专利名称：多核苷酸交联剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种光敏化合物，可引入合成低聚核苷酸用来交联核酸链。
与本发明相关的背景技术在K.Yabusaki等的美国专利No.4,826,967中论证了可交联探针在核酸杂交检测中与靶序列交联的用途；交联化合物基于呋喃骈香豆精(furocoumarin)(或补骨脂素)连接到存在的多核苷酸上(通常通过形成加合物)并适合于很多用途。但是，交联基团/核苷加合物难于合成，特别是难于大量合成。
在美国专利No.5,082,934中，Saba等叙述了一种可光敏化的核苷类似物，由香豆素部分通过其苯环连接到核糖或脱氧核糖没有引入碱基部分的糖部分的1位上构成的。所得到的核苷类似物用作光交联基团引入多核苷酸中，代替一个或多个用于杂交检测的探针中存在的互补核苷碱基。但是，糖部分限制交联部分的构象柔性。
在PCT公报WO96/28438中，Wood等叙述了可光敏化的非核苷香豆素衍生物，其中香豆素部分是通过非脱氧核糖或核糖的部分加入到低聚核苷酸探针的主链中的。由于在香豆素部分和对应链中存在的自然碱基之间的快速交联反应，这些化合物的稳定性和反应性对核酸诊断性检测和疗法特别有用。
尽管如此，它们也可用于可交联探针的反应，不是期望与自然碱基反应，而代之以所期望的模式是两非自然反应物之间的反应。
发明简述本发明提供在核酸杂交检测和治疗学应用中可用作光交联试剂的非核苷、稳定、光敏化合物，以及引入这种化合物的探针。
这种化合物由芳基烯烃衍生物构成，其制备是通过芳基部分连接到功能化饱和或不饱和烃分子例如甘油来进行的。所得到的化合物的功能化烃部分等价于核苷的糖部分，同时芳基烯烃部分占据碱基的位置。相应地，这种化合物可使用自动或人工多核苷酸合成技术插入增长的多核苷酸链中。当含有这种可交联非核苷类似物(“探针”)的低聚核苷酸用于杂交检测和/或治疗学用途时，芳基烯烃的双键是与互补部分中的适当反应物共价交联的光敏基团。
光敏化合物具有结构式 这里V是 或 或
Y是H、F、低级烷基、低级烷氧基，或低级氟烷基。
Z是O或S；R1是H、R′、-OR′、-SR′、或-NR′R″，其中R′和R″独立地代表H、低级烷基、卤代烷基、烷氧基、烷基羰基、或芳基、杂芳基、或多环芳基，每个都以W任意取代。
R2是芳基、杂芳基或多环芳基，每个都以W任意取代。
B代表(1)含有2到10个碳原子并且，如果是环形，含有5或6元环的线性、分枝、或环形烃基团或(2)含有5或6元环的杂环芳环体系，上述B(1)或B(2)被1、2、或3个结构式R3的基团取代，其中R3独立地代表H、OH、NH2或COOH，或在多核苷酸合成过程中能够保护或偶联功能基团的保护性或偶联性基团、或R3代表与上述结构式的剩余部分相连的核苷酸或多核苷酸，并且其中烃基团的一到三个碳原子可被氧、氮、或硫原子置换；只是B不是核糖或脱氧核糖。
X代表(1)键、(2)含有1到10个碳原子的线性、分枝、或环烃基团，其中烃基团的任意一到三个碳原子被氧、硫、或氮原子置换；其中X以1-3个选自含有羟基、卤素、氨基、酰胺基、叠氮基、羧基、羰基、全氟甲基、和氰基功能基的取代基任意取代；并且其中X直接或通过W与上述结构式的苯环相连。
n是0、1、2、或3。
每个W独立地代表羟基、卤素、氨基、酰胺基、叠氮基、硝基、硫基、羧基、羰基、全氟甲基、或氰基功能基；10或更少个碳原子的未取代烃基基团；或上述烃基基团以1-3个上述功能基取代或其中一个碳原子被氧、硫、或氮原子置换并且两个W一起可代表与上述结构式的苯环稠合的环；
附加条件是(1)当X或W是取代烃时，在X或W中的取代基总数少于在上述X或W中的碳原子总数，并且不多于一个取代基或杂原子与一个给定的碳原子相连，除非在上述给定碳原子上的上述取代基是卤素原子，以及(2)在所有W取代基中的碳原子总数是15个或更少。
图2是说明在后面的实例3中叙述的化合物12的合成路线的流程图。DMTr代表4,4′-二对甲氧三苯甲基。
发明详述本发明提供的可交联化合物，可用在杂交检测和/或治疗学用途中的低聚核苷酸探针中作为可光敏化的非核苷交联剂。在核酸诊断检测中，本发明的化合物一般用作合成DNA或RNA低聚核苷酸的一部分，用来确定在样品中特异的DNA或RNA碱基序列。更具体地，本发明提供在杂交检测中起光敏交联化合物作用的连接到稳定、柔性、功能化烃主链单元上的光敏芳基烯烃。
本发明的化合物具有通式主链部分-结合部分-交联部分交联部分是芳基烯烃衍生物，其中交联基团(活化双键)位于恰当的取向和恰当的距离，用来与在对应链中的非核苷反应物交联。
结合部分通常由一种前体形成，该前体含有在两个位置具有功能基的用来将其它部分彼此结合的原子，所述原子数目为1到100，优选的是1到25，最好是1到10。在前体形成结合部分的反应之后，在芳基烯烃的环系和主链部分(糖取代基)之间的原子的最短连接链中，原子总数一般是1到15，推荐为1到7，最好是1到3。除此之外，这部分的结构可以变化很大，因为这基本上仅是一种从交联部分到主链部分的柔性连接。
结合部分最常见的是一端结合交联分子而在另一端结合主链分子的稳定环形或无环部分，是由带有适当的功能基的分子衍生而成。但是，如果在主链和交联部分中存在足够的功能基，则不需使用结合部分的前体(即，主链和交联部分可通过共价键结合)。
主链部分，这样称是因为其最终功能是代替多核苷酸主链的核糖或脱氧核糖部分，一般具有1到3个(有时更多)连接在不同碳原子上的羟基基团(或类似功能基，如后面所讨论)。主链部分通常不带电荷，以使它在最终的改性核苷酸中起核糖或脱氧核糖的取代基的功能。主链部分包含但不限于下述部分(1)线性烃部分如具有适当功能基的乙基或丙基或更长烃链，通常选自含有-OH、-NH2、-SH、-COOH、酰卤、和酸酐以及乙基(2)一般具有5到7元碳环结构环烃，带有一到三个羟基或上述(1)中的功能基的部分。上面提到的反应性功能基(除了-OH和-SH)一般只存在于中间体中；但是，在与其它功能基反应之后，他们变成稳定基团或与分子的其它部分形成共价键。
除上面叙述的基本结构之外，一个或更多偶合部分可连接到主链上来，以促进现有的或增长的多核苷酸链的键的形成。偶联部分一般由当分子在探针分子制备中用作中间体存在问题时，在溶液或固相核酸合成中使用的羟基偶联和/或保护基团构成。一般偶联基团包含磷酰胺糖醇(phosphoramidite)、磷酸酯、三磷酸酯、H-膦酸酯、和甲基膦酰胺糖醇(methyl phosphoramidite)；一般保护基团包含三苯甲游基、二甲氧基三苯甲游基、单甲氧基三苯甲游基、pixyl、叔丁氧羰基(Boc)、芴基甲氧羰基(Fmoc)、6-硝基藜芦基(3,4-二甲氧苄基，3,4-二甲氧苯甲基)、6′-硝基胡椒基(6’-nitropiperonyl)、芘甲基、甲基-6-硝基藜芦基和甲基-6-硝基胡椒基基团。非磷偶合基团包含羰基、氨基甲酸酯、酰胺、胺以及线性和环形烃基。对这类化学物质的综述，见“低聚核苷酸合成，应用研究”(OligonucleotideSynthesis,A Practical Approach),M.J.Gait等，IRL出版有限公司(IRL Press Ltd.)，英国奥克特夫德，1984，这里将其作为文献引用。光活化保护基团披露于Fodor等的美国专利No.5,489,678和No.5,744,101中。酰胺主链披露于美国专利No.5,539,082,No.5,705,333和5,773,571中。
该光敏化合物具有结构式 这里V是 或 或 Y是H、F、低级烷基、低级烷氧基、或低级氟烷基。
Z是O或S。
R1是H、R′、-OR′、-SR′、或-NR′R″，其中R′和R″独立地代表H、低级烷基、卤代烷基、烷氧基、烷基羰基、芳基、杂芳基、或多环芳基，每个都以W任意取代；
R2是芳基、杂芳基或多环芳基，每个都以W任意取代。
B代表(1)线性、分枝、或环形烃基团，含有2到10个碳原子，并且，如果是环形，含有5或6元环，或者(2)含有5或6元环的杂环芳环体系，上述B(1)或B(2)被1、2、或3个结构式R3的基团取代，其中R3独立地代表H、OH、NH2或COOH，或在多核苷酸合成过程中能够保护或偶合功能基团的保护性或偶合性基团，或者，R3代表与上述结构式的剩余部分相连的核苷酸或多核苷酸，并且其中烃基团的一到三个碳原子可被氧、氮、或硫原子置换；但是B不是核糖或脱氧核糖。
X代表(1)键、(2)含有1到10个碳原子的线性、分枝、或环烃基团，其中烃基团的任意一到三个碳原子被氧、硫、或氮原子置换；其中X以1-3个选自含有羟基、卤素、氨基、酰胺基、叠氮基、羧基、羰基、全氟甲基和氰基功能基的取代基任意取代；并且其中X直接或通过W与上述结构式的苯环相连。
n是0、1、2、或3；每个W独立地代表一种羟基、卤素、氨基、酰胺基、叠氮基、硝基、硫基、羧基、羰基、全氟甲基、或氰基功能基；一种10或更少个碳原子的未取代烃基基团；或上述烃基基团以1-3个上述功能基取代，或其中一个碳原子被氧、硫、或氮原子置换，并且两个W一起可代表与上述结构式的苯环稠合的环；附加条件是(1)当X或W是取代烃时，在X或W中的取代基总数少于在上述X或W中的碳原子总数，并且不多于一个取代基或杂原子与一个给定的碳原子相连，除非在上述给定碳原子上的上述取代基是卤素原子，以及(2)在所有W取代基中的碳原子总数是15个或更少。
桥接B-X连接的功能基(如醚或羧酸酯)的氧原子或其它非C原子(如果存在)，经常是由在B的前体中的羟基产生的，但是在这里和后面的结构式中被当作X连接的一部分(以便定义各种基团)，除非明显与讨论的前后关系矛盾。
在前述的通式Ⅰ中，某些化合物是优选的。优选的B部分选自第一次级结构式的基团。
第一次级结构式的基团 第二次级结构式的基团 或第三次级结构式的基团
其中Rx、Ry、和Rz独立地代表H或R3；m、n、p、q、和r独立地是0或1；并且所有其它取代基和化合物的结构式的定义与以前为通式Ⅰ定义的相同。
B部分的一个氢原子被一个连接X基团的共价键代替，通常是羟基的氢(即，在这种前体分子中，至少一个R3将代表羟基)。但是，这种推荐只是为了合成的方便，如果所得到的B-X连接可容易地从(多)羟基烃前体制备，则其中许多都是可从商业渠道获得的。如果需要的话，其它氢也可被指定的共价键代替。合成中实际使用的分子，经常是通过一系列反应，从其中一个羟基已经被功能基代替的(多)羟基化合物衍生获得。例如，羟基可被卤素原子或其它活性基团代替，并且活性基团可与在X基团的前体中的给电子基团一起参与键的形成。
其中优选的B是由饱和烃形成的化合物，尽管不饱和化合物(包含环形芳烃)也可使用。
结构式Ⅰ的化合物中B是第三方案中优选的，特别是其中m+n+p+q+r=0、1、或2的那些。更值得推荐的是，这些化合物代表无环的、饱和的、二或三羟基烃，特别是甘油和3到5碳的1,2-或1,3-二羟基烷，其在离指定羟基最远的末端位置上与X基团连接，如4,5-二羟基戊基、3,5-二羟基戊基、2,4-二羟基-2-甲基丁基、3-羟基-2-(羟甲基)丙基，以及2,3-二羟基丙基。
芳环体系可在B部分中存在。这包含烃和杂环芳环体系两种。其中B由苯或萘环体系构成的化合物是优选的，特别是1,2-二(羟甲基)-取代芳香物。当B由杂环环系，如吡喃、吡咯、吡唑、咪唑、哌啶、吡啶、吡嗪、嘧啶、吡嗪啶(pyrazidine)、噻吩、吖啶、吲哚、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹恶啉(quinoxaline)、占吨(xanthene)或1,2-苯并吡喃环系构成时，推荐的取代基是相同的。
下述化合物也在本发明范围内，该化合物中B是由桥烃环系构成的化合物，如双环[3.1.0]己烷，或[2.2.1]庚烷环系。这些分子具有降低活动性的构型，因而各种顺和反取代模式可容易地制备和保持。参见Ferguson著的“有机分子结构”(Organic Molecular Structure),Willard Grant、Boston,1975，第17-19章的，关于这一化学和合成技术的综述。类似的，其中B由螺或双螺烃环系构成的化合物也在本发明的范围之内。
正如前面所提到的，X连接基团没有特别的结构限制，因为它不作为与主链结构的剩余部分，或多核苷酸的互补成分相互作用的分子的一部分存在。但是，分子的这一部分有优选的结构，如下所述，可用X代表两种可能取向的任一个-OCH2-,-SCH2-,-NHCH2-, -CJ2(CH2)n-其中J代表H、F、Cl、I、或Br并且n=0、1、或2。
其它优选的化合物是那些其中X由具有5或6元碳或杂环(后者含有一个O、S、或N原子)的环形结构，如环戊烷、环己烯、二氢呋喃、吡咯、或吡啶构成的化合物。
其中W是氢的化合物是优选的。
其中核苷酸或多核苷酸与化合物相连的结构式Ⅰ的化合物通常(但不总是)通过含磷连接基团连接。推荐的含磷连接基团与其它连接基团一样，在别处讨论。这种化合物是本发明的推荐化合物，因为它们可直接用于主要在末端使用本发明的检测和交联过程。这些化合物具有结构式(Nm1QNm2)m3其中m1和m2是从0到200，推荐为0到50，最好是0到30的整数；m3是从1到10，推荐为1到5的整数；每个N独立地代表一个期望多核苷酸序列的一个核苷酸；Q代表引入到正常多核苷酸序列中的本发明的核苷酸代替分子。推荐的连续的正常核苷酸序列的长度是上面给出的m1和m2。
除了天然存在的碱基A、T、G、C、U，在每个期望的核苷酸序列N中也可含有合成核酸类似物，如5-甲基胞(嘧啶核)苷、2-氨基腺嘌呤等等，它们帮助稳定核酸二聚物；或肌苷、水粉覃素(nebularine)、3-硝基吡咯等，或在同一位置的混合碱基，或简单隔离分子，它们在建立杂交探针时帮助克服在靶序列中的同素异构现象。Q可以在多核苷酸的内部或在它的一个末端位置存在。在内部位置，必须至少存在两个R3基团，以允许Q分子与两个独立部分的末端连接；如果Q在末端位置引入，只需一个R3，尽管在两种情况下其它基团都可能存在。
在这些结构式中，应该认识到，在m3是大于1的多核苷酸序列中，每个Nm1QNm2可以彼此不同；也就是说，多重Q部分可以沿着分子的长度随机存在，只要剩余部分遵从上面描述的参数。
推荐的多核苷酸的一个基团具有1-5个Q部分，存在于分子的每个或两个末端的连续正常碱基的长序列(推荐为1-3个Q部分)。如上所述，Q部分既可以是连续的，也可以被少量正常核苷酸中断。在探针的中间多于一个的Q部分(无论连续与否)，也代表一种优选的具体物，相对于每边的交联Q单元，具有相对较长的连续序列。
在所有优选实施例中，至少具有一个与相应的靶核苷酸互补的核苷酸的连续序列。这一连续序列在杂交过程中提供稳定性，以便产生稳定性、选择性及识别靶的适当因素。在本过程中产生稳定性和选择性的因素，与在任何其它杂交过程中是相同的。后面有Q部分的互补核苷酸的连续序列，在这方面与后面有非互补正常碱基的靶核苷酸的连续序列没有差别。因此，容易根据核酸杂交的标准条件，对含有本发明的交联部分的多核苷酸的稳定性进行预测。
在另一个优选实施例中，含有交联单元Q的探针，是由与靶序列互补的核苷酸序列和另一个其中Q位于与靶核苷酸不互补的位置的核苷酸序列构成。探针的这一区域因而可用于与另一个与靶的相邻区域互补的探针的部分杂交。在一种情况中，两探针和靶杂交形成探针的交联单元Q位于探针-探针杂交部分中间的三臂结构。在另一种情况下，探针和靶复合物结合形成探针的交联单元Q，位于探针-探针杂交部分中间的四臂结构中。
也推荐的是，其中在B部分中存在两个R3基团，并且二者代表不同羟基偶联或羟基保护基团的化合物，因为这种化合物在可交联多核苷酸的合成中容易使用。这些保护和活化基团也在本说明书的其余部分讨论。
本发明的另一组特别推荐的化合物具有下面的结构式Ⅱ 这里n1是0到10(推荐为0到5，最好是1到3)；n2是0到5(推荐为0到2，最好是0到1)；
n3是0到5(推荐为0到2，最好是0到1)；V是 或 或 Y是H、F、低级烷基、低级烷氧基或低级氟烷基；Z是O或S。
R1是H、-OR′、-SR′、或-NR′R″，其中R′和R″独立地代表H、低级烷基、卤烷基、烷氧基、烷羧基、芳基、杂芳基或稠环芳基，每个都以W任意取代。
R2是芳基、杂芳基或稠环芳基，每个都以W任意取代。
每个W独立地代表羟基、卤素、氨基、酰胺基、叠氮基、硝基、硫基、羧基、羰基、全氟甲基、或氰基功能基；10或更少个碳原子的未取代烃基基团；或上述烃基基团以1-3个上述功能基取代或其中一个碳原子被氧、硫、或氮原子置换并且两个W一起可代表与上述结构式的苯环稠合的环。
X是含有(a)1到10个碳原子和(b)0到10，推荐为0到2个杂原子，选自O、S、和N，并且其中X由在它所连接的结构式的其它原子之间1到10个原子的最短连接链构成。
R3是H、OH、NH2、COOH、或在自动多核苷酸合成过程中能够偶联或保护功能基的基团。换句话说，R3代表核苷酸或多核苷酸，通过磷酸二酯，或其它用来偶联多核苷酸中单体单元的常用基团与化合物连接。优选的偶联基团包括含磷基团，如亚磷酸酯、磷酰胺糖醇(phosphoramidite)、磷酸酯、H-膦酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、和甲基膦酰胺糖醇(methylphosphoramidite)。非磷偶联基团包含羧基、氨基甲酸酯、硬树脂(animes)和酰胺。常见保护基团包含三苯甲游基、二甲氧基三苯甲游基、单甲氧基三苯甲游基、pixyl、叔丁氧羰基(Boc)、芴基甲氧羰基(Fmoc)、6-硝基藜芦基、6′-硝基胡椒基、芘甲基、甲基-6-硝基藜芦基、和甲基-6-硝基胡椒基基团。
本发明的化合物可应用于，例如，在杂交检测中，可作为探针的光敏多核苷酸制备的中间体，或作为其成分。由于目的是由一个或多个这类分子最终形成多核苷酸部分，在大多数情况下，主链部分构成分子的部分，是从甘油或不同多羟基烃分子衍生的。甘油基或其它多羟基烃分子，一般通过与分子中的相邻核苷酸的3′和/或5′羟基的磷酸二酯类连接，引入核酸的主链的任何位置，交联部分一般是在这种引入之前与主链部分连接。
本发明的化合物的交联部分，可从任意取代数的芳基烯烃衍生。位于在交联部分前体中甘油或另一主链部分所要连接的位置的有机功能基，在最终产物中一般用来把交联部分与主链部分连接起来。由于最终产物经常可从另一个合成路线制备，任何最终产物将会有数种可能的前体。交联部分可由独立的分子产生，或通过交联部分前体的部分与主链部分前体的反应形成。
在除交联位置之外的位置，芳环体系既可是不饱和的，也可以是饱和的。一般环上的取代基是在有机化合物中芳环上常见的小的、稳定的取代基。取代基可根据希望选择，以改变激发波长。
在特定推荐具体物中芳基部分前体，在与主链部分前体反应之前，具有结构式
其中n2、V、和Wn具有前面定义的意义；并且X1是X连接部分的全部或部分前体。X1将与在连接部分的前体上的有机功能基反应形成共价键。一般反应性功能基包含羟基、胺、卤素、硫基、羰基、羧基酯、羧基酰胺、甲硅烷基和乙烯基基团。这些前体可通过有机合成的标准方法，用从市场可购到的芳基衍生物合成出来。
在特定推荐具体物中主链部分前体具有结构式 其中R3、R4、和n1、和n3具有前面定义的意义，并且X2是X连接基团的全部或部分前体。
X2将与芳基部分上的有机功能基反应，形成最终连接X部分中的共价键。X2一般选自反应性功能基和能够进行亲核或亲电取代或加成的亲核和亲电基团。具体功能基的例子包含羟基、氨基、卤素、硫基、羰基、羧基酯、羧基酰胺、乙烯基、和硅衍生物。这一前体可通过有机合成的标准方法从(多)羟基烃如甘油、市场上买得到的1,2-或1,3-二羟基烷衍生物，这种化合物在指定羟基的位置带有保护羟基基团、或在后面的反应中可以转化成(多)羟基烃的化合物，就像，例如，烯烃、羰基化合物、卤化物、或环氧化物合成出来。这种反应在有机合成设计中是常用的；更多的例子可见Larock,R.C.,《广泛有机转化》(Comprehensive Organic Transformation)功能基制备指南(A Guide to Functional Group Preparations),VCH出版社纽约(New York)1989。见Misiura,K.,Durrant,I.,Evans,M.R.，和Gait,M.J.,《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)(1990)18,4345-4354，这里将其作为参考文献引用，用于讨论在多核苷酸合成中，与现有主链碱基部分具有相似结构部分的连接。
利用本说明书中提出的指导路线，本发明的化合物可通过合成有机化学的标准技术制备。例如，下面的例子中，给出了利用可在市场购得的原料进行的有代表性的合成。
实施例2基于苄叉苯酮(benzylidenephenone)的交联剂的合成化合物51-苯基-3-(4′-羟基苯基)-2-丙烯-1-酮[4-羟基苄叉苯乙酮(4-hydroxybenzylidenephenone)]1.10g,3.6mmol)、表溴醇(0.5mL,5.84mmol)和碳酸钾(840mg,6.1mmol)在丙酮(20mL)中混合并将混合物回流18小时。用旋转蒸发器除去溶剂，残余物溶于乙酸乙酯，并用2N氢氧化钠水溶液萃取。有机相用Na2SO4干燥，并用旋转蒸发器除去溶剂。以95％的收率(1.3g)得到油状的粗产物。化合物65的溶液(680mg,2.43mmol)和2M硫酸(1.0mL)于丙酮(6mL)中加热到60℃保持30分钟。接下来是与制备2相同的步骤，以74％的收率(540mg)得到6。化合物7二醇6(540mg,1.81mmol)、4,4′-二对甲氧三苯甲基氯(680mg,2.01mmol)、4-(二甲氨基)吡啶(20mg,0.16mmol)和三乙胺(0.25mL,1.8mmol)在吡啶(9mL)溶液中，室温下搅拌1小时。接下来是与制备3相同的步骤，以58％的收率(630mg)得到7。化合物8在氩气氛下，向快速搅拌的DMT衍生物7(620mg,1.03mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.3mL,1.72mmol)的干燥二氯乙烷(2mL)溶液中，加入2-氰乙基二异丙基氯代磷酰胺糖醇(2-cyanoethyldiisopropylchlorophosphoramidite)(0.4mL,1.8mmol)。接下来是与制备4相同的步骤，以48％的收率(400mg)得到8。
实施例3基于4-甲氧基苄叉苯酮(4-methoxybenzylidenephenone)的交联剂的合成化合物94′-羟苯乙酮(6.80g,49.9mmol)、表溴醇(4.5mL,52.6mmol)和碳酸钾(7.0g,50.6mmol)，在丙酮/二甲基甲酰胺(15mL/5mL)中混合并将混合物回流，进行2小时。用旋转蒸发器除去溶剂，残余物溶于乙酸乙酯，并用2N氢氧化钠水溶液萃取。有机相用Na2SO4干燥，并用旋转蒸发器除去溶剂。粗产物(8.0g)与2M硫酸(4mL)在丙酮(10mL)中混合并加热到60℃保持30分钟。反应溶液用NaCl水溶液(饱和)稀释，然后用乙酸乙酯萃取。
有机溶液用Na2SO4干燥，并用旋转蒸发器除去溶剂。粗产物在硅胶上进行层析，用30％(v/v体积比)丙酮/己烷洗提。收集适当的部分，并合并以20％的收率(2.0g)得到9。化合物10根据文献(《有机合成胶体》(Org.Syn.Coll.)1,78)提供的步骤，碱基的含水乙醇溶液用270mg氢氧化钠溶于水(1mL)和乙醇(3mL)制备，并在冰水浴中冷却。二醇9(1.2g,6mmol)溶于乙醇(6mL)，并在搅拌下滴加到冷却的含水乙醇溶液中。加完后，立即加入茴香醛(anisaldehyde)(0.81g,6mmol)，并使反应混合物的温度保持在15°-30℃之间。2小时后收集布氏漏斗(Buchner funnel瓷漏斗)上的固体，并用水洗至中性。固体最后用50％(v/v体积比)乙醇/丙酮洗涤。干燥后，以31％的收率(620mg)得到10。化合物11二醇10(600mg,1.83mmol)、4,4′-二对甲氧三苯甲基氯(1.5g,4.43mmol)、4-(二甲氨基)吡啶(53mg,0.44mmol)和三乙胺(0.6mL,4.3mmol)的吡啶(10mL)溶液在室温下搅拌1小时。接下来是与制备3相同的步骤，以29％的收率(340mg)得到11。化合物12在氩气氛下，向快速搅拌的DMT衍生物11(230mg,0.36mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.125mL,0.72mmol)的干燥二氯乙烷(1.5mL)溶液中加入2-氰乙基二异丙基氯代磷酰胺糖醇(2-cyanoethyl diisopropylchlorophosphoramidite)(0.2mL,0.9mmol)。接下来是与制备4相同的步骤，以50％的收率(150mg)得到12。
实施例4含有交联剂的探针的合成合成低聚核苷酸探针，是根据β-氰乙基磷酰胺糖醇(β-cyanoethylphosphor-amidite)方法，在自动DNA合成仪(MilliporeExpedite 8909)上制备的。交联化合物以制备成带有一个活化羟基磷酰胺糖醇(phosphoramidite)衍生物和一个保护羟基二甲氧基三苯甲游基衍生物的二醇的形式引入。保护/活化化合物在反应瓶中溶于干燥乙腈(浓度50-100mM)，并放在自动仪器的特定入口处。低聚核苷酸使用标准仪器方案以0.2μmol的规模制备。紧接着自动合成，低聚核苷酸从固体载体上解离并通过用浓氢氧化铵在55℃处理30分钟脱保护。在真空中除去氨，水溶液用丁醇萃取，然后低聚核苷酸通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行提纯。期望的低聚核苷酸的键从凝胶上断开，并洗提到水中。凝胶提纯的低聚核苷酸用Sep-Pak C18(Waters公司)根据制造商的程序处理脱盐。
实施例5在二聚物中的交联反应序列探针1:5′-AXA GCG CGC AAA GAC AAA AT(序列识别号NO:1)探针2:5′-ATT TTG TCT TTG CGC GCT TT(序列识别号NO:2)探针3:5′-AZA GCG CGC AAA GAC AAA AT(序列识别号NO:3)探针4:5′-ATT TTG TCT TTG CGC GCT ZT(序列识别号NO:4)这里X是Wood等(PCT WO96/28438)披露的基于3-O-(7-香豆素基)甘油的非核酸香豆素衍生物，而Z是基于在实例2中叙述的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物。低聚核苷酸根据实例4的方法制备。
探针2和4是使用多核苷酸激酶和γ-32P-ATP根据标准程序用32P磷酸酯在5′-末端进行标记的。
按照下列组合测试了探针的互补对的交联速率1和2、3和2、3和4。未标记探针(1或3)以10倍摩尔浓度过量于标记探针(2或4)。
每个探针组合制备了五个相同样品，然后分别进行辐照1到60分钟。探针在40℃下，在缓冲溶液中杂交20分钟，然后在辐射室(UV产品，CL-1000)中用UV-A光辐照特定的时间间隔。
杂交缓冲器由牛血清蛋白，0.1225％；乙酸钠，68nM；SSC(柠檬酸钠盐水(saline sodium citrate))4.515X；和TE(tris EDTA)0.28X构成。样品体积是90μL，并且含有0.5pmol的标记探针和5.0pmol的未标记探针。
交联程度作为时间的函数通过用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离交联和非交联探针确定，接下来通过断开键的闪烁计数来定量分析在每个键中的放射标记探针。结果交联百分数作为辐照时间的函数辐照时间[分钟]探针组合1 3 9 2760探针1和212 29638693探针3和21.21.4 2.9 5.7 9.5探针3和483 848483 83结果表明，这里披露的交联化合物Z，存在于探针3和4中，提供低聚核苷酸的交联成分的反应非常迅速。作为对照，在交联剂Z和只含有天然碱基的探针之间(探针3和2)的反应相对较慢，并且反应的程度在短时间内可以认为微不足道当辐照1分钟时是83％对1.2％。
以前披露的交联化合物X当辐照30-60分钟时达到超过86％的交联产物转化率，但是这是经过在整个最初的30分钟的辐照期间的产物数量的稳定增长取得的。作为对照，交联剂Z在第一分钟内已经达到完全的反应程度，明显提高了交联过程的时间效率。
实施例6在三臂结构中的交联反应序列探针5:5′-TCT AGG TTC ATG ACA AGC TCG TCA GAX A(序列识别号NO:5)探针6:5′-TTT TTT CCT CAA GAG CAT TGT AAG CAG AAGACT T(序列识别号NO:6)探针7:5′-TCT AGG TTC ATG ACA AGC TCG TCA GAZ A(序列识别号NO:7)探针8:5′-TTT TZT CCT CAA GAG CAT TGT AAG CAG AAGACT T(序列识别号NO:8)探针9:5′-TAA GTC TTC TGC TTA CAA TGC TCT TGA GGCTGA CGA GCT TGT CAT GAA CCT AGA T(序列识别号NO:9)这里X是Wood等(WO96/28438)披露的基于3-O-(7-香豆素基)甘油的非核酸香豆素衍生物，而Z是基于在实例2中叙述的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物。低聚核苷酸根据实施例4的方法制备。
探针6和8是使用多核苷酸激酶和γ-32P-ATP，根据标准程序，用32P磷酸酯在5′-末端进行标记的。
一般程序与实施例5相同，每个样品制备了四个重复样，并且每个样品含有0.5pmol的标记探针和5.0pmol的未标记探针。结果交联百分数作为辐照时间的函数辐照时间[分钟]探针组合 1 4 1660探针5和6和928678586探针7和6和91.7 2.9 7.1 16探针7和8和951555958结果表明，这里披露的交联化合物Z，存在于探针7和8中，提供低聚核苷酸的交联成分的反应非常迅速。作为对照，在交联剂Z和只含有天然碱基的探针之间(探针7和6)的反应相对较慢，并且反应的程度在短时间内可以认为微不足道当辐照1分钟时是51％对1.7％。
以前披露的交联化合物X，当辐照16-60分钟时达到超过85％的交联产物转化率，尽管这是经过在整个最初的16分钟的辐照期间的产物数量的稳定增长取得的。作为对照，交联剂Z在第一分钟内已经接近达到完全的反应程度，明显提高了交联过程的时间效率。
实施例7不同交联剂之间在三臂结构中的交联反应序列探针10:5′-TCT AGG TTC ATG ACA AGC TCG TCA GAX A(序列识别号NO:10)探针11:5′-TCT AGG TTC ATG ACA AGC TCG TCA GAZ A(序列识别号NO:11)
这里X是Wood等(PCT公报WO96/28438)披露的，基于3-O-(7-香豆素基)甘油的非核酸香豆素衍生物的R对映体，而Z是基于在实施例1中叙述的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物。低聚核苷酸根据实施例4的方法制备。
探针8，含有实施例2中叙述的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物是使用多核苷酸激酶和γ-32P-ATP，根据标准程序，用32P磷酸酯在5′-末端进行标记的。
一般程序与实施例5相同，每个样品制备了四个重复样，并且每个样品含有0.5pmol的标记探针和5.0pmol的未标记探针。结果交联百分数作为辐照时间的函数辐照时间[分钟]探针组合 1 4 1660探针10和8和918477182探针11和8和928333641结果表明，这里披露的交联化合物，存在于探针8和11中，和另一个已知进行2+2光环化反应的光敏化合物，存在于探针10中，提供低聚核苷酸的交联复合物的交叉反应非常迅速。
显然对于那些所属技术领域的一般技术人员而言，可以根据对本发明的精神进行各种各样的修改和改进。因此，本发明受所附权利要求的限定和保护。
在本申请中提到的所有出版物和专利说明书在这里作为文献引用。
序列表213>人工序列<220><221>杂项特征<222>(27)<223>香豆素衍生物R对映异构体，基于3-O-(7-香豆素基)甘油<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>10tctaggttcatgacaagctc gtcagana 28<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项_特征<222>(27)<223>基于亚苄基丙酮的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>11tctaggttcatgacaagctc gtcagana 28序列表<110>Chen,Peter C.
Albagli,DavidWood,Michael L.<120>多聚核苷酸交联剂<130>14251-0008 US<140>09/189,294<141>1998-11-10<160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<220><221>杂项特征<222>(2)<223>香豆素衍生物R对映异构体，基于3-O-(7-香豆素基)甘油<400>1anagcgcgca aagacaaaat 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<220><221>杂项特征<222>(1)<223>32P磷酸酯在5′-末端进行标记(5′-end labeled with 32P phosphate)<400>2attttgtctttgcgcgcttt 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项特征<222>(2)<223>基于亚苄基丙酮的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>3anagcgcgca aagacaaaat 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项特征<222>(19)<223>基于亚苄基丙酮的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<220><221>杂项特征<222>(1)<223>32P磷酸酯在5′-末端进行标记<400>4attttgtctttgcgcgcttt 20<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项特征<222>(27)<223>香豆素衍生物R对映异构体，基于3-O-(7-香豆素基)甘油<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>5tctaggttcatgacaagctc gtcagana 28<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项特征<222>(1)<223>32P磷酸酯在5′-末端进行标记<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>6ttttttcctc aagagcattgtaagcagaag actt 34<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项特征<222>(27)<223>基于亚苄基丙酮的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>7tctaggttcatgacaagctc gtcagana 28<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项特征<222>(5)<223>基于亚苄基丙酮的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物<220><221>杂项_特征<222>(1)<223>32P磷酸酯在5′-末端进行标记<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>8ttttntcctc aagagcattgtaagcagaag actt 34<210>9<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>9taagtcttct gcttacaatg ctcttgaggctgacgagctt gtcatgaacctagat55<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项_特征<222>(27)<223>香豆素衍生物R对映异构体，基于3-O-(7-香豆素基)甘油<220><223>人工序列的说明合成寡核苷酸探针<400>10tctaggttcatgacaagctc gtcagana28<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>杂项特征<222>(27)<223>基于亚苄基丙酮的查耳酮(苯丙烯酰苯)衍生物<220>
权利要求
1．一种结构式如下的化合物该光敏化合物具有结构式 这里V是 或 或 Y是H、F、低级烷基、低级烷氧基或低级氟烷基；Z是O或S；R1是H、R′-OR′、-SR′或-NR′R″，其中R′和R″独立地代表H、低级烷基、卤代烷基、烷氧基、烷基羰基、芳基、杂芳基、多环芳基，每个都以W任意取代；R2是芳基、杂芳基或多环芳基，每个都以W任意取代；B代表(1)含有2到10个碳原子并且，如果是环形，含有5或6元环的线性、分枝、或环形烃基团或(2)含有5或6元环的杂环芳环体系，所述的B(1)或B(2)被1、2、或3个结构式R3的基团取代，其中所述的R3独立地代表H、OH、NH2、或COOH，或在多核苷酸合成过程中能够保护或偶合功能基团的保护性或偶合性基团、或R3代表与上述结构式的剩余部分相连的核苷酸或多核苷酸，并且其中烃基团的一到三个碳原子可被氧、氮、或硫原子置换；只是B不是核糖或脱氧核糖；X代表(1)键、(2)含有1到10个碳原子的线性、分枝、或环烃基团，其中烃基团的任意一到三个碳原子被氧、硫、或氮原子置换；其中X以1-3个选自含有羟基、卤素、氨基、酰胺基、叠氮基、羧基、羰基、全氟甲基、和氰基功能基的取代基任意取代；并且其中X直接或通过W与上述结构式的苯环相连；n是0、1、2、或3；每个W独立地代表羟基、卤素、氨基、酰胺基、叠氮基、硝基、硫基、羧基、羰基、全氟甲基或氰基功能基；一种10或更少个碳原子的未取代烃基基团；或所述的烃基基团以1-3个所述的功能基取代，或其中一个碳原子被氧、硫、或氮原子置换，并且两个W一起可代表与上述结构式的苯环稠合的环；附加条件是(1)当X或W是取代烃时，在X或W中的取代基总数少于在上述X或W中的碳原子总数，并且不多于一个取代基或杂原子与一个给定的碳原子相连，除非在上述给定碳原子上的上述取代基是卤素原子，并且(2)在所有W取代基中的碳原子总数是15个或更少；
2．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的X，以每个取向，是-OCH2-,-SCH2-,-NHCH2-, ,和-CJ2(CH2)n-,其中J代表H、F、Cl、I或Br，并且n=0、1、或2。
3．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的X是带有5-或6-元环，或含有至少一个O、S、或N原子的5-或6-元杂环的环形结构。
4．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的V是
5．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的V是
6．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的V是
7．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的X的定位是烯烃的间位或对位。
8．根据权利要求1所述的化合物，其中B代表第一次级结构式的基团 第二次级结构式的基团 或第三次级结构式的基团 其中Rx、Ry、和Rz独立地代表H或R3；m、n、p、q、和r独立地代表0或1；并且上述次级结构式的一个氢被一个与上述X基团相连的共价键代替。
9． 根据权利要求1所述的化合物，其中所述的B是饱和的。
10．根据权利要求8所述的化合物，其中所述的B具有上述第三次级结构式。
11．根据权利要求10所述的化合物，其中所述的m+n+p+q+r=0、1、或2。
12．根据权利要求8所述的化合物，其中所述的第三次级结构式代表一种无环、饱和、二或三羟基烃。
13．根据权利要求8所述的化合物，其中所述的第三次级结构式代表三-O-取代甘油(tri-O-substituted glycerin)。
14．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的核苷酸或多核苷酸与上述化合物通过含磷连接基团相连。
15．根据权利要求14所述的化合物，其中所述的含磷基团是磷酸二酯基团。
16．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的B包含苯或萘环。
17．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的B含有桥烃环。
18．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的B含有双环[3.1.0]己烷或[2.2.1]庚烷环。
19．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的B含有螺或双螺环。
20．根据权利要求1所述的化合物，其中至少一个R3选自含有亚磷酸酯、磷酰胺糖醇(phosphoramidite)、磷酸酯、H-膦酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、和甲基磷酰胺糖醇(methyl phosphoramidite)的基团。
21．根据权利要求1所述的化合物，其中所述的B含有选自含有吡喃、吡咯、吡唑、咪唑、哌啶、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、噻吩、吖啶、吲哚、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹恶啉(quinoxaline)、占吨(xanthene)或1,2-苯并吡喃环系的杂环环系。
22．一种结构式为(Nm1QNm2)m3的多核苷酸，其中所述的每个N代表一个期望多核苷酸序列的一个核苷酸，Q代表根据权利要求1所述的结构式的核苷酸代替分子，并且每个m1、m2、和m3是整数，并且m3是从1到10其中每个(NQN)基团可有不同的m1、m2、和m3的值。
23．根据权利要求22所述的一种化合物，其中m1和m2少于100。
24．根据权利要求22所述的一种化合物，其中至少一个Q位于末端位置，并且至少一个Q位于所述的多核苷酸序列的内部位置。
25．根据权利要求22所述的化合物，其中至少一个Q位于所述的多核苷酸序列的内部位置。
26．根据权利要求22所述的的化合物，其中Q位于所述的多核苷酸序列的末端位置。
27．根据权利要求1所述的化合物，其中B-X-是R3-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH(OR3)-CH2-O-；
28．一种结构式如下的化合物
29．根据权利要求1所述的一种化合物，具有R或S构型或是其外消旋混合物。
30．一种核酸探针由至少一个根据权利要求1的化合物构成。
31．一种由根据权利要求30的探针交联到靶低聚核苷酸上构成的复合物。
32．一种由根据权利要求30的两个探针构成的复合物，其中所述的每个探针含有不同的光敏化合物。
33．一种由根据权利要求30的两个探针构成的复合物，其中所述的每个探针含有相同的光敏化合物。
34．一种由至少一个根据权利要求28的化合物构成的核酸探针。
35．一种由根据权利要求34的探针交联到靶低聚核苷酸上构成的复合物；
36．一种由根据权利要求34的两个探针构成的复合物，其中所述的每个探针含有不同的光敏化合物。
37．一种根据权利要求34所述的两个探针构成的复合物，其中所述的每个探针含有相同的光敏化合物。
全文摘要
披露了新的芳基衍生物,由芳基烯烃部分连接到非核苷主链部分上构成,所得到的分子一般用作光敏交联基团,引入低聚核苷酸中,用来交联核酸链。
文档编号C07F9/26GK1325402SQ99813116
公开日2001年12月5日 申请日期1999年11月10日 优先权日1998年11月10日
发明者郑仲衡, 大卫·艾尔贝格利, 迈克尔·L·伍德 申请人:纳克斯科尔公司