牦牛皮降血压胶原蛋白多肽及其制备方法
【专利摘要】本发明公开牦牛皮降血压胶原蛋白多肽及其制备方法，包括物理及化学法对原料的预处理，明胶的制备，复合酶解制备ACE抑制胶原多肽，通过利用超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析和高效液相色谱等方法进行分离纯化多肽，浓缩干燥。本发明技术方案成功从牦牛皮中提取胶原蛋白多肽，其具有良好的溶解度、乳化能力和起泡特性，具有较高的ACE抑制活性即降血压功效，制法简单、易操作、成本低，扩展牦牛皮的应用前景。
【专利说明】牦牛皮降血压胶原蛋白多肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种胶原蛋白多肽及其制备方法，更加具体地说，尤其涉及牦牛皮降 血压多肽及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白肽通常是由胶原或明胶经过蛋白酶等降解处理得到的产物，含有的氨基 酸和胶原的基本一致，特别是特征氨基酸羟脯氨酸。现代生物代谢的研究发现，通过一系列 酶消化蛋白，可以形成一些小分子的物质，并被人体吸收。体内吸收不仅局限于游离氨基酸 的形式，而且主要是以2-3个氨基酸组成的小肽形式直接吸收。抗高血压肽又被称为血管 紧张素转化酶（ACE)抑制肽。ACE抑制多肽是通过竞争性抑制作用，阻碍ACE的催化反应， 与血管紧张素 I相比，ACE抑制肽与ACE的结合能力更强，而且还不容易释放，从而阻碍ACE 催化水解血管紧张素 I成为血管紧张素II的生化反应过程，发挥降低血压的作用。
[0003] 自从蛇毒中发现ACE抑制肽，已经有许多研究尝试合成ACE抑制多肽，如依那普 利、阿拉普利和赖诺普利等，这些合成化合物被用来治疗人体的高血压和心力衰竭等疾病。 但是合成的ACE抑制化合物一般都会有副作用，如咳嗽、味觉障碍、皮疹和血管神经性水肿 等。因此，在最近10年，人们都在努力寻找天然来源的ACE抑制剂，尽管很少但是这些抑制 剂是没有副作用的。
[0004] 牦牛是青藏高原地区的重要畜种，拥有顽强的生命力，生长环境是无污染、绿色纯 天然的青藏高原。牦牛皮中含有人体必需的各种氨基酸、多种营养元素、二十多种对人体 有益的矿物质。其化学成分主要由蛋白质、水、无机盐、脂类、色素及碳水化合物等组成，其 中水分占60% -70%，蛋白质含量占到30% -40%，脂类的含量的百分比在2. 0% -4. 0%之 间，无机盐含量为0. 3% -1. 0%，碳水化合物及其他占0. 5% -1. 5%。从牦牛皮中提取天然 的胶原蛋白多肽，可拓宽牦牛皮产品的种类，从而充分利用牦牛皮的营养价值和功用，防止 浪费，保护环境。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，对牦牛皮进行胶原蛋白提取，进行明胶 的提取和复合酶解，获得具有降血压功效的胶原蛋白肽，扩展牦牛皮的应用前景。
[0006] 本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
[0007] 本发明提供一种以牦牛皮为主原料的具有降血压功效的胶原蛋白多肽的制备方 法，依据上述制备方法制备牦牛皮降血压胶原蛋白多肽，其工艺步骤包括物理及化学法对 原料的预处理，明胶的制备，复合酶解制备ACE抑制胶原多肽，通过利用超滤、离子交换层 析、凝胶过滤层析和高效液相色谱等方法进行分离纯化多肽，浓缩干燥，具体步骤是：
[0008] 步骤1，牦牛皮的脱毛，即将牦牛皮置于水中清洗除去表面杂质，在剪去折干牦牛 皮上的毛后在60?80°C温水中浸泡牦牛皮4?48h，机械彻底脱毛，清水冲洗，清除毛屑， 将皮剪切成〇. 5X0. 5cm的小块，得到脱毛的牦牛皮，置于-18?-20°C冷冻保存；
[0009] 步骤2,牦牛皮的脱脂，即将步骤1脱毛的牦牛皮置于5wt%?20wt%正丁醇的水 溶液中（即在溶液中，正丁醇的质量百分数为5 - 20% )，在溶液温度为0?10°C下连续搅 拌4?48h，得到脱脂的牦牛皮，所述步骤1脱毛的牦牛皮与正丁醇的水溶液的质量比为1 : (5 ?20);
[0010] 步骤3,牦牛皮的除杂蛋白，即将步骤2脱脂的牦牛皮置于碱液中，在0?10°C下 连续搅拌5?48h，得到除杂蛋白的牦牛皮，其中所述碱液为0. 01?0. 2M的氢氧化钠水溶 液或者氢氧化钾水溶液，所述步骤2脱脂的牦牛皮与碱液的质量比为1 : (15?40);
[0011] 步骤4,牦牛皮的脱酸，即将步骤3除杂蛋白的牦牛皮置于酸液中，在室温20- 25°C搅拌浸泡2?15h，再反复水洗牦牛皮至pH值达到5?7,得到脱酸牦牛皮，其中所述 酸液为质量百分数为〇. 01 %?2 %的盐酸水溶液或者硫酸水溶液，所述步骤3除杂蛋白的 牦牛皮与酸液的质量比为1 : (5?15);
[0012] 步骤5,对脱酸牦牛皮进行抽提，即将步骤4脱酸的牦牛皮置于70?90°C的热水 中搅拌抽提，所述步骤4脱酸的牦牛皮与热水的质量比为1 : (5?15)，在搅拌抽提过程中 每隔30?120min进行过滤并更换热水继续进行搅拌抽提，直至牦牛皮全部溶解，每次过滤 得到的滤液汇总成为水抽提产物；
[0013] 步骤6,将水抽提产物制备明胶粉末，即将步骤5得到的水抽提产物（即牦牛皮全 部溶解后得到的全部胶液）在4000?10000g离心力下离心2?20min，收集上清液，利用 旋转蒸发仪进行浓缩后干燥得到明胶粉末，2?4°C储存备用；
[0014] 步骤7,对明胶粉末进行酶解，即将步骤6制备的明胶粉末溶于0. 01?0. 2M的磷 酸钠缓冲溶液中以得到质量百分数4?10%的明胶水溶液，加入复合酶进行酶解，加酶量 为底物（即明胶粉末）重量的〇. 1?2%，酶解温度为35?55°C，酶解时间4?8h，pH值 为7 ;酶解后置于75?90°C灭酶处理5?15min ;灭活后，在4000?10000g离心力下离心 15?40min，保留上清液；
[0015] 步骤8,将步骤7制备的上清液进行超滤以得到所需分子量的胶原蛋白溶液，其中 选择使用超滤膜进行超滤，分别使用分子量为10kDa及3000Da的超滤膜进行超滤，得到分 子量为小于10kDa和3000Da的胶原蛋白溶液。
[0016] 优选的，在步骤2中，所述正丁醇浓度优选10 - 20 %，温度为5?10°C，时间为 20 ?40h。
[0017] 优选的，在步骤3中，所述碱液为氢氧化钠的水溶液，摩尔浓度为0. 01M，除杂温度 为2?6°C，时间为15 - 40h。
[0018] 优选的，在步骤4中，所述酸液为质量百分数为0.01%?2%的盐酸水溶液，在室 温20- 25°C搅拌浸泡10?15h。
[0019] 优选的，在步骤6中，在浓缩后进行的干燥为冷冻干燥或者喷雾干燥。
[0020] 优选的,在步骤7中，复合酶酶解明胶，复合酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者质 量比例为（0.5-1. 5) :1，复合蛋白酶添加量为明胶粉末质量的0. 在35?55°C下 酶解4?8h。
[0021] 优选的，在完成步骤8的超滤之后，进行离子交换层析、凝胶过滤层析和高效液相 色谱等方法进行分离纯化多肽，浓缩干燥，以得到胶原蛋白多肽的粉末。
[0022] 利用本发明的技术方案成功从牦牛皮中提取胶原蛋白多肽，其具有良好的溶解 度、乳化能力和起泡特性，具有较高的ACE抑制活性即降血压功效。制法简单、易操作、成本 低。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。 HHL:Hippuryl-Histidyl-Leucin马尿酰组氨酸亮氨酸（购于sigma公司）、盐干牦牛皮（青 海牛牦牛市场）、胰蛋白酶（分析纯试剂、购于天津诺维信公司）、血管紧张素转化酶（ACE) 分析纯（购于天津诺维信公司）、碱性蛋白酶（天津诺维信公司提供）、喷雾干燥机（上海 雅程有限公司）。
[0024] 实例 1
[0025] (1)将牦牛皮置于水中清洗除去表面杂质，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在80°C 温水中浸泡牦牛皮20h，机械彻底脱毛，清水冲洗，清除毛屑，将皮剪切成0. 5 X 0. 5cm的小 块，得到脱毛的牦牛皮，置于-18?_20°C冷冻保存；
[0026] (2)将脱毛牦牛皮置于12%正丁醇中，料液比为1:10,在溶液温度为4°C下连续搅 拌20h，得到脱脂的牦牛皮；
[0027] (3)将脱脂牦牛皮以1 :15的比例置于摩尔浓度为0. 1M的碱液中，在4°C下连续搅 拌20h，得到除杂蛋白的牦牛皮；
[0028] (4)将除杂蛋白牦牛皮置于0. 2%的酸溶液中，料液比为1 :10,室温搅拌浸泡5h， 再反复水洗牦牛皮至pH值达到7,得到脱酸牦牛皮；
[0029] (5)将脱酸牦牛皮以1:5的比例置于80°C的热水中搅拌抽提，每隔30min过滤并 更换蒸馏水，至碎皮全部溶解，得到水抽提产物；
[0030] (6)将水抽提产物即全部胶液，8000g离心力下离心15min，收集上清液；
[0031] (7)将上清液利用旋转蒸发仪进行浓缩，后干燥得到明胶粉末，4°C储存备用；
[0032] (8)将明胶粉末溶于0. 1M的磷酸钠缓冲溶液，得到5%的明胶溶液，后加入复合 酶进行酶解，加酶量为底物重量的1 %，复合酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者质量比例为 0. 5 :1，酶解温度为50°C，酶解时间6h，pH值为7 ;酶解后置于90°C灭酶处理lOmin ;灭活后， 4000g离心30min，保留上清；
[0033] (9)将上清液分别通过分子量为lOkDa及3000Da的超滤膜超滤，得到分子量为小 于lOkDa和3000Da的胶原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分别为0· 802mg/ml，0· 437mg/ml。
[0034] 实例 2
[0035] (1)将牦牛皮置于水中清洗除去表面杂质，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在80°C 温水中浸泡牦牛皮l〇h，机械彻底脱毛，清水冲洗，清除毛屑，将皮剪切成0. 5X0. 5cm的小 块，得到脱毛的牦牛皮，置于-18?-20°C冷冻保存；
[0036] (2)将脱毛牦牛皮置于5%正丁醇中，料液比为1:5,在溶液温度为4°C下连续搅拌 12h，得到脱脂的牦牛皮；
[0037] (3)将脱脂牦牛皮以1 :20的比例置于摩尔浓度为0. 1M的碱液中，在5°C下连续搅 拌20h，得到除杂蛋白的牦牛皮；
[0038] (4)将除杂蛋白牦牛皮置于1 %的酸溶液中，料液比为1 :5,室温搅拌浸泡5h，再反 复水洗牦牛皮至pH值达到7,得到脱酸牦牛皮；
[0039] (5)将脱酸牦牛皮以1:5的比例置于80°C的热水中搅拌抽提，每隔40min过滤并 更换蒸馏水，至碎皮全部溶解，得到水抽提产物；
[0040] (6)将水抽提产物即全部胶液，8000g离心力下离心15min，收集上清液；
[0041] (7)将上清液利用旋转蒸发仪进行浓缩，后干燥得到明胶粉末，4°C储存备用；
[0042] (8)将明胶粉末溶于0. 05M的磷酸钠缓冲溶液，得到4%的明胶溶液，后加入复合 酶进行酶解，加酶量为底物重量的1%，复合酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者质量比例为 1.5 :1，酶解温度为40°C，酶解时间6h，pH值为7 ;酶解后置于85°C灭酶处理lOmin ;灭活后， 8000g离心15min，保留上清；
[0043] (9)将上清液分别通过分子量为lOkDa及3000Da的超滤膜超滤，得到分子量为小 于lOkDa和3000Da的胶原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分别为4. 780mg/ml，2. 012mg/ml。
[0044] 实例 3
[0045] (1)将牦牛皮置于水中清洗除去表面杂质，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在60°C 温水中浸泡牦牛皮4h，机械彻底脱毛，清水冲洗，清除毛屑，将皮剪切成0. 5X0. 5cm的小 块，得到脱毛的牦牛皮，置于-18?_20°C冷冻保存；
[0046] (2)将脱毛牦牛皮置于10%正丁醇中，料液比为1:10,在溶液温度为4°C下连续搅 拌12h，得到脱脂的牦牛皮；
[0047] (3)将脱脂牦牛皮以1 :40的比例置于摩尔浓度为0. 2M的碱液中，在4°C下连续搅 拌20h，得到除杂蛋白的牦牛皮；
[0048] (4)将除杂蛋白牦牛皮置于2%的酸溶液中，料液比为1 :5,室温搅拌浸泡5h，再反 复水洗牦牛皮至pH值达到6,得到脱酸牦牛皮；
[0049] (5)将脱酸牦牛皮以1:10的比例置于70°C的热水中搅拌抽提，每隔60min过滤并 更换蒸馏水，至碎皮全部溶解，得到水抽提产物；
[0050] (6)将水抽提产物即全部胶液，6000g离心力下离心20min，收集上清液；
[0051] (7)将上清液利用旋转蒸发仪进行浓缩，后干燥得到明胶粉末，4°C储存备用；
[0052] (8)将明胶粉末溶于0. 15M的磷酸钠缓冲溶液，得到10%的明胶溶液，后加入复合 酶进行酶解，加酶量为底物重量的2%，复合酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者质量比例为 0. 8 :1，酶解温度为35°C，酶解时间4h，pH值为7 ;酶解后置于75°C灭酶处理lOmin ;灭活 后，6000g离心20min，保留上清；
[0053] (9)将上清液分别通过分子量为lOkDa及3000Da的超滤膜超滤，得到分子量为小 于lOkDa和3000Da的胶原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分别为12. 26mg/ml，5. 243mg/ml。
[0054] 实例 4
[0055] (1)将牦牛皮置于水中清洗除去表面杂质，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在70°C 温水中浸泡牦牛皮48h，机械彻底脱毛，清水冲洗，清除毛屑，将皮剪切成0. 5X0. 5cm的小 块，得到脱毛的牦牛皮，置于-18?_20°C冷冻保存；
[0056] (2)将脱毛牦牛皮置于20%正丁醇中，料液比为1:15,在溶液温度为4°C下连续搅 拌12h，得到脱脂的牦牛皮；
[0057] (3)将脱脂牦牛皮以1 :30的比例置于摩尔浓度为0. 15M的碱液中，在4°C下连续 搅拌48h，得到除杂蛋白的牦牛皮；
[0058] (4)将除杂蛋白牦牛皮置于1. 5%的酸溶液中，料液比为1 :10,室温搅拌浸泡10h， 再反复水洗牦牛皮至pH值达到7,得到脱酸牦牛皮；
[0059] (5)将脱酸牦牛皮以1:10的比例置于90°C的热水中搅拌抽提，每隔80min过滤并 更换蒸馏水，至碎皮全部溶解，得到水抽提产物；
[0060] (6)将水抽提产物即全部胶液，10000g离心力下离心5min，收集上清液；
[0061] (7)将上清液利用旋转蒸发仪进行浓缩，后干燥得到明胶粉末，4°C储存备用；
[0062] (8)将明胶粉末溶于0. 05M的磷酸钠缓冲溶液，得到4%的明胶溶液，后加入复 合酶进行酶解，加酶量为底物重量的2 %，复合酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者质量比例 为1 :1，酶解温度为45°C，酶解时间8h，pH值为7 ;酶解后置于90°C灭酶处理lOmin ;灭活 后，8000g离心15min，保留上清；
[0063] (9)将上清液分别通过分子量为10kDa及3000Da的超滤膜超滤，得到分子量为小 于10kDa和3000Da的胶原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分别为1. 67mg/ml，0· 721mg/ml。
[0064] 实例 5
[0065] (1)将牦牛皮置于水中清洗除去表面杂质，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在75°C 温水中浸泡牦牛皮4h，机械彻底脱毛，清水冲洗，清除毛屑，将皮剪切成0. 5X0. 5cm的小 块，得到脱毛的牦牛皮，置于-18?_20°C冷冻保存；
[0066] (2)将脱毛牦牛皮置于5%正丁醇中，料液比为1:5,在溶液温度为10°C下连续搅 拌12h，得到脱脂的牦牛皮；
[0067] (3)将脱脂牦牛皮以1 :15的比例置于摩尔浓度为0. 15M的碱液中，在10°C下连续 搅拌24h，得到除杂蛋白的牦牛皮；
[0068] (4)将除杂蛋白牦牛皮置于0. 05%的酸溶液中，料液比为1 :5,室温搅拌浸泡15h， 再反复水洗牦牛皮至pH值达到7,得到脱酸牦牛皮；
[0069] (5)将脱酸牦牛皮以1:15的比例置于90°C的热水中搅拌抽提，每隔30min过滤并 更换蒸馏水，至碎皮全部溶解，得到水抽提产物；
[0070] (6)将水抽提产物即全部胶液，4000g离心力下离心30min，收集上清液；
[0071] (7)将上清液利用旋转蒸发仪进行浓缩，后干燥得到明胶粉末，4°C储存备用；
[0072] (8)将明胶粉末溶于1M的磷酸钠缓冲溶液，得到5%的明胶溶液，后加入复合酶 进行酶解，加酶量为底物重量的〇. 5%，复合酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者质量比例为 1.2 :1，酶解温度为55°C，酶解时间6h，pH值为7 ;酶解后置于90°C灭酶处理lOmin ;灭活 后，4000g离心30min，保留上清；
[0073] (9)将上清液分别通过分子量为10kDa及3000Da的超滤膜超滤，得到分子量为小 于10kDa和3000Da的胶原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分别为8. 561mg/ml，2. 331mg/ml。
[0074] 在本发明技术方案中，ACE抑制能力的测定方法如下：
[0075] HHL底物溶液配制：将HHL溶于pH8. 350mmol/L硼酸缓冲液中（含0· 5mol/LNaCl)， 配制成8. 3mmol/L的溶液
[0076] 取50μl样品与150μlHHL底物溶液在37°C预热5min后，加入50μlACE酶液 (25mU/ml)，在37°C反应60min后立即加入250μ llmol/LHCl终止反应。加入1. 5ml乙酸乙 酯萃取反应生成的马尿酸，1200Xg转速下离心15min，吸取乙酸乙酯层溶液lml加入干净 试管中，放入烘箱120°C挥发溶剂35min，最后用3ml蒸馈水溶解马尿酸，测定228nm下的吸 光度值。
【权利要求】
1. 牦牛皮降血压胶原蛋白多肽，其特征在于，按照下述步骤进行： 步骤1，牦牛皮的脱毛，即将牦牛皮置于水中清洗除去表面杂质，在剪去折干牦牛皮上 的毛后在60?80°C温水中浸泡牦牛皮4?48h，机械彻底脱毛，清水冲洗，清除毛屑，将皮 剪切成0. 5X0. 5cm的小块，得到脱毛的牦牛皮，置于-18?-20°C冷冻保存； 步骤2,牦牛皮的脱脂，即将步骤1脱毛的牦牛皮置于5wt%?20wt%正丁醇的水溶液 中（即在溶液中，正丁醇的质量百分数为5-20% )，在溶液温度为0?10°C下连续搅拌4? 48h，得到脱脂的牦牛皮，所述步骤1脱毛的牦牛皮与正丁醇的水溶液的质量比为1 : (5? 20)； 步骤3,牦牛皮的除杂蛋白，即将步骤2脱脂的牦牛皮置于碱液中，在0?10°C下连续 搅拌5?48h，得到除杂蛋白的牦牛皮，其中所述碱液为0. 01?0. 2M的氢氧化钠水溶液或 者氢氧化钾水溶液，所述步骤2脱脂的牦牛皮与碱液的质量比为1 : (15?40); 步骤4,牦牛皮的脱酸，即将步骤3除杂蛋白的牦牛皮置于酸液中，在室温20- 25°C搅 拌浸泡2?15h，再反复水洗牦牛皮至pH值达到5?7,得到脱酸牦牛皮，其中所述酸液为 质量百分数为〇. 01 %?2%的盐酸水溶液或者硫酸水溶液，所述步骤3除杂蛋白的牦牛皮 与酸液的质量比为1 : (5?15); 步骤5,对脱酸牦牛皮进行抽提，即将步骤4脱酸的牦牛皮置于70?90°C的热水中搅 拌抽提，所述步骤4脱酸的牦牛皮与热水的质量比为1 : (5?15)，在搅拌抽提过程中每隔 30?120min进行过滤并更换热水继续进行搅拌抽提，直至牦牛皮全部溶解，每次过滤得到 的滤液汇总成为水抽提产物； 步骤6,将水抽提产物制备明胶粉末，即将步骤5得到的水抽提产物（即牦牛皮全部溶 解后得到的全部胶液）在4000?10000g离心力下离心2?20min，收集上清液，利用旋转 蒸发仪进行浓缩后干燥得到明胶粉末，2?4°C储存备用； 步骤7,对明胶粉末进行酶解，即将步骤6制备的明胶粉末溶于0. 01?0. 2M的磷酸钠 缓冲溶液中以得到质量百分数4?10 %的明胶水溶液，加入复合酶进行酶解，加酶量为底 物（即明胶粉末）重量的〇· 1?2%，酶解温度为35?55°C，酶解时间4?8h，pH值为7 ; 酶解后置于75?90°C灭酶处理5?15min ;灭活后，在4000?10000g离心力下离心15? 40min,保留上清液； 步骤8,将步骤7制备的上清液进行超滤以得到所需分子量的胶原蛋白溶液，其中选择 使用超滤膜进行超滤，分别使用分子量为10kDa及3000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量 为小于10kDa和3000Da的胶原蛋白溶液。
2. 根据权利要求1所述的牦牛皮降血压胶原蛋白多肽，其特征在于，在步骤2中，所述 正丁醇浓度优选10 - 20%，温度为5?10°C，时间为20?40h ;在步骤3中，所述碱液为氢 氧化钠的水溶液，摩尔浓度为0. 01M，除杂温度为2?6°C，时间为15-40h ;在步骤4中，所 述酸液为质量百分数为〇. 01 %?2%的盐酸水溶液，在室温20- 25°C搅拌浸泡10?15h。
3. 根据权利要求1所述的牦牛皮降血压胶原蛋白多肽，其特征在于，在步骤6中，在浓 缩后进行的干燥为冷冻干燥或者喷雾干燥。
4. 根据权利要求1所述的牦牛皮降血压胶原蛋白多肽，其特征在于，在完成步骤8的超 滤之后，进行离子交换层析、凝胶过滤层析和高效液相色谱等方法进行分离纯化多肽，浓缩 干燥，以得到胶原蛋白多肽的粉末。
5. 牦牛皮降血压胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：步骤1， 牦牛皮的脱毛，即将牦牛皮置于水中清洗除去表面杂质，在剪去折干牦牛皮上的毛后在 60?80°C温水中浸泡牦牛皮4?48h，机械彻底脱毛，清水冲洗，清除毛屑，将皮剪切成 0. 5X0. 5cm的小块，得到脱毛的牦牛皮，置于-18?-20°C冷冻保存； 步骤2,牦牛皮的脱脂，即将步骤1脱毛的牦牛皮置于5wt%?20wt%正丁醇的水溶液 中（即在溶液中，正丁醇的质量百分数为5-20% )，在溶液温度为0?10°C下连续搅拌4? 48h，得到脱脂的牦牛皮，所述步骤1脱毛的牦牛皮与正丁醇的水溶液的质量比为1 : (5? 20)； 步骤3,牦牛皮的除杂蛋白，即将步骤2脱脂的牦牛皮置于碱液中，在0?1(TC下连续 搅拌5?48h，得到除杂蛋白的牦牛皮，其中所述碱液为0. 01?0. 2M的氢氧化钠水溶液或 者氢氧化钾水溶液，所述步骤2脱脂的牦牛皮与碱液的质量比为1 : (15?40); 步骤4,牦牛皮的脱酸，即将步骤3除杂蛋白的牦牛皮置于酸液中，在室温20- 25°C搅 拌浸泡2?15h，再反复水洗牦牛皮至pH值达到5?7,得到脱酸牦牛皮，其中所述酸液为 质量百分数为〇. 01 %?2%的盐酸水溶液或者硫酸水溶液，所述步骤3除杂蛋白的牦牛皮 与酸液的质量比为1 : (5?15); 步骤5,对脱酸牦牛皮进行抽提，即将步骤4脱酸的牦牛皮置于70?90°C的热水中搅 拌抽提，所述步骤4脱酸的牦牛皮与热水的质量比为1 : (5?15)，在搅拌抽提过程中每隔 30?120min进行过滤并更换热水继续进行搅拌抽提，直至牦牛皮全部溶解，每次过滤得到 的滤液汇总成为水抽提产物； 步骤6,将水抽提产物制备明胶粉末，即将步骤5得到的水抽提产物（即牦牛皮全部溶 解后得到的全部胶液）在4000?10000g离心力下离心2?20min，收集上清液，利用旋转 蒸发仪进行浓缩后干燥得到明胶粉末，2?4°C储存备用； 步骤7,对明胶粉末进行酶解，即将步骤6制备的明胶粉末溶于0. 01?0. 2M的磷酸钠 缓冲溶液中以得到质量百分数4?10 %的明胶水溶液，加入复合酶进行酶解，加酶量为底 物（即明胶粉末）重量的〇· 1?2%，酶解温度为35?55°C，酶解时间4?8h，pH值为7 ; 酶解后置于75?90°C灭酶处理5?15min ;灭活后，在4000?10000g离心力下离心15? 40min,保留上清液； 步骤8,将步骤7制备的上清液进行超滤以得到所需分子量的胶原蛋白溶液，其中选择 使用超滤膜进行超滤，分别使用分子量为10kDa及3000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量 为小于10kDa和3000Da的胶原蛋白溶液。
6. 根据权利要求5所述的牦牛皮降血压胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，在步 骤2中，所述正丁醇浓度优选10 - 20%，温度为5?10°C，时间为20?40h ;在步骤3中， 所述碱液为氢氧化钠的水溶液，摩尔浓度为〇. 01M,除杂温度为2?6°C,时间为15 - 40h ; 在步骤4中，所述酸液为质量百分数为0. 01 %?2 %的盐酸水溶液，在室温20-25 °C搅拌 浸泡10?15h。
7. 根据权利要求5所述的牦牛皮降血压胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，在步 骤6中，在浓缩后进行的干燥为冷冻干燥或者喷雾干燥。
8. 根据权利要求5所述的牦牛皮降血压胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，在完 成步骤8的超滤之后，进行离子交换层析、凝胶过滤层析和高效液相色谱等方法进行分离
【文档编号】C07K14/78GK104087641SQ201410326515
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】朱宏吉, 马力, 王世鹏 申请人:天津大学