专利名称：一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种苦荞麦组培苗的快速繁殖方法，特别是涉及一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法。
背景技术：
荞麦是一种药食同源的植物，有苦荞和甜荞两种。由于苦荞其籽粒、根、茎、叶及花等多种器官中都含有大量黄酮类物质，因而被誉为“降血糖、降血压、降血脂”的三降食品。 随着其营养价值和药用价值的不断发现，苦荞麦植物资源越来越受到人们的青睐。由于苦荞麦植物自花授粉的特点使其在生产育种上人工杂交难以成功，因此目前苦荞麦在育种方面仍未获得重大突破。
组织培养可在一定程度上解决苦养麦在育种上所遇到的一些问题。目前已有利用荞麦的胚轴、子叶、原生质体为外植体的植株再生研究，但采用以苦荞麦叶柄为外植体进行的植株再生研究还未见有任何的报道。
目前以荞麦叶柄为外植体的组织培养研究只进行到愈伤组织阶段，如于寒松等人的论文《利用悬浮细胞培养方法提高荞麦中总黄酮含量的研究》和王爱国等人的论文《普通荞麦愈伤组织诱导及其分化的正交设计试验研究》。在王爱国等人的论文研究中，还检测了荞麦植物叶柄以及由荞麦叶柄形成的愈伤组织中各自含有的总黄酮含量，结果发现荞麦叶柄中的总黄酮含量为18. 97mg/g(高于荞麦的其它部位)，而由荞麦叶柄形成的愈伤组织中的总黄酮含量为58. 80mg/g，总黄酮含量共增加了 2. 1倍。
综上所述，苦荞麦植物由于人工杂交难以成功，因此不易选育出优良品种。而以荞麦的胚轴、子叶、原生质体为外植体进行植株再生研究，虽然可解决苦养麦在育种上的一些问题，但由于胚轴、子叶、原生质体为幼嫩体，其总黄酮含量及其它次生代谢物含量均低于叶柄，因此用胚轴、子叶、原生质体培养出的再生植株的品种不及用叶柄培养出的再生植株的品种优良。发明内容
本发明的目的在于一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法，该方法可实现苦荞麦植物优良品种的选育和快速繁殖。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案由如下步骤构成
(1)外植体的处理选取生长健康和无病虫害的苦荞叶，切去叶片部分，将叶柄用浓度为0. 的升汞消毒2 6分钟，再用无菌水清洗3 4次；
(2)愈伤组织诱导将消毒后的叶柄外植体上的水分吸干，再切成0. 7cm 1. 5cm 的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 0. 1 2. 0mg/L+2,4-D 1 6mg/L+IAA 0 lmg/L中进行培养；
(3)芽分化培养选取质地较紧密、生长状况良好的愈伤组织，将其切成0. 5 1. Ocm2的块状后，接入芽分化培养基MS+6-BA 1. 0 4. 0mg/L+NAA0. 1 lmg/L+KT 0 1. 5mg/L中进行培养；
(4)生根培养当不定芽长至2.0 4. Ocm时，将其切下转接到生根培养基MS+IBA 0 2. Omg/L上进行生根培养；
(5)炼苗和移栽当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，先在室内炼苗2 4天， 再将组培苗从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至松软的土壤中生长；
上述所有培养基的pH值为5. 5 6. 7、蔗糖15 50g .L-1、琼脂6. O 7. Og .L—1 ；
上述光照培养条件均为每天光照8 16小时、光照强度为1500 25001x、培养温度 20 27°C。
上述步骤(1)中苦荞叶应在晴天选取且叶龄为3 40天。
上述步骤O)中消毒后的叶柄外植体在切成0. 7cm 1. 5cm的长度前，应先切去叶柄两端少量的游离末端，使切口保持新鲜。
上述步骤( 中叶柄外植体接入培养基的方式为正接(形态学下端插入培养基)、 反接(形态学上端插入培养基)或平放(不插入培养基即平放在培养基表面)。
上述步骤(5)中将组培苗移栽至松软的土壤中生长时应适当遮光，温度保持在 20 27°C，相对湿度在70 80%。
本发明以苦养麦叶柄为外植体，通过愈伤组织诱导、芽分化培养、生根培养和移栽，可快速繁殖品种优良的苦荞麦再生植株，为苦荞麦植物优良品种的选育和快速繁殖提供了一条新途径。另外本发明所用叶柄来源丰富，取材容易，可充分利用资源。
具体实施方式
实施例1
(1)外植体的处理选取生长健康、无病虫害、叶龄在15天左右的苦荞叶，切去叶片部分，将叶柄放在超净工作台上用浓度为0. 的升汞消毒4分钟，再用无菌水清洗4 次；
(2)愈伤组织诱导将消毒后的叶柄外植体上的水分吸干，并切去其两端少量的游离末端，再沿45°方向将叶柄斜切成Icm的长度，然后采用正接(形态学下端插入培养基)的接种方式，将其接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 0. 5mg/L+2,4-D 4mg/L+IAA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂6. 8g/L中进行培养，叶柄在接入培养基后第3天开始出现膨大， 并在随后的培养过程中，可观察到叶柄膨大处开始长出质地较紧密的愈伤组织，在培养20 天后统计其愈伤组织诱导率为100% ；
(3)芽分化培养选取质地较紧密、生长状况良好的愈伤组织，将其切成0. Scm2的块状后，接入芽分化培养基MS+6-BA 2. Omg/L+NAAO. lmg/L+KT lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂 6. 8g/L中进行培养，在培养30天后统计其不定芽诱导率为34. 45% ；
(4)生根培养当不定芽长至3. Ocm左右时，将其切下转接到生根培养基MS+IBA 0. 5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂6. 8g/L上进行生根培养，在培养20天后统计其生根率为 85. 0% ；
(5)炼苗和移栽当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，先在室内炼苗3天，再将组培苗从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至松软的土壤中，适当遮光，温度保持在左右，相对湿度在75%左右；组培苗生长健壮，成活率在90%以上；
上述所有培养基的pH值为5. 5 6. 7，光照培养条件均为每天光照8 16小时、 光照强度为1500 25001x、培养温度20 27°C。
实施例2
将实施例1步骤中产生的不定芽切下后，转接到不加激素的MS培养基中，其它步骤同实施例1，在培养20天后统计其生根率为71. 4%;但产生的不定根数目较少、且根细长和根毛不发达；并在后期的组培苗移栽过程中，成活率较低，为68. 8%。
实施例3
将实施例1步骤( 中叶柄接入愈伤组织诱导培养基中的接种方式改为平放(不插入培养基、平放在培养基表面)，其它步骤同实施例1 ；尽管叶柄在培养20后统计其愈伤组织诱导率也为100%，但愈伤组织生长的速度慢、产生的数量也少，仅为采用正接方式产生愈伤组织量的1/5。
权利要求
1.一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法，其特征在于包括如下步骤(1)外植体的处理选取生长健康和无病虫害的苦荞叶，切去叶片部分，将叶柄用浓度为0. 1 %的升汞消毒2 6分钟，再用无菌水清洗3 4次；(2)愈伤组织诱导将消毒后的叶柄外植体上的水分吸干，再切成0.7cm 1.5cm的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 0. 1 2. 0mg/L+2,4-D 1 6mg/L+IAA 0 lmg/L中进行培养；(3)芽分化培养选取质地较紧密、生长状况良好的愈伤组织，将其切成0.5 1. Ocm2 的块状后，接入芽分化培养基MS+6-BA 1. 0 4. 0mg/L+NAA0. 1 lmg/L+KT 0 1. 5mg/L 中进行培养；(4)生根培养当不定芽长至2.0 4.Ocm时，将其切下转接到生根培养基MS+IBA 0 2. Omg/L上进行生根培养；(5)炼苗和移栽当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，先在室内炼苗2 4天，再将组培苗从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至松软的土壤中生长；上述所有培养基的pH值为5. 5 6. 7、蔗糖15 50g · L-1、琼脂6. 0 7. Og · L-1 ；上述光照培养条件均为每天光照8 16小时、光照强度为1500 25001x、培养温度 20 27°C。
2.根据权利要求1所述的一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法，其特征在于步骤(1)中苦荞叶应在晴天选取且叶龄为3 40天。
3.根据权利要求1所述的一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法，其特征在于步骤(2)中消毒后的叶柄外植体在切成0. 7cm 1. 5cm的长度前，应 先切去叶柄两端少量的游离末端，使切口保持新鲜。
4.根据权利要求1所述的一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法，其特征在于步骤O)中叶柄外植体接入培养基的方式为正接、反接或平放。
5.根据权利要求1所述的一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法，其特征在于步骤(5)中将组培苗移栽至松软的土壤中生长时应适当遮光，温度保持在20 27°C， 相对湿度在70 80%。
全文摘要
本发明公开了一种以苦荞麦叶柄为外植体的植株快速繁殖方法，该方法包括如下步骤外植体的处理→愈伤组织诱导→芽分化培养→生根培养→炼苗和移栽。本发明以苦荞麦次生代谢物总黄酮含量高的叶柄为外植体可快速繁殖品种优良的苦荞麦再生植株，为苦荞麦植物优良品种的选育和快速繁殖提供一条新途径。
文档编号A01H4/00GK102499080SQ20111032441
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月23日 优先权日2011年10月23日
发明者孙雁霞, 宋超, 彭镰心, 段有丽, 王跃华, 胡一冰, 赵钢, 邬晓勇, 邹亮, 陈丽 申请人:成都大学