专利名称：溶组织内阿米巴粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对溶组织内阿米巴(或称痢疾内变形虫)(Enta-moeba histolytica)感染的诊断和治疗。更具体地，本发明涉及利用编码该变形虫的Gal/GalNAc外源凝集素基因尤其是编码35/31千道尔顿(kDa)轻链亚基的cDNA以及针对其蛋白质产物的抗体进行的治疗。
背景技术：
溶组织内阿米巴感染极其广泛，每年估计影响4.8亿人。但是，这些人中仅10％会发展成类似结肠炎或肝脓肿症状。据假设病症的低发生率现象归因于存在变形虫致病性形式和非致病性形式。截止1988年，已发现最终出现症状的病人携带致病性“酶同类群”(zy-modemes)。根据这些酶同类群特殊的已糖激酶和磷酸葡萄糖变位酶的同工酶进行了分类。但是，使用形态发生标准并不能方便地将致病形式与相对应的非致病的酶同类群区分开。
在诊断中，致病和非致病株之间的区别至关重要，因为只有那些会被溶组织内阿米巴感染得病的人才需要治疗。在发达国家，虽然至少经济上能够对每个携带者都用已知的有效药物(甲硝哒唑)进行治疗，但情况仍很糟。当然，不加区分地施用这些药物是不利的。在较不发达国家，不加区分地施用药物的费用太高，从而会对整个卫生保健资源产生极不利影响。
在被致病的酶同类群感染与得病之间，以及被不致病的酶同类群感染与不得病之间几乎具有极好的相关性。通常认为，只有致病株能在无异种生物下生长(即在无相关的微生物存在下生长)，而非致病株的生长是先与减毒细菌一起，再在一系列培养基变更中培养。伴随着这种适应的是表现出致病株的酶格局特征(Mirelman D.etal.，Infect Immun(1986)54827—832)。这项工作在其他实验室中没有重复过，而且最近对基因组差别的研究(见下文)表明，致病的和非致病的形式属不同的种。
尽管有上述普遍感兴趣的和有用的研究结果，但是诊断溶组织内阿米巴致病株的存在与否是困难的。因为致病株和非致病株形态学上相似，所以显微镜检测并不特别有效。已经在粪便样品和血清中用ELISA技术检测溶组织内阿米巴抗原的存在与否，但是这些测试手段似乎不能区别致病和非致病株。Root等人(Arch Invest Med(Mex)(1987)9Supplement 1203)率先以ELISA技术，利用兔多克隆抗血清在粪便样品中检测变形虫抗原。此后，已有使用这种方法的多种形式，其中一部分与显微镜研究相关，而且全部使用多克隆抗血清。很明显，没有任何一种能准确指出被致病形式而不是非致病形式感染的例子。例如参见Palacios et al.，Arch Invest Med(Mex)(1987)9Supplement 1203；Randall et al.，Trans Roy Soc TropMed Hyg(1984)78593；Grundy，Trans Roy Soc Trop Med Hyg(1982)76396；Ungar，Am J Trop Med Hyg(1985)34465。
关于对粪便样品的研究总结于AmebiasisHuman Infection byEntamoeba Histolytica，J.Ravdin，ed.(1988)Wiley MedicalPublishing，pp.646—648。在血清和肝脓肿液中检测特征性的溶组织内阿米巴抗原的类似方法同样不能将病原体与非病原体区分开(出处同上，pp661—663)。正如这篇文章中所述，截止1988年，将这种变形虫的致病形式与非致病形式区分开的唯一方法是通过电泳确定同工酶格局的特征。
最近，两个不同研究小组的研究表明，通过DNA分离物的比较可以显示致病和非致病株之间的差异。Garfinkel，L.I.等人(InfectImmun(1989)57926—931)发展了用DNA探针与分离自溶组织内阿米巴的DNA杂交，而且得到了四种类型的限制性片段长度格局。这些格局与致病的/非致病的特性相关。类似地，Tannich，E.等人(Proc Matl Acad Sci(1989)865118—5122)用探针探测了用不同株构建的cDNA库，结果表明致病分离物在遗传上不同于非致病分离物。但是，这些技术需要培养从病人处分离的有机体以便获得足够数量用于测试，因此费时费力。
Strachan，W.D.等人(Lancet(1988)561—562)报道生产了两种单克隆抗体，分别命名为22.3和22.5。这两种抗体是按标准程序从用致病溶组织内阿米巴株NIH200/ATCC30458的无异种生物培养物免疫过的小鼠中得的一大组抗体中的两个。这些单克隆抗体在免疫荧光测定中与得自假定的侵袭性和非侵袭性株的培养物一起进行测试。但在该出版文献中没有提及如何筛选具有这种特性的抗体，也不知道这些抗体结合于怎样的靶目标，以及如果没有这些特异性的抗体是否可以重复该实验结果。所描述的该测试需要完整的溶组织内阿米巴，因此不能用于血清、尿或肝脓肿液，而只能用于刚收集的粪便样品。
原生动物寄生虫溶组织内阿米巴对宿主靶细胞的粘附及随后的破坏是由半乳糖和N-乙酰基-D-半乳糖胺特异性的细胞表面外源凝集素(Gal/GalNAc外源凝集素)介导的(Mann，et al.，Proc NatlAcad Sci(1991)3248—3252；Petri et al.，J Biol Chem(1989)2643007—3012；Petri，et al.Infect Immun(1991)5997—101；Ravdin，et al.，J Exp Med(1980)152377—390)。该外源凝集素具有一个轻链和重链，分子量(MW)为260千道尔顿；如下所述的轻亚基分子量为31/35千道尔顿；而重链分子量约为170千道尔顿。
最近能够区分溶组织内阿米巴的致病和非致病形式的单克隆抗体的制备方法已有描述(Petri W.A.et al.，Infect Immunol(1990)581802—1806)。这些抗体结合于外源凝集素170千道尔顿重链的不同表位上。
对通过外源凝集素正常粘附的抑制可以防止溶组织内阿米巴对哺乳动物细胞的接触依赖性的杀死(Ravdin et al.，J Clin Invest(1981)681305—1313；saffer et al.，Exp Parasit(1991)72106—108)。这种外源凝集素的重亚基几乎能广泛地被感染上侵袭性变形虫病的病人的免疫血清和T细胞所识别。(Petri et al.，InfectImmun(1987)552327—2331；Schain et al.，Infect Immun(1992)602143—2146)。已表明，用纯化的外源凝集素对沙鼠进行免疫可以使67％在肝内受溶组织内阿米巴激发产生免疫应答的动物提供免得变形虫肝脓肿的完全保护。(Petri et al.，Infect Immun(1991)5997—101)。170千道尔顿亚基被认为是疫苗的活性组份(U.S.专利5,004,608,1991年4月2日授权)。
一般而言，与碳水化合物结合的蛋白质或外源凝集素在自然界是普遍存在的，而且涉及大量的识别过程，其中包括哺乳动物受精、细胞粘附于细胞外基质以及免疫系统的细胞相互作用。在细胞附着过程的特异性方面外源凝集素与碳水化合物的相互作用起着关键作用。与信息量仅靠单体的数目和顺序的肽和寡核苷酸相反，碳水化合物具有“编码”极其丰富的信息的潜能，这些信息是糖苷单元的位置和端基异构构型以及分支点的出现位置。自从发现了在淋巴细胞再循环过程中白细胞与内皮结合时归巢受体选择的作用之后，碳水化合物在细胞与细胞粘附中的重要性日益为人们关注。除了哺乳动物细胞之外，细菌和其他微生物利用蛋白质-碳水化合物相互作用来定居和侵袭宿主组织。
上述讨论的溶组织内阿米巴Gal/GalNAc粘附外源凝集素是从一致病病株中分离得到并且由Petri W.A.等人纯化了500倍(J Bi-ol Chem(1989)2643007—3012)。这种成功的分离和纯化是通过产生能抑制变形虫滋养体体外粘附的小鼠单克隆抗体而实现的。从感染的病人中分离得到致病株，在无异种生物的培养基中生长，用超声处理过的滋养体免疫小鼠，再从小鼠脾脏的无限增殖化细胞中制得抗体(Ravdin J.I.et al.，Infect Immun(1986)531—5)。根据上清液对滋养体粘附靶组织的抑制能力而筛选细胞。因此，所有这些报道的单克隆抗体大概都与病原体的Gal/GalNAc表面粘附区域有免疫反应。Gal/GalNAc外源凝集素可以通过半乳糖亲和色谱制备(1987年报道)(Petri W.J.et al.，J.Clin Invest(1987)801238—1244)。对具有溶组织内阿米巴致病感染症状特征(包括肝脓肿和结肠炎)的病人血清学交叉反应的研究表明，粘附外源凝集素被所有的测试病人血清所识别(Petri Jr.W.A.et al.，Am J Med Sci(1989 296163—165)。
纯化的260千道尔顿与半乳糖结合的外源凝集素在十二烷基磺酸钠(SDS)中是稳定的，但在β-巯基乙醇存在下解离成重(170千道尔顿)和轻(35/31千道尔顿)糖蛋白亚基，暗示亚基间存在二硫键。如此文中所用，“轻亚基”意指轻糖蛋白亚基的35或31千道尔顿同种型中的任一者或两者。重亚基和轻亚基由不同的mRNA编码(Mann et al.，Proc Natl Acad Sci(1991)883248—3252)，并且具有不同的氨基酸组成和氨基端序列(Petri et al.，J Biol Chem(1989)2643007—3012)。在Western印迹法中仅识别重亚基和小鼠多克隆抗外源凝集素抗血清能完全抑制变形虫的附着，这暗示重亚基含有半乳糖结合区域(Petri et al.，J.Biol Chem(1989)2643007—3012)。170千道尔顿亚基的cDNA序列分析揭示，它是一个内在膜蛋白，具有富含半胱氨酸的胞外区域和一个短的细胞质尾部(Mann et al.，Proc Natl Acad Sci(1991)supra；Tannich et al.，Proc Natl Acad Sci(1991)881849—1853)。最近的报道表明该重亚基是一个多基因家族中的成员(Mann et al.，Parasit Today(1991)1173—176；Tannich et al.，supra)。35/31千道尔顿亚基的氨基端序列表现出微不均一性，表明存在多种轻亚基同种型。
在Tannich等人最近的一篇文章中(Molec Biochem Parasitol(1992)55225—228)报道了编码称为Gal/GalNAc外源凝集素的35千道尔顿轻亚基的cDNA克隆过程，并公开了推导的氨基酸序列(该文章将外源凝集素的总分子量确定为220千道尔顿)。没有暗示报道的DNA的35千道尔顿亚基能用作疫苗，事实上，引用与本申请人的通信，该文称，用分离的35千道尔顿分子免疫的兔子不能产生针对异源二聚体或其小亚基的抗体。
先前的技术显示了仅针对溶组织内阿米巴170千道尔顿亚基的免疫应答；在感染的动物或施用Gal/GalNAc外源凝集素的动物中还没有检测到针对轻亚基的抗体。因此，根据先前的技术，人们不能预期到轻亚基能用于针对溶组织内阿米巴的疫苗或可用于对感染进行诊断。此外，还没有针对该亚基的免疫特异性抗体。发明揭示已发现，溶组织内阿米巴Gal/GalNAc外源凝集素的35/31千道尔顿亚基是溶组织内阿米巴疫苗的有效活性成分。35/31千道尔顿亚基的结构已经清楚而且已制备了据此产生的重组材料。因此本发明提供了一种不曾预见到具有保护作用的针对溶组织内阿米巴的改良疫苗。
在本发明之前，由于没有轻亚基特异的抗体，因此难于对35/31千道尔顿亚基进行结构和功能上的分析，从而不知道其在粘附和接触依赖的细胞溶解中的作用。开发疫苗的努力都完全集中于170千道尔顿亚基。在本发明中，对半乳糖结合的外源凝集素的轻亚基(35/31千道尔顿)进行了定性分析，以确定其结构和膜锚定的机制。从35/31千道尔顿亚基cDNA推导出的氨基酸序列具有一个假设的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚添加信号，而且生化分析和免疫分析支持该发现。
本发明的一个方面为含有溶组织内阿米巴Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基或其功能部分的疫苗，该疫苗会导致免疫应答并起保护免受溶组织内阿米巴感染的作用。也可以含有170千道尔顿重亚基或其功能部分，该蛋白质或其片段可以用作活性成分，或者重组表达载体尤其那些利用病毒感染和表达系统的表达载体可以用作疫苗。
因此，在其他方面，本发明涉及能用于在细胞培养条件中或在免疫宿主原位产生35/31亚基的重组物质。本发明还涉及含有35/31千道尔顿亚基的嵌合融合肽。另一方面还涉及产生编码轻链亚基的DNA互补链和互补寡核苷酸本身的重组物质，它们用于干扰溶组织内阿米巴在培养中或在原位生长。
本发明的另一方面涉及用本发明的疫苗针对溶组织内阿米巴进行免疫的方法和产生针对35/31千道尔顿亚基免疫特异性的抗体的方法以及这些抗体本身。
本发明的另一方面涉及在生物样品中检测非致病或致病溶组织内阿米巴存在与否的方法，该方法包括对样品作聚合酶链反应(PCR)，其中使用框定Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿轻链某个区域的引物，并在严紧条件下将扩增的DNA与对应于该区域的寡聚体进行杂交。通过选择致病或非致病溶组织内阿米巴各自的或两者共有的DNA特征区域，可以区分或共同确定这些酶同群类。其他方法采用本发明的单克隆抗体。附图简述
图1a和1b为基因家族中两个基因编码的35/31千道尔顿亚基的核苷酸序列及其氨基酸序列。
图2是亲和纯化的外源凝集素的二维SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)的照相复印图。
图3是用CNBr(溴化氰)消化后31和35千道尔顿亚基的肽图。
图4是用棕榈酸和肉豆蔻酸代谢标记的半乳糖外源凝集素SDS-PAGE的放射自显影图。
图5是[3H]葡糖胺标记的外源凝集素SDS-PAGE的放射自显影图。
图6a是显示对来自变形虫总蛋白质的31千道尔顿条带进行硝酸脱氨基作用后得到的类脂产物进行薄层色谱的结果图。
图6b是显示对来自免疫沉淀的外源凝集素的31千道尔顿条带进行硝酸脱氨基作用后得到的类脂产物进行薄层色谱的结果图。
图7是用抗CRD(交叉反应决定簇)抗体对电洗脱的31和35千道尔顿亚基进行Western印迹法的照相复印图。
图8a是测定溶组织内阿米巴蛋白质GPI-PLC(糖基磷脂酰肌醇-磷脂酶C)活性的结果图。
图8b是对来自GPI-PLC测定的类脂产物薄层色谱(TLC)的结果图。
图9a是用35/31千道尔顿亚基的PCR扩增片段作为探针对溶组织内阿米巴DNA进行Southern印迹法的照相复印图。
图9b是溶组织内阿米巴RNA与35/31千道尔顿亚基探针的Northern印迹法的照相复印图。
图10是融合蛋白与亚基或者分离的亚基与免疫和预免疫血清的Western印迹法的照相复印图。本发明实施方式本发明提供了能用于开发针对致病和非致病形式溶组织内阿米巴的疫苗和诊断测定的材料。本发明开发的疫苗使得产生针对Gal/GalNAc粘附外源凝集素的两种亚基、尤其是35/31千道尔顿轻亚基的疫苗成为可能。可以在得自细胞培养或来自受到感染危险的受试者的生物样品上进行诊断测定。该测定采用杂交探针或抗体，并且通过设计测定方法，可以将变形虫的致病形式与非致病形式区分开。此外，由于提供了cDNA，所以有机会不用“反义”法产生粘附外源凝集素。
轻亚基DNA序列能够产生基于该序列的合成肽。这些肽可以被特异性地构建以含有例如轻亚基的T细胞表位或B细胞表位。例如参见实施例16，其中描述了一种含有代表轻亚基一个预计的B细胞表位的合成肽疫苗。根据31/35千道尔顿亚基序列来鉴别能被T细胞及免疫个体的抗体识别的合成肽的方法在本领域是知晓的。
本发明提供了溶组织内阿米巴半乳糖结合外源凝集素35/31千道尔顿亚基的基本氨基酸序列，并表明它含有一个GPI锚。对轻亚基cDNA的序列分析表明，亚基含有一个潜在的GPI锚添加信号；此外，在用PI-PLC处理后，轻亚基会与抗CRD抗体反应。(“CRD”指交叉反应决定簇，它是由磷脂酰肌醇特异性的磷脂酶C(PI-PLC)将二酰基甘油从锚上切下而暴露的决定簇)。类脂标记的31千道尔顿亚基同种型的硝酸脱氨基作用释放出的类脂产物与磷脂酰肌醇一起迁移，也与GPI锚的存在相符。半乳糖外源凝集素是GPI-锚式蛋白中的一个独特例子，它是异源二聚体，而目前已描述的其他GPI锚式蛋白是单体或同源二聚体。170千道尔顿亚基的cDNA序列已显示含有26个氨基酸疏水域，随后为羧基端的41个氨基酸亲水域，这与其为内在膜蛋白质相符。因此这两种外源凝集素亚基使用不同的膜锚住机制。
轻亚基的同种型形成二种外源凝集素异源二聚体，即170/35和170/31。尽管Southern印迹法表明轻亚基由某一基因家族编码，而且35千道尔顿亚基蛋白的直接测序也揭示了与存在一种以上的基因相符的微不均一性，但是，35和31千道尔顿种型呈抗原性地交叉反应(实施例15)而且具有很相似的氨基酸组成和CNBr消化后的肽格局。这表明它们含有相同的基本氨基酸序列。31千道尔顿和35千道尔顿亚基显示出与葡糖胺的差异标记，且存在有标记的脂肪酸。它们的氨基端对于Edman降解作用的接受性也不同。因此，两种同种型间的生化差别是复杂的。
31千道尔顿和35千道尔顿亚基由相同基因编码。图1a显示了相应35/31千道尔顿亚基多基因家族中一员(称为“lgl 1”)的同种型的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。用下划短线标出的残基表示假设的氨基端引导序列中的三个残基以及疏水的羧基端区域。用下划实线标出的残基为由Edman降解法确定的氨基端和CNBr顺序。潜在的N-连接的糖基化位点用星号标出。推测的GPI锚切除/添加位点用实心圆点标出。成熟的亚基蛋白的第79—90氨基酸用框标出，对应该部分的合成肽在疫苗中具有活性(见实施例16)。残基1(K)是成熟蛋白质的氨基端。用Edman降解法确定氨基端(KTN/QDN/GR/KDQF/LSPNYPYG/DKM DN)和CNBr肽(MSTSYAIPKSV/DI SARAP)的氨基酸序列。带下划线的残基表示与衍生序列不同，主要位于微不均一性区域。
图1b显示了编码35/31千道尔顿亚基的一个克隆的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。该克隆是多基因家族中另一员(“lgl 2”)，用与实施例12中提出的相似方式得到。当然，得到的氨基酸序列基本上与图1a中所示该基因的氨基酸序列同源。从不同的溶组织内阿米巴株获得的这两种35/31千道尔顿亚基基因的其他克隆序列几乎与图1a和1b中的序列相同，株间最多仅有少数氨基酸不同。
已表明溶组织内阿米巴具有GPI-PLC活性。尽管外源凝集素以可溶形式和膜形式存在(Petri et al.，J Clin Invest(1987)201238—1244)，但在培养变形虫和培养基中还没有鉴别出CRD。轻亚基与170千道尔顿亚基的共价连接(似乎是一个内在膜蛋白质)使得GPI锚水解不可能成为溶组织内阿米巴中外源凝集素释放的有效机制。
因为这种性质的异源二聚体蛋白以前没有描述过，所以便提出这样的问题为什么溶组织内阿米巴将一条GPI锚式多肽与一条内在膜多肽相连。该问题的可能答案要依据GPI锚式蛋白质的生化和生物学功能。已发现，GPI锚式蛋白质具有与膜磷脂相似的侧向扩散系数，这在细胞相互作用中使得GPI锚式受体样蛋白质能够快速迁移至与其他细胞发生接触的区域。如果异源二聚体结构是动态的，即35/31千道尔顿亚基有时从170千道尔顿假设的内在膜亚基上解离，呈游离态在膜中扩散，则这样性能可能与外源凝集素有关。其次，据信GPI锚式蛋白质在细胞信号中起某种作用。有证据表明，大量T淋巴细胞(即Thy-1，TAP和Ly-6)上的GPI锚式蛋白质介导细胞激活信号。免疫沉淀研究表明，GPI-锚式细胞表面分子与p56lck(大量哺乳动物细胞中Src族酪氨酸激酶的一员)之间存在结合现象，将GPI-锚式蛋白质与已知的信号传导分子相连。用半乳糖抑制外源凝集素可防止用离心法使变形虫与靶细胞膜接触时变形虫接触依赖而对靶细胞的杀死。这暗示外源凝集素(也极可能是其GPI锚)涉及细胞裂解过程的信号起始。定义如此文所用，“对应于”某所指对象的DNA或RNA是指编码相同功能的蛋白质(如外源凝集素31/35千道尔顿亚基)或其片段的DNA或RNA或其互补链。“对应于”某所指对象的蛋白质是指相同或不同溶组织内阿米巴株中相同功能的蛋白。
“基本”同源是指同源性充分以便在采用DNA时提供与靶目标的必要杂交。类似地，本文中“有效片段”是指一个具有足够大小的片段从而在采用DNA时提供与靶目标的必要杂交。
具有致病或非致病株特征的核苷酸序列或表位是指在这些种类间存在差别的核苷酸序列或表位。因此，具有致病溶组织内阿米巴特征的核苷酸序列或表位是指某核苷酸或表位，其与非致病株的对应序列或表位不同，且非致病株的对应序列或表位在特征上与致病株的序列或表位相异。
复合核苷酸序列指某核苷酸序列，其部分对应于溶组织内阿米巴致病株的序列，部分对应于溶组织内阿米巴非致病株的序列。
“复制子”是指当转化入适当的宿主时能自成复制的DNA载体。当转化入大肠杆菌时，此处上下文中最频繁地使用(复制子)。
诊断测试涉及不同杂交严紧程度下的杂交，这些程度定义如下低严紧性对应于在0.2×SSC，0.1％SDS中于37℃的洗膜(1×SSC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，SDS为十二烷基磺酸钠)。
高严紧性对应于在0.2×SSC，0.1％SDS中于65℃的洗膜。
中等严紧性对应于在0.2×SSC，0.1％SDS中于45℃的洗膜。
如此文所用，关于某特定靶目标的“免疫特异性”是指所描述的抗体能以比该抗体与其他表位即抗原决定簇结合的亲和性大得多的亲和性与靶目标结合。所需的特异性程度随环境而变，但是典型地，某指定靶目标的免疫特异性抗体是与该靶目标亲和结合，此亲和结合比该抗体与其他表位或抗原决定族结合时的亲和性至少大1个或2个或最好几个数量级。
术语“抗体”不仅指免疫球蛋白本身，而且还指那些保持完整分子免疫特异性的免疫球蛋白片段。这些片段的例子在本领域中是众所周知的，例如包括Fab、Fab′和F(ab′)2片段。术语“抗体”不仅包括免疫球蛋白的天然形式，而且还包括经修饰后赋于所需性能且不改变免疫特异性的免疫球蛋白形式(本领域中已有用于修饰的技术)。例如形成得自两个种的嵌合抗体正变得更可行。简言之，“抗体”指保留免疫球蛋白自身的免疫特异性的免疫球蛋白的任何组分或衍生形式。
术语溶组织内阿米巴的“致病形式”是指那些侵袭性的并导致感染者病症的形式。“非致病形式”是指被携带者携带又不表现症状的形式。
“Gal/GalNAc外源凝集素”指上述的发现在溶组织内阿米巴表面的糖蛋白，它介导变形虫粘附靶细胞并且该介导作用被半乳糖或N-酰基半乳糖胺抑制。Gal/GalNAc外源凝集素特指Petri等人(出处同上)从致病株HMI-IMSS中分离并报道的外源凝集素，也指从其他溶组织内阿米巴品种中发现的相应外源凝集素。“35/31千道尔顿亚基”或“轻亚基”是指通过还原Gal/GalNAc外源凝集素而获得的小亚基以及其他种中的对应小亚基。制备纯化的Gal/GalNAc外源凝集素和35/31千道尔顿亚基实施例2详细描述了来自致病溶组织内阿米巴高纯化形式的Gal/GalNAc外源凝集素的制备。制备包括一个亲和色谱步骤，其中使用通过用Gal/GalNAc外源凝集素免疫而制得的单克隆抗体作为亲和配基。分离的外源凝集素再用巯基还原剂还原，如使用二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇，以得到35/31千道尔顿亚基。从纯化的外源凝集素中分离出的35/31千道尔顿轻亚基或轻亚基和重亚基可用于免疫。
用与实施例2相似的方式，可从非致病株中分离出35/31千道尔顿亚基，其中使用可与非致病形式特有的外源凝集素表位或致病和非致病形式共有的外源凝集素表位发生免疫反应的抗体作为亲和配基。
如下所述，外源凝集素35千道尔顿和31千道尔顿形式用CNBr水解并测序。根据得到的序列，制备引物用于扩增用作探针的cD-NA。使用这种探针，获得了编码致病形式35/31千道尔顿亚基的cD-NA；两种同种型由同一基因编码，而且具有同样的一级结构。这些同种型的推导氨基酸序列示于图1a和1b，上文描述过。制备单克隆抗体下面所述的单克隆抗体通过使用本发明分离和纯化的Gal/GalNAc外源凝集素轻亚基的免疫方案而制备。作为免疫原的纯化和分离形式外源凝集素的使用，以及它们在筛选以获得单克隆制剂中的可用性极大地促进了合适单克隆抗体的制备和鉴别。
对于免疫，可以使用标准的方案，而任何合适的脊椎动物尤其是哺乳动物如大鼠、小鼠、兔等都能用作实验材料。当获得足够的滴度时，便可收获血清。如上制备的血清能用作多克隆抗体组合物，已发现这些组合物对于回收表达编码35/31千道尔顿轻亚基基因的重组克隆是必需的。
若需要单克隆抗体，则实验动物产生抗体的细胞，理想的是脾细胞，经无限增殖化方案处理。最方便的是由Kohler和Millstein最初提出的形成杂交瘤方法。但是，其他的无限增殖化技术如病毒感染也可以使用。
这时筛选无限增殖细胞以产生所需的单克隆抗体。一般性地，用标准免疫测定法例如ELISA或RIA法测试经培养的无限增殖化细胞的上清液，用它们作为抗原，而纯化的外源凝集素或亚基作为免疫原。阳性反应的上清液再进一步测试。通过使用还原形式的分离的外源凝集素作为分析或Western印迹法中的抗原，可以方便地证明与35/31千道尔顿来基的免疫反应性。
接着再测试上清液与其他形式的外源凝集素或亚基的交叉反应性，例如，用从致病溶组织内阿米巴免疫的实验对象中制得的抗体分泌细胞的上清液，通过免疫测定法测试其抗非致病变形虫纯化的外源凝集素或其他含外源凝集素的抗原组合物的情况。反过来，用非致病形式外源凝集素免疫的实验对象的抗体分泌细胞的上清液，测试其与致病形式外源凝集素或其他含抗原的组合物的交叉反应性。
因此，得到的单克隆抗体制剂或者与病原体和非病原体共有的表位起免疫反应，或者与衍生自某种形式并对其是独特的表位起免疫反应。因此就35/31千道尔顿亚基而言，可制得三类单克隆抗体。一类抗体对在致病形式特有的35/31千道尔顿亚基上发现的表位呈免疫特异性，因此在相当大程度上这些抗体仅能与变形虫的致病形式或与其外源凝集素的35/31千道尔顿亚基起免疫反应。第二类单克隆抗体对非致病形式的35/31千道尔顿亚基特有的表位呈免疫特异性；因此实际上仅与非致病的变形虫或与其外源凝集素起免疫反应，而不与致病形式起免疫反应。第三类单克隆抗体对致病和非致病形式所共有的35/31千道尔顿亚基的表位呈免疫特异性。这类抗体能与变形虫或与亚基起免疫反应，而不论其病原性如何。
在上面的背景技术一书中提及的本领域报道过的单克隆抗体，是通过利用变形虫对靶细胞粘附的抑制作用进行筛选的方法而制得。因此，先前技术产生的抗体和本发明的抗体不同，因为到目前为止已有的技术还不能制备针对35/31千道尔顿亚基的抗体。
本发明的单克隆抗体是通过培养能分泌抗体的无限增殖化细胞系而制得的。如本领域所知，这些细胞系的培养通常有两种方法如通常所知道的用营养物进行的体外培养方法，或者将其注射入适当的宿主如小鼠，使其在体内繁殖，随后从腹水中回收单克隆抗体。如此处所用，“培养”无限增殖化细胞系和“从培养物中回收单克隆抗体”都包括使用这两种方法的过程。疫苗类似地，可以制备具有与病原体和非病原体共有的表位起免疫应答或与衍生自某种形式并对其是独特的表位起免疫应答的疫苗。另外，可以制备针对Gal/GalNAc外源凝集素轻亚基和重亚基的疫苗。用于制定疫苗配方的方法是本领域中已知的，而且疫苗可以含有载体和/或佐剂。用本领域已知的技术可以确定最佳施用方案(即为了产生保护性应答而需要的最少量抗原。)本发明提供了编码35/31千道尔顿轻亚基的DNA，从而能重组产生该蛋白，包括含有该蛋白的融合蛋白。在疫苗中存在这些蛋白质促进了接种动物对溶组织内阿米巴的免疫应答，适合的融合蛋白包括(但并不局限于)大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽转移酶。此外，用Wolff等人的方法(Science(1990)2471465)可以直接将编码35/31千道尔顿轻亚基的DNA用作疫苗。可以在本领域已知的原核或真核系统中单独地产生蛋白质(即不是作为融合蛋白)。这些系统包括(但不限于)哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等。另外可以使用DNA在活的、减毒疫苗载体如牛疫病毒、卡介菌、减毒沙门氏菌中进行表达。基于DNA的测定为了进行本发明的测定，根据适用于所提供样品类型的标准步骤制备样品并加溶其中所含的变形虫。例如参照Ungar等人的方法(Am J Trop Med Hyg(1985)34465)处理粪便样品。血清或血浆样品在磷酸盐缓冲液中进行一系列稀释。尽管也可以使用其他生物体液或活检材料，但粪便、血清或血浆样品是优选的。
根据Kawasaki，E.S.在“PRC方案”一书(Innis M.A.等人编辑，(1990)Academic Press，第18章，p.153以及下列等)中的方法，从样品中抽提DNA。简言之，在该方案中，样品经冷冻干燥后悬浮于100μl 50mM Tris pH8.3、150mM NaCl、0.5％NP40中。加入蛋白酶K至100μg/ml。样品在55℃培育1小时，煮沸3分钟，然后置于冰上。冷却后，样品在微离心机上离心5分钟后留下上清液，将其保存于4℃或立即使用。本步骤中每50μl反应混合物使用约5μl上清液作为DNA模板进行扩增。
标准的制备是在最初的制备过程中使用已鉴定的滋养体。约2×106个滋养体用PBS洗涤一次，离心沉淀，冷冻干燥并贮藏于20℃以供进一步使用。在抽提中使用约10mg冻干的变形虫。
与致病或非致病株相关的DNA的存在与否可以通过利用这些类型株间的核酸序列差异的技术方案加以确定。所有的技术方案都涉及用PCR扩增DNA。
以标准步骤，用设计的匹配靶目标特异性区域的引物进行PCR反应。在一种方案中，引物被设计成能与所期望的致病或非致病的形式特有的DNA某区域杂交。因此，只有特征区域被扩增出，用于与探针的检测。再选择特异性地对应该区域的探针。因为致病株中存在该区域，所以依据其与对应于该区域的探针的杂交能力可以将致病株与非致病株区分开。同样，依据非致病株与其特有的序列相对应的探针的杂交能力可以检测非致病株。
在另一种方案中，这样的引物被用于区分病原体和非病原体。在该方案中，至少一种PCR反应中使用的引物是对应于一种类型或另一种类型株所特有的序列。因此只有所期望的序列会被扩增并被探针检测出。在该例子中，使用的探针可以来自致病或非致病株，或者是它们的复合体，而且可以调节杂交条件的严紧性以适应所选的探针。严紧性的高、低或中等取决于探针的同源性程度。
当使用对应于待检测区域的探针时，一般采用高严紧性。在上述的第一种方法中需要高严紧性以便将致病和非致病株区分开。在第二种依赖特征性以选择PCR引物的方法中，可以使用低严紧性，因为病原体和非病原体的区分已进行过。用常规技术并在上述的严紧条件下检测与探针的杂交。
本发明还提供了适用于上述诊断方法的试剂盒。这些试剂盒至少包括合适的引物、探针、其它试剂(如果需要)和进行测定的说明。反义法运用反义技术，可以使用本发明的DNA来控制产生35/31千道尔顿Gal/GalNAc结合外源凝集素亚基的。用标准的施用方法，例如Remingto′s Pharmaceutical Sciences一书(Mack Publishing Com-pany，Easton，PA出版，最新版)中所述的方法，将35/31千道尔顿或其主要片段DNA的互补链提供给变形虫培养物或者提供给带溶组织内阿米巴感染的宿主生物体。理想地，对于体内处理受试对象，互补链是通过注射提供并且用常规的赋形剂如Ringer氏溶液，Hank氏溶液等进行配制。用适当的配方进行口服施用也有效。尽管大多数施用是全身性的，但至于区域化情况如实体肿瘤的生长，也可以是表面或局部施用。也可以使用药物传送的缓释机制。
另外，互补性的核苷酸序列可以在原位产生，即提供一个表达系统，该系统在“反取向”的表达系统中含有35/31千道尔顿亚基的DNA或来自其他溶组织内阿米巴株的它的类似DNA或其活性片段。表达系统可以被设计成能在宿主实验对象例如哺乳动物实验对象中操作，其中反向的溶组织内阿米巴编码顺序位于如SU-40启动子、腺病毒启动子等的控制下从而使得互补链能在原位被转录。当表达系统用于溶组织内阿米巴的细胞培养中时，可以通过与溶组织内阿米巴株共容的复制子而提供表达系统。
下列实施例用于阐述本发明，而不是限定本发明。实施例1溶组织内阿米巴的培养和收获于37℃，15ml玻璃培养管中，在加有100单位/毫升青霉素和100μg/ml硫酸链霉素(Pfizer)的培养基TYI—S—33(酪蛋白胰蛋白酶解物(trypticase)和酵母提取物，铁离子和血清)中培养无异种生物混杂的溶组织内阿米巴株HMI1—IMSS。在生长72小时后，通过于4℃150xg离心5分钟而收获变形虫滋养体，并在75mM Tris(Sigma)，65mM NaCl pH7.2中洗涤(Ravdin et al.，1981)。通过向TYI—S—33培养基添加50μCi/ml[3H]棕榈酸或肉豆蔻酸(NewEngland Nuclear)并在37℃培养变形虫24小时而实现[3H]棕榈酸盐和[3H]肉豆蔻酸盐的代谢标记。实施例2通过单克隆抗体亲和色谱纯化半乳糖外源凝集素72小时培养后收获的变形虫滋养体按所述进行洗涤并加溶于150mM NaCl、50mM Tris pH 8.3、0.5％乙基苯基聚乙二醇(Non-idet P—40，NP—40)(Sigma)、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma)和2mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)(Sigma)中。加溶的变形虫在15,000xg离心10分钟，将上清液于4℃上样于一个单克隆抗体亲和柱，该亲和柱的1—2毫升的亲和凝胶10(Affi—Gel10)(Bio—Rad)上含有各种用蛋白质A—纯化的抗外源凝集素单克隆抗体H8—5，7F—4，5B—8，3F—4和6D—2各2毫克。上清液用蠕动式泵再循环通过亲和柱过夜，然后用加溶缓冲液充分洗涤柱。结合的外源凝集素用0.2N乙酸pH2.5洗脱，然后立即冷冻并冻干。在某些制剂中，加溶缓冲液中含有5mM对—氯汞基苯基—磺酸(PCMS)(Sigma)以抑制变形虫的糖基磷脂酰肌醇-磷脂酶C(GPI—PLC)。实施例3十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和放射自显影按Laemmli(1970)以前描述的标准程序，用6—15％丙烯酰胺胶进行SDS—PAGE。分子量根据得自Amersham公司的分子量标记物(Rainbow Markers(14,300—200,000))进行测定。除非另外注明，所有用于电泳的蛋白质都在4％SDS和10％β—巯基乙醇中煮沸。对于放射自显影，在干燥之前将SDS—PAGE胶浸泡于Entensi-fy A和B(DuPont)中，然后在-70℃对柯达XAR—5胶片曝光一周或更长时间。
对经免疫沉淀和亲和纯化的外源凝集素的一维SDS—PAGE鉴别出170、35和31千道尔顿(未显示出)的条带。因为31千道尔顿条带以前在纯化的外源凝集素制剂中没有分辨到(Petri et al.，J BiolChem(1989)2643007—3012)，所以我们希望能对其和35千道尔顿亚基进行定性分析。31千道尔顿或35千道尔顿蛋白质在非还原胶上都以异源二聚体形式迁移，这表明它们都通过二硫键联于170千道尔顿亚基(Petri，et al.，1989，出处同上)。
为了确定31千道尔顿条带是否是以前未鉴别出的异源三聚体蛋白质的亚基，通过二维凝胶分析法来分析外源凝集素。纯化的外源凝集素在6％管式凝胶中于非还原条件下沿水平方向进行电泳，然后在10％平板凝胶中于还原条件下进行垂直方向的电泳，用考马斯亮蓝进行染色。结果显示于图2，箭头指出了170、35和31千道尔顿亚基。以千道尔顿表示的分子量标记物列于第二个方向的左侧。170千道尔顿亚基为水平方向上的宽主条带，与160—170千道尔顿的次条带一起。如图所示，35和31千道尔顿亚基在垂直方向上位于170千道尔顿条带的下方，但在水平方向上它们分开迁移。这暗示它们不是异源三聚体的成员，而是两种不同的异源二聚体的轻亚基。这两种异源二聚体中的一种含有170和35千道尔顿亚基，另一种含有170和31千道尔顿亚基。实施例4外源凝集素轻亚基的氨基酸组成两种亚基的氨基酸组成几乎相同，并与得自35/31千道尔顿cD-NA的氨基酸组成以及以前发表的35/31千道尔顿氨基酸组成进行仔细比较。
表1半乳糖外源凝集素亚基的氨基酸组成残基 1 2 3 4残基/100氨基酸CysNDaND 1.8 NDAla4.1 4.5 5.8 6.8Ile3.6 3.7 4.4 4.4Leu5.6 5.4 4.4 5.8Asp9.6 10.86.2 7.0AsnND ND 7.3 NDGly12.8 10.05.1 8.5Glu12.1 12.14.0 9.2GlnND ND 5.5 NDSer8.0 6.9 5.1 7.3Val5.0 4.9 4.7 5.1Tyr5.0 4.6 8.0 6.6Phe3.9 4.1 5.1 5.1His1.4 1.3 1.1 1.9Lys11.6 12.08.4 9.4Met0.4 0.4 1.4 1.5Pro4.3 4.4 5.8 5.9Arg4.5 5.4 6.5 6.9Thr7.9 9.4 8.0 7.7TrpND ND 1.5 NDaND，测不出栏1，电洗脱的31千道尔顿亚基栏2，电洗脱的35/31千道尔顿亚基栏3，根据cDNA推导栏4，得自[Petri，1989]观察到的细微差别可能归因于使用了不同的溶组织内阿米巴株(HM—1IMSS用于氨基酸分析，而H—302NIH用于cDNA测序)，或者由于各个具体的轻亚基基因家族的成员而造成的。实施例5外源凝集素轻亚基的溴化氰消化为了进一步定性分析31和35千道尔顿亚基，用CNBr(溴化氰)消化两种亚基，得到的肽用N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)—SDS—PAGE分析(图3)。电洗脱的31和35千道尔顿亚基干燥后用CNBr消化过夜。消化的蛋白质用N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)—SDS—PAGE分析，电泳后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)滤膜上，并用考马斯亮蓝进行染色。左电泳道为35千道尔顿亚基；右电泳道为31千道尔顿亚基。以千道尔顿表示的分子量标记物列在右侧。
对于两种亚基，CNBr消化后的肽片段格局基本上是相同的。这表明，如果它们不是相同的，那么就是密切相关的蛋白质。用Edman降解法对31千道尔顿亚基的CNBr消化片段进行氨基酸序列测定的尝试没有获得成功。此外，31千道尔顿亚基的氨基端对于Edman降解法是封闭的，但35千道尔顿亚基的氨基端不是封闭的。这暗示两种蛋白质之间的差别在于翻译后的修饰，它造成了31千道尔顿亚基氨基端的封闭。实施例6代谢标记A.脂肪酸为了检查轻亚基是否存在糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，从用[3H]棕榈酸盐和[3H]肉豆蔻酸盐代谢标记的变形虫中纯化外源凝集素。变形虫滋养体在TYI—SS—33培养基中用50μCi/ml[3H]棕榈酸或[3H]肉豆蔻酸代谢标记24小时。代谢标记后，变形虫被沉淀，用75mM Tris、65mM NaCl，pH7.2洗涤2次，再加溶于150mM NaCl、50mM Tris，pH8.3、0.5％NP—40(Nonidet P—40)、5mM EDTA、2mM PMSF和5mM PCMS中。结果示于图4。电泳道1和4为总的变形虫蛋白质；电泳道2和5为经过小鼠的预免疫血清免疫沉淀的蛋白质；电泳道3和6为经过小鼠的抗外源凝集素抗血清免疫沉淀的蛋白质。如电泳道1和4所示，大量的变形虫蛋白质也被两种脂肪酸标记了。
B.[3H]葡糖胺标记和与磷脂酰肌醇-磷脂酶C(PI—PLC)一起的培育与31千道尔顿亚基相比，35千道尔顿亚基被[3H]葡糖胺标记得更强。这表明这两种多肽的糖基化不同。标记强度的不同不能仅仅归因于数量的差别，因为如用考马斯亮蓝染色的外源凝集素凝胶所示(图2)，两种亚基基本上同样丰富。
SDS—PAGE表明，去污剂溶胞产物中的布鲁斯锥虫(T.brucei)表面糖蛋白变体(VSG)具有比可溶性VSG低800—2000道尔顿的表观分子量。为了确定外源凝集素在SDS—PAGE上的迁移是否受PI—PLC影响，将[3H]葡糖胺标记的外源凝集素与蜡状芽胞杆菌的PI—PLC或PCMS(一种PI—PLC抑制剂)一起培育，再进行SDS—PAGE和放射自显影分析。如图5所示，溶组织内阿米巴滋养体用50μCi/ml[3H]葡糖胺，在有5mM PCMS存在(电泳道A)，或有1单位/毫升蜡状芽胞杆菌PI—PLC存在(电泳道B)下，于不含半乳糖的TYI—S—33培养基中37℃代谢标记1小时。然后用抗外源凝集素抗血清进行免疫沉淀，再通过SDS—PAGE和放射自显影进行分析。以千道尔顿表示的分子量标记物列于左侧。[3H]葡糖胺标记的外源凝集素的PI—PLC消化对35和31千道尔顿亚基的迁移性都没有明显的影响。这暗示31千道尔顿亚基上的GPI锚是抵抗蜡状芽胞杆菌PI—PLC的。对于其他的GPI锚式蛋白质，已列出了对来自不同来源的PI—PLC的抗性差别。实施例7来自加溶的变形虫的半乳糖外源凝集素的免疫沉淀如上所示，用[3H]棕榈酸盐对变形虫进行代谢标记和加溶，然后在4℃离心10分钟以去除不溶物。在某些试验中，在加入抗体之前，将加溶的变形虫与0.5单位的蜡状芽胞杆菌PI—PLC(Sigma)于37℃一起培育1小时。将加溶的半乳糖外源凝集素与小鼠的抗重亚基单抗或抗外源凝集素抗血清一起培育过夜，用小鼠IgG1或小鼠的预免疫血清作为对照。免疫复合物用50μl的50％蛋白质—A琼脂糖珠(Sigma)于4℃沉淀过夜，并在SDS—PAGE之前用加溶缓冲液洗涤5次。
用小鼠的抗外源凝集素抗血清的免疫沉淀表明，被[3H]棕榈酸盐代谢标记的是170和31千道尔顿亚基而不是35千道尔顿亚基(图4，电泳道3和6)。重亚基上的类脂修饰没有观察到，但是cDNA序列分析表明它是一个内在膜蛋白质。[3H]肉豆蔻酸盐标记的21千道尔顿处的条带似乎并不与外源凝集素相关，因为它与对照抗血清一起非特异地免疫沉淀，图4，电泳道5和6。实施例8免疫沉淀的外源凝集素的硝酸脱氨基作用GPI锚式蛋白质的硝酸脱氨基作用使葡糖胺—(1—6)—肌醇糖苷键断开释放磷脂酰肌醇或酰基磷脂酰肌醇，并用于诊断GPI锚的存在与否。为了鉴别类脂修饰的性质，来自变形虫总蛋白质的被[3H]棕榈酸盐标记的、31千道尔顿条带用硝酸进行脱氨基，得到的类脂产物用正丁醇萃取。当用薄层色谱(TLC)分析时，释放的类脂产物精确地与磷脂酰肌醇一起迁移。
变形虫滋养体在TYI—S—33培养基中用50μCi/ml[3H]棕榈酸盐代谢标记24小时。[3H]棕榈酸盐标记的变形虫蛋白质用抗外源凝集素抗血清进行免疫沉淀，再用SDS—PAGE进行分离，干燥，并经放射自显影以鉴别被类脂标记的31千道尔顿亚基。从凝胶上切取31千道尔顿条带，在去离子水中再水合，并电洗脱。电洗脱的蛋白质进行对水进行透析并蒸去水分。干燥的蛋白质再悬浮于400μl新制备的脱氨基缓冲液(0.1M乙酸钠(CH3COONa)pH3.7、0.1％NP—40、0.25M NaNO2)中，于室温培育12小时，再用6μl 5M HCl进行酸化。反应产物在400μl水饱和的正丁醇∶水(1∶1)中进行分配，水相再用400μl水饱和的正丁醇进行萃取以除去残余的盐。丁醇相被合并，蒸去水份，并进行TLC分析。
简要地，TLC是按如下进行的。将类脂再悬浮于9∶1的氯仿∶甲醇中。然后在使用前已经被加热到80℃ 30分钟的Kieselgel 60衬有塑料的硅胶板(EM Science)上进行色谱分析。使用的溶剂系统是4∶4∶1氯仿∶甲醇∶水。各电泳道被切成1厘米的狭带并用闪烁计数器进行分析。类脂标准物是与标记的类脂同时进行色谱的并在碘蒸气中显色。标准物是(A)磷脂酰氯；(B)磷脂酰肌醇；(C)磷脂酰乙醇胺；(D)二肉豆蔻酰基甘油。结果示于图6a中。
为了证实来自SDS—PAGE的31千道尔顿条带代表31千道尔顿外源凝集素轻亚基，外源凝集素，用小鼠抗外源凝集素抗血清进行免疫沉淀并重复试验。变形虫蛋白质用[3H]棕榈酸盐进行代谢标记并用去污剂加溶。加溶后，用小鼠的抗外源凝集素抗血清进行免疫沉淀。再用SDS—PAGE分离外源凝集素亚基。31千道尔顿条带用放射自显影鉴别，再从凝胶中切取并按如上步骤对类脂组份进行分析。在这次色谱中，让溶剂前沿在TLC板上进一步进行迁移，这使磷脂酰肌醇标准物和标记的类脂都成为宽条带，但是放射性标记仍然与磷脂酰肌醇一起共迁移，从而证明31千道尔顿亚基上类脂的同一性(图6b)。磷脂酰肌醇(一种GPI锚组份)的释放证实了在31千道尔顿亚基上存在GPI锚。实施例9用抗交叉反应决定簇(CRD)抗体进行Western印迹法来自几种种类的GPI锚表明共同具有一个已知是交叉反应决定簇(CRD)的碳水化合物表位，该表位通过用磷脂酰肌醇特异性的磷酸酯酶C(PI—PLC)将二酰基甘油从锚上切下而暴露。为了确定外源凝集素是否含有CRD，对实施例3中制备的31和35千道尔顿亚基进行电洗脱，与蜡状芽胞杆菌的PI—PLC一起培育，并用抗CRD抗体进行免疫印迹。10微克的每个亚基与0.1单位的蜡状芽胞杆菌PI—PLC(磷脂酰肌醇特异性的磷酸酯酶C)于37℃培育30分钟，通过SDS—PAGE进行电泳，再转移至PVDF滤膜上，以便进行考马斯亮蓝染色或用1∶500稀释的抗CRD抗体(由Johns Hopkins Uni-versity的Dr.Tamara Doering赠予)进行免疫印迹。免疫印迹之前，滤膜在5％脱脂奶粉(Carnation)中于4℃培育过夜以封闭滤膜空白处的蛋白结合能力。与抗体的培育时间是在室温下1小时，然后在50mM Tris—HCl、200mM NaCl、0.1％Tween 20 pH 7.35/31中洗涤3次，各10分钟。与一抗抗体一起培育后的第一次洗涤是在50℃。二抗抗体是抗兔IgG碱性磷酸酯酶共轭物(Promega)。印迹在Western Blue(Promega)中显色。
结果示于图7。电泳道1，亲和纯化的半乳糖结合的外源凝集素；电泳道2和4，电泳洗脱的31、35千道尔顿亚基；电泳道3和5，电洗脱的31千道尔顿亚基。电泳道1、2和3，考马斯亮蓝染色的蛋白质。电泳道4和5；用抗CRD抗体进行的免疫印迹。两种亚基都被抗CRD抗体结合(电泳道4和5)。在无PI—PLC时，根据印迹强度(未显示)，抗体都能同样好地进行结合。
膜形式的VSG与抗CRD抗体的弱反应性已有报道，而且很可能是由于暴露在膜形式的GPI锚上的一个CRD表位造成的。抗CRD抗体并不与外源凝集素170千道尔顿亚基反应，而且单独的二抗抗体也不与31或35千道尔顿亚基结合(未显示)。实施例10溶组织内阿米巴细胞的分级分离和对变形虫的GPI—PLC活性的测定GPI锚式蛋白质的发现暗示溶组织内阿米巴具有内源性的GPI—PLC活性。为了对变形虫GPI—PLC进行测定，纯化[3H]肉豆蔻酸盐标记的VSG并用作底物。从VSG上释放二酰基甘油用于诊断GPI—PLC活性。
变形虫的胞液组份和膜组份按以前描述的方法(Fox et al.J.Biol Chem(1986)26115767—15771)并稍加改变进行制备。简要地，离心5×107变形虫滋养体并在5ml 75mM Tris、65mM NaCl pH7.2中进行洗涤，然后在同样的缓冲液中与1∶1000二异丙基氟代磷酸酯(Sigma)一起在冰上培育30分钟。然后滋养体在5ml含有2mMPMSF pH8.0的10mM磷酸钠缓冲液中通过渗透裂解细胞。在37℃培育5分钟后，制备物被冻融并在50000xg于4℃离心1小时。上清液经测定是胞液组份，得到的沉淀物再悬浮于新鲜裂解缓冲液中并在100,000xg于4℃离心1小时。该沉淀物置冰上于振荡均浆器中，在5ml 1％正辛基葡糖苷、25mM Tris HCl、pH8.0及2mM PMSF中进行均浆化。均化物再在100,000xg于4℃离心1小时，上清液经测定是膜组份。
变形虫GPI—PLC活性的测定是用2微克/15毫升[3H]肉豆蔻酸盐标记的VSG(表面糖蛋白变异体)作为底物，在0.1％NP—40、50mM Tris—HCl、5mM EDTA pH8.0中，于37℃按所述方法(Hereld et al.，J Biol Chem(1986)13813—13819)进行半小时。每个组份含有1×107变形虫当量。将1单位纯化的蜡状芽胞杆菌PI—PLC作为阳性对照，将测定缓冲液(0.1％NP—40、50mM Tris—HClpH8.0、5mM EDTA)作为阴性对照。用二硫苏糖醇(DTT)和EDTA进行测定，将25mM DTT和5mM EDTA加入胞液组份。重复做一次DTT和EDTA测定，结果用两次测定的平均值表示。在PI—PLC分析后，正丁醇相在真空离心蒸发浓缩器(Speed Vac)中蒸发，然后再悬浮于10微升氯仿/甲醇(9∶1)中，并在衬有塑料的硅胶60的薄层(在使用前先加热至80℃30分钟)上，用石油醚/二乙醚/乙酸(80∶20∶1)作为溶剂进行色谱。将电泳道切成0.5厘米的狭带，用闪烁计数法进行分析。
结果用丁醇相中的每分钟计数(cpm)/两相中的总cpm表示。栏1∶1单位纯化的蜡状芽胞杆菌PI—PLC；栏2单独的缓冲液；栏3溶组织内阿米巴膜组份；栏4溶组织内阿米巴胞液组份。
如图8a所示，与布鲁氏锥虫(T.Brucei)不同，溶组织内阿米巴在胞液中含有GPI—PLC，而布鲁氏锥虫(T.Brucei)在膜组份中鉴别出内源性的GPI—PLC活性。加入5mM EDTA或25mM DTT分别使[3H]膜形式VGS的断裂增加23％和41％(未显示)，这表明，与布鲁氏锥虫(T.Brucei)GPI—PLC相似，变形虫的酶也部分受Ca2+抑制，而且可能含有一个活性位点巯基。
为了证实从VSG释放的类脂是变形虫GPI—PLC，用变形虫胞液组份对从[3H]肉豆蔻酸盐标记的VSG上切下的有机相产物进行TLC。得自GPI—PLC测定的丁醇相与纯化的蜡状芽胞杆菌的PI—PLC消化产物一起进行TLC分析。丁醇相被蒸发，类脂再悬浮于9∶1氯仿∶甲醇中，再点至衬有塑料的硅胶60TLC板上(在使用前先加热至80℃30分钟)，用石油醚/二乙醚/乙酸(80∶20∶1)作为溶剂进行分析。将各电泳道切成0.5厘米的狭带，用闪烁计数法进行分析。类脂标准物在碘蒸气中显色。标准物是(A)二肉豆蔻酰基甘油；(B)肉豆蔻酸；(C)二肉豆蔻酰基磷酸。在TLC上显示出一条单一的放射性条带，它与纯化的二肉豆蔻酰基甘油以及与纯化的用蜡状芽胞杆菌PI—PLC消化的[3H]VSG的类脂产物共迁移(图8b)。用变形虫的膜组份进行的相同的试验表明，不能释放放射性标记进入有机相(未显示)。实施例11氨基酸分析和溴化氰消化如上对亲和纯化的外源凝集素进行电洗脱。31和35千道尔顿的条带通过在室温下，用0.5％考马斯亮蓝于乙酸∶异丙醇∶水(1∶3∶6)中染色而确定，然后在乙酸∶甲醇∶水(50∶165∶785)中脱染色。有用的条带被从凝胶中切除并电洗脱。电洗脱的蛋白质在University ofVirginia的蛋白质和核酸测序中心分析其氨基酸组成。对于肽的作图，将50微克干蛋白质用50微升70毫克/毫升的CNBr在70％甲酸的溶液中，室温下于黑暗中消化过夜。消化后的蛋白质被干燥并在2X还原样品缓冲液中煮沸用于N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)—SDS—PAGE分析(Schagger & von Jagow，1987)。在N-[三(羟甲基)甲基]苷氨酸(tricine)—SDS—PAGE分析之后，蛋白质被电泳转移至PVDF膜上并用考马斯亮蓝进行染色。外源凝集素轻亚基的氨基端和一个CNBr片段用Edman降解法进行测序，如Mann等人(Proc Natl Acad Sci(1991)852444—2448)所述。实施例12聚合酶链反应(PCR)和测序反应利用溶组织内阿米巴密码子的偏差，根据实施例11的测序中获得的序列设计两种兼并性寡核苷酸，并在聚合酶链反应(PCR)中用作引物以便从溶组织内阿米巴基因组DNA中扩增出400bp的片段。使用的引物是5′GCGCAAGCTTCCAAA(C，T)TA(C，T)CCATA(C，T)GG3′(有义)和5′GCGCCTCGAG(T，A)AC(T，A)GA(CT)TTTGGAAT(T，A)G3′(反义)。PCR反应用Pfu聚合酶(Stratagent)进行。反应时间是93℃1分钟、37℃1分钟和72℃3分钟，共30个循环。400bp的PCR产物以α[32P]dCTP(Amersham)用随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer—Mannheim)进行标记。[32P]标记的PCR片段被用于筛选来自H—302NIH株的溶组织内阿米巴λgt 11 cDNA库(Louisiana State University的Bruce Torian博士馈赠(Torian et al.Proc Natl Acad Sci(1990)876358—6362))。鉴别出一个与标记的PCR片段杂交的噬菌斑。分离该噬菌斑并纯化，将该纯化的噬菌斑作为模板DNA来源，与根据400bp片段和λgt11的侧翼序列而设计的引物一起产生额外的PCR产物。按所述方法(Mann et al.，Proc Natl Acad Sci(1991)883248—3252)，通过聚乙二醇沉淀制备用于测序的PCR产物。400 bp片段与随后纯化并测序的单一噬菌斑杂交，并用TAQuenase系统(USB)通过Sanger的双脱氧测序法进行测序。
凝胶数据读取用Sequence Assembly Manager进行。用FAS-TA软件程序(Pearson et al，Proc Natl Acad Sci(1988)852444—2448)将推导的蛋白质序列与国立生物医学研究基金会(NationalBiomedical Research Foundation)、Swiss—prot和Genbank的数据库进行比较。来自纯化的噬菌斑(称为lgl1)的cDNA插入子含有一个开放阅读框架(ORF)，预测它编码一个分子量为32.1千道尔顿的具有278个氨基酸的多肽(图1a)。对推导的氨基酸序列的分析鉴别出了用Edman降解法确定的氨基端序列和CNBr序列以及成熟多肽氨基端的3个氨基酸，它们极可能是膜蛋白和分泌蛋白共同的引导序列的一部分。(在成熟的蛋白质的氨基端的-3和-1位分别存在丙氨酸和甘氨酸，这与信号肽在这些位置上的小氨基酸要求相符)。引导序列的剩余部分，包括预期的氨基端翻译起始密码子ATG，在该克隆中并不存在。
氨基端序列和总氨基酸组成与以前描述的轻亚基(Petri et al.，1989)几乎相同，从而证实了该cDNA的同一性(图1和表1)。氨基酸序列含有两个潜在的通过N-连接的糖基化位点，这支持了代谢标记的研究结果即35/31千道尔顿亚基的[3H]葡糖胺掺入。在35/31千道尔顿亚基与经典的C型和S型外源凝集素的碳水化合物结构域之间没有序列上的相似性。对完整的轻亚基氨基酸序列的FASTA软件查找发现，与国立生物医学研究基金会(National BiomedicalResearch Foundation)数据库(Person et al.，1988)中的其他蛋白质没有显著的相似性。
亲水性图显示，该多肽相对亲水且缺少跨膜结构域。取而代之的是在羧基端鉴别出7个氨基酸的疏水序列。疏水的羧基端区域是GPI锚式蛋白质所特有的。尽管与大多数其他的GPI锚式蛋白质相比，疏水的7个残基的羧基端区域相对较小，但是，布鲁氏锥虫(T.Bru-cei)通过丝氨酸锚住的VSG具有短的前体尾并且在一段仅8个疏水氨基酸处终止。据信，GPI锚的添加是早期翻译后事件，其中第15—30个羧基端残基从新生蛋白质上被切下，随后将GPI锚连接上，从15个残基的氨基端至疏水的羧基端的cDNA编码的三肽C—S—A。在这三个位置上的该三肽与以前测序的GPI锚切除/添加位点是一致的，但与目前鉴别出的最短的信号肽相比，是更靠近羧基端的三个氨基酸。
在约100种已知的GPI锚蛋白质中仅有约20种对GPI附着位点进行了定性研究，而且在其他生物的GPI添加信号中已发现了相当大的异质性。因此，仅根据序列信息还不能确定准确的锚添加位点。对氨基端和羧基端的信号肽以及潜在的切除/添加位点的鉴别，加上缺乏假定的跨膜结构域和胞质结构域，这些都暗示该cDNA编码一个GPI锚式蛋白质。
用上述的技术方案得到的另一个克隆代表了基因家族的另一个成员(lgl 2)，显示于图1b。lgl 2的序列包括864个核苷酸的单一开放阅读框架，它编码一条288个氨基酸的多肽，其成熟蛋白质的计算的分子量是32.4千道尔顿。实施例13Southern和Northern分析A.Southern印迹分析为了分析溶组织内阿米巴是否存在多个外源凝集素轻亚基基因，从株HM—1IMSS中分离基因组DNA，用限制酶BglII和EcoRI消化完全，然后按照发表的程序(Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1982))将其转移至Zetabind滤膜(CUNO)上。400bp的PCR片段用α[32P]dCTP(Boehringer Mannheim)以随机引物法标记，然后在使用前通过煮沸10分钟而变性。杂交在37℃进行。洗涤在0.1×SSC、0.1％SDS中于50℃进行。图9a显示了BglII(电泳道A)或EcoRI(电泳道B)消化后用琼脂糖凝胶电泳进行分离并转移至尼龙滤膜上的结果。以千碱基对表示的分子量标记物列于左侧。标记的PCR产物与用BglII消化DNA而得的8.3和4.8kb片段以及用EcoRI消化DNA而得的10.5和6.8kb片段结合。探针与用限制酶消化后的两个片段的杂交暗示存在一个轻亚基基因家族，因为在35/31千道尔顿亚基cDNA上没有发现限制性酶切位点。以前的研究工作已经在35/31千道尔顿亚基的氨基酸序列中鉴别出微观不均一性，这与它由一个以上的基因所编码是一致的(Petri et al.，1989)。
B.Northern印迹分析对于Northern印迹分析，按以前所述的方法(Mann et al.，Proc Natl Acad Sci(1991)883248—3252)纯化溶组织内阿米巴总RNA，然后进行分析。通过甲醛凝胶电泳纯化和分离溶组织内阿米巴总RNA，然后转移至尼龙滤膜上。如该实施例的A段落所述，滤膜与用[32P]标记的35/31千道尔顿亚基的400bp片段杂交。图9b显示了结果，以千碱基对表示的分子量标记物列于左侧。鉴别出编码35/31千道尔顿亚基的约1.0kb的单一mR-NA，这与837bp的cDNA大小以及更早估计的1.2kb(Mann et al.，Proc Natl Acad Sci(1991)883248—3252)很好地吻合。在North-ern印迹中存在单一的条带表明多种轻亚基的mRNA一定是大小相近的。实施例14粘附外源凝集素轻亚基的识别35千道尔顿和31千道尔顿同种型都能被针对重组表达的谷胱甘肽—S—转移酶(GST)—轻亚基融合蛋白的抗血清所识别。编码35/31千道尔顿外源凝集素轻亚基的完整氨基酸序列的cDNA序列以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中用pGEX表达质粒进行表达。因此融合蛋白含有作为氨基端的GST，含有作为羧基端的轻亚基。融合蛋白用弗氏压碎器(French press)破裂并经电泳和电洗脱得以纯化，然后用于免疫小鼠。得自小鼠的免疫血清与纯化的融合蛋白以及Western印迹上的粘附外源凝集素反应。结果列于图10。电泳道1是与预免疫血清反应的融合蛋白；电泳道2是与用GST—35千道尔顿亚基融合蛋白免疫的小鼠免疫血清反应的融合蛋白；电泳道3是与预免疫血清反应的纯化的外源凝集素；电泳道4是与针对GST—35千道尔顿的免疫血清反应的31/35千道尔顿同种型。从电泳道2和4的结果证实35千道尔顿和31千道尔顿亚基同种型被抗血清识别。实施例15用粘附外源凝集素35/31千道尔顿亚基免疫沙鼠用50微克于完全Freund氏佐剂中的纯化的35/31千道尔顿亚基—GST融合蛋白通过腹膜内注射免疫沙鼠。两周后，试验动物第二次用50微克于完全Freund氏佐剂中的融合蛋白通过腹膜内注射。第二次注射四周后，再通过将变形虫滋养体直接注射入肝脏激发动物免疫应答。两周后杀死动物，检查是否存在变形虫肝脓肿。作为对照，用GST蛋白质单独免疫一组动物。与仅用GST蛋白质免疫的动物相比，用35/31千道尔顿融合蛋白进行免疫导致肝脓肿大小的减小。
免疫 脓肿重量(克)动物#1 GSA6.14#2 GSA0.68#3 GSA13.87#4 GSA1.66#5 GSA4.39#6 GSA0.33#7 GST6.27#8 GAT—35/31千道尔顿 1.16#9 GAT—35/31千道尔顿 1.33#10 GAT—35/31千道尔顿5.81#11 GAT—35/31千道尔顿1.44#12 GAT—35/31千道尔顿0.12#13 GAT—35/31千道尔顿1.34#14 GAT—35/31千道尔顿0.75#15 GAT—35/31千道尔顿1.85平均脓肿重量GST35/31千道尔顿平均4.761.72SD(+/-4.71 1.73SSE 1.780.61实施例16用含有粘附外源凝集素35/31千道尔顿亚基的第79—90氨基酸的合成肽免疫沙鼠粘附外源凝集素成熟的1gl 1的35/31千道尔顿亚基的第79—80氨基酸(在图1a中用框框出的氨基酸)的轻亚基肽，经35/31千道尔顿氨基酸序列的亲水性图分析被鉴别为潜在的B—细胞表位。例如参见T.P.Hopp et al.，″Prediction of Protein antigenic determi-nants from amino acid sequences，″Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(1981)783824—3828。合成该肽并通过本领域已知的常规肽化学方法将其连于匙孔血蓝蛋白(KLH)载体上。例如参见美国专利No.4,708,871，其所公开的内容在此引用作为参考。用50微克以谷胱甘肽—S—转移酶(GST)融合蛋白(“轻亚基”)形式表达的轻亚基，或者为了比较，用轻亚基肽或单独的GST(“对照”)免疫沙鼠。用完全Freund氏佐剂通过腹膜内注射免疫沙鼠。两周后，用额外的50微克于完全Freund氏佐剂中的免疫原再次通过腹膜内注射加强免疫。六周后，再通过将变形虫滋养体直接注射入肝脏激发动物免疫应答。两周后杀死动物，检查是否存在变形虫肝脓肿。下表中的结果表明，轻亚基肽疫苗与35千道尔顿亚基融合产物疫苗几乎同样有效。
免疫 脓肿重量(克) 有脓肿的动物对照 1.19±0.53(n＝6) 83％35千道尔顿亚基0.31±0.09(n＝7)*100％35千道尔顿肽(氨基酸79-90) 0.40±0.34(n＝6)#50％*(p＜0.06，与对照相比)#(p＜0.20，与对照相比)
权利要求
1.一种疫苗，其特征在于，它含有与至少一种药物学上可接受的赋形剂相混的溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基或其功能片段。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，该外源凝集素源自致病株。
3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，还含有溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc外源凝集素的170千道尔顿亚基或其功能片段。
4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，35/31千道尔顿亚基是处于与额外的氨基酸序列相融合的融合蛋白的形式。
5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，该额外的氨基酸序列是谷胱甘肽—S—转移酶或其基本片段。
6.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，含有一种基本上由该35/31千道尔顿亚基的第79—90氨基酸构成的肽作为活性成分。
7.一种使宿主对溶组织内阿米巴产生免疫的方法，其特征在于，包括施用一种含有溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基或其功能片段作为活性成分的疫苗，而该疫苗会在宿主中引起针对由溶组织内阿米巴滋养体引起的侵袭性阿米巴病的免疫应答。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该活性成分是该功能片段，而且该功能片段诱导阻断外源凝集素粘附的抗体。
9.一种纯化和分离的DNA，其特征在于，它基本上由编码溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基或其功能片段的DNA组成。
10.一种重组DNA，其特征在于，它含有连接异源DNA的、编码溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基或其功能片段的DNA。
11.一种用于表达溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基或其功能片段的表达系统，其特征在于，它含有在操作上能连接影响其表达的控制序列的编码该亚基或其片段的DNA。
12.如权利要求11所述的表达系统，其特征在于，该控制序列是病毒控制序列。
13.如权利要求12所述的表达系统，其特征在于，它位于活的减毒病毒中。
14.如权利要求13所述的表达系统，其特征在于，该病毒是牛痘病毒。
15.一种通过重组产生的融合蛋白，其特征在于，含有融合于额外的异源氨基酸序列的溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基或其功能片段的氨基酸序列。
16.一种在溶组织内阿米巴的培养物中抑制产生Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基的方法，其特征在于，将该培养物与图1a或1b的核苷酸序列互补的寡核苷酸、或相应的寡核苷酸或其有效片段接触；其中，该寡核苷酸是致病株的，以及其中该接触是在能实现表达的条件下提供该寡核苷酸一个表达系统而实现的。
17.一种以重组形式连于异源多聚核苷酸或处于纯化和分离形式的多聚核苷酸，其特征在于，它含有与图1a或1b的核苷酸序列互补的序列、或相应的寡核苷酸或其有效片段。
18.一种表达系统，其特征在于，它含有图1a或1b的核苷酸序列、或溶组织内阿米巴的相应核苷酸序列、或其活性片段，它们在相容的控制序列的控制下处于反义取向。
19.一种在已经过处理从而含有单链多聚核苷酸的生物样品中检测是否存在溶组织内阿米巴的方法，其特征在于，将该处理过的样品进行聚合酶链反应(PCR)扩增，其中使用框定溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基区域的引物，和在严紧条件下用相应于该区域的寡聚体探针对扩增的DNA进行探测。
20.一种对溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基免疫特异的抗体。
21.如权利要求20所述的抗体，其特征在于，是单克隆抗体。
22.如权利要求21所述的抗体，其特征在于，致病株的表位特征是免疫特异的。
23.如权利要求21所述的抗体，其特征在于，非致病株的表位特征是免疫特异的。
24.如权利要求21所述的抗体，其特征在于，致病和非致病株的表位特征是免疫特异的。
25.一种能分泌如权利要求21所述抗体的无限增殖化细胞。
26.一种在生物样品中检测是否存在溶组织内阿米巴的方法，其特征在于，将该样品与如权利要求22—24中所述的抗体在任何溶组织内阿米巴存在都会与任一该抗体形成复合物的条件下接触；和检测该复合物的存在与否。
全文摘要
本发明提供了不同株溶组织内阿米巴的Gal/GalNAc粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基和编码该蛋白质的DNA。这些材料能用于疫苗和诊断测定，以及在反义方法中中断Gal/GalNAc外源凝集素的产生。还公开了对35/31千道尔顿亚基特异的抗体。
文档编号C07K16/20GK1120315SQ94191690
公开日1996年4月10日 申请日期1994年4月6日 优先权日1993年4月9日
发明者小威廉·A·彼德里, 詹姆斯·J·麦考伊, 芭芭拉·J·曼 申请人:维吉尼亚大学专利基金会