硫酸化葡糖胺聚糖在建立妇女有效分娩中的用途的制作方法

专利名称：硫酸化葡糖胺聚糖在建立妇女有效分娩中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及硫酸化葡糖胺聚糖(glycosaminoglycans)在制备用于预防和治疗足月分娩进展缓慢的药物组合物中的用途。
背景技术：
产科学中常见的临床问题是滞产或某些方面的功能障碍性分娩。据证明在瑞典在所有分娩中约40％-60％的分娩产程进展缓慢或停止。在发展中国家，由伴有产后(post partum)大出血的产程停止引起的孕产妇死亡(maternaldeaths)是孕产妇死亡的最常见原因。分娩产程进展缓慢是紧急剖宫产术(caesarian section)的最常见的指征，而其通常又导致在下次怀孕时对选择性的剖宫产术的需求。滞产的其它并发症使胎儿窒息增加，导致长期的后遗症。
子宫由两部分组成，子宫体和子宫颈，它们在怀孕和分娩期间具有不同的功能。子宫体主要由平滑肌束、包埋在细胞外基质(ECM)中的子宫肌层组成，子宫颈主要由ECM组成。ECM的主要成分是胶原，但是也有较少量的蛋白聚糖。蛋白聚糖由连接有一至一百条多糖链(葡糖胺聚糖)的蛋白核心构成。
子宫收缩和软化(softening)之间的协调，或者换句话说成熟(ripening)，以及子宫颈的扩张对于正常分娩都是至关重要的。这些过程之间的不协调导致异常分娩。
在怀孕和分娩期间，子宫颈和子宫体都被重塑(remodel)。子宫体极大的重塑导致其容积增加大约七倍。子宫重塑不足与收缩性障碍有关。在建立的产程期间，子宫颈口的正常扩张是张开1-10cm，这暗示着通过胶原和蛋白多糖浓度降低产生的子宫颈结缔组织完全重建，并由此得到柔软且有弹性的子宫颈。如果此过程开始得太早，子宫颈成熟障碍会导致不足月分娩。不足月分娩必须与不足月子宫颈成熟相一致，从而导致早产。另一方面，不充分的子宫颈成熟不足导致滞产(protracted labor)和仪器分娩频率高的过月妊娠(post-term pregnancy)。因此，子宫颈成熟和子宫肌层收缩是两个过程，它们必须协调才能完成正常分娩。
顺产和滞产的生理学都是不清楚的。激素控制似乎包括孕酮引起的抑制作用和由雌激素水平增加引起的激活。促肾上腺皮质激素释放激素、前列腺素和变化的雌激素/孕酮比率暗示了涉及产程的开始。于1950年提出的静脉内输注催产素仍然是滞产的主要疗法，并且近来出版的关于产程进展缓慢的研究和综述文章主要介绍了催产素给药的不同治疗方案。这一疗法在很多病例中都失败了，并且导致手术分娩数目增加。尽管产程进展缓慢是巨大的全球性问题，但是开发用于产程促进的新药的努力却很少。
通过局部施用前列腺素E2来诱导子宫颈恶化的妇女分娩已进行了约20年。所述病例中的15％-20％子宫颈成熟及产程诱导失败。最突出的是产程停止。
现有技术K.Shaker等，British Medical Journal 16 November 1974将肝素引起的子宫收缩描述为静脉给药高剂量肝素治疗怀孕32周的32岁经产孕妇的静脉血栓形成的副作用。肝素是从动物组织分离的工业级葡糖胺聚糖，并在临床中用作抗血栓形成药。
EP0509120B1公开了葡糖胺聚糖(GAGs)在制备用于预防和治疗子宫颈阴道区域疾病的局部药物组合物中的用途。所述疾病的例子是提及的由缺乏雌激素诱发的营养不良和萎缩状况、阴道皮炎、无特异性的阴道炎等。所述GAGs据说参与了天然阴道生态系统的防护和复原。
葡糖胺聚糖被描述为属于一类高度异源类(heterogeneous)的大分子，其具有包含形成线性大分子的重复二糖单元的非常长的分子。通常，每一个重复单元包含由氨基糖，即葡糖胺和半乳糖胺组成的残基，以及由葡糖醛酸或艾杜糖醛酸组成的糖醛酸残基。C2、C3、C4和C6位的羟基以及C2位的氨基可以被硫酸根基团取代。GAGs由下列化合物所代表肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素。
EP0867452A1涉及子宫颈催熟剂(ripening agent)，其作为活性成分包括透明质酸或其衍生物。
众所周知，葡糖胺聚糖对于细胞活性有多种作用。

发明内容
最近发现，在怀孕和分娩期间的子宫重塑期间，硫酸乙酰肝素蛋白多糖的表达发生变化。因此相信它们在产程中发挥关键的作用。也已发现用硫酸化葡糖胺聚糖处理人子宫条(strips)增强了其收缩活性。
本发明涉及抗凝血活性为100BP单位/mg或更少的硫酸化葡糖胺聚糖在制备为建立妇女有效产程而预防性启动(prophylactic priming)或治愈性治疗子宫颈和子宫肌层(myometrium)的药物制剂中的用途。正常产程包括子宫颈的软化和规则的子宫肌层收缩。
通过测量每mg硫酸化葡糖胺聚糖凝血时间的增加来评价抗凝血作用，以BP单位/mg表示。肝素的抗凝血活性是157BP单位/mg。
硫酸化葡糖胺聚糖，即主要是肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素，由交替的己糖胺和糖醛酸残基构成。透明质酸没有硫酸根基团。D-葡糖醛酸(GlcA)和其C-5差向异构体L-艾杜糖醛酸(IdoA)的存在和己糖胺和糖醛酸(uronosyl)残基的特异性硫酸化赋予了聚合物极大的结构差异。此结构可以从无或极少变化至几乎100％的含艾杜糖醛酸的二糖。含GlcA-和IdoA-N-己糖胺的二糖结构可以从长嵌段变成交替的二糖模式。高度的硫酸化和高度的艾杜糖醛酸硫酸盐通常包括高生物活性的化合物。有不同的定义明确的(well-defined)硫酸皮肤素(DS)、硫酸软骨素(CS)、硫酸乙酰肝素(HS)和解聚肝素的多糖。
硫酸乙酰肝素，具有葡糖胺和糖醛酸作为重复二糖，且由主要以分隔方式排列的N-乙酰化和N-硫酸化二糖组成，在细胞表面和细胞外基质中有广泛分布。与肝素相比，它通常硫酸化较少且艾杜糖醛酸含量较低并且结构变化更大。硫酸乙酰肝素和蛋白质之间的相互作用牵涉多种生理过程，例如细胞粘着、酶调节、细胞因子作用、病毒入侵和抗凝血性质。硫酸乙酰肝素具有依赖于特定抗凝血五糖存在的抗凝血活性，然而明显不如肝素。硫酸乙酰肝素是线性多糖，如Fransson等，Structural studies on heparan sulphates，Eur.J.Biochem.106，59-69(1980)所述，其可以从猪的肠粘膜、从牛肺或从肝素支链部分利用十六烷基吡啶氯化物部分和随后的盐提取物制备。
本发明涉及硫酸化葡糖胺聚糖的用途，其属于硫酸乙酰肝素或解聚硫酸乙酰肝素。
硫酸软骨素是硫酸化线性多糖，由交替的葡糖醛酸和N-乙酰-半乳糖胺残基组成，后者在4或6位被硫酸化。它们可以由牛气管软骨或鼻软骨制备。CS对于细胞外基质的构成(organization)很重要，产生间质的膨胀压力及参与噬中性粒细胞募集。
本发明也涉及硫酸软骨素或解聚硫酸软骨素的用途。
硫酸皮肤素是硫酸化线性多糖，由交替的糖醛酸和N-乙酰-半乳糖胺残基组成。糖醛酸分别是D-GlcA或L-IdoA并且所述二糖可以分别在半乳糖胺和IdoA的4和6和2位上被硫酸化。DS可以从猪皮肤和肠粘膜制备。硫酸皮肤素具有生物学活性，例如细胞外基质的构成、与细胞因子相互作用、抗凝血活性和噬中性粒细胞的募集。
本发明也涉及硫酸皮肤素或解聚的硫酸皮肤素的用途。
低分子量肝素或解聚肝素是线性寡糖，具有2-10kDa的Mr，主要由交替的N-硫酸化葡糖胺和IdoA残基组成，并且常包含抗凝血五糖。它们可以通过特定的化学裂解由肝素制备。它们的主要临床功能是抑制因子Xa，产生抗血栓形成作用。已提出其具有抗转移(antimetastatic)性质。Fragmin(Pharmacia，瑞典)是由可控性肝素解聚获得的低分子量肝素的例子，由于因子Xa的抑制具有抗血栓形成作用。具有选择性抗凝血活性的肝素片段及其制备方法在美国专利4303651中有描述。然而，抗凝血作用对于在分娩中使用的制剂通常是不理想的。
本发明特别涉及葡糖胺聚糖的用途，其属于相对分子量低于10000Da，优选不高于6000Da的解聚肝素。
抗凝血活性必须不能太高，并且按照优选的方面，本发明涉及抗凝血活性为30BP单位/mg或更低的硫酸化葡糖胺聚糖的用途。
体外实验建议，优选的化合物是凝血效力低或无的低硫酸化结构。因此，在肝素制备期间获得的副产物是用于选择起始材料的良好候选物质。利用特定的高碘酸氧化作用来根除抗凝血酶III结合性质可以从乙酰肝素和肝素侧链部分获得具有理想性质的化合物。
选择性N-脱硫作用，然后通过再-N-乙酰化作用，或选择性O-脱硫作用也能得到抗凝血活性低的化合物。
选择性N-脱乙酰化作用，然后通过特定的N-和/或O-硫酸化作用也能得到有理想活性的化合物。
本发明尤其涉及硫酸盐/己糖胺比率低于1.0，且抗凝血活性或凝血时间小于10BP单位/mg的葡糖胺聚糖的用途。
如果在产程开始时，内源性催产素的量已经达到了其理想水平，则用将用于本发明的硫酸化葡糖胺聚糖预先治疗将促使产程开始。在内源性催产素水平不足的情况下，所述硫酸化葡糖胺聚糖可以按照单剂量与静脉注射催产素联合使用来启动子宫肌层。
本发明也涉及硫酸化葡糖胺聚糖在制备药物制剂中的用途，其可以局部地给药，例如通过子宫颈内、阴道、直肠或皮肤给药，或全身给药即胃肠外给药，例如通过皮下或静脉内注射。此药物组合物也可以通过口服给药方式给药。
至于胃肠外给药，所述活性化合物可以被加入溶液或悬液，其也包含一种或多种辅剂，例如无菌稀释剂如注射用水、生理盐水、固定性油(fixed oils)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂、抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、缓冲剂和渗透压(tonicity)调节剂。所述胃肠外制剂可以在安瓿、一次性注射器或作为输注剂输送。
局部用制剂，由活性硫酸化葡糖胺聚糖与常规可药用载体联合组成。所述载体或赋形剂可以是固体、半固体或液体材料，它们可以作为活性物质的载体。局部制剂的例子是软膏剂(ointment)、膏霜(cream)、凝胶、鼻或阴道喷剂、洗剂(lotion)、溶液或悬液。
为了使产程有效，所述硫酸化葡糖胺聚糖可以每24小时按单剂量给药1-30天，优选1-10天。此剂量必须被评估为给予子宫肌层收缩的最低剂量。推算的单剂量是25-100mg/d，但是可能高达1g或更多。该剂量与给药形式有关。
实施例实施例1制备硫酸乙酰肝素将10g肝素副产物，TB 001-91 SVCM 950130(Kabi-Pharmacia，瑞典)溶于1升的5％醋酸钙-0.5M醋酸中。将该溶液过滤。然后将过滤的溶液调整到乙醇浓度为18％。然后，将离心后的上清液浓度调整至乙醇浓度为36％。通过离心收集沉淀物。按照Fransson等，Structural studies on heparansulphates，Eur.J.Biochem.106，59-69(1980)制备下面的硫酸乙酰肝素。
制备HS6
将获得的乙醇浓度为18-36％的沉淀物溶解在1.2M的NaCl中。加入18g十六烷基吡啶氯化物(CPC)并使沉淀物生成24小时。通过过滤回收所述沉淀物，并再溶解在2M NaCl中。滤出液被用来制备HS5。向溶解的沉淀物中加入3体积的乙醇。使得到的沉淀物生成16小时，并通过离心收集。最终，将其再溶解在水中，并用3体积的乙醇-0.4％醋酸钠再沉淀。通过离心收集此沉淀物并干燥。其产量为4.34g。
制备HS5然后用0.1％的CPC稀释由制备HS6得到的滤出液至最终浓度为1.0MNaCl。然后如HS6的制备那样对其进行处理。所述沉淀物被用来制备HS4。其产量是0.82g。
制备HS4然后用0.1％的CPC稀释从制备HS5得到的滤出液至最终浓度为0.8MNaCl。然后如HS6的制备那样对其进行处理。所述沉淀物被用来制备HS3。其产量是0.51g。
制备HS3然后用0.1％的CPC稀释从制备HS4得到的滤出液至最终浓度为0.6MNaCl。然后如HS6的制备对其进行处理。所述沉淀物被用来制备HS2。其产量是0.17g。
制备HS2然后用0.1％的CPC稀释从制备HS3得到的滤出液至最终浓度为0.4MNaCl。然后如HS6的制备那样对其进行处理。其产量是0.09g。
分析不同的硫酸乙酰肝素中葡糖醛酸、艾杜糖醛酸和总硫酸根基团的含量。测定己糖胺的氨基上硫酸根基团的数目，单位为摩尔/摩尔，并测定艾杜糖醛酸残基的百分比。所述结果在下面表1中给出。通过测量每mg硫酸乙酰肝素的凝血时间来评价抗凝血活性，并且在下面表1中以BP单位/mg表示。
表1 分析硫酸乙酰肝素


上述所有硫酸乙酰肝素制剂的抗凝血活性可以通过选择性高碘酸氧化作用被消除，见Fransson LA和Lewis W，Relationship between anticoagulantactivity of heparin and susceptibility to periodate oxidation，FEBS Lett.1979，97119-23。
实施例2制备硫酸皮肤素将1kg干燥的猪皮混悬在5升的0.5M NaCl、0.01M EDTA和0.01M半胱氨酸盐酸盐中，pH为6.5，加入500mg结晶木瓜蛋白酶并使消化进行50小时。将消化液过滤然后用75ml的10％的CPC溶液沉淀。通过过滤收集所得的吡啶盐复合物，并且再溶解在包含15％乙醇的2M NaCl中。将此溶液用3体积的0.5％CPC稀释。收集所述沉淀物并溶解在200ml 1M的NaCl和40ml乙醇中。将所述物质再溶解在100ml水中，然后用3体积的乙醇-0.4％醋酸钠沉淀。收集所得沉淀物并干燥。最终产量为2.32g。见Fransson等，Structure of pig skin dermatan sulfate.1.Distribution of D-glucuronic acidresidue.(1971)Eur.J.Biochem.18，422-430。
用不同含量的L-艾杜糖醛酸制备DS将上面获得的2.2g物质溶解在220ml的5％醋酸钙-0.5M醋酸中。将此溶液与乙醇混合并分别收集在0-18％乙醇(DS-18)、18-36％乙醇(DS-36)和36％-50％乙醇(DS-50)中形成的沉淀物。将所述材料再溶解在水中并用3体积的乙醇-0.4％醋酸钠再沉淀。在干燥后，最终产量是DS-18 0.9g；DS-361.02g；DS-50 0.28g。
分析不同硫酸皮肤素中的硫酸根基团、葡糖醛酸、艾杜糖醛酸和己糖胺的含量，且所述结果列在下面表2中。
表2分析硫酸皮肤素


所述DS制剂包含占总己糖胺99％的半乳糖胺，且所述HS和肝素制剂包含占总己糖胺＞97％的葡糖胺。
实验实验1收缩性检测在下面的试验中，用从肝素支链片(heparin side fraction)段TB001-91SVCM 950130(Kabi-Pharmacia，瑞典)获得的硫酸乙酰肝素HS2和HS6进行试验。HS6与HS2不同之处在于被更高度硫酸化并且具有更多L-艾杜糖醛酸残基(见上面表1)。
子宫标本从怀孕38-39星期的进行选择性剖宫产术的妇女处获得。所述标本尺寸为20×10×10mm，取自峡状切口(isthmic incision)的较上部分。将活组织立即放入冰冷的Krebs-Ringer缓冲液中。将活组织切成纵向的条，长10-15mm且宽约5mm。将条垂直地安置在包含2ml Krebs-Ringer溶液的37℃的器官水浴中。用95％O2和5％CO2的混合物使溶液起泡以维持水浴的pH值为7.35-7.45。在所述条已平衡至稳定收缩状态后，通常在安放后1-2小时内进行试验。用Grass型7多道生理仪(Grass Instr.Co.，Quincy，MA，USA)等大地(isometrically)记录收缩。在试验期间使所有标本与100mM KCl接触以达到标准化的最大响应。然后将不同剂量的硫酸乙酰肝素加入包括所述子宫条的水浴中。在20分钟后，加入1单位催产素。用只加入1单位催产素作为对照。
使用6μg硫酸乙酰肝素重复这一步骤。在20分钟后，加入1单位催产素。记录收缩并通过积分曲线下的面积对其进行评价。加入具有不同结构的两种硫酸乙酰肝素，HS2和HS6，并使用1单位的催产素作为对照。见下面表3。
表3子宫肌层条在用硫酸乙酰肝素和催产素刺激后，相对未刺激对照的收缩性百分率


催产素与HS6联用导致收缩力增加2.5倍，而且与HS2联用导致收缩力增加4.1倍。
这表明硫酸乙酰肝素提高了人子宫条体外的收缩力。此效果依赖于硫酸乙酰肝素的结构，并且低硫酸化结构似乎更有效。
当这一试验用硫酸皮肤素DS-18重复时，见表2，收缩性已记录，但是结果还没有评价。
实验2对子宫颈成纤维细胞中Ca2+水平的影响自未怀孕的和足月怀孕的患者以及阴道分娩的妇女(分娩后患者)建立成纤维细胞培养物。将这些细胞在有10％供体小牛血清的极限必需培养基的单层培养物中培养。为了试验，将这些细胞半汇合地铺在盖玻片上，并且加入在包含10mM HEPES的磷酸盐缓冲的生理盐水中的Fluo-430分钟。最初将包含10mM HEPES(HEPES-缓冲液)的磷酸盐缓冲的生理盐水抽吸入观察室30秒，然后将在同一缓冲液中的KCl抽吸60秒，接下来是HEPES-缓冲液30秒。然后加入含10ng PDGF/ml的HEPES-缓冲液。持续监测荧光3分钟。在另外的试验中，用100μg HS6替代PDGF。在由未怀孕和足月怀孕的患者建立的培养物中没有记录到荧光的变化。在分娩后直接从患者获得的培养物中，KCl、PDGF和HS6都诱导了荧光的瞬时4-8倍的增加，这说明了细胞内Ca2+的瞬时增加。这说明从分娩后的患者建立的培养物中的细胞被HS6激活。这一效应假定为对于在临产(partus)时为待产子宫颈作最终准备是很重要的。
实验3使用达特肝素钠(dalteparin sodium)盐(Fragmin)的临床试验研究了未生育过的妇女分娩结果的临床数据。由于血栓形成的危险性增加，在怀孕期间皮下给予14名未生育过的妇女Fragmin(Pharmacia，瑞典)。除了4名妇女是每天2500IE，给药其他人的预防性剂量是每天5000IE。治疗其中的8名妇女12星期以上(范围12-28星期)且其中的6名妇女1-6星期。在本研究所包括的妇女之后在同一诊所立即生产的另外13名未给药Fragmin的未生育过的妇女被用作匹配对照。终点是产程-分娩时间(小时)和剖宫产术数目及其指征。
在所述治疗持续时间和分娩持续时间之间未发现相关性。患者组的产程-分娩时间是5.8±2.6h，对照组的产程-分娩时间是14.0±6.3h(p＜0.001)。此外，与治疗组14名中的1名相比，对照组的13名受试者中有6名被报告产程进展缓慢。
在每一组中有3例剖宫产术，但是研究组中的指征是在先惊厥、痛觉丧失不足和怀疑的胎儿窒息。在对照组中，3名都有产程停止的主要指征，并且2名妇女还有怀疑胎儿窒息。
与9名对照比较，也调查了上面给予Fragmin的21名分娩妇女的产程-分娩时间。与对照组的5.9±2.1h(范围3-12)相比，给予Fragmin组的产程-分娩时间是3.5±2.9h(范围0.5-8)(p＜0.05)。由此可见，在给药组中产程-分娩时间显著较低。
权利要求
1.抗凝血活性为100BP单位/mg或更少的硫酸化葡糖胺聚糖在制备为建立妇女有效分娩产程而预防性启动或治愈性治疗子宫颈和子宫肌层的药物制剂中的用途。
2.根据权利要求1的葡糖胺聚糖的用途，其属于硫酸乙酰肝素或解聚的硫酸乙酰肝素。
3.根据权利要求1的葡糖胺聚糖的用途，其属于硫酸软骨素或解聚的硫酸软骨素。
4.根据权利要求1的葡糖胺聚糖的用途，其属于硫酸皮肤素或解聚的硫酸皮肤素。
5.根据权利要求1-5中任一项的葡糖胺聚糖的用途，其属于由平均分子量小于10000Da，优选不大于6000Da的解聚的肝素。
6.根据权利要求1的葡糖胺聚糖的用途，所述葡糖胺聚糖的抗凝血活性为30BP单位/mg或更少。
7.根据权利要求2或6的葡糖胺聚糖的用途，所述葡糖胺聚糖的硫酸盐/己糖胺比率低于1.0，且其抗凝血活性为10BP单位/mg或更少。
8.根据权利要求1-7中任一项的葡糖胺聚糖与催产素联用的用途。
9.根据权利要求1-7中任一项的葡糖胺聚糖在制备局部用药物制剂中的用途。
10.根据权利要求1-7中任一项的葡糖胺聚糖在制备胃肠外药物制剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及抗凝血活性为100BP单位/mg或更少的硫酸化葡糖胺聚糖在制备为建立妇女有效分娩产程而预防性启动或治愈性治疗子宫颈和子宫肌层的药物制剂中的用途。
文档编号C08B37/00GK1612741SQ03801944
公开日2005年5月4日 申请日期2003年1月2日 优先权日2002年1月2日
发明者冈弗·埃克曼·奥德伯格, 安德斯·马姆斯特罗姆 申请人:迪拉富尔公司