专利名称：从乳汁中提取免疫球蛋白a的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用现代生物工程技术、从乳汁中提取纯化免疫球蛋白A的方法。
免疫球蛋白A主要以单体形式、双体形式存在于动物体内。血液中的免疫球蛋白A主要以单体形式存在，这种免疫球蛋白，由于没有双体免疫球蛋白A分子中所具有的、能够抵抗消化道内分泌的蛋白酶的分解破坏作用的、叫做分泌片的糖蛋白结构，因此不能作为口服制剂达到免疫防护作用。乳汁中的免疫球蛋白主要是双体免疫蛋白A，这是由两个单体免疫球蛋白A通过一个叫做分泌片的分子量约6万的糖蛋白连接在一起的。分泌糖蛋白具有抵抗消化道中分泌出的各种蛋白消化酶对免疫球蛋白A的分解破坏作用，使免疫球蛋白A免遭破坏，保护其应有的免疫活性。如果血液中的免疫球蛋白A制成注射用免疫球蛋白，给免疫球蛋白A缺乏的人注射会使其产生抗免疫球蛋白A抗体，多次注射还会引起过敏反应和休克反应。口服从血液中提取的免疫球蛋白制剂，则因血液中的免疫球蛋白A不具有抵抗消化道中蛋白分解酶的破坏作用，无法起到免疫保护作用。因此，只有乳汁等动物分泌的乳汁中的双体免疫球蛋白A才能真正自然地充分发挥应有的免疫保护作用。
新生儿童早期易患呼吸道及消化道感染。这与新生儿机体发育不全、合成免疫球蛋白的功能不全或不完善有关。儿童体内合成免疫球蛋白A的能力随着年龄的增长而增长，12岁左右才基本达到成年人水平，而老年人随着年龄的增长，机体新陈代谢的能力逐渐降低，体内合成免疫物质的能力也逐渐下降，对细菌感染和病毒侵袭的抵抗能力也逐年下降，这时给予足量的外源性免疫球蛋白A的补充，可以在消化道和呼吸道形成天然保护屏障，预防多种感染性疾病的发生。肿瘤病人在放化疗治疗期间及以后相当长的一段时间都极易罹患感染性疾病，一个重要的原因便是治疗药物或射线在杀伤肿瘤细胞的同时，也损伤了机体内正常的代谢功能活跃的组织细胞，这其中也包括合成分泌免疫球蛋白的组织细胞，使消化道和呼吸道中免疫球蛋白A的合成、分泌受损减少，甚至功能丧失。目前，尚没有其它很好的办法阻止机体遭受细菌和病毒的侵袭。高浓度的双体免疫球蛋白A可以干扰和限制致病菌在消化道及呼吸道上皮细胞表面的聚集，以及中和病毒的毒性，从而有效地提高正在进行放化疗肿瘤病人的存活率，但是，目前尚没有这种既能够保持双体免疫球蛋白A活性又能够方便需要者服用的高浓度双体免疫球蛋白A的制剂。
本发明的目的是提供一种从乳汁中批量分离纯化双体免疫球蛋白A，并将其加工成可以口服的固体剂型的方法。
本发明的目的是这样实现的一种从乳汁中提取免疫球蛋白A的方法，其特征是用新鲜采集的乳汁(人乳、牛乳、羊乳等动物乳汁)，加入0.8-1.2倍(重量)的0.01N-0.5N(N-当量)氯化钠溶液，混合均匀，在0-15℃条件下离心1-3小时，离心转速(重量)控制在2000-15000rpm，离心结束，弃去上层油脂和底部沉渣，取中部清液加0.01M-1M的酸性溶液(如盐酸、硫酸、磷酸或有机酸)，调节PH值使其成酸性。PH值调节范围应控制在2-5之间，可形成大量不溶性杂蛋白颗粒。用过滤、离心或过滤加离心的方法将不溶性颗粒除掉。清液加碱性溶液(如氢氧化钠、碳酸钠或有机碱性化合物)，调节PH值在7-8之间。随后，采用凝胶柱层折法、半透膜法、超滤法等方法进一步纯化。如采用凝胶柱层折法，可以采用DEAE柱作为分离柱。洗脱液为三份Tris-HCl(0.01M，PH8.0)，NaCl的浓度分别为0.03±0.01M、0.05±0.01M及0.1±0.01M。注意NaCl浓度不同，收集到的成份也不同，如0.03MNaCl洗脱液洗脱的主要为免疫球蛋白G，0.05MNaCl洗脱液洗脱的主要为免疫球蛋白A的分泌片，双体免疫球蛋白A则集中在0.1MNaCl洗脱液中，因此，首先用0.03M的NaCl洗脱液洗脱并去除洗脱液，然后用0.05MNaCl洗脱液洗脱并去除洗脱液，最后用0.1M的NaCl洗脱液洗脱并收集洗脱液。经280nm紫外分光光度计测定确认后，继续浓缩。这时可用超滤法、半透明法脱水浓缩，即为双体免疫球蛋白A的浓缩液，浓缩液的蛋白浓度一般控制在10-50％(重量)之间，为防止浓缩液在从贮放到干燥的过程中发生蛋白变质，可考虑加入一种即可以防腐但在终产品中又不留迹量的防腐剂，如乙醇等有机低沸点、无毒物质，若选用乙醇，用量应控制在10-50％(重量)之间。双体免疫球蛋白A浓缩液的干燥方法是免疫球蛋白A浓缩液预冷至0-4℃，备用。干燥方法可选择真空干燥法、低温冷冻干燥法、低温冷冻真空干燥法或其它合适的方法。本发明采用低温冷冻真空干燥法，所采用的冷冻真空干燥设备适合于大批量生产免疫球蛋白A固体制剂。具体方法如下。首先开启制冷系统，使冷冻真空干燥箱的温度降到-15-35℃之间，一般可选在-30℃。当冷冻真空干燥箱的温度达到后，冷冻干燥箱处于待用状态，这时，将预冷的免疫球蛋白A浓缩液倾倒在冷冻干燥盘中。注意液体的厚度应控制在0.5-2.5cm之间，一般可选在1.5cm的液体厚度，将装有液体的冷冻干燥盘置于冷冻干燥箱中的搁板上，关闭冷冻真空干燥箱的箱门，开启制冷系统，使冷冻干燥箱内的温度降至-20--45℃，并保持在此温度范围内2-6小时。待溶液冻结后，开启真空系统，使冷冻干燥箱内的压力在短时间内达到低于0.04KPa。待压力稳定后，开启搁板加热系统，在最初阶段，搁板温度的上升控制在5℃/2小时以内，并以此速度逐渐升温，当温度升至-10-20℃之间时，停止加热一段时间，时间约为2-12个小时，一般可控制在6小时左右，待制品中约90％的水份去除后，则重新开启搁板加热系统，以2-5℃/小时的速度升温。当温度升至-5-10℃时，注意观察制品的外观形状是否保持正常，如水份过高，则重新快速降温至-35℃左右，保持在此温度水平4小时左右，再缓慢升温，保持5℃/小时左右的速度升温，最终控制搁板的温度在20-40℃之间，一般可控制在30℃左右，并在此温度范围保持4-6小时，此时制品的温度与搁板的温度一致，两条记录曲线汇合，整个过程约需时20-30小时。制品最终的残留水份对以后的制品保管、加工、制造有十分重要的影响，因此，在制品干燥结束后，收集制品的工作应在能控制相对湿度的房间里进行，一般收集室的相对湿度应控制在30-50度之间。收集到的固体免疫球蛋白粉末应密封在容器中贮存。
本发明与现有技术相比，其显著优点是首次用人工的方法从乳汁中提取免疫球蛋白A，为人类利用免疫球蛋白A提供了一种既可行，又丰富的方法。
下面结合实施例对本发明作进一步详述实施例，新鲜采集的牛乳，加等量0.15NraCl溶液，混合均匀，在4℃条件下离心1小时，离心转速为10000rpm，离心结束，弃去上层油脂和底部沉渣。取中部清液加0.5M HCl溶液，调节PH到4.6±0.2，离心去除产生的不溶性蛋白颗粒。清液加0.5M NaOH溶液，调PH至7.6±0.2。用DEAE柱纯化，洗脱液为梯度NaClTris-HCl液(0.01M，PH8.0)，内含NaCl分别为0.03M、0.05M及0.1M。收集0.1M NaCl洗脱液，经280mm紫外分光光度计确认及测定含量后，用排阻分子量1000的滤膜脱水浓缩。浓缩到蛋白含量在20％左右。加入适量乙醇，使浓度控制在10％。置4℃冷室备用。开启低温冷冻真空干燥机的制冷系统，使冷冻真空干燥箱的温度降到-30℃，并保持在此温度。将预冷到4℃的浓缩液倾倒在冷冻干燥盘中，厚度为1.2-1.5cm，将装有液体的冷冻干燥盘置于冷冻干燥箱中的搁板上，关闭冷冻真空干燥箱箱门，开启制冷系统，使冷冻干燥箱内的温度降至-30℃，并保持在此温度4小时，待溶液冻结后，开启真空系统，使冷冻干燥箱内的压力在短时间内达到0.01kPa，待压力稳定后，开启搁板加热系统。在最初阶段，搁板温度的上升控制在5℃/2小时以内，当温度升至-20℃时，停止加热，并保持4-6小时，待制品中约90％的水份去除后，重新开启搁板加热系统，以5℃/小时的速度升温，当温度升至-5℃时，观察制品的外观形状，如无异常，继续升温，控制搁板的最终温度在30-35℃，并在此温度范围保持4-6小时，此时制品的温度与搁板的温度一致，两条记录曲线汇合。整个干燥过程约需时20小时。在能控制相对湿度在50℃以下的房间里收集制品密封贮存。
权利要求
1.一种从乳汁中提取免疫球蛋白A的方法，其特征是该方法包括下列步骤1．1用新鲜采集的乳汁加入0.8-1.2倍(重量)的0.01-0.5N氯化钠溶液，混合均匀，在0-15℃条件下离心1-3小时；1．2弃去上层油脂和底部沉渣，取中部清液，加0.01-1.0M的酸性溶液，使其PH值在2-5之间，形成不溶性杂蛋白颗粒，用过滤、离心或过滤加离心的方法去除不溶性颗粒；1．3加碱性溶液，使PH值在7-8之间；1．4用凝胶柱层折法，半透膜法或超滤法进行纯化；1．5用真空干燥法对浓缩液进行干燥即可。
2.根据权利要求1所述的从乳汁中提取免疫球蛋白A的方法，其特征是所述的凝胶柱层折法进行纯化浓缩的方法步骤是2．1选用DEAE柱，三份Tris-HCl(0.01M，PH8.0)洗脱液，三份洗脱液的NaCl的浓度分别是0.03±0.01M、0.05±0.01M、0.1±0.01M；2．2首先用0.03±0.01M的Tris-Hcl洗脱液进行洗脱并去除洗脱液，然后用0.05±0.01M的Tris-Hcl洗脱液进行洗脱并去除洗脱液，再用0.1±0.01M的Tris-Hcl洗脱液进行洗脱，收集此次洗脱液；2．3用超滤法、半透膜法进行脱水浓缩，使蛋白浓度在10-50％(重量)之间；2．4加入10-50％(重量)的乙醇防腐。
3.根据权利要求1所述的从乳汁中提取免疫球蛋白A的方法，其特征在于所述的用低温冷冻真空干燥进行干燥的方法步骤是3．1将免疫球蛋白A浓缩液预冷至0-4℃备用；3．2开启制冷系统，使冷冻真空干燥箱的温度降到-15-35℃；3．3将预冷的免疫球蛋白浓缩液倾倒在冷冻干燥盘中，液体厚度为0.5-2.5cm，将干燥盘置于冷冻干燥箱的搁板上，开启制冷系统，使冷冻干燥箱中的温度降至-20--45℃，并保持2-6小时；3．4开启搁板加热系统，搁板温度以5℃/2小时的速度上升，当温度升至-10--20℃时停止加热2-12小时；3．5重新开启搁板加热系统，以2-5℃/小时的速度升温至-5-10℃，然后以5℃/小时速度升温至20-40℃，并在此温度内保持4-6小时；3．6将收集到的固体免疫球蛋白粉末密封在容器中贮存。
全文摘要
本发明公开了一种从乳汁中提取免疫球蛋白A的方法,具体方法步骤是用新鲜乳汁加入适量氯化钠溶液、离心,去除上层油脂和底部沉渣,取中部清液加入酸性溶液,形成不溶性杂蛋白颗粒,并将不溶性颗粒去除,加入碱性溶液,用凝胶柱层折法、半透膜法或超滤法浓缩,再用真空干燥法、低温冷冻干燥法或低温冷冻真空干燥法对浓缩液进行干燥即可收集免疫球蛋白A。本发明的优点是首次用人工的方法从乳汁中提取免疫球蛋白A,为人类利用免疫球蛋白A提供了一种既可行、又丰富的方法。
文档编号C07K1/00GK1287125SQ9911442
公开日2001年3月14日 申请日期1999年9月7日 优先权日1999年9月7日
发明者郭曙平 申请人:郭曙平