鸭甲肝病毒3型vp1蛋白和ltb的融合蛋白抗原及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；上述的蛋白用于制备基因工程重组亚单位疫苗。本发明利用pET30a(+)表达性载体构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了30kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭(产蛋种)，免疫后可以使孵化的雏鸭获得免疫保护。
【专利说明】鸭甲肝病毒3型VP1蛋白和LTB的融合蛋白抗原及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白 及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是世界养鸭大国，鸭肉年生产总量约占世界总量的70%，自2000年的186. 6 万吨增长到2008年的258. 1万吨，年均增长率约3. 8%，大大高于世界平均水平。20世纪 W来，鸭病毒性肝炎已经成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一，其主要感染1-3周龄 的维鸭，死亡率高达90% W上。该病的发生与流行对我国养鸭业的发展造成严重威胁。
[0003] 鸭甲肝病毒是造成鸭病毒性肝炎的主要病毒，主要分为H个血清型DHAV-1、 DHAV-2和DHAV-3。其中DHAV-1最早是在1950年从美国分离得到的，是经典毒株，目前分 布于世界各地，也是中国目前流行的主要毒株。DHAV-2是分离自台湾的新型毒株，主要在台 湾地区流行。DHAV-3为最早分离自韩国的新型毒株，近年来我国DHAV-3导致的鸭病毒性肝 炎频繁爆发，且在一些地区与DHAV-1的共流行，而使用现有DHAV-1型的疫苗株或者卵黄抗 体均起不到有效的保护作用。因此开发DHAV-3的新型疫苗株对养鸭业的健康发展无疑具 有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白，即通过筛选鸭 甲肝病毒3型结构蛋白VP1获得含优势抗原表位的截短的VP1蛋白，并通过Lingker (GGG巧 与肠毒素LTB组成新型融合蛋白LTB-VP1，并W该融合蛋白作为抗原来制备鸭甲肝病毒基 因工程亚单位疫苗。
[0005] 本发明首先提供一种鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其编码蛋白 的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ;
[0006] 上述蛋白的一种核巧酸序列为SEQ ID NO:2 ;
[0007] 本发明还提供一种鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗，其中的抗原为上述的截 短的鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其浓度为0. 1-lmg/ml之间；
[0008] 本发明的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下：
[0009] 1)将新型融合蛋白LTB-VP1基因插入表达载体中，构建成表达重组质粒；
[0010] 2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建了能表达LTB-VP1的重组基因工程 菌；用该重组基因工程菌表达出新型融合蛋白LTB-VP1 ;
[0011] 3)对重组表达的LTB-VP1蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。
[0012] 本发明利用祀T30a(+)表达性载体构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的大肠 杆菌化21 〇)E3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了 30kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯 化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭（产蛋种），免疫后可W使赔化的维鸭获 得免疫保护。
【具体实施方式】
[0013] 申请人:在获得一个具有免疫特性的鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白 LTB-VP1，并进一步通过大肠杆菌稀有密码子优化获得其基因，然后通过祀T30a(+)原核表 达载体构建出能表达蛋白LTB-VP1的大肠杆菌化21 〇)E3)重组基因工程菌，通过对工程菌 的诱导、超声破碎、蛋白纯化、定量、与佐剂配比等制备和生产方法制备出了鸭甲肝病毒基 因工程重组亚单位疫苗。
[0014] 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可W对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，该些修改和替换均落入本发明保护范围内。
[0015] 实施例1截短的鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白的获得
[0016] 1、利用生物软件DNAStar对DHAV-3代表毒株（GenBank登录号；EU289393. 1) 的VP1蛋白进行抗原表位分析，尝试了抗原表位随机拼接、抗原表位连接整合等多种技 术手段，最终选定VP1蛋白抗原性较强部分巧〇-225aa)与LTB序列进行拼接，中间设 计LingkeHGGG巧进行连接，获得一种截短的鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白 LTB-VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1，并利用在线生物软件DNAWorks进行大 肠杆菌稀有密码子优化，获得融合蛋白LTB-VP1的核巧酸序列SEQ ID N0:2。
[0017] 将新获得的融合蛋白LTB-VPl的核巧酸序列进行全基因合成，同时两端分别加上 BamH I和Hind III酶切位点。
[0018] 实施例2基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得
[0019] 1、上述全基因合成的融合蛋白LTB-VP1基因用BamH I和化nd III双酶切后连入 祀T30a载体相应的酶切位点，构建祀T30a/VPl表达载体。
[0020] 2、用CaCl2法将祀T30a/VP 1表达载体转化入大肠杆菌化21 0E3)，涂布于含 50 y g/ml卡那霉素的琼脂平板，37C过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和化nd III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵 培养至0. 6?0. 8时加入0. 3mMIPTG诱导4?5小时，离也收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同 时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在30kD处多出一条蛋白条带， 与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为30% W上。经DHAV-3抗体免疫印迹检定，显示阳 性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌，命名为ZH株。
[0021] 实施例3发酵、纯化与鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制备
[0022] 1、发酵工艺
[0023] 1)LB培养基作为种子培养基，含5g/L葡萄糖和5g/L M拆〇4 ? 7&0的LB培养基 作为发酵培养基，补料为葡萄糖400g/L、蛋白腺24g/L、酵母提取物lOg/L、化C1 5g/L、 M拆〇4 ? 7&0 5g/L。
[0024] 。发酵过程
[00巧]挑取鉴定过的工程菌接种于含卡那霉素的浓度为50y g/ml的LB培养基，37C振 荡培养8小时，作为种子液。将种子液按2%接种量接种于发酵罐中，调节好各参数，37C， 200转，溶氧控制在20% W上。发酵4小时后开始流加补料，发酵6小时后加入0. 3mmol/L IPTG进行诱导表达，表达后6小时发酵结束。
[002引如媒柱纯化、脱盐
[0027] 4)亲和层析
[0028] 采用媒离子金属馨合层析柱，重组蛋白可W用含400mmol/L咪哇的洗脱液洗下 来，纯度达到91 % W上
[002引 W脱盐
[0030] 收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后用甲酵灭活 后测蛋白浓度，用PBS液稀释至0. 5mg/ml，0. 22 y m过滤除菌，即得重组蛋白液。
[0031] 2、鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制备
[0032] 将制备的重组蛋白96份与灭菌的4份吐温-80充分揽拌混合作为水相。同时注 射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸铅2份，混合均匀，高压灭菌后作为油相。按水相 和油相1:3比例混合乳化即可制备鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。将制备的疫苗按兽用 生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验，检测结果表明疫苗各项指标均合 格。
[003引具体操作如下：
[0034] 1菌毒种
[00巧]1. 1制造用菌种为鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗生产菌株ZH株；检测用的强毒 株为DHAV-3强毒株VF-3。
[0036] 1. 2生产用菌种标准
[0037] 1. 2. 1形态和生化特性
[0038] 含有卡那霉素的LB琼脂平板上过夜培养，在培养板上呈现圆形、边缘整齐、突起、 乳白色有光泽的光滑菌落，革兰氏染色后，镜下显示为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果均 为葡萄糖发酵+，剛巧试验+，甲基红试验+，VP-，构稼酸利用试验-。
[0039] 1.2. 2培养特性可在含有卡那霉素的培养基中生长。
[0040] 1. 2. 3鉴别检验
[0041] 1. 2. 3. 1PCR检测将本菌的LB液体培养物3 y 1做模板，用W下PCR引物进行PCR 扩增，应能扩增出380bp左右的片段。
[0042] Pl:5' -ACAACGGCACCACCCCTT-3'
[0043] P2;5' -CGGCAGATTTCGCACAGA-3'
[0044] 扩增的条件如下；94°C 5min 变性，94°C 30S，6(TC 30S，72°C lmin，30 个循环，72°C 延伸lOmin。
[0045] 1. 2. 3. 2Western-blot检测将LB固体培养平板上的重组菌单菌落接种于5ml含 有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至ODe。。值在0. 6?1. 0之间时加入0. 8mM的IPTG诱 导，持续培养4小时，收集菌体，用PBS重息后高压匀质破碎，80(K)r/min离也去沉淀，上清液 与抗鸭甲肝病毒3型阳性血清进行Western-blot试验，应出现特异性条带。
[0046] 1.2. 4纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。
[0047] 1. 2. 6基础种子代次F4?F10代。
[0048] 1. 2. 7保存冻干菌种，-2(TC，保存期为2年。
[0049] 2疫苗制造及半成品检验
[0050] 2. 1生产用种子制备
[0051] 2. 1. 1 -级种子繁殖和鉴定将冻干菌种分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基 中，37C振荡培养8?10小时，然后划线接种于含卡那霉素的LB固体培养基上37C培养 16?18小时，作为一级种子。在2?8C保存，不超过14天；在培养基上传代，应不超过2 代。
[0052] 2. 1. 2二级种子繁殖在一级种子中选取符合1. 2. 1项标准的典型菌落10个混合 于少量LB培养液中，接种于含卡那霉素的LB培养液中，37C培养8?10小时，进行纯粹检 验，应纯粹。置2?8C保存，应不超过3天。
[0053] 2.2制苗用培养基为改良LB培养基，每1000ml培养基中含膜蛋白腺lOg，酵母浸 粉5g，氯化轴lOg，葡萄糖5g，M拆〇4 ? 7&0 5g。
[0054] 2. 3巧瞄用抗原液制备
[00巧]2. 3. 1菌液培养用培养罐通气培养，按培养罐容积装入适量培养基（70%左右） 及消泡剂，灭菌后按培养基量的2%接种二级种子菌液，37C通气培养，待菌液的0化。。值达 到7. 0时，加入8g/L的a -乳糖诱导，再继续培养6?8小时。使用20%化0H调节抑在 7. 0,通过转速关联控制溶氧在20% W上。当溶氧迅速上升时，流加补料。
[0056] 2. 3. 2破菌培养结束后，离也收集菌体。收集的菌体用PBS清洗2次，将收集的菌 体用PBS制成10%的息液，在4°C下用高压匀浆机破碎细菌。破碎后的菌液，80(K)r/min，离 也15分钟，收集上清液。
[0057] 2. 3. 3媒柱层析纯化收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液， 透析脱盐后即得重组蛋白液。
[0058] 2. 3. 4灭活将纯化的上清液中按比例加入10%的甲酵溶液，甲酵溶液的最终浓 度为0.2%，37°C灭活12小时，W灭活残存的大肠杆菌。取少量样品进行半成品检验。2? 8°C保存，不超过7天；-15°C W下保存，不超过60天。
[005引 2. 4半成品检验
[0060] 2. 4. 1VP1含量检测用BCA法检测上清液蛋白浓度，稀释至终浓度0. 5mg/ml，无菌 过滤，待用。
[0061] 2. 4. 2无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
[0062] 2.4.3内毒素含量检测按當试剂方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于 1000抓/ml者方可用于制苗。
[0063] 2. 5疫苗制备
[0064] 2.5.1油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铅2份。在油相罐中混合均匀， 加热融化至半透明状，再加司本-80 6份，至温度达到125?13CTC时维持30分钟，冷却至 室温备用。
[0065] 2. 5. 2水相制备取灭菌的吐温-804份，加检验合格的半成品96份，充分揽拌至吐 温-80完全溶解。
[0066] 2. 5. 3乳化取油相3份置于高速剪切机内，开动电机低速揽拌，同时缓缓加入水相 1份，再W 3600r/min乳化40分钟，在终止揽拌前加入1 %硫柳隶溶液，终浓度达到0. 01 %。 乳化后，取样10ml加入离也管，W 3000r/min离也15分钟，管底析出水相应不超过0. 5ml。
[0067] 2. 5. 4分装定量分装，密封瓶口。
[006引 3成品检验
[006引 3. 1物理性状
[0070] 外观为乳白色乳剂。
[0071] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不 扩散。
[0072] 稳定性吸取疫苗10ml加入离也管中，经3000r/min离也15分钟，管底析出的水 相应不超过0. 5ml。
[0073] 黏度按现行《中国兽药典》进行，符合规定。
[0074] 装量检查按现行《中国兽药典》进行，符合规定。
[00巧]3. 2无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。
[0076] 3. 3安全检验取1日龄维鸭10只，肌肉或颈部皮下注射疫苗0. 5ml/只，观察14 天，不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。
[0077] 3. 4效力检验下列方法任择其一。
[0078] 3.4. 1抗体检测将4月龄麻鸭（产蛋种）10只平均分为两组，第一组为免疫组，用 制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫（第一次免疫21天后进行第二次免 疫，每次每只0. 5ml，皮下注射），第二次免疫14天后测对DHAV-3的血清中和抗体效价。第 二组为对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。免疫组的血清中和抗体效价均应> 1:152， 而对照组中和抗体效价均应《1:4。
[0079] 3. 4. 2攻毒保护将4月龄麻鸭（产蛋种）10只平均分为二组，每组5只。第一组 为免疫组，用本发明制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫（第一次免疫21 天后进行第二次免疫，每次每只0. 5ml，皮下注射），第二组为生理盐水对照组，注射同等体 积的无菌生理盐水。第二次免疫后21-28天收集各组鸭所产的鸭蛋进行赔化，分别与维鸭 出壳后的14天各随机取10只，用DHAV-3强毒株VF-3(100LDg。）注射攻毒，攻毒14天后统 计攻毒保护率（未死亡的只数占总只数的百分率）。免疫组应至少保护8只，对照组全部死 亡。
[0080] 3. 5甲酵、隶类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，均符合规定。
[0081] 实施例4鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价
[0082] 将4月龄麻鸭（产蛋种）10只平均分为两组，第一组为本发明免疫组，用制备的鸭 甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫（第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每 只0. 5ml，皮下注射），第二次免疫14天后测对DHAV-3的血清中和抗体效价。第二组为生 理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。结果表明本发明免疫组的血清中和抗体效 价均> 1:128,而生理盐水对照组中和抗体效价均为阴性。
[0083] 表1 ;鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价
[0084]
【权利要求】
1. 一种鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白，其特征在于，所述的鸭甲肝病毒VP1和LTB 的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的鸭甲肝病毒VP1和LTB的 融合蛋白。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
4. 权利要求1所述鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白在制备疫苗中的应用。
5. -种基因工程重组亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗其中的抗原为权利要求1 所述的鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白。
6. 如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合 蛋白的浓度为〇? l-lmg/ml。
7. 权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括有如下的步骤： 1) 将权利要求2所述的基因连入表达载体中，构建成表达重组质粒； 2) 将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建了能表达鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融 合蛋白的重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合 蛋白； 3) 对重组表达的蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。
【文档编号】C07K19/00GK104448005SQ201410771449
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月13日 优先权日:2014年12月13日
【发明者】王宏华 申请人:青岛宏昊生物科技有限公司