专利名称：得到经过修饰降低了鼠抗体可变区之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有免疫球蛋白的 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，特别是涉及得到经过修饰降低了鼠抗体可变区之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有这些免疫球蛋白的组合物。
免疫系统产生以高亲和力和特异性与很大范围的抗原结合并激发效应细胞机制的抗体。医学中已将抗体用作诊断和治疗剂，并且随着新技术的出现而成功地提高了它们的应用潜力。
杂交瘤技术的应用得以分离产生单一特异性抗体的细胞系(Koehler G.，Milstein C.(1975)，Natare(London)256，495—497)，并且基因技术允许自杂交瘤构建一系列工程化抗体。
抗体的区域结构有利于对抗体进行工程化改造，并且通过得到或丢失其某些性质而进一步改善许多抗体的实用性。抗体的抗原结构特性提供了识别功能，并可将其连接到一种或多种效应剂上。然后则必须基于效力、特异性和免疫原性标准来检验抗体是否同时具有这两种性质。
已很容易从被免疫的啮齿动物得到产生单克隆抗体的杂交瘤。目前已将几种鼠单克隆抗体广泛用于恶性肿瘤的影像诊断和治疗、抗中毒性休克预防给药、修饰移植物排斥部分，以及缓解急性炎症反应。在使用啮齿动物抗体进行治疗的大多数病例中，接受者体内都引发了针对抗体的免疫反应。这些反应已限制了治疗期限和效果。
虽然存在几种选择，例如使用SCID—hu小鼠、体外免疫、重组的文库，或这些方法的某些有用结合，但因为有许多已明确鉴定的啮齿动物单克隆抗体已可以得到(如果能够排除免疫反应，即可将其用于临床)，所以开发人来源的相似制剂的努力已受到挫拆，而生产工程化改造的抗体则引起了很大关注。
已设计了工程化抗体，以尽可能地用等同的人序列取代外源序列。在基团工程化抗体中，大都是将来自不同种的免疫球蛋白的片段连接在一起的嵌合抗体。
首先，构建了包含与人恒定区融合之啮齿动物可变区的嵌合抗体。特别是小鼠/人嵌合抗体因表现出同样的特异性，但与其小鼠对应物相比又降低了免疫原性，故可用于免疫治疗。下列参考文献描述了嵌合抗体技术Lobuglio et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864220—4224(1989)；美国专利4,816,567；PCT国际公开WO 87/02671(1987年5月7日)；欧洲专利公开255,694(1988，2，10)；欧洲专利公开274,394(1988年7月13日)；欧洲专利公开323,806(1989年7月12日)；PCT国际专利公开WO89/00999(1989年2月9日)；欧洲专利公开327,000(1989年8月9日)；欧洲专利公开328,404(1989年8月16日)和欧洲专利公开332,424(1989年9月12日)。
值得注意的是，用人等同物取代恒定区也可能不降低它们的免疫原性，而仍有大约一半的接受者产生了对啮齿动物可变区的免疫反应。因此，已广泛地操作啮齿动物抗体，以使之更加相似于人抗体。
已实现的进一步降低嵌合抗体之免疫原性的方法是，首先只将啮齿动物单克隆抗体的CDR(互补决定区)移植到人框架区上，然后再与适当的恒定区融合(Jones et al.，Nature 321522—525(1986))。这样完成CDR移植的方法常常产生不完善的人抗体，即是说所得到的抗体失去了亲和性，或者在保留其原有亲和性的尝试中，许多鼠框架残基已取代了相应的被选择之人框架的残基(Winter，欧洲专利申请，239,400；Riechmann，et al.，Nature332323—327(1988))。
就鉴定用于转移的最小数目的残基，以达到对免疫原性有最小潜在影响的有用结合亲和性这一目的来说，已经发展了许多战略，但从所显示的结果看，每个战略都只在重建亲本亲和性中取得一定程度上的成功。
虽然也已发现某些邻近框架残基参予抗原结合，但主要还是根据CDR的结构和相对变位来确定抗体结合位点的配基结合特性(Davies et al.，Ann.Rev.Biochem.59439—473(1990))。因此，如果能够严格地保留其CDR结构及某些邻近残基、它们彼此间的相互作用，以及它们与可变区的相互反应，便可以维持抗体的精确特异性。
Padlan(Padlan，欧洲专利申请0519596A1；Padlan，Molecular Immunology 28489—498(1991))提出了抗体人源化的进一步方法，该方法是基于蛋白质的抗原性取决于其表面的性质，并且其中在啮齿动物可变区中许多可接近溶剂的残基被人抗体的残基所取代这一事实。通过观察人抗体KOL和鼠抗体J539的高分辨率X射线结构来鉴定这些残基的定位。通过鉴定最大同源性抗体群实现对人表面残基的选择。
蛋白质表面的性质对于其被抗原加工细胞，特别是抗原特异性B细胞识别和在这些细胞中内在化都是很重要的，由T细胞识别特定线性结构对于蛋白质的免疫原性也是很重要的。
已建立了几组鉴定在辅助T细胞抗原肽的MHC限制中起作用的序列特征和结构性决定基的计算机自动分析方法(Berssofskyetal.，The Journal of Immunology 1382213—2229(1987)；Elliott et al，J.Immunol.1382949—2952(1987)；Reyeset al，The Journal of Biological Chemistry 26412854—12858(1989))。使用这些计算方法有可能鉴定推测的T细胞提呈肽。
分析已知原子结构的抗体已阐明了抗体结合位点的序列与三维结构的关系(Chothia et al.，J.Biol.Chem.196901—917(1987))。这种关系揭示，在VH区中除第三区域外，结合位点环还具有小数目的主链构象之一，即“典型结构”(“CanonicalStructures”)。在特定环中形成的典型结构是根据其大小和在环与骨架区中的关键位点上存在某些残基而确定的。
已将一个附加的骨架残基亚组定义为“游标”带，其可能调整CDR结构并精调与抗原的配合性(Foot et al.，J.Mol.Biol.224487—499(1992))。取代这些残基已显示对于恢复CDR移动抗体的亲和性是很重要的。因此游标带对于设计人源化抗体有着明显的意义。
因此，本发明的目的是提供将一种哺乳动物的单克隆抗体转化为另一个种的单克隆抗体的方法。另一个目的是推测可变区序列上的潜在的T抗原决定基。另一个目的是鉴定负责T免疫原性的单克隆抗体序列上，负责种特异性或免疫原性的氨基酸残基。再一个目的是用第二个种的T抗原决定基序列上的氨基酸残基取代第一个种的T抗原决定基序列上的氨基酸残基，从而使第一个种的抗体在第二个种中不再有免疫原性。再一个目的只在重和轻链的框架区中而不在互补决定区中造成取代，属于游标带的氨基酸和参予典型结构的氨基酸可不被取代。本发明的再一个目的是提供掺入取代氨基酸残基的新的DNA序列。再一个目的是提供含有改变了抗体之DNA序列的载体。再一个目的是用含有被修饰的抗体之DNA序列的载体转化的真核或原核宿主细胞。
公开了一种鉴定和取代T细胞抗原序列的独特方法，该方法将第一种哺乳动物的免疫球蛋白抗原性转变为第二种哺乳动物的免疫球蛋白抗原性。该方法将同时改变免疫原性并严格保留配基结合性质。审慎地取代可变区的T细胞抗原序列上的那些与三维结构未牵连的氨基酸残基，没有影响配基结合性质但大大改变了免疫原性。
图1推测的IOR egf—IOR EGF—R3单克隆抗体之可变区的氨基酸序列。
(a)可变区κ轻链。
(b)可变区重轻链。
互补决定区已被划下线并用粗体铅字表示。
图2和3对抗体IOR egf—R3重链和轻链可变区所作修饰的分析。
A鼠IOR egf—R3单克隆抗体可变区的序列。
B最同源的人免疫球蛋白之可变区的序列。
C经修饰的IOR egf—R3可变区的序列。
阴影部分推测的T细胞抗原序列。
加下线的氨基酸残基参予三级结构的氨基酸。
粗体铅字互补决定区。
方框中的氨基酸残基提议的取代。
对于重链和轻链的描述同上。
图4mAB IOR egf—R3可变区的分子模型。
以直方图展示分子模型，其中VH在右边并且比VL暗。该模型显示了鼠残基的侧链，这些残基经过突变以使预测的两亲和性片段人源化。
图5通过RRA检测嵌合和突变IOR egf—R3与EGF—R的结合。
以不同浓度的纯化的鼠IOR egf—R3(—■—)、嵌合IOR egf—R3(+)和突变VHR3/muR3VK(—*—)进行抗原结合活性检测，并将结合的125I—EGF的CPM数对各抗体浓度的对数作图(以ELISA法定量IgG的浓度)。
图6用鼠IOR egf—R3、嵌合IOR egf—R3和突变体IOREGF—R3免疫猴。
纵座标405nm吸光率。
横座标采血的天数。
ELISA按实施例9所述步骤进行。
箭头指示每种MAb各注射2mg的间隔时间。
使用的血清稀释度为1/10,000。
图7和8对抗体IOR—T1的重链和轻链可变区所作修饰的分析。
A鼠IOR—T1单克隆抗体可变区的序列。
B最同源的人免疫球蛋白可变区的序列。
C经修饰的IOR—T1抗体可变区的序列。
各标号的意义同图2。
对重链和轻链的描述同上。
图9和10对抗体IOR—CEA1重链和轻链可变区所作修饰的分析。
A鼠IOR—CEA1单克隆抗体可变区的序列。
B最同源的人免疫球蛋白可变区的序列。
C经修饰的IOR—CEA1抗体可变区的序列。
各标号的意义同图2。
对重链和轻链的描述同上。
本发明涉及降低啮齿动物单克隆抗体的免疫原性，同时又在整体上保留其配基结合特性的方法。因为免疫球蛋白的抗原性取决于其序列上T细胞抗原肽的存在，故可经取代包括不同于通常见于另一种哺乳动物抗体中的T细胞抗原序列上的残基，来降低异种或同种异体抗体的免疫原性。
残基的取代并不包括参予到典型结构或游标带(VernierZone)中的残基。这种残基的适宜取代没有影响结构决定基或区域内接触，因此，配基结合性质没有因只限于可变区框架残基的改变而受到影响。
(1)可变区同源性的分析本方法中使用了由Kabat等人(“Sequence of ProteinsofImmunological Interest”Fifth edition Bethesda，Maryland；National Inst.of Health，1994)收集的人抗体可变区的序列资料。
第一步骤中，将第一种动物即小鼠的重或轻链可变区与第二种动物即人的相应可变区进行比较。预定本发明将允许对任何种动物的抗体进行抗原改变。
借助自动化计算机分析方法(PC—DOS HIBIO PROSIS 06—00，Hitachi)进行比较。然后将最同源的人可变区残基与相应的小鼠可变区残基相比较。如此也将确定与各小鼠序列更加相类似的人可变区亚组。
(2)T—抗原决定基的预测第二步骤中，分析小鼠和人的两同源可变区序列，以便预测T抗原序列。
AMPHI计算程序(Bersofsky el al.，The JournalofImmunology 1382213—2229，(1987))用于预测a螺旋序列。SOHHA计算程序则推测螺旋疏水性的条带(Elliott et al，J.Immunol.1382949—2952，(1987))。这些计算程序可预测抗原蛋白质的T细胞提呈片段。
(3)对免疫原性降低的分析用人对应物中存在的残基取代小鼠框架中不同于其人对应物的那些残基。发生这种变换只是涉及那些存在于T抗原序列上的残基。
最后，取代负责典型结构的那些残基或卷入游标带中的那些残基可能对三级结构有重要影响。因此，它们不能被包括在该取代中。有关所提议的取代对三级结构或结合位点的影响的附加信息，可从可变区的分子模型中获得。
在运行UNIX和利用分子模型包“QUANTA”(Polygen corp)的Silicon Graphics Iris 4D工作站构建所说的分子模型。
(4)构建和表达被改变之抗体的方法使用下述方法制备将第一种哺乳动物，小鼠mAb轻和重链的CDR掺入第二种哺乳动物人中的重组DNA序列，呈现可用于转染哺乳动物细胞的框架，以表达有较小免疫原性并有该动物单克隆抗体之抗原特异性的重组抗体。
本发明进一步包括构建和表达经修饰的抗体的方法，该方法包括a)诱变并组装包括CDR和FR区域的可变区。较好地使用PGR诱变方法(Kamman et al.，Nucleic Acids Res，175404—5409，(1989))以在不同的位置引入改变。
b)制备包括一个可变区和相应的人恒定区的表达载体，在将其转染到细胞中后即导致分泌足可供亲和性和特异性检测的蛋白质。
c)将重和轻链表达载体共转染到适当的细胞系中。约两周后，用ELISA方法分析细胞上清液中有无人IgG产生。然后用任何已知方法分析样品中能够与特异性抗原结合的人IgG。
本发明提供了将动物单克隆抗体的CDR掺入似乎为天然人免疫球蛋白的框架中，从而使所得重组抗体在用于人时只有微弱免疫原性或无免疫原性的方法。当用于治疗目的时，重组体免疫球蛋白被较好识别为自身蛋白质。因为重组体抗体在给人使用时将是有微弱免疫原性的或无免疫原性的，所以该方法可使重组抗体作为治疗剂使用。
本发明还期望包括任何动物单克隆抗体向提供适当框架区之显现重组人的单克隆抗体的重组转化。
本发明意欲包括任何动物免疫球蛋白向显现人的免疫球蛋白的转化。另外还试图使显现人的免疫球蛋白不合有κ或λ轻链，或者下列任何重链异型(α、σ、ε、γ和μ)之一。
下列实施例旨在举例说明本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例1测得的IOR egf—R3单克隆抗体DNA序列的鼠可变区按Faloro等人(Faloro，J.et al.，Methods in Enzymology65718—749(1989))所述方法从大约106个R3(抗表皮生长因子受体)杂交瘤细胞中提取胞浆RNA。
cDNA合成反应混合物由5μgRNA、50mM TrisHCl pH7.5、75mMKCl、10mMDTT、3mMMCl2、25pmol重链可变区的CG2AFOR引物(5′GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3′)或轻链可变区的CK2FOR引物(5′GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3′)、各250μM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、15U核糖核酸酶抑制剂(RNA保护剂，Pharmacia)组成，总体积50μl。样品于70℃加热10分钟并经30分钟缓慢冷却至37℃。然后加入100单位MMLV反转录酶(BRL)并于37℃持续保温1小时。
使用Orlandi等人(Orlandi，R.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833—3837(1989))所述PCR扩增VH和VKcDNA。用于VH的PCR扩增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CG2A FOR (5′GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3′)和VH1BACK引物(5′AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3′组成。用VK的PCR扩增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CK2 FOR (5’GGAAGCTTGAAGATGGATA C AGTTGGTGCAGC3’)和KIOBACK(5’TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA3’)引物组成。向这些混合物中加入各2.5mM dATP、dCTP、dTTP和dGTP、5μl 10X嗜热酶(thermolase)缓冲液成分和1单位嗜热酶(IBI)，终体积为50μl。样品在94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟进行25次热循环，并于72℃持续保温5分钟。在Prep.A Gene纯化药盒(BioRad)上纯化扩增的VH和VK DNA。
将纯化的VH和VK cDNA克隆到M13载体中。使用T7DNA Pol(Pharmacia)经二脱氧方法测定克隆的序列。结果见图1。
实施例2嵌合基因的构建我们使用扩增VH的VH1 BACK(5′AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3′)和VH1FOR(5′TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3′)引物，和用于扩增VK的VK3 BACK(5′GACATTCAGCTGACCCA3′)与VK3FOR(5′GTTAGATCTCCAGTTTGGTGCT3′)引物，经PCR再次扩增cDNA。用Pst I和BstEII消化VH基因的扩增的cDNA，或用PvuII和Bg1II消化VK基因的扩增的cDNA。将消化的片段克隆到M13—VHPCR1(用PstI和BstEII消化过的)中或M13—VKPCR1(用PvuII和Bc1I消化过的)中。有关这些载体详见Orlandi等人的报导(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833—3837(1989))。经序列分析直接鉴定含有可变区基因的M13VHPCR—R3和M13VKPCR—R3。
经用HindIII和BamHI消化，从M13载体上切掉VH基因连同Ig重链启动子、适用的切接位点及信号肽序列，并克隆到表达载体(pSVgpt)中。然后加进作为BamH I片段的人IgG1恒定区(Takahashi，N.et al.，Cell 29718—749(1982)。所得到的构建体是R3VH—pSVgpt。R3VK—pSVhyg的构建方法基本相同，不同的是用潮霉素抗性基因取代gpt基因，并加入人κ链恒定区(Hieter，P.A.et al.，Cell 22197—207(1980))。
实施例3修饰IOR egf—R3鼠单克隆抗体的可变区序列以使预测的T细胞抗原序列人源化。
根据T细胞抗原序列分析IOR egf—R3之重和轻链的可变区序列。使用计算机AMPHI计算程序进行分析，推测带有两亲性螺旋结构的长度中序列11氨基酸的片段，该片段有一个疏水侧和一个与MHCII分子结合的亲水侧。
推测重链可变区序列上有5个片段，它们是(使用Kabat的序列编号)1.氨基酸3—13间的FR1，
2.氨基酸8—20间的FR1，3.氨基酸39—55之间的FR2和CDR2，4.氨基酸74—84间的FR3，5.氨基酸100c—110之间的FR4和CDR3。
图2显示相当于重链的序列。
将该鼠序列与包括在GeneBank和EMBL数据库中的免疫球蛋白序列相比较。确定最同源的人可变区序列并限定与小鼠序列最密切相似的人亚类序列。在这种情况下所发现的人序列是称为HUMIGHVA的胎儿免疫球蛋白，其可变区与鼠免疫球蛋白IORegf—R3的FR区有75％的同源性。
然后比较人和鼠可变区序列的残基，并选择出那些在FR区不参予游标带或与典型结构相关的残基。因此，它们可以被在人序列上同一位置的那些残基所改变。
最后，该分析用结合位点的计算机模型设计而得以充实。基于该分子模型有可能限定那些扰乱结合位点之三级结构的取代。
对于鼠IOR egf—R3的重链，我们提出6处取代1.11位上的LEU被VAL取代，2.12位上的VAL被LYS取代，只有这两处取代有可能破坏两亲性螺旋，因此推测的T抗原决定基在FR1处。
3.75位上的SER被THR取代，4.76位上的THR被SER取代，5.78位上的ALA被VAL取代，6.83位上的THR被ARG取代。
在这种情况下，取代提示在FR3中，其为人源化的。
FR2中的T细胞抗原序列包含两个PRO，而它们在大多数螺旋抗原位点中是很罕见的氨基酸残基，所以我们认为它不是真正的T细胞抗原决定基。
在FR4的108位中出现存在于某些人免疫球蛋白同一位置上的THR，在人免疫球蛋白中只有109位(LEU)是很罕见的，除了这一个点差异处，大多数推测的T细胞抗原决定基是人的，基于此不需要对其进行修饰。
图3中显示对鼠IOR egf—R3之轻链的分析结果。此序列中，推测相应于CDR2和FR3的残基52—63之间只有一个两亲性螺旋，并在这个区域中，鼠和人序列间在63位只有一个点差异。因为该鼠轻链对人应是非免疫原性的，故没有提出取代(见分子模型设计)。
实施例4mAb IORegf—R3 VK和VH的分子模型设计使用在150MHz Silicon Graphics Indigo Extreme工作站上运行的分子模型设计程序QUANTA/CHARm4.0(MolecularSimulations Inc.，(1994))，组构小鼠mAb IOR egf—R3可变区的模型。分别从Fab 26—10(Jeffrey，P.D.et al.，Proc Natl，Acad，Sci.USA，9010310(1993))和Fab36—71(Strong，R.K. et al.，Biochemistry 303739(1993))组构VK和VH框架。Fab 26—1O和mAb IOR egf—R3在VK框架中有92％同源性，在完整VK区中有88％同源性。Fab 36—71和R3 mAb的VH框架有85％同源性。从Brookhaven Protein Data Bank(入口II G1和6FAB)取得等同物(Coordinates)。将Fab 36—70的框架对接于Fab 26—10的架上，结果只有那些已发现常常卷入重和轻链可变区间界面中的残基相匹配(Chotia，C et al.，J.Mol.Biol.186651(1985))。然后，删除Fab 26—10的VH区和Fab 36—71的VK区以留下必须的杂合体。按最大交迭方法(Snow，M.E.et al.，Proteins 1；267(1986))进行侧链取代，并且在可能时与其他结晶结构相比较。
构成IOR egf—R3—可变轻(VL)区(L1，L2和L3)的高可变区而保留如Fab 26—10中一样的主链构象，因两种抗体中相应的CDR是高度同源的，并且都属于同一典型结构组群(Chotia，C.etal，Nature.342877(1989))。在mAb IOR egf—R3的VH区中，CDRH1同在Fab 36—71中一样属于典型结构组群1，所以保持了亲代分子的主链扭转角。CDR H2相当于典型结构组群2并且该环的主链构象是从Fv片段4D5(入口IFVC)取得的，因为其H2环基础与Fab 36—71的框架能良好匹配，所以它是从其他高分辨的结构中选择的。将所有上文提到的环与Data Bank中的其他CDR比较，以确定侧链的方向。
为了构建在mAb R3中有14氨基酸长的CDR H3模型，使用高温度分子动力学进行构象选择(Bruccoler，R.E.et al.，Biopolymers，291847(1990))。首先，对没有CDR H3的整个结构进行能量最小化处理以保持被固定的残基H—94和H—103，并对主链原子使用10Kcal/(mole原子A2)的谐振抑制。然后，从两个原先固定的氨基酸开始构成一个有随机构象的环。放置这些靠近框架的残基时考虑到其他晶体结构，并且构成有伸展构象的环的顶部，以避免与分子其他部分的强的空间作用。对于下一个模型设计步骤，只允许CDR H3和邻近侧链在5A°的距离内运动。首先完成能量最小化，然后在800K进行分子动力学运行150微微秒。运行的时间间隔定为0.001微微秒，并且每100次间隔存贮协调数据。提取从动力学运行中得到的120个最低能量构象，并使之受到使结构中所有原子均可运动的能量最小化限制。得到几个低能量构象并将其中一个有最低能量者用于继后的分析。就IOR egf—R3抗体的鼠和人变异体间的差异个别设计模型，以研究它们对CDR构象可能产生的影响。
重链可变区中11，12(FR1)和83(FR3)位的氨基酸取代距CDR—FR边缘足够远，并且对结合亲和性不应有任何影响。SER75残基指向外侧，因些被THR取代对结合能力似乎并不重要。相反THR76则易受分子顶部的影响，并且可能参予与抗原的相互作用。但是由SER取代THR 76是一个保守的改变，在结合亲和性上可能不会导致大的变化。
由VAL取代ALA 78将不需要空间重排。但VAL 78可能向前“推动”ILE 34(HI)。一般说来，根据计算机辅助的分子模型设计研究(图4)，所提出的点突变不应影响结合亲和性。
对IOR EGF—R3的轻链可变区作同样分析，分子模型设计表明于该区域的任何改变都是不必要的。
实施例5用PCR诱变法构建IOR egf—R3的突变体重链可变区使用PCR诱变技术(Kammann，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，864220—4224(1989))构成突变重链可变区氨基酸的改变。
简单地说，经PCR进行两次扩增反应混合物是0.5μl在M13中克隆的单股DNA的VH上清液、25pmole诱变的Oligo 1或2、25pmole诱变的Oligo 3或4引物(见下示引物序列)。向这些混合物中加入各2.5mM dATP、dCTP、dTTP和dGTP、5μl 10XVent聚合酶缓冲液(NEB)的成分及1单位Vent DNA聚合酶(NEB)，终体积为50μl。样品于94℃，30秒；50℃，30秒；75℃，1分钟进行12—15次热循环；并于75℃持续保温5分钟。将两次PCR的产物连接到第二个只使用外部引物(3和4)的PCR产物中。用Prep.A Gene纯化试剂盒(BioRad)纯化扩增的VH DNA。
为造成FR1中由VAL和LYS分别取代LEU11和VAL12的改变，所用引物是引物15′GAAGCCCCAGGCTTCTTCACTTCAGCCCCAGGCTG 3′引物35′GTAAAACGACGGCCAGT 3′这些引物合用于一个PCR中。引物25′CAGCCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCA 3′引物45′ACTGGCCGTCGTTTTAC 3′。这些引物合用在一个PCR中。
然后，两PCR的产物合用在一个使用引物3和4的PCR中。
为造成FR3中分别由THR、SER、VAL和ARG取代SER75，THR76、VAL78和THR86的改变，所设计的引物是引物15′GCAGAGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTGAGTTGCATGTAGACTGTGCTGGTGGATTCGTCTACCGT 3′，引物35′GTAAAACGACGGCCAGT 3′。这些引物合用在一个PCR中。引物25′ACGGTAGACGAATCCACCAGCACAGTCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACTCTGC3′引物45′ACTGGCCGTCGTTTTAC 3′。这些引物合用在一个PCR中。
然后，将两PCR的产物合并在一个使用引物3和4的PCR中。
诱变后，将VH基因克隆到表达载体(pSVgpt)中产生质粒IORegf—R3 mut VH—pSVgpt。
实施例6将DNA转染到NSO细胞中用Pvu I消化后，将4μg R3VH—pSVgpt和8μg R3VK—pSVhyg(嵌合体)或R3突变体VH—pSVgpt和鼠R3Vk—pSVhyg切成线性。将DNA混合在一起，用乙醇沉淀，溶解于25μl水中。使约107个NSO细胞(大鼠骨髓瘤NSO是不分泌Ig的细胞系)生长至半会合，离心收获细胞并连同经消化的DNA一起重新悬浮在电穿孔容器内的0.5ml DMEN中。在冰上放置5分钟后，在960μF下给细胞170V的单一脉冲(Gene—Pulser，Bio—Kad)，并继续在冰上放置30分钟。然后将细胞倒入20ml DMEN加10％胎牛血清中并使之复原24小时。此时将细胞分配到96小井平板中并加入选择培养基，14天后裸眼可见有转染的克隆。
实施例7人IgG产生的定量分析用ELISA方法检测含被转染克隆之小井的培养基中存在的人抗体。用羊抗人IgG(重链特异性的)抗体(Sera—Lab)包被微量滴定板的小井。用PBST(含有0.02％吐温20的磷酸盐缓冲盐水，pH7.5)洗涤后，向各小井中加入20μl在100μlPBST稀释的从含转化体小井中得到的培养基，于37℃保温1小时。然后排空各小井，用PBST洗并加入过氧化物酶结合的羊抗人к(轻链特异性的)区域抗体(Sera—Lab)，37℃保温1小时，然后排空各小井，用PBST洗并加入含邻苯二胺的底物缓冲液。几分钟后加入硫酸终止反应，并检测492nm吸光率。
实施例8EGF受体放射配基竞争试验用人胎盘微粒体部分，经同源性放射受体分析方法(RRA)(Macias，A.et al.，Interferony Biotechnologia 2115—127(1985))检测鼠IOR egf—R，嵌合抗体和经破坏抗原决定基T突变的抗体对与其受体结合的125I—EGF的亲和常数和影响。
使用该技术检测嵌合抗体和破坏抗原决定基T抗体的突变体结合EGF—R的能力(图5)。两种抗体均以如原始鼠抗体的同样亲和力(1O—9M)与EGF—R结合，进一步证实已克隆了正确的小鼠可变区，并且新的抗体异型没有影响结合。进一步说，突变抗体中的改变并没有影响与抗原的结合。
实施例9用鼠抗体、嵌合抗体和VH突变抗体免疫CercopithecusAethiops猴三个处理组各有2只Cercopithecus aethiops猴，各组分别用鼠IOR egf—R3 mAb、嵌合IOR egf—R3抗体和突变VH IOR egf—R3抗体免疫。在0、14、28和42天，用2mg吸附到5mg氢氧化铝上的抗体经皮内注射免疫各组动物。第—次免疫前和每次免疫后1周从所有各组动物体内采血，从每份样品分离血清并于-20℃保存。以ELISA技术检测抗鼠IOR egf—R3 mAb之抗体的滴度。
用50μl鼠IOR egf—R3单克隆抗体(在碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中浓度为10μg/ml)包被Costar平板(Inc.highbinding)，并保温过夜。然后用PBST洗平板，用含有1％BSA的同样缓冲液于室温下封闭1小时。
重复洗涤步骤并加入50μl/小井不同的血清稀释液。37℃保温2小时后，再次洗平板并加碱性磷酸酶结合的抗人IgG Fc区域特异性抗血清(Sigma，Inc.)37C保温1小时。用PBST洗涤后各小并加50μl底物缓冲液(在二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中稀释的1mg/ml对硝基苯磷酸)保温。在ELISA记录仪(Organon Teknika，Inc.)中读出405nm吸光率。
当使用该抗体作为免疫原时得到对鼠IOR egf—R3抗体的高IgG反应。当用嵌合抗体免疫猴时，与用突变体VH译本免疫相反，得到较低的但仍可检测到的抗鼠IOR egf—R3抗体的IgG反应(1/10,000)(图6)。用突变的VH IOR egf—R3抗体免疫二次后没有检测到抗体反应，且在经4次免疫后只测得很小的反应(1/10,000)。
实施例10修饰IOR—T1鼠单克隆抗体的可变区序列以使推测的T细胞抗原序列人源化分析IOR—T1重和轻链可变区序列的T细胞抗原序列。
预测了重链可变区上的3个片段，它们是1.氨基酸2—21间的FR—1，2.氨基酸29—43间的FR1，CDR1，FR2，3.氨基酸97—111间的FR4、CDR3。
图7中显示与最同源的人序列的比较和所提出的取代，在FR1上5处，FR2上2处，FR4上2处。
对于轻链(图8)以同样方法提出下列T细胞抗原片段1.氨基酸60—65间的FR3，2.氨基酸79—90间的FR3、CDR3，3.氨基酸93—95A间的CDR3。
分析后，我们提出在FR3中的60，63，83，85和87位上的5处取代。
实施例11修饰I0R—CEA1鼠单克隆抗体的可变区序列，以使推测的T细胞抗原序列人源化分析IOR—CEA1重和轻链可变区序列中的T细胞抗原序列。
推测重链可变区上的2个片段，它们是1.氨基酸1—16间的FR1，2.残基96—110间的FR4和CDR3。
图9中，显示与最同源的人序列的比较，和所提出的取代，其FR1上7处(在2，3，5，6，9，10和15位)且在FR4上2处(在108和109位)。
对轻链作同样分析(图10)，提出下列T细胞抗原片段
1.氨基酸1—14间的FR1，2.氨基酸55—70间的FR3—CDR2，3.残基74—100间的FR—3—CDR 3—FR4。
分析后，我们提出FR1中9，10，11和13位上的4处取代，FR3中58，60，63，70，75，76，78，81，83，85和87位上的11处取代，以及FR4中100位上的1处取代。
实施例12分析免疫球蛋白家族的可变区中的两亲性片段AMPHI程序以子程序的形式被包括在一个为阅读和加工来自Kabat数据库的免疫球蛋白序列而编制的程序中。在加工序列中制得下列重排—将未限定的GLX型氨基酸(可能是GLN或GLU)限定为GLN(GLN和GLU有相似的亲水性(hydrofilicity)指数分别为—0.22和—0.64)。
—将未限定的ASX型氨基酸(可能是ASN或ASP，分别具有—0.60和—0.77的亲水指数)限定为ASN。
—其他未限定的氨基酸(序列中的空位或“奇形”符号)被限定为XXX(未知)。对该氨基酸，程序AMPHI指定亲水值为0.0。
该分析中不包括有5个以上未知氨基酸(XXX)的序列。
该初步分析后，用程序AMPHI处理各序列，并且对每个免疫球蛋白家族以表格形式示出所得结果。
表I至VI中显示对6个小鼠重链家族的分析结果。基于那些数据，可以限定“优势两亲性区域”(PAR)在90％以上的可变区序列属于每个家族。例如，比较框架结构1(FR1)，家族I和II的PAR可限定在11和16个氨基酸残基之间，相反，家族III和IV一般从第1个氨基酸到第30个氨基酸没有两亲性区域。在家族V和VI中，较小的PAR可分别限定在12—14和12—15个残基。
PAR的人源化将降低在病人体内的免疫原性。两亲性区域群集在免疫球蛋白可变区框架中，支持所提出的方法的普遍适用性，即通过几个点突变使这些预测的T细胞抗原决定基人源化。
小鼠重链族I名称 5 10 1520 25 30 35 40 45 5055 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-TF5-139′CL ** ****** *** **--************* ***2-E7′CL** ****** *** **--************* *---------*******3-DFB-6l11′** ****** *** **--************* *----------******4-BALB/C121 ** ****** *** **--*************5-MOPC 450′C ** ****** *** **--************* ********** *** ***6-TF2-36′CL** **--************* ***** ********7-D35′CL ** ****** *** **--************* ** ***8-A/J GERMLI** **********--*************9-H37-92′CL** ****** *** **--*************---*****10-H37-85′CL********** *** **--*************11-36-60 CRI-** **********--******* ******12-JD31′CL ** ****** *** **--************13-H37-78′CL** ****** *** **--*************---*********14-H37-68′CL** ****** *** **--*************---*** *---------*******15-D7′CL** ****** *--*************16-42.7C.11.2*************--************ *****----------------*****17-42.BE.9.2′ *************--************ *****----------------*****18-H37-96′CL** ****** **--************* ****19-HF5.49′CL** **********--******************20-H37-24′CL** ****** *** **--*****************21-H37-42′CL***** *** *******---* *******22-42.7B3.2a′ *************--*****************---------------*****23-A10′CL ** **********--******* *******24-H37-88′CL** ****** *** **--***********25-JD21′CL *** **********--******* ******26-L69′CL ****** *** ************ **----------** ***27-VMS9′CL ********* **--****** ***********--* ***28-264″CL ********* **--****** ***********--***********29-VFM11′CL ********* **--****** ***********--* ***30-VMS2′CL ********* **--****** ********* ******31-VFM1′CL ********* ********* ******32-VMS1′CL *********** **** **** ***33-N-T151′CL****** ** *********--------*****
表2小鼠中链族II名称 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 5560 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-LB8′CL ****** *-***************------------******2-DF4-29.4′ ** **** *-************ *** ***3-mAb D′CL ****** *-***************** ****4-BAT123′CL ****** *-************ *****--------------****5-35-20 ****** *-******************6-AN02*********-************7-AN02′CL*********-************8-40-120 ****** *-*************---***** ***------------*******9-40-40 ****** *-*************---***** ***------------*******10-H146-24E9** ****** *-*** ***********11-AN07′CL ** ****** *-****** *****12-40-160 ****** *********-********* ***---******------------*******13-S1.2′CL****** *-*************---***** **--------------*****14-40-140 ****** *-*** *******---***** ***------------*******15-37.1.1′CL ****** ****-************------------*****16-GAM3-2′CL ******* *-*** ****** ********------------***17-8-1-12-58′ ****** *-************ ******-------------------------*******18-S27′CL ****** *-************ **--------------*****19-AN03′CL****** ****-************ **----------******20-L11-1A1′CL ****** *-**************--******21-AN01′CL****** ****-************ *---------******22-VHIF′CL****** *-*** ****** *** **----------*****23-MOPC 315′C ****** *****-***************** *******24-MOPC315 ****** *****-************ *** *****
表3小鼠重链族III名称 5 10 15 20 25 30 35 40 45505560 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-H220-22′CL **--*** *** ********* ***2-DB1-453.2 **--*** *** ***3-H61-15′CL**--*** *** ******* ***4-1G7′CL **--*** *** ***5-NQ2 20.5.3**--*** *** ***6-E′CL **--*** *** ***7-NQ5 4.3.1′ **--*** *** ***8-NQ2 17.4.1**--*** *** ***9-H26′CL **--*** *** ***10-18G8′CL **--*** *** ****** **--------------**11-NQ5 61.1.2*** *** ****12-NQ2 48.2.2**--*** *** ***13-9G6′CL **--*** *** *** **--------------*14-3B6′CL **--*** *** ***15-2B2′CL **--*** *** ***16-F5-1419′CL **--*** *** ***17-E3′CL*** *** ***-------* ***18-20G9′CL **--*** *** ******19-3E3′CL **--*** *** ***20-12G10′CL **--*** ***21-5.4K 1y p′ **--*** ****--------**** ***22-17s.145′CL **--*** *** *** ******23-NC19FB′CL**--****** *** *** ***24-NPYI-125.3 *** **--*** *** *** *** **** ***25-NPYII-14.1 *** **--*** *** ***** ***-----------*****26-Lym-1′CL **--*** ****27-18-2-3′CL**--*** *** *********-------* *** ***28-PJ14′CL **--****** *** **** ****29-185.6′CL ******* **** *******30-185.6′CL ******* **** *******31-48.2.1′CL *** *** *** ***32-D1.3 **--****** *** *** ****33-PCG1-1′CL ***** *** **** **** *--------** ****34-F5-1336′CL **--****** *********---------**35-F5-444′CL ****--****** ****** *******--------*****36-F5-1126′CL ****--****** **********--------*****37-VD2H9′CL*** *** *** ***38-MOPC141J′CL **--****** *********---*******33-NPYII-269*** **--****** *** *****40-H220-22′CL **--*** *** *** ****** ***
表4小鼠重链族IV名称51015 20 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 8085 90 95 100 1011-FAC1′CL *** ** ***2-D23′CL *********3-AB.1′CL *** ****-------------*******4-AB.2′CL *** *** *****---------*****5-JV10′CL*** *** ********6-MA-1505′CL **** *** *****-------------*****7-163.69′CL *** **-----------*******8-Mik-81(Fv) **** *** ***-----------**9-VH101′CL*** *** ***----------***10-MC101′CL*** *** ***----------***11-BPPI-6.4′C *** ***12-36.1.2D′CL *** **** ******13-36.5.7Bu′C *** **** ******
表5小鼠重链族V名称 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-HDEX31 **** ****--****** *** *** ***2-MOPC104E **** ****--****** *** *** ***3-HDEX1**** ****--****** *** ****----------******4-HDEX25 **** ****--****** *** *** ***5-HDEX4**** ****--****** *** *** *****6-HDEX7**** ****--****** *** *** ***7-HDEX5**** ****--****** *** ****----------*****8-HDEX6**** ****--****** *** *** ***9-HDEX11 **** ****--****** *** *** *****10-HDEX3**** *****--***** *** *** ***11-HDEX24 **** ****--****** *** ****----------*****12-J558 **** ****--****** *** *** ***13-HDEX37 **** ****--****** *** ****----------*****14-HDEX2**** ****--****** *** *** ***15-HDEX12 **** ****--****** *** *** ***16-414.2′CL**** ****--****** ******** ****----------*****17-262.9′CL**** ****--****** ***** *** ***18-126.33′CL **** ****--****** ***** *** ****----------*****19-9.14.7′CL *******--****** *** ***20-HDEX10 **** ****--****** *** *** ***21-HDEX14 **** ****--****** *** *** ***22-16.3′CL **** ****--****** ***** **** ***23-HDEX9**** ****--****** *** *** ***24-AC38 205.1 *******--****** *** *** ***---------******25-9.4.5′CL*******--****** *** ****--------*******26-4.1.3C4′CL *******--****** *** ******* ***27-3.2.3E5′CL *******--****** *** *** ***28-45.21.1′CL *******--****** *** ***29-4.8.1′CL*******--****** *** *** ***30-3.4.1G6′CL *******--****** *** ***31-42.5D4.2a′ *******--****** *** *** *******32-4.3F1′CL*******--****** *** ***33-37.1E5.2a′ *******--****** *** ***34-59.102.2′C *******--****** *** ***35-2.31.1′CL *******--****** *** ****---------** ***36-MRA1OH′CL **** ****--****** ******** ** *****37-165.60′CL **** ****--****** ******** ** *******38-A5.B12.1′C *******--****** *** *** **---------** ***39-A6/24′CL ****--****** *** *** **---------******40-163.72′CL******* ****--****** ******* *** ********---------******41-17s.93g′CL **** ****--****** ******** ** ***42-A20/44′CL ****--****** *** ***43-106-10E′CL ***********--****** ******** **44-I.29′CL **** **** *********--****** *** ********* ***45-L1.15′CL**** **** *********--****** ***46-HDEX8**** ****--****** *** *** ***
表6小鼠重链族VI名称 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 5560 65 70 7580 85 90 95 10010l1-202.135′CL ******* **********--****** *** ****----------*******2-202.61′CL******* **********--****** *** *** **-----------******3-202.80′CL******* **********--****** *** *** *******4-202s.38′CL ******* **********--****** *** *** *** ***5-111.34′CL******* **********--****** *** *** ** ***6-111.109′CL********** **********--****** *** ******* *----------***7-17p.101′CL********** **********--****** *** *******---------------** ***8-C′CL ******* **********--****** *** **********9-AN11′CL ******* **********--****** ******* ***10-D44′CL **** **** **** **********--****** *** *** ***11-D14A031VH ******* **********--*********** *** ***12-AM29′CL **** ** *********** *** ******--------** ***13-AM28′CL ******* ******** *--******* *** ******--------** ***14-BWR4.H′CL*********** *** **-------------******15-D444′CL ******* *********--****** ******** **---------------******16-PL2-8′CL **** **** ***** *** ***---------*****17-PL2-3′CL ********* *** *** ***---------*****18-PL2-6′CL ********* *** *** ***---------*****19-34-28′CL ******* **********--** ******
权利要求
1.鉴定免疫球蛋白的T细胞抗原序列上哺乳动物种特异性氨基酸残基的差异的方法，包括a.比较第一种哺乳动物的可变区框架氨基酸与第二种哺乳动物的可变区的框架氨基酸；b.确定与第一种哺乳动物最密切对应的第二种哺乳动物的亚群；c.确定最相似于第一种哺乳动物序列的第二种哺乳动物序列；d.鉴定不同于第二种哺乳动物之氨基酸残基的第一种哺乳动物的氨基酸残基，其中所说的氨基酸是在免疫球蛋白可变区中的T细胞抗原序列上；e.只鉴定不在互补区域内或不直接与典型结构或游标带相关联的那些氨基酸残基。
2.根据权利要求1的方法，其中第一种哺乳动物是小鼠。
3.根据权利要求1的方法，其中第二种哺乳动物是人。
4.将具有第一种哺乳动物之免疫原性的免疫球蛋白转化成具有第二种哺乳动物之免疫原性的抗体的方法，包括用按权利要求1方法鉴定的最相似的第二种哺乳动物的相应氨基酸残基取代第一种哺乳动物框架中不同于第二种哺乳动物之氨基酸残基的氨基酸残基。
5.根据权利要求4的方法，其中第一种哺乳动物是小鼠。
6.根据权利要求4的方法，其中第二种哺乳动物是人。
7.一种方法，包括a.制备编码对已知抗原有特异性的经修饰的免疫球蛋白的DNA序列，其中不同于第二种哺乳动物同一位置上的氨基酸残基的第一种哺乳动物的T细胞抗原序列上的某些残基被按权利要求1的方法鉴定的最相似的第二种哺乳动物的相应氨基酸残基取代；b.将该序列插入经操作连接到与宿主细胞相容之适当启动子上的可复制的表达载体中；c.用b的载体转化宿主细胞；d.培养该宿主细胞；e.从宿主细胞培养物中回收经修饰的免疫球蛋白。
8.根据权利要求7的方法，其中第一种哺乳动物是小鼠。
9.根据权利要求7的方法，其中第二种哺乳动物是人。
10.一种包含对已知抗原有特异性之修饰的免疫球蛋白的组合物。
11.编码识别EGF—R之鼠IOR—R3抗体的DNA序列。
12.编码按权利要求1、4和7的方法得到的经修饰之嵌合IOR—R3抗体的DNA序列。
13.按权利要求1、4和7的方法得到的表现有人抗体之抗原性的经修饰的嵌合IOR—R3抗体。
14.根据权利要求13的经修饰的嵌合IOR—R3抗体，其重链框架区中有下列点突变FR1.11位LEU由VAL取代，12位VAL由LYS取代，FR3.75位SER由THR取代，76位THR由SER取代，78位ALA由VAL取代，且83位THR由ARG取代。
15.包含根据权利要求13的经修饰的嵌合单克隆抗体的药物组合物。
16.编码按权利要求1、4和7的方法得到的经修饰的嵌合IOR—T1抗体的DNA序列。
17.按权利要求1、4和7的方法得到的表现有人抗体之抗原性的经修饰的嵌合IOR—T1抗体。18.根据权利要求17的经修饰的嵌合IOR—T1抗体，其两链的框架区域中有下列点突变重链FR13位上LYS被GLN取代5位上VAL被LEU取代6位上GLN被GLU取代13位上LYS被GLN取代19位上LYS被ARG取代FR240位上THR被ALA取代42位上GLU被GLY取代FR4108位上THR被LEU取代109位上LEU被VAL取代轻链FR360位上ASP被ALA取代63位上THR被SER取代83位上LEU被PHE取代85位上GLU被VAL取代87位上PHE被TYR取代。
19.包含根据权利要求17之经修饰的嵌合单克隆抗体的医药组合物。
20.编码按权利要求1、4和7的方法制得的经修饰之嵌合IOR—CEA1抗体的DNA序列。
21.按权利要求1、4和7的方法制得的表现有人抗体之抗原性的经修饰的嵌合IOR—CEA1抗体。
22.根据权利要求21的经修饰的嵌合IOR—CEA1抗体，其两链的框架区域中有下列点突变重链FR12位上的PRO被VAL取代3位上的LYS被GLN取代5位上的LEU被VAL取代6位上的GLU被GLN取代9位上的GLY被ALA取代10位上的ASP被GLU取代15位上的GLU被GLY取代FR4108位上的THR被LEU取代109位上的LEU被VAL取代轻链FR19位上的LYS被SER取代10位上的PHE被THR取代11位上的SER被LEU取代13位上的THR被ALA取代FR358位上的VAL被ILE取代60位上的ASP被SER取代63位上的THR被SER取代70位上的ASP被GLU取代75位上的ILE被VAL取代76位上的SER被ILE取代78位上的VAL被LEU取代81位上的GLN被ASP取代83位上的LEU被PHE取代85位上的GLU被THR取代87位上的PHE被TYR取代FR4100位上的ALA被GLN取代。
23.包含根据权利要求21或22的经修饰的单克隆抗体的药物组合物。
24.根据权利要求13、14、17、18、21和22的经修饰的嵌合单克隆抗体的治疗应用。
25.根据权利要求13、14、17、18、21和22的经修饰的嵌合抗体用于制造抗肿瘤药物。
26.包括衍生于第一种哺乳动物的重和轻链可变区及衍生于第二种哺乳动物的重和轻链恒定区的经修饰的嵌合抗体，其中在T细胞抗原序列内重链可变区或轻链可变区，或两者被修饰，以使此氨基酸序列与衍生于所说的第二种哺乳动物之抗体相应区域中的氨基酸序列相适应，并除外在互补决定区中的修饰，以及在框架区内典型结构或游标带中的修饰。
27.包括衍生于第一种哺乳动物的重链可变区和衍生于第二种哺乳动物的重链恒定区的经修饰的嵌合抗体重链，其中T细胞抗原序列内的重链可变区被修饰，以使此氨基酸序列与衍生于所说的第二种哺乳动物之抗体的相应重链区域中的氨基酸序列相适应，但除外在互补决定区的修饰以及在框架区内典型结构或游标带中的修饰。
28.包括衍生于第一种哺乳动物的轻链可变区和衍生于第二种哺乳动物的轻链恒定区的经修饰的嵌合抗体轻链，其中T细胞抗原序列内的轻链可变区被修饰，以使此氨基酸序列与衍生于所说的第二种哺乳动物之抗体的相应轻链区域中的氨基酸序列相适应，并且其中除外在互补决定区中的修饰以及在框架区内的典型结构或游标带中的修饰。
全文摘要
本发明涉及鉴定免疫球蛋白的T细胞抗原序列上哺乳动物种特异性氨基酸残基的差异的方法，它包括a.比较第一种哺乳动物和第二种哺乳动物的可变区框架氨基酸；b.确定与第一种哺乳动物最密切对应的第二种哺乳动物的亚群；c.确定最相似于第一种哺乳动物序列的第二种哺乳动物序列；d.鉴定不同于第二种哺乳动物之氨基酸残基的第一种哺乳动物的氨基酸残基。
文档编号C07K19/00GK1133886SQ95109148
公开日1996年10月23日 申请日期1995年6月30日 优先权日1994年6月30日
发明者R·P·罗德里古, C·M·德考思塔·戴里奥, J·L·瓦拉达列 申请人:分子免疫中心