获取岩蔷薇型双萜的方法，特别是由印度鞘蕊制取鞘蕊双萜的方法

专利名称:获取岩蔷薇型双萜的方法，特别是由印度鞘蕊制取鞘蕊双萜的方法
植物印度鞘蕊(Coleusforskohlii)属唇形科(Lamiaceae)，产地印度，含有数种岩蔷薇型双萜。含量最多的双萜是1，9-二脱氧鞘蕊双萜(1，9-dideoxyforskolin，DDF)和鞘蕊双萜(forscokin)(BHAT等;四面体通讯19，1669-1672(1977))。鞘蕊双萜的含量按全植物重计大约为0.05%，根中含量为0.1%(SHAH等药用植物39，183-185(1980))。
鞘蕊双萜(7β-乙酰氧基-8，13-环氧-1α，6β，9α-三羟基-岩蔷薇-14-烯-11-酮)的结构式如下
对植物印度鞘蕊的兴趣是由于鞘蕊双萜具有明确的药理作用。它有阳性的收缩能效应，可增加心率和降低血压(LINDNER等药物研究28(I)No.2，284-289(1978)。调节这种作用和其它许多作用是通过对膜上的腺苷酸环化酶的活化，从而增加了细胞内的环腺苷-磷酸(cAMP)的浓度(METZGERH.，LINDNERE.药物研究31(Ⅱ)No.8，1248-1250，(1981);SEAMONK.B.，DALYJ.W.环核苷酸研究7(4)201-224，(1981);DESOUZAN.等医学研究述评3(1983)，201-219)。因而鞘蕊双萜的重要意义是双重的一方面它是一种药物，另一方面它通过作为第二信使的cAMP而启动激素的作用，是研究激素作用的极好辅助剂。
鞘蕊双萜迄今主要是从野生的印度鞘蕊的干燥根中提取而得，在某些情况下也可从栽培的植物根中获得。
下面所述的本发明的方法是获得各种双萜，特别是鞘蕊双萜的新方法。
为此，将印度鞘蕊细胞进行悬浮培养，在称作维持培养基中生成的鞘蕊双萜衍生物是零或只是微量。为了刺激其产生，将细胞团块转移到“诱导培养基”中，它与维持培养基的区别特别是在植物激素激素的含量方面。在2-6周后，双萜的生成达到最大值，按干细胞物质计算，鞘蕊双萜的浓度为0.005-0.06%。
这种新的生产方法的优点是制备该物质时不受季节和气候制约;不限于印度的产地，也减少了经济和政治的风险。
下面详述本发明的方法。首先，用已知的方法制成印度鞘蕊植物的愈伤组织培养物。在用琼脂固化了的营养培养基上经过数个培养周期后，可将细胞团块转移到液体培养基中，并以悬浮培养物形式保持之。
维持培养的适宜的培养条件是贮存在玻璃器皿例如锥形瓶内;通气是靠在80-150转/分钟的轨道摇床上经振荡实现的;温度为18-38℃;连续光照，持续黑暗，或光暗交替。
常用的植物细胞培养基可以作为维持培养基，例如盖姆伯格的B5培养基(GAMBORGD.L植物生理45，372(1970)或MS培养基(MURASHIGE，T，及SKOOG，F植物生理28，473-497(1962))加上植物激素，例如适当浓度的植物生长素如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，吲哚-3-丁酸(IBA)或萘乙酸(NAA)，浓度例如为0.2-5mg/l，最好是0.5-2mg/l，和(或)加入适当浓度的植物细胞分裂素，如激动素或6-苄基氨基瞟呤(BAP)，浓度例如为0.05-2mg/l，最好是0.1-0.5mg/l。
刺激鞘蕊双萜产生的关键步骤是将细胞转移到“工作培养基或诱导培养基”中。该培养基与维持培养基的不同是a)它不含有植物激素;或b)在诱导培养基中含有一个或多个其它的植物生长素，例如IBA或NAA代替具有强去分化作用的植物生长素，2，4-D，或c)不含有植物生长素而只含有植物细胞分裂素;或d)含有浓度较维持培养基低的植物生长素和(或)植物细胞分裂素。
诱导培养基每7-30天的间隔加以更新，在每个培养周期后，要收获部分细胞物质以得到鞘蕊双萜。
在产生鞘蕊双萜期间，最好是在持续的黑暗条件下培养。
在第一诱导培养周期中，起初的培养几乎看不到生长有什么变化，鞘蕊双萜衍生物的形成通常只限于小量的1，9二脱氧鞘蕊双萜(DDF)和痕量的其它双萜。最早到第二个或第三个诱导培养周期时，鞘蕊双萜及其衍生物的生成量达到最大值。在植物根中发现的所有的双萜化合物都生成了。
产生阶段可以在锥形瓶内持续达数月，然而鞘蕊双萜的含量和培养物的生长主要取决于该方法是在无激素的培养基中进行(→产生期间大约3个培养周期)，还是在以植物生长素/植物细胞分裂素的组合形式的植物激素的存在下进行。例如，含有1.0mg/l的IBA和0.1mg/l的BAP的培养基适于进行长期产生。
为了较大规模地获得含双萜的细胞物质，培养物要在诱导培养基中要在商业发酵罐内培养。这类实验的预培养(即在诱导实验开始之前的培养周期)最好是在锥形瓶中进行，但也可移到发酵罐内进行，此时可用适当的种类换掉维持培养基。
产生实验完成以后，将细胞与营养培养基分开，因营养培养基中含双萜量很低，故可弃去。细胞干燥后，用有机溶剂(特别是甲苯，二氯甲烷，甲醇)萃取，这与由根中萃取方法相似(见德国专利No.2，557，784)。最后，用层析的方法，例如用硅胶柱将鞘蕊双萜及在适当的情况下将其它的岩蔷薇型的衍生物，例如1，9-二脱氧鞘蕊双萜和1-脱氧鞘蕊双萜从粗萃取物中分离出来。
含量测定的方法可用例如气液层析，高效液相层析(INAMDAR等药物科学杂志69，1449-1451(1980);药用植物50，30-34(1984))或薄层层析扫描。
实例1光照悬浮液的诱导作用使用保持在连续光照下的印度鞘蕊悬浮培养物。
预培养开始重量16g细胞材料(湿重)置于含有300ml培养液的锥形瓶中培养基B5(盖姆伯格的植物细胞培养基，植物生理45，372(1970))，其中含有1.0mg/l的2，4-D和0.2mg/l的激动素温度24℃振摇速度每分钟100转光照连续光照培养时间14天增殖12
诱导和产生阶段培养基含有0.4mg/l的吲哚-3-丁酸的B5培养基光照持续暗处温度24℃振摇速度每分钟100转进一步详细的方法，见下面表1
表1三个连续培养周期的光照悬浮液(即在持续光照下的悬浮培养物)的诱导作用第一个诱导第二个诱导第三个诱导培养周期培养周期培养周期细胞材料的开始重量(每300ml培养基中15g16g24g的细胞鲜重)培养时间15日13日12日增殖＊10.16.04.6鞘蕊双萜(+)0.05160.0239(干重的百分数)DDF0.01810.05420.0209(干重的百分数)＊基于冷冻干燥细胞的生物量的增殖因子处理及含量测定除掉营养培养基后，将新鲜收获的细胞冷冻干燥;
在瓷乳钵中将细胞材料研成粉末;
在常压旋转蒸发器上，一边旋转一边用甲苯萃取双萜(2小时，50℃);
萃取液过滤后，于旋转蒸发器上将滤液浓缩至干(温度为50℃);
粗萃取物在超声波浴中用甲醇处理。
鞘蕊双萜衍生物的含量测定是用薄层层析法展开，薄层扫描检测流动相甲苯∶乙酸乙酯为85∶15展开板2×15cm铺板硅胶60 F254检测STAHL茴香醛/硫酸试剂，浸泡浴;然后于130-140℃加热约5分钟扫描岛津二元CS-930由Desaga波长500nm始实例2光照悬浮法发酵，无激素培养基中产生。
本实例说明在诱导条件下对印度鞘蕊也可以较大规模地进行悬浮培养。所用的培养容器是20升的气升式发酵罐(WAHL J.，博士论文，吐宾根，1977)，并带有能自动维持培养基中氧气溶解量(pO2)的恒定装置。
起始是在发酵罐中，在正常的维持培养基中进行一次生长培养周期，然后留下4升并除去细胞悬浮物，发酵罐的工作容积为19升，再加入无激素的B5培养液。
现在紧接着是第一个诱导培养周期，培养物的生长持续旺盛;仅仅约13天后，填充细胞体积(PCV)可达到95%。此时在细胞内只能检测到小量的DDF，但没有鞘蕊双萜。
为继续实验，可再将细胞悬浮物除留下的3.5升外除去，换上无激素的新鲜B5培养液。在第二个诱导培养周期中，开始生成大量的双萜，在第9天鞘蕊双萜含量达到最大值0.0053%，DDF为0.0116%，因而第9天是收获细胞材料的最佳时刻。若继续发酵，则由于培养细胞的部分死亡，使双萜的含量不断下降。
发酵数据培养法印度鞘蕊的光照悬浮法瓶中预培养15天，在300ml的B5维持培养基中，新鲜细胞的起始重量为16-17g(新鲜细胞重量＝去掉培养基后湿细胞重量)。
温度24℃工作容积19升蔗糖葡萄糖加入蔗糖溶液(30%)以保持残留的葡萄糖含量＞0.5%生长培养周期(散射的阳光)培养基B5(1.0mg/l的2，4-D和0.2mg/l的激动素)接种细胞量2.4升＝8个预培养瓶(接种量)培养时间16天
pO235%，自第14天增至50%第一个诱导培养周期(持续暗处)培养基无激素的B5接种细胞量由生长培养周期得到的4升悬浮物培养时间13天pO235%泡沫消除总体积中加入大约250ml的聚丙二醇溶液第二个诱导培养周期(持续暗处)培养基无激素的B5接种细胞量由第一个诱导培养周期得到的3.5升悬浮物培养时间26天pO2由70%降到40%通气速度vvm＝0.06-0.10(＝每小时和每19升工作容积中通入空气70-110升)双萜含量(重量百分数)鞘蕊双萜DDF第7日0.00350.0092第8日0.00320.0093第9日0.00530.0116第11日0.00160.0102
实例3光照悬浮法的诱导，双萜的分离使用维持于连续光照下的印度鞘蕊的悬浮培养物。
预培养如实例1所述诱导和产生阶段如实例1所述，但有以下区别培养基无激素的B5起始重量每300ml培养基中含有22.5g到29.5g新鲜细胞(第二个诱导培养周期)培养时间第一个诱导培养周期15天第二个诱导培养周期11天第二个诱导培养周期终结的，收获细胞，分离双萜。
萃取用甲苯萃取2.26g冷冻干燥细胞(见实例1)粗萃取物68.6mg＝3.0%，只部分地溶解于甲醇中用柱层析法纯制鞘蕊双萜衍生物层析柱Labomatic，约50ml，装填30μm的硅胶流动相二氯甲烷∶乙酸乙酯为8∶1萃取溶剂流动相作为溶剂取代甲醇进行分离的物料量约25mg(即原溶出的粗萃取物的一半)由可洗脱物质的总量12.8mg中主要得到
0.7mg鞘蕊双萜1.0mg1，9-双脱氧鞘蕊双萜(DDF)0.4mg1-脱氧鞘蕊双萜各个组分是由气-液层析，高效液相层析(INAMDAR等，1980及1984)或双向薄层层析法鉴定核实的。
薄层层析板HPTLC，硅胶60F25410×10cm流动相Ⅰ二氯甲烷∶乙酸乙酯为8∶1Ⅱ异丙醚∶氯仿为7∶权利要求
1.获得岩蔷薇型双萜的方法，该方法是在有适当的植物激素存在的维持培养基中对印度鞘蕊细胞进行悬浮培养，然后将细胞转移到营养培养基(诱导培养基)中，诱导细胞培养物产生鞘蕊双萜，营养培养基与维持培养基的不同是加入的植物激素的浓度和(或)种类不同，以后用已知的方法分离双萜。
2.按照权利要求
1的方法，其中所用的维持培养基是植物细胞培养中常规用的培养基，加入浓度为0.2-5mg/l的植物生长素和(或)浓度为0.05-2mg/l的植物细胞分裂素。
3.按照权利要求
1的方法，其中诱导培养基与维持培养基的区别是a)不含植物激素;或b)不用具有强去分化作用的植物生长素，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，而是含有一个或多个其它的植物生长素;或c)不含植物生长素，但只含一个或多个植物细胞分裂素;或d)含有一个或多个植物生长素和(或)植物细胞分裂素，但浓度比维持培养基所含的低。
4.按照权利要求
1的方法，其中在维持培养基中的所用的植物生长素是2，4-二氯苯氧乙酸和(或)萘乙酸，这两种植物生长素在诱导培养基中改为吲哚-3-丁酸或其它具有较弱去分化作用的植物生长素，或者根本不用植物生长素。
5.按照权利要求
1的方法，其中使用的是浸没培养物。
6.按照权利要求
1的方法，其中培养是在光照，在黑暗，或在光照-黑暗交替下进行的。
7.按照权利要求
1的方法，其中培养是在温度为18到38℃下进行的。
8.按照权利要求
1的方法，诱导时间为7到30天。
9.按照权利要求
1的方法，数个诱导阶段是相继发生的，是靠一部分细胞受到刺激而产生了双萜，每种情况下，都是在新鲜的诱导培养基中进一步培养。
10.按照权利要求
1的方法，可得到鞘蕊双萜。
专利摘要
本发明是关于制取岩蔷薇型双萜的方法，特别是从印度鞘蕊的细胞培养物中获取鞘蕊双萜。该方法是将细胞培养物由维持培养基转移到诱导培养基中，诱导培养基与维持培养基的区别主要是植物激素的含量，以及在诱导培养基中经过特定的时间后，用有机溶剂萃取得到双萜。
文档编号C12N5/02GK87107118SQ87107118
公开日1988年6月15日 申请日期1987年10月24日
发明者埃内斯特·赖恩兰, 雷纳·梅尔新哥, 安德列亚·曼德勒 申请人:赫彻斯特股份公司