该产品既能直接杀癌细胞，又能提高机体免疫力的药物，被美 国FDA批准直接进入II期临床试验。因此荞麦也被誉为21世纪的明星作物，受到越来越 多人们的关注。
[0003] 凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白，具有一个或多个可以与单糖或寡糖特 异可逆结合的非催化结构域。凝集素在生物学及医学上有重要用途，在生物鉴定方面主要 应用于血型鉴定和微生物的鉴定。凝集素在恶性肿瘤诊断和治疗中的也具有重要的作用。 岩藻糖凝集素可以专一性识别甲胎蛋白（AFP)糖链中岩藻糖，如果AFP糖链中岩藻糖增加 就可以诊断患者是原发性肝癌。百脉根凝集素在未分化型胃癌中反应降低，而在分化型胃 癌中刀豆凝集素反应降低。某些凝集素也可以用于癌症的治疗，如槲寄生凝集素（ML)能使 肝癌细胞中端粒酶活性降低，使端粒失去功能，使细胞凋亡，被认为是癌症患者化疗最重要 的成分。
[0004] II型核糖体失活蛋白是一类兼有细胞凝集和N-糖苷酶活性的凝集素，由于其对 肿瘤细胞比对正常细胞更具毒性，而且具有抗病毒、抗肿瘤、抗真菌等功能，引起了人们的 广泛关注。早在几百年前，人们就已经知道相思豆种子和蓖麻种子的毒性都是由于一类特 殊蛋白的存在，并将来自菌麻中的毒性蛋白命名为Ricin。1987年，Endo等人发现ricin类 蛋白具有N-糖苷酶活性，可特异性的水解大核糖体RNA上的腺嘌呤，从而使核糖体失活，至 此就赋予了凝集素新的功能，即核糖体失活蛋白（RIP)的酶性功能。目前，人们已经从大约 50多种植物中得到了 RIPs，但是II型核糖体失活蛋白，仅仅6科8种植物中发现。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种苦荞麦凝集素的制备方法，以及该凝集素在制备抗肿 瘤药物中的应用。
[0006] 本发明提供的一种苦荞麦凝集素，来源于苦荞麦（tartary buckwheat)，其分子量 为 62 kD。
[0007] 本发明提供的一种苦荞麦凝集素，可以通过如下方法制得：将烘干的苦荞麦种 子，脱壳粉碎后，然后按每克荞麦粉加入10_15mL pH4.0-pH 5.0的醋酸盐缓冲液，4°C抽提 4-24小时，8000rpm离心20分钟除去沉淀，收集上清；将上清用纱布过滤，除去麸皮，在上清 中加入硫酸铵，至80%的饱和度，在4°C搅拌4小时；8000rpm离心30分钟，收集沉淀；用少 量pH7. 0的PBS缓冲液重新溶解沉淀，上样于脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋 白粗提物；将粗提物上样于HiTrap? DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集洗脱峰， 将收集的洗脱峰蛋白样品再次上样于脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到该分子量为 62 kD的苦荞麦凝集素。
[0008] 采用SDS-PAGE技术分析，通过与标准分子量比对，该苦荞麦凝集素的分子量约为 62 kD。
[0009] 本发明提供的苦荞麦凝集素是一种糖基化蛋白。
[0010] 本发明提供的一种苦荞麦凝集素可以使人红细胞发生凝集。
[0011] 经体外抗肿瘤活性检测显示，该苦荞麦凝集素可显著地抑制结肠癌细胞增殖。当 用终浓度为40ug/mL的该蛋白处理结肠癌细胞24小时，对该细胞的增殖抑制率达到50%以 上，而当作用时间为48小时时，增殖抑制率达到90%以上。而对正常细胞及其它癌细胞生 长无明显的抑制作用。
[0012] 本发明获得的抗肿瘤活性的荞麦凝集素经体外抗肿瘤活性检测，显示出对结肠癌 细胞的活性具有明显的抑制作用，对结肠癌具有专一性抑制。该蛋白可以在制备抗肿瘤药 物中应用，也可以在保健食品中应用。
[0013] 与现有技术相比，本发明首次从小杂粮作物，苦荞麦种子中分尚纯化出一种苦荞 麦凝集素，对结肠癌细胞具有特异的增殖抑制活性，但是对正常细胞及其它肿瘤细胞无毒 副作用。这一蛋白的发现，对于荞麦资源的深度开发及有效利用具有巨大的经济价值，同时 也为抗肿瘤药物及保健食品的开发提供技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1是苦荞麦凝集素的SDS-PAGE分析图
[0015] 图2是苦荞麦凝集素的PAS染色图
[0016] 图3是苦荞麦凝集素对结直肠癌细胞生长抑制图
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 :苦荞麦凝集素的制备
[0018] 将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，过40目筛，收集粉末；称取100g粉末，加入 1000mL pH4. 5的20mM的醋酸盐缓冲液，4°C提取12小时，8000rpm离心20分钟除去沉淀， 上清用纱布过滤，然后加入硫酸铵，至80%的饱和度；在4°C搅拌4小时，使蛋白充分沉淀， 8000rpm离心30min，收集沉淀，用30mL pH7. 0的PBS缓冲液将沉淀重新溶解；将溶解的沉 淀上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提物；将粗提物 上样于HiTrap? DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集氯化钠洗脱峰，将收集的洗 脱峰蛋白样品再次上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到苦荞麦 凝集素。采用Folin-酚法测定蛋白浓度，经计算采用该方法制得5. 4mg苦荞麦凝集素，经 SDS-PAGE分析，分子量大小为62 kD(见图1)。
[0019] 实施例2 :苦荞麦凝集素的制备
[0020] 将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，过40目筛，收集粉末；称取100g粉末，加入 1000mL pH4. 0的20mM的醋酸盐缓冲液，4°C提取4小时，8000rpm离心20min除去沉淀，上 清用纱布过滤，然后加入硫酸铵，至80 %的饱和度；在4°C搅拌4小时，使蛋白充分沉淀， 8000rpm离心30min，收集沉淀，用30mL pH7. 0的PBS缓冲液将沉淀重新溶解；将溶解的沉 淀上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提物；将粗提物 上样于HiTrap? DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集氯化钠洗脱峰，将收集的洗 脱峰蛋白样品再次上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到苦荞麦 凝集素。采用Folin-酚法测定蛋白浓度，经计算采用该方法制得3. 7mg苦荞麦凝集素，经 SDS-PAGE分析，分子量大小为62 kD。
[0021] 实施例3 :苦荞麦凝集素的制备
[0022] 将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，过40目筛，收集粉末；称取100g粉末，加入 1500mL pH4. 5的20mM的醋酸盐缓冲液，4°C提取12小时，8000rpm离心20min除去沉淀， 上清用纱布过滤，然后加入硫酸铵，至80%的饱和度；在4°C搅拌4小时，使蛋白充分沉淀， 8000rpm离心30min，收集沉淀，用30mL pH7. 0的PBS缓冲液将沉淀重新溶解；将溶解的沉 淀上样于HiP^pTM26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提物；将粗提物 上样于HiTrap? DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集氯化钠洗脱峰，将收集的洗 脱峰蛋白样品再次上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到苦荞麦 凝集素。采用Folin-酚法测定蛋白浓度，经计算采用该方法制得4. 3mg苦荞麦凝集素，经 SDS-PAGE分析，分子量大小为62 kD。
[0023] 实施例4 :苦荞麦凝集素的PAS染色
[0024] 实施例1制备的苦荞麦凝集素，经SDS-PAGE(浓缩胶浓度：4%，分离胶浓度： 12. 5%)分离后，转移到固相支持物PVDF膜上。将PVDF膜放置于含有Schiff试剂的培养 皿中避光染色30min，将膜用蒸馏水漂洗3次，可以看到苦荞麦凝集素可以被Schiff试剂染 色，呈现玫红色，说明苦荞麦凝集素是一种糖基化蛋白（见图2)。
[0025] 实施例5 :苦荞麦凝集素对结直肠癌细胞生长抑制作用
[0026] 应用MTT法，检测苦荞麦凝集素对正常细胞株HL7702和HEK293以及其它肿瘤细 胞株 Η印 G2, HeLa，MCF-7, QBC939, SGC7901，SW480, HCT116, DLD1 等的生长抑制作用。取 对数生长期的细胞，以1-5X 103个/孔传入96孔培养板，37°C含5%的C02细胞培养箱中孵 育24小时后，分别加入实施例1中的苦荞麦凝集素蛋白，使其终浓度分别为40ug/mL，20ug/ mL, 10ug/mL，5ug/mL,每组浓度设5个复孔，并用等体积的ρΗ7· 0的20mM/L PBS缓冲液作 为对照，分别孵育24h和48h后，每孔加入20uL MTT试剂（5mg/mL)，继续孵育4小时后，终 止培养，弃去孔内培养上清，每孔加入150uL DMS0,振荡10分钟，使结晶物充分溶解，在酶 标仪上490nm波长处测定其光吸收值。本发明所得的荞麦凝集素，对人结肠癌细胞，SW480， HCT116和DLD1具有显著的抑制增殖作用（见图3)。用终浓度为40ug/ml的该蛋白处理结 肠癌SW480细胞24小时，对该细胞的增殖抑制率达到50%以上，而当作用时间为48小时 时，增殖抑制率达到90%以上。而对正常细胞及其它肿瘤细胞无明显的抑制增殖作用。
【权利要求】
1. 一种苦荞麦凝集素，其特征在于，通过如下方法制得：将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉 碎后，然后按每克荞麦粉加入10-15mL pH4. 0-PH5. 0的醋酸盐缓冲液，4°C抽提4-24小时， 8000rpm离心20分钟除去沉淀，收集上清；将上清用纱布过滤，除去麸皮，在上清中加入硫 酸铵，至80%的饱和度，在4°C搅拌4小时；8000rpm离心30分钟，收集沉淀；用少量pH7. 0 的PBS缓冲液重新溶解沉淀，上样于脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提 物；将粗提物上样于HiTrap? DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集洗脱峰，将收集 的洗脱峰蛋白样品再次上样于脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到该分子量为62kD 的苦荞麦凝集素。
2. 如权利要求1所述的苦荞麦凝集素在制备抗结肠癌药物中的应用。
【文档编号】C07K1/36GK104086638SQ201410326985
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】崔晓东, 王转花, 贾乔瑾, 申剑 申请人:山西大学