专利名称：：用于免疫测定的氨甲酰氮酰肼的制作方法
背景技术：
：发明领域本发明涉及共价连接到聚合物颗粒试剂上和用作抗原的新氨甲酰氮化合物，包括其制备，特别涉及具有亲核特性的氨甲酰氮化合物。
背景技术：
：的描述在美国专利号2,948,718中对氨甲酰氮进行了描述。它是用作为止痛和避免或消除抽搐的抗惊厥药物，当用该药如氨甲酰氮对病人进行治疗时，监测病人血清中药物的水平是重要的。在美国专利号3,221,011中描述的各种氨甲酰氮即二苯并氮杂卓衍生物是用于肠内或肠胃外给药的药物制剂，它们具有下面的通式结构其中，Am可以表示为基团-NH2，一甲基氨基，一乙基氨基，一正丙基氨基，一异丙基氨基，一正丁基氨基，一异丁基氨基，或一叔丁氨基基团，二甲基，二乙基，二正丙基，二异丙基，二正丁基，因为它没有合适的亲核部分，所以它不是适合于连接到美国专利号为4,401765和4,480,042的亲电子环氧化物聚合物颗粒上的候选物。本发明的目的是提供用于监测病人血清中氨甲酰氮的免疫测定中共价连接到颗粒上的新氨甲酰氮化合物，本发明的另一个目的是提供用于竞争免疫测定和测定病人血清中氨甲酰氮的其它免疫测定的氨甲酰氮抗体产生的氨甲酰氮免疫原，本发明的最后目的是提供新氨甲酰氮化合物的制备方法。发明概述本发明的目的是提供具有下列通式的适合于共价连接到颗粒试剂上或由蛋白质性质的物质上的新氨甲酰氮酰肼化合物，本发明还提供了用于氨甲酰氮免疫原产生的适合于连接到蛋白质上的新氨甲酰氮酸化合物，本发明的氨甲酰氮抗原具有下列通式结构其中X是C＝O，CH2，或SO2；Y是C＝O，CH2，SO2；R是烷基和P是蛋白质或半抗原。本发明还包括可以用于制备氨甲酰氮抗原的方法，方法一般包括步骤(i)在基本上无氧的环境中，使三光气与亚氨基均二代苯烯反应，(ii)在基本上无氧的环境中，加入一水合肼并使其回流，其回流时间为足以使具有上述结构式的氨甲酰氮酰肼化合物形成沉淀，(iii)将沉淀过滤，(iv)优选在碱存在下，使纯化的沉淀与选自于琥珀酸酐、溴代乙酸、和卤素取代的脂族磺酸基团反应，反应时间为足以使具有下式结构的氨甲酰氮酸形成，其中X选自于C＝O，CH2，和SO2.，Y选自于C＝O，CH2，和SO2，和R是烷基，(v)溶解氨甲酰氮酸，并在碱存在下，使溶解的氨甲酰氮酸与碳酸琥珀酰亚氨基酯反应来合成氨甲酰氮-NHS酯，和(vi)使氨甲酰氮-NHS酯与蛋白质的缓冲水溶液反应。或选择代替使溶解的氨甲酰氮酸与碳酸琥珀酰亚氨基酯反应和后来的(v)-(vi)步骤，通过选择下列步骤可以进行该方法(v)将氨甲酰氮酸和水合羟基苯并三唑溶解在溶剂中，(vi)使混合物与二环己基碳化二亚胺混合，得到活化的氨甲酰氮-羟苯并三唑酸，和(vii)使活化的氨甲酰氮-水合羟基苯并三唑酸与蛋白溶液反应。本发明进一步包括氨甲酰氮颗粒试剂和在免疫测定中使用该试剂的方法。优选的实施方案描述本发明的新氨甲酰氮酰肼化合物为共价连接到亲电聚合物颗粒上提供了在此以前没有得到过的优异的亲核氨甲酰氮。任何亲电颗粒试剂都可以共价连接到本发明亲核氨甲酰氮化合物上。优选的颗粒试剂是聚合物颗粒，并最优选具有内芯和外壳的聚合物颗粒，其中内芯是在氘化钠线型波长下测量具有不少于1.54折射率的聚合物，外壳是烯化未饱和单体的聚合物，该单体具有能与生物特性的化合物如本发明的氨甲酰氮酰肼化合物的互补官能团反应的官能团。例如，聚合物颗粒的外壳聚合物的官能团通常可以是环氧，羧基、氨基、羟基和醛。用于描述本发明的官能团将是环氧官能团，这仅是为了说明本发明的优选方案并不是为了限定可以附着到本发明氨甲酰氮化合物上的颗粒试剂的范围。此外，特性官能团例如，环氧官能团，聚合物表面或外壳可以进一步包括其它烯化未饱和单体，其量足以产生所需特征的水不溶聚合物颗粒。外壳可以是均聚物，在内芯存在下，它可以通过聚合作用而形成，并且，如果不是均聚物，应当包括不大于10、优选不大于5份重量内芯的单体，优选用于本发明的聚合物颗粒直径可以大约在0.03-0.1μm。直接或通过蛋白质性质的物质使颗粒试剂共价连接到生物特性的化合物或其抗体上。被用于制备聚合物的单体和其制备方法被描述在美国专利4401765和4480042中，这两个专利的内容在此引入作为参考，优选对于具有环氧官能团颗粒的单体包括异丁烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、乙烯基缩水甘油基醚，和甲代烯丙基缩水甘油基醚。亲核氨甲酰氮酰肼和氨甲酰氮酸(CBMP-酸)的合成和其免疫原通常进行如下下列表1中列出了用于实施例1和2的试剂。表I</tables>实施例1三光气与亚氨基均二苯代乙烯反应1〕将0.9650g(0.0050mol)化合物I(亚氨基均二苯代乙烯)，0.5441g(0.00183mol)化合物II(三光气)和30ml作为溶剂的甲苯加到配备有回流冷凝装置、附加漏斗和氮气入口管的100ml三颈烧瓶中。搅拌混合物并在氮气氛下使其回流超过2小时，直到溶液变成淡黄色为止。如果回流2小时后颜色没变化，应当加入40mg三光气，并使其回流1小时以上。将含有化合物III的溶液冷却至室温。2〕伴随着搅拌，将1.250g一水合肼(0.02497mol)加到含有上述溶液的三颈瓶中，然后，在氮气氛下使反应物回流2小时，并在室温下，将其搅拌2小时，然后，将混合物冷却至室温，产生完全的沉淀，将沉淀过滤得到白色(淡黄色)固体化合物IV。3〕将步骤2〕中固体沉淀物，即化合物IV溶解在30ml氯仿中以纯化化合物IV，用INHCl(10ml×3)萃取氯仿。产物是在HCl溶液中。用氯仿(10ml×3)洗涤HCl溶液，然后将2N氢氧化钠加到HCl溶液中并将PH调至11。用氯仿(15ml×3)萃取碱溶液，用硫酸钠(2-3g)干燥氯仿溶液。通过旋转蒸发除去氯仿并剩下纯化的产物，即化合物IV。产物经真空干燥后，其重量是0.9661g，表明从亚氨基均二苯代乙烯得到化合物IV的产率是76.9％。具有附加胺官能团的化合物IV(酰肼氨甲酰氮)可以共价被键接在聚合物颗粒上，如键连到蛋白质性质的物质如蛋白质或半抗原上的上述和美国专利4,401,765和4,480,042中描述的颗粒，或进一步处理形成的氨甲酰氮酸(上述化合物V)，实施例12说明了氨甲酰氮颗粒试剂的制备。实施例2通过使化合物IV与琥珀酸酐反应制备氨甲酰氮酸1〕将0.5g(0.0019897mol)化合物IV和0.404g(0.0040mol)三乙胺溶解在30mlTHF中，伴随着搅拌，将0.1990g琥珀酸酐(0.001990mol)的10mlTHF溶液加到化合物IV溶液中。在室温下，搅拌混合物过10小时，用硅胶TLC和85％EtOAc/15％EtOH溶剂的薄层液相色谱(TLC)监测反应，直到化合物IV消耗尽。化合物IV和CBMP-酸，化合物V的Rf值分别是0.5-0.6和0-0.1。2〕通过旋转蒸发除去THF，并将残余物溶解在30ml氯仿中。用0.1N氢氧化钠(10ml×3)从溶液中萃取产物(氨甲酰氮酸)。然后，用氯仿(10ml×3)洗涤NaOH溶液。用1NHCl酸化NaOH溶液，直到达到PH2-3。用氯仿(15ml×3)萃取酸溶液，然后用硫酸钠(2-3g)干燥氯仿溶液。通过旋转蒸发除去溶剂，得到产物CBMP-酸。真空干燥后，通过称重产物并将其重量与上述加入的化合物IV的重量比较来测定化合物IV对于CBMP-酸的百分产率。如果用另一种连接物代替琥珀酸酐，那么X和Y的成分能够被改变。例如为了得到其中X是CH2和Y是C＝O的CBMP-酸，则用溴代乙酸(BrCH2COOH)代替实施例2步骤1的琥珀酸酐。合成氨甲酰氮免疫原下表II列出了用于实施例3-7所用的试剂表II<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="572">分子量(FW)W(g)molCBMP-酸，V351.31.930.01磷酸丁二酰亚胺(DSC)256.22.970.01三乙胺(TEA)50.061.500.03DMF(溶剂)KLH，钥孔血蓝素PSG，南瓜子球蛋白卵清蛋白</table></tables>实施例3合成CBMP-NHS酯(化合物VI)1〕DSC储液制备如下将213.08mgDSC称入8ml管形瓶中，将5,281mgDMF加入其中。搅动混合物至DSC溶解，通过对1000μL等分称重测定溶液的密度。常用的密度是d＝0.97458mg/μL，由下列等式计算DSC浓度CDSC＝([DSC重量]×溶液密度}/{[DSC分子量]×[溶液重量]}＝[213.08mg×0.97458mg/μL]/[256.2×5494.08mg]＝1.475×104mmoles/μL2〕将75.0mg(0.2135mmole)CBMP-酸称入6ml管形瓶中，将磁力搅拌棒加入其中。吸取1450μL无水DMF溶解CBMP-酸，吸取步骤1的1592.2DSC储液和75μL无水三乙胺到上述溶液中，在室温下黑暗中，搅拌混合物1小时，得到化合物VI(CBMP-NHS酯)，如果不需要储液，例如一次性过程，则在步骤1〕中，使用表II所列出的试剂量。合成CBMP-蛋白质免疫原实施例4钥孔血蓝素缓冲溶液1〕水中的钥孔血蓝素(KLH)在冷室4℃下，将150mg的KLH(从西格玛公司购得)溶解在40ml离心管中的24ml去离子水中，温和搅拌过夜.将该管进行离心，并将悬浮液倒入1-盎司(OZ)螺旋盖帽瓶(用作为共轭合成的反应器)中，然后，贮存于冰箱中。2〕4-乙基吗啉(4-EM)缓冲浓缩液(1.25M)将6.25ml1.00NHCl吸入10ml体积的烧瓶中，因为产生放热，所以于冰中冷却烧瓶并小心地加入591μL的4-EM。加样完成后，使烧瓶的内容物达到室温，用水将溶液精确地稀释到10.00ml并彻底混合。3〕KLH的50毫摩尔4-EM缓冲液使用前，将KLH/水溶液从冰箱中迅速移出，并加入磁力搅拌棒，快速搅拌溶液并在进行共轭合成以前，加入步骤2〕中的1000μL4-EM浓缩液。实施例5南瓜子球蛋白(PSG)的4MNaCl/0.15MNaHCO3液1〕4MNaCl/0.15MNaHCO3液将23.40mg氯化钠和1.26g碳酸氢钠称入100ml体积的烧瓶中，然后，用去离子水将其精确溶解至100.0ml。2〕PSG的4MNaCl/0.15MNaHCO3液将150mg南瓜子球蛋白溶解在具有磁力搅拌棒的1-盎司(OZ)螺旋盖帽瓶中的25ml4M氯化钠/0.15M碳酸氢钠溶液中，在进行共轭合成以前，对溶液进行搅拌。实施例6卵清蛋白的0.15MNaHCO3液1〕0.15MNaHCO3液称取重为1.26g的碳酸氢钠，并且加到100ml体积的烧瓶中，然后，用去离子水将其精确溶解至100.0ml。2〕卵清蛋白的0.15MNaHCO3液将150mg卵清蛋白(购自SigmaCorp.)溶解在具有磁力搅拌棒的1-盎司(OZ)螺旋盖帽瓶中的25ml0.15M碳酸氢钠溶液中，在进行共轭合成以前，对溶液进行搅拌。实施例7CBMP-酸与蛋白质的共轭作用1〕伴随着搅拌，将实施例3的1020.0μLCBMP-NHSDMF溶液吸入实施例4，5和6的各蛋白缓冲液中，搅拌反应混合物10分钟，然后，贮存在4℃的冷室下过夜，如果溶液出现雾状则将溶液轻微摇动。2〕将各溶液对去离子水透析，换三次水，然后对磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲液透析，换三次缓冲液。根据用蛋白质的重量(mg)除以溶液总体积(ml)数来计算各蛋白质-氨甲酰氮偶联溶液的浓度。通过下列所示另一方法能够合成氨甲酰氮免疫原，因为对下列所示方法估计的产率高于实施例3和7方法所得到的产率，所以优选下列所示方法。当如实施例3和7所用的DSC/DMF使CBMP-酸偶联到蛋白质上时，由于产生高度的分子内环合作用而使其产率较低，环合产物是无活性的，因此，不适合作免疫原。用上述TLC方法测定环合作用的程度。下表III列出了用于实施例8-10的试剂表III实施例8合成CBMP-OBt酯合成CBMP-OBt酯1〕将23.71mg(0.0675mmole)CBMP-酸和12.41mg(0.0810mmole)HOBt称入2ml管形瓶中，加入磁力搅拌棒。将300μL无水DMF吸入管形瓶中溶解CBMP-酸和HOBt。2〕伴随着搅拌，将13.9lmg(0.0675mmole)DCC称重并加入步骤1〕溶液中。3〕在室温下，将反应混合物搅拌2小时，活化的酸准备与蛋白质偶联。合成CBMP-蛋白质免疫原实施例9卵清蛋白的0.15MNaHCO3液1〕0.15MNaHCO3液称取重量为0.315g的碳酸氢钠，并加到25.0ml体积的烧瓶中，然后，用去离子水将其精确溶解至25.0ml。2〕卵清蛋白的0.15MNaHCO3液在16ml有磁力搅拌棒螺旋盖帽瓶中，将50mg卵清蛋白溶解在8ml0.15M碳酸氢钠溶液中。实施例10KLH水溶液1〕KLH水溶液在4℃冷室中，将50mgKLH溶解在16ml离心管中的8ml去离子水中，并将其温和搅拌过夜。将该溶液离心并将上清液倒入16ml螺旋盖帽瓶(用于偶联合成的反应器)中，然后，将其贮存在冰箱中。实施例11CBMP-酸与蛋白质的偶联1〕伴随着搅拌，将100μLCBMP-OBtDMF溶液(0.0225mmole的CBMP-OBt)吸入到实施例9和10的各KLH水和卵清蛋白缓冲液中，室温下，温和搅拌反应物10分钟，然后，贮存在4℃的冷室中过夜。2〕*将各溶液对去离子水透析，换三次水，然后对PBS缓冲液(用具有6-8,000MW截止(cut-off)范围的透析管)透析，换三次缓冲液。*在这一步骤中，可以用凝胶过滤除去小分子。将实施例11的各蛋白质-氨甲酰氮偶联溶液称重。用式C＝(Wp×0.85)/V计算蛋白质-氨甲酰氮偶联物浓度(mg/ml)，其中，Wp是蛋白质的重量(mg)和V是溶液总体积(ml)，设定1g溶液的重量等于1ml溶液的体积，因此，对于卵清蛋白而言C＝(50mg×0.85)/V，对于KLH而言C＝(50mg×0.85)/V。在美国专利号4,480,042和4,401,765中描述了制备聚合物试剂的方法，实施例1中的产物化合物IV可共价连接在所述聚合物试剂上。实施例12氨甲酰氮颗粒试剂的制备和其用途通过加入氢氧化钡中和实施例1中制备的5ml去离子水中的50mg氨甲酰氮酰肼即化合物IV，直到不进一步形成沉淀。通过离心除去沉淀。将上清液加到美国专利号4,401,765中制备的5ml聚苯乙烯/异丁烯聚缩水甘油酯聚合物颗粒和5ml、0.1％“Schercozoline”S的悬浮液(由硬脂酸制得的取代的咪唑啉，从Scher化学公司购得)中，用氢氧化钾将其调为PH8.5。将混合物加温至75℃约30分钟，用200ml水稀释，并用混合床的离子交换树脂去离子。将0.4ml得到的颗粒试剂加到20ml、0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)中，随后加入含有0.3mNaCl和0.1％SDS的0.2ml、0.020M的磷酸盐缓冲液(PH7.43)。用众所周知的技术，如用分别加入人血清，氨甲酰氮，抗氨甲酰氮(如实施例13所制备)和从抗氨甲酰氮和氨甲酰氮混合物制备的凝集剂，和用测定混浊度变化率，测试该混合物的免疫学活性。在凝集抑制反应中，加入凝集剂。凝集剂可以是氨甲酰氮或其类似物的抗体，或以本文所述的共价连接到氨甲酰氮或其类似物的抗体上的聚合物颗粒为基础的颗粒试剂。这里所用的氨甲酰氮化合物的类似物或其抗原类似物指具有抗原决定因素的任何物质或物质基团，因此，关于抗体对于氨甲酰氮的结合特性，它们表现基本与氨甲酰氮相同。实施例13氨甲酰氮免疫原的制备根据众所周知的技术，给小鼠分别注射如实施例7和11所制备的各氨甲酰氮-蛋白质偶联物，通过正常免疫应答，产生小鼠抗氨甲酰氮抗体。通过众所周知的技术，从融合的骨髓瘤细胞和免疫鼠的正常脾细胞可以形成杂交瘤。然后，对单克隆抗氨甲酰氮抗体，采用众所周知的技术，体外筛选产生的抗体。用已知技术纯化鼠抗氨甲酰氮抗体并可以用作为免疫测定如光散射免疫测定中的抗体以测定如上述血清样品中的氨甲酰氮。可以将实施例12的颗粒试剂悬浮于可以进一步含有缓冲液、血清成分和表面活化剂的水溶液介质中，得到用于光散射免疫测定的单扩散颗粒试剂。根据需要的灵敏度，该试剂可用于直接颗粒增强浊度免疫沉淀技术，或直接竞争或抑制测定。氨甲酰氮试剂可以用于市售的自动化临床化学分析仪，如acaTM不连续临床分析仪或Dimensiontm化学分析仪(购自于E.I.duPontdeNemoursandCompany)以测定人血清中氨甲酰氮的水平。在acaTM分析仪中，将含有未知量的氨甲酰氮血清水溶液(0.20ml)加到含有2.5％聚乙二醇6000的PH7.8、0.15M磷酸盐缓冲液(4.98ml)中。加入实施例13中制备的抗氨甲酰氮(0.004ml)并使其保温约3.5分钟，通过加入0.150ml实施例12制备的氨甲酰氮颗粒试剂使该反应启动，加入颗粒以后，随着340nm(变化率)29s和46s的吸收不同，用acaTM分析仪测定由于颗粒凝集增加的浊度。权利要求1.具有下式结构的化合物2.具有下式结构的抗原其中X选自C＝O，CH2，和SO2；Y选自C＝O，CH2，和SO2；R是烷基和P是蛋白质性质的物质。3.一种颗粒试剂，它包括(a)具有共价连接的亲核官能团的颗粒；(b)至少一种具有如下结构的氨甲酰氮酰肼4.权利要求3所述颗粒试剂，其中颗粒进一步含有具有内芯和外壳的聚合物颗粒，其中内芯是在氘化钠线型波长下测量具有不少于1.54折射率的聚合物，和其中的外壳是这样的聚合物(i)烯化未饱和单体的聚合物，该单体具有能与生物特性的亲核化合物反应的官能团，(ii)可选择地，其它足以产生水不溶聚合物颗粒量的烯化未饱和单体，和(iii)不大于内芯单体10份重量的外壳，在内芯存在下，通过聚合作用形成外壳。5.权利要求3所述颗粒试剂，其中连接到氨甲酰氮酰肼上的颗粒官能团选自环氧、羧基、氨基、羟基和醛。6.权利要求3所述颗粒试剂，其中通过由蛋白质性质的连接物，使氨甲酰氮酰肼连接到颗粒上。7.测定人血清中氨甲酰氮的方法，包括步骤(1)温育(a)颗粒试剂共价连接到至少一种具有下式结构的氨甲酰氮酰肼上；(b)可能含有氨甲酰氮的血清悬浮液；和(c)凝集剂；和(2)光度法测定凝集产生的颗粒大小的增加值。8.权利要求7的方法，其中颗粒试剂包括具有内芯和外壳的聚合物颗粒，内芯是在氘化钠线型波长下测量具有不少于1.54折射率的聚合物，和外壳是这样的聚合物(i)烯化未饱和单体的聚合物，该单体具有能与生物特性的亲核化合物反应的官能团，(ii)可选择地，其它足以产生水不溶聚合物颗粒量的烯化未饱和单体，和(iii)不大于10份重量内芯单体的外壳，在内芯存在下，通过聚合作用形成外壳。9.一种包括下列步骤的方法在基本上无氧的环境中，三光气与亚氨基均二代苯烯反应；在基本上无氧的环境中，加入一水合肼并使其回流，其回流时间为足以使具有下式结构的沉淀形成，将沉淀过滤；和在碱存在下，使沉淀与选自于琥珀酸酐、溴代乙酸、和卤素取代的脂族磺酸基团反应，反应时间为足以使具有下式结构的氨甲酰氮酸形成，其中X选自于C＝O，CH2，和SO2；Y选自于C＝O，CH2，和SO；和R是烷基。10.权利要求9所述方法，进一步包括通过溶解氨甲酰氮酸，并在碱存在下，使溶解的氨甲酰氮酸与碳酸琥珀酰亚氨基酯反应来合成氨甲酰氮-NHS酯；和使氨甲酰氮-NHS酯与蛋白质的水缓冲溶液反应。11.权利要求10所述方法，它进一步包括在合成氨甲酰氮-NHS酯以前纯化氨甲酰氮-酸的步骤。12.权利要求9所述方法，它进一步包括将氨甲酰氮酸和水合羟基苯并三唑溶解在溶剂中；使混合物与二环己基碳化二亚胺混合，得到活化的氨甲酰氮-羟苯并三唑酸；和使活化的氨甲酰氮-羟苯并三唑酸与蛋白溶液反应。13.权利要求12所述方法，它进一步包括在将氨甲酰氮酸和水合羟苯并三唑的混合物溶解在溶剂中以前纯化氨甲酰氮-酸的步骤。14.权利要求9所述方法，它进一步包括在使沉淀与反应剂反应形成氨甲酰氮-酸以前纯化沉淀的步骤。全文摘要本发明提供了具有通式(I)的适合于共价连接到聚合物颗粒试剂上的新氨甲酰氮酰肼化合物。本发明还提供了用于氨甲酰氮免疫原产生的适合于连接到蛋白质上的新氨甲酰氮酸化合物。本发明的氨甲酰氨抗原具有通式(2)结构，其中X是C=O，CH文档编号C07D223/22GK1159186SQ96190835公开日1997年9月10日申请日期1996年6月7日优先权日1995年6月7日发明者王成荣申请人:达德化学系统公司