功能性多糖茶及其制备方法

专利名称：：功能性多糖茶及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及具有通便、调节胃肠功能的保健食品-功能性多糖茶及其制备方法，属于医药
技术领域：
。
背景技术：
：糖类药物的研发目前被认为是糖生物学研究的重要组成部分，国际上以美国、日本、欧洲研究进展较快。现已确认糖链参与生物体受精、发育、分化、免疫、神经系统的识别与调控，并在微生物与动物、微生物与植物的相互作用中担负重要作用；人体的衰老、癌症过程也涉及糖链的参与。美国已利用其在生物学方面的优势，在特殊糖产品的开发上发展迅速。日本的科技策略是以产业应用促进基础研究，糖生物工程技术已得到全面发展，在糖类药物的应用开发方面更是走在了世界的前列。目前我国糖产品的生产主要集中在一些大宗产品上，如异麦芽糖、果糖和大豆糖等，这类糖生产技术和市场相对成熟和稳定。我国糖产品主要用于食品添加剂和功能性保健食品，在饲料、生物农药和药物上也有一些应用，应用糖产品开发的终端产品市场规模达100亿元以上。除此之外，目前正加紧研发的功能性更好、有效成分含量更高的糖品种有甘露糖(包括半乳甘露糖)、木糖以及壳聚糖等。"十五"期间，一些具有一定规模和实力的科研机构和公司正纷纷涉足这些"新型"糖产品的深度研发和生产。随着人们生活节奏的加快以及环境的不断变化，越来越多的人受到便秘的困扰。宿便可以产生多种毒素并被肠道反复吸收，通过血液循环到达人体的各个部位，导致面色晦暗、皮肤粗糙、毛孔扩张、褐斑、痤疮、细小皱纹、肥胖、乏力、烦躁，宿便中的毒素进入血液，导致中老年人出现高血压、心脏病等，同时还会加重中老年人的心脑血管疾病。目前，临床上常使用的泻药有以下几种①非吸收的盐类泻药，如硫酸镁、硫酸钠等，其在肠道难以吸收，大量口服形成高渗透压而阻止肠内水分的吸收，扩张肠道，刺激肠壁，促进肠道蠕动。但硫酸镁、硫酸钠下泻作用较剧，可引起反射性盆腔充血和失水。②食物纤维素类泻药，包括蔬菜、水果中天然和半合成的多糖及纤维素衍生物如甲基纤维素、羧甲基纤维素等。其不被肠道吸收，通过增加肠内容积并保持粪便湿软而达到通便作用。但其起效较慢，且有时治疗效果不明显。③接触性泻药，如酚酞。其口服后在肠道内与碱性肠液相遇形成可溶性钠盐，能促进结肠蠕动。但其有过敏性反应，发生肠炎、皮炎及出血倾向等不良反应。④润滑性泻药，如开塞露。其主要成分为甘油、抑制菌等，是通过刺激肠壁引起排便反射来帮助排便，如果经常使用，直肠被刺激次数越多，其敏感性就越差，一旦适应了该药物将不再有反应，特别是那些大便干结且量少的患者，长期依赖开塞露排便会更困难。此外开塞露还会造成肠壁干燥，经常使用会引起习惯性便秘，并对其产生依赖性。市场上的通便保健品药物大多含大黄、芝硝、决明子、番泻叶等，因含大量刺激性成分，其产品副作用大，都不宜长期服用。我们将植物提取多糖与人们日常的茶饮料结合起来，开发出了功能性多糖茶。
发明内容为了克服现有通便产品含大量刺激性成分，副作用大，不宜长期服用的不足，本发明提供了一种功能性多糖茶，有效地解决了问题。本发明所说的功能性多糖茶，是由下列重量份的成分组成生白术多糖580份，生白术580份、生何首乌515份及荷叶纳米粉515份。本发明还提供了上述功能性多糖茶的制备方法。具体是将配方量的生白术、生何首乌及荷叶混合并超微粉碎，制得的纳米中药粉与生白术多糖混合造粒，干燥后得功能性多糖茶。本发明中所说的生白术多糖可釆用常规方法制得，但最好是通过推荐的以下具体步骤制取生白术多糖的制备取生白术粗粉加20倍水(W/W)，浸泡一h后微沸煎煮2h，滤过，滤渣再加20倍水，微沸煎煮lh，滤过，合并两次滤液，加10%(W/W)ZnS04溶液(0.4L左右)和饱和Ba(OH)2溶液(3L左右)，振摇静置。上清液加几滴Ba(OH)2溶液直至蛋白质沉淀产生完全，倾注法过滤，滤液浓缩至2L左右，静置过夜，离心除去沉淀，加4倍量的95%乙醇，静置过夜，离心后倾注法过滤，沉淀用95%乙醇洗涤，减压抽干，真空干燥即得白术多糖，收率在20%以上。本发明的功能性多糖茶具有润肠通便、提高机体免疫力、抗衰老、降血糖等功效。产品作用机理如下①增强肠蠕动，加速肠内容物在结肠内的转移，促进人体胃肠道内的粪便排出体外。②健脾补肾，润肠通便，使粪便松软润滑，容易排出。中医认为"痛则不通，不通则痛"，中、老年人、病后产后等大便不通，多为脾虚肾亏，中医称"虚秘"。使用市场上的通便保健品大多含大黄、芒硝、决明子、番泻叶等，因含大量刺激性成分，大便不通虽可短期缓解，但勉削正气，日久脾虚肾亏更重，大便不通越来越严重，造成恶性循环。我们开发的功能性多糖茶健脾补肾，通便疗效甚佳。白术是传统中药。白术中含有多糖、苍术酮、苍术醇、白术内酯、含氧香豆素类、氨基酸及树脂等成分，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎等功效，是卫生部审定的预防"非典"参考中药处方中所用药材之一。多糖和挥发油是白术发生药效的重要物质基础之一。近年来，对于多糖在抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、降血糖等方面的作用，国内外亦有报道。生何首乌具有补肝肾，益精血，乌须发，生发，强筋骨之功效。能促进造血功能，提高机体免疫功能，降血脂，抗动脉粥样硬化，保肝，延缓衰老，润肠通便等。何首乌功效作用的物质基础主要为磷脂、蒽醌类、葡萄糖苷类等成分。荷叶中国自古以来就把荷叶奉为瘦身的良药。荷叶为多年水生草本植物莲的叶片。其化学成分主要有荷叶碱、柠檬酸、苹果酸、葡萄糖酸、草酸、琥珀酸及其它抗有丝分裂作用的碱性成分。药理研究发现，荷叶具有解热、抑菌、解痉作用。经过炮制后的荷叶味苦涩、微咸，性辛凉，具有清暑利湿、升阳发散、祛瘀止血等作用，对多种病症均有一定疗效。功能性多糖茶补中求通，恢复肠道的功能，使肠道菌相发生变化，抑制腐败菌增多，促进肠道的生态平衡使肠道的功能逐渐恢复。茶中不含泻药，无任何毒副反应。图1是小鼠近端结肠组织c-kit+和nNOS+表达照片A.正常对照组小鼠近端结肠c-kit+表达(x400)E.正常对照组小鼠近端结肠nNOS+"400)B.模型对照组小鼠近端结肠c-kit+表达(x400)F.模型对照组小鼠近端结肠nNOS+(x400)C.西药尼为孚组小鼠近端结肠c-kit+表达(x400)0.西药尼为孚组小鼠近端结肠1^03+(x400)D.功能性多糖茶中剂量组小鼠近端结肠c-kh+表达(x400)H.功能性多糖茶中剂量组小鼠近端结肠nNOS+"400)图2是小鼠远端结肠组织c-kit+和nNOS+表达照片I.正常对照组小鼠远端结肠c-kit+表达(x400)M.正常对照组小鼠远端结肠nNOS+(x400)J.模型对照组小鼠远端结肠c-kit+表达(x400)N.模型对照组小鼠远端结肠nNOS+(x400)K.西药尼为孚组小鼠远端结肠c-kit+表达(x400)0.西药尼为孚组小鼠远端结肠1^03+(x400)L.功能性多糖茶中剂量小鼠远端结肠c-kit+表达(x400)P功能性多糖茶中剂量小鼠远端结肠nNOS+(x400)图3是近端结肠c-kit+细胞与nNOS+细胞平均光密度值相关性分析图4是各组近端结肠c-kit+细胞平均光密度值与小鼠排便评价指标平均积分的相关性分析(散点图)图5是各组近端结肠nNOS+细胞平均光密度值与小鼠排便评价指标平均积分的相关性分析(散点图)具体实施例方式5以下实验中涉及溶液百分浓度，乙醇为体积分数，其余为质量分数。实施例1:一、制备取生白术粗粉加20倍水(W/W)，浸泡一h后微沸煎煮2h，滤过，滤渣再加20倍水，微沸煎煮lh，滤过，合并两次滤液，加10%ZnSO4(W/W)溶液(0.4L左右)和饱和Ba(OH)2溶液(3L左右)，振摇静置。上清液加几滴Ba(OH)2溶液直至蛋白质沉淀产生完全，倾注法过滤，滤液浓縮至2L左右，静置过夜，离心除去沉淀，加4倍量的95%乙醇，静置过夜，离心后倾注法过滤，沉淀用95%乙醇洗涤，减压抽干，真空干燥即得白术多糖，收率在20%以上。配方l;将生白术400g、生何首乌100g及荷叶100g混合并超微粉碎至纳米级粒径，制得的纳米中药粉与400g生白术多糖混合造粒，干燥后装袋或压制成片得功能性多糖茶。配方2:将生白术25g、生何首乌25g及荷叶25g混合并超微粉碎至纳米级粒径，制得的纳米中药粉与200g生白术多糖混合造粒，干燥后装袋或压制成片得功能性多糖茶。配方3:将生白术200g、生何首乌75g及荷叶75g混合并超微粉碎至纳米级粒径，制得的纳米中药粉与25g生白术多糖混合造粒，干燥后装袋或压制成片得功能性多糖茶。二、用法、用量每次一袋，(35g/袋)，热水冲泡，一日三次，饭后服用。三、使用注意事项1.孕妇慎用。2.年青体壮者便秘时不宜用本药。3J艮用本药出现大便稀溏时应立即停服。4对本品过敏者禁用，过敏体质者慎用。5.大便溏泄者慎服。6.儿童必须在成人监护下使用。四、质量标准(一)鉴别取供试品三袋研成粉末并取0.5g，加正己烷2ml，超声处理15min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取白术对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。吸取上述新制备的两种溶液各10pl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(609(TC):乙酸乙酯=50:1为展开剂，展开；取出，晾干；喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，6在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，并应显有一桃红色主斑点(苍术酮)。(二)多糖含量测定1、仪器与试药仪器WFZ-26A型紫外分光光度计(天津拓普仪器有限公司)试剂75%乙醇、硫酸锌、氢氧化钡、硫酸、苯酚(均为分析纯)；果糖标准品中国药品生物制品检定所供试品功能性多糖茶2、方法与结果1)水溶性糖的制备取供试品三袋研成粉末并取2.00g，置圆底烧瓶中，加水20ml，煮2h，滤过，然后在滤渣中加水15ml，回流煮沸30min，滤过，合并两次滤液，加2ml5。/。硫酸锌溶液和8ml饱和氢氧化钡溶液，振摇静置至蛋白质沉淀完全，滤过，保留溶液，加水稀释至50mL。2)还原性糖的制备取供试品三袋研成粉末并取2.00g，置圆底烧瓶中，加乙醇液30ml，放至85。C水浴中，回流提取lh，过滤，在滤渣中加乙醇液30ml，同法提取两次，合并3次滤液，蒸发掉乙醇后，加水稀释至100ml还原性糖溶液。3)检测方法紫外分光光度法(1)线性关系考察精密称取经干燥至恒重的果糖标准品100mg，置1000ml量瓶中，加水至刻度，配成浓度为100[ig/ml的标准贮备液，用10ml量瓶8个，分别加入上述标准贮备液0，1.00，2.00，4.00，5.00，6.00，8.00，9.00ml加水至刻度，分别转移至lOOml的干燥小烧杯中，各加入10ml5。/。苯酚水溶液，混匀，再各加入50ml浓硫酸振摇10min，在85。C的水浴中放置20min,于495nm波长处测定吸光度，计算回归方程。(2)精密度试验取果糖标准品对照品溶液，按上述方法操作，重复测量6次，记录测量值并计算RSD。(3)稳定性试验取供试品溶液，按上述方法操作，于12h内每隔lh测定l次吸光度，计算RSD。(4)回收率试验在水溶性糖溶液和还原性糖溶液中精密加入果糖标准品溶液(n=6，高、中、低各两个剂量)，按供试品溶液的制备方法处理并适当稀释，测定吸光度，计算回收率及其RSD。7(5)样品含量测定取水溶性糖溶液l.OOml、还原性糖溶液4.00ml，分别置100ml量瓶中，稀释至刻度，分别取上述两种溶液l.OOml，4.00ml，按上述方法操作，于495nm波长处测定吸光度，代入回归方程计算百分含量。功能性多糖茶总糖含量应^40%。实施例2药效学实验(一)功能性多糖茶对DC所致小鼠STC的治疗作用研究1、材料1)生白术各剂型及其有效成分的制备(1)药材生白术饮片，产地浙江，批号070516，购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司。将其粉碎成粉末状，过20目筛。(2)制备方法A.生白术挥发油制备采用C02超临界流体萃取装置萃取。用前先用95%酒精清洗仪器，直到流出的液体变为无色，并将其排尽，以排除其他药材影响。加粉碎后的生白术粉末9kg，萃取温度50'C，压力为28Mpa，C02流量为120L/h。在分离温度35°C，压力为5Mpa条件下收集到挥发油316.8654g，得率2.11%。B.功能性多糖茶制备按实施例1的方法制备配方1的产品C.生白术水煎剂制备-取生O术粉末lkg，蒸馏水浸泡12小时后自动煎药锅煎煮，煮沸后再保持微沸30分钟，12层纱布过滤，重复两次，合并三次滤液，用旋转蒸发仪80'C加热浓缩至500ml，每毫升相当于原药材2g。D.生白术结肠微丸由扬州联环制药有限公司研制。2)实验动物ICR小鼠，清洁级，140只，雌雄各半，18~25g，由扬州大学医学院动物房购自南京医科大学实验动物中心。3)药物复方地芬诺酯(每片含盐酸地芬诺酯2.5mg，硫酸阿托品0.025mg),批号0707002,常州康普药业有限公司生产，购自苏北人民医院。尼为孚(马来酸曲布美汀分散片)，国药准字HZ0040882，浙江昂立康制药有限公司，购自江苏省苏北人民医院。硫酸钡(I型)干混悬剂，批号060310，青岛东风化工有限公司生产，苏北人民医院放射科赠。4)实验试剂配制(水为溶剂)按照体表系数折算人和小鼠的用药量，人(70kg)和小鼠(20g)的换算系数为0.0026生白术水煎剂稀释成浓度为780g(相当生药)/L，置-2(TC冰箱内保存。生白术挥发油配制成浓度分别为390g(相当生药)/L、780g(相当生药)/L、1560g(相当生药)/L的低、中、高组，置-2(TC冰箱内保存，用前摇匀。功能性多糖茶配制成浓度分别为390g(相当生药)/L、780g(相当生药)/L、1560g(相当生药)/L的低、中、高组，置-2(TC冰箱内保存。尼为孚配制成浓度为7.80g/L的溶液，置-20'C冰箱内保存。复方地芬诺酯片，研钵研成极细粉末，以盐酸地芬诺酯计，配制成5g/L的悬浊液，置4'C冰箱备用。硫酸钡混悬剂临用前配制成200%糊状液。5)实验仪器超临界流体萃取装置HA221-40(50)-25型南通市华安超临界萃取有限公司(江苏省中医药研究院.南京)；中药煎药机YFT20型北京东华原医疗设备有限责任公司；旋转蒸发器SENCOR203型上海申生科技有限公司产品；电子天平DT500:常熟市百灵天平仪器有限公司；电子天平MP200A:上海市第二天平仪器厂；微波炉WP800TL23-K1:顺德市格兰仕微波炉电器有限公司2、实验方法1)动物分组A.空白对照组12只，不造模，给药以蒸馏水10ml/kg*d灌胃。B.模型对照组12只，造模，给药以蒸馏水10ml/kg*d灌胃。C.西药尼为孚组12只，造模，给药以尼为孚78mg/kg'd灌胃。D.生白术水煎剂组12只，造模，给药以相当于生药7.8g/kg'd灌胃。E.生白术结肠微丸组12只，造模，给药以相当于生药7.8g/kg'd灌胃。F.生白术挥发油低剂量组12只，造模，给药以相当于生药3.9g/kg'd灌胃。G.生白术挥发油中剂量组12只，造模，给药以相当于生药7.8g/kg"d灌胃。H.生白术挥发油高剂量组12只，造模，给药以相当于生药15.6g/kg*d灌胃。I.功能性多糖茶低剂量组12只，造模，给药以相当于生药3.9g/kg，d灌胃。J.功能性多糖茶中剂量组12只，造模，给药以相当于生药7.8g/kg.d灌胃。K.功能性多糖茶高剂量组12只，造模，给药以相当于生药15.6g/kgd灌胃。2)造模方法及给药方法小鼠适应性饲养两天。然后依照文献[2方法加以改进进行造模，以复方地芬诺酯50mg/kg灌胃，连续14天。给药14天剂量如上。生白术结肠微丸用自制灌胃针每日灌服。其余各组常规方法给小鼠灌胃。3)观察指标正常饲养期、便秘造模期和药物治疗期结束前日予200%硫酸钡糊状液0.3ml/只灌胃，记录时刻，待其排出第一粒白色粪便时再记录时刻，从而计算出口-肛传输时间。正常饲养期、便秘造模期和药物治疗期结束当天10:OO将全部小鼠单笼饲养，下午13:00收集3h粪便放于纸上，称重，电子天平称其重量(粪便湿重)，微波炉高火烘烤5分钟，称得干重，含水量=(湿重干重)/湿重X100。/a。次日上午10:00收集324h粪便，如上得出324h粪便湿重及324h含水量。此外，分别按照口肛传输时间、3h粪便湿重及含水量、3~24h粪便湿重及含水量五个指标的统计结果，按照治疗效果将各组从优到差进行排序，按照顺序依次记为1~11分，并将各组的五个分值输入统计软件，进行统计，综合五个方面评价各组治疗效果。4)统计处理所得数据输入SPSS10.0统计软件包及EXCEL软件进行处理，描述性资料以均数土标准差(；士s)表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，两两比较采用q检验LSD法。而小鼠排便评价指标积分的多组整体比较采用Kmskal-Wallis检验，组间两两比较则采用Mann-Whitney检验。以P<0.05为有统计学差异，以P<0.01为有显著统计学差异。3、结果1)小鼠一般情况和体重变化情况各组小鼠在三期均能正常饮水、进食。造模期小鼠死亡三只，西药尼为孚组及生白术低剂量组小鼠在给药期各死亡一只。治疗期功能性多糖茶中剂量组小鼠的活动状况及生长情况均要好于其余各组。102)口-肛传输时间(1)模型期各组均明显长于正常对照组(P<0.01)。(2)给药期A.与正常对照组相比模型对照组、生白术结肠微丸组、西药尼为孚组、生白术挥发油各剂量组均显著长于该组(P<0.01);B.与模型对照组相比西药尼为孚组，生白术水煎剂组、多糖功能茶各剂量组均短于该组，前者(P<0.05)，后三者(P<0.01);C.与西药尼为孚组相比生白术水煎剂组、多糖功能茶各剂量组均显著短于该组(P〈0.01)，生白术结肠微丸组则长于该组(P<0.05)。此外，生白术各组间比较水煎剂组及多糖功能茶各剂量组均短于结肠微丸组、挥发油各组(P〈0.01)。多糖功能茶中剂量组短于水煎剂组、多糖功能茶低、高剂量组(P〈0.01)。(见表l)表l小鼠口肛传输时间(min,;c±_g)_正常期模型期给药期正常对照组119.58±23.60120.67±23.96119.92±21.14模型对照组123.25±27.79224.17±27.47180.67±26.95女西药尼为孚组122.09±14.18223.00±29.03161.73±23.93*众生白术水煎剂组120.17±16.56222.67±31.81132.00土22.36#厶生白术结肠微丸组121.33±11.37219.58±31.88跳00±21.生白术挥发油低剂量组120.70±18.10218.82±32.07178.27±20.16女V生白术挥发油中剂量组120.75±22.54220.92±28.21176.75±14.44★▽生A术挥发油高剂量组122.28±14.40218.00±28.25178.45±22.46功能性多糖茶低剂量组120.82±17.39228.45±38.89129.64±16.10#A*T功能性多糖茶中剂量组122.58±14.70221.25±30.23104.25±14.Ol共AV*功能性多糖茶高剂量组119.73±20.39227.09±36.36129.64±17.70#A*▼注VS正常对照组女P〈0.01;VS模型对照组弁P《0.01,众P〈0.05;VS西药尼为孚组AP<0.01，女P〈0.05;VS生白术水煎剂组VP〈0.01;VS生白术挥发油各剂量组及生白术组*P<0.01;VS功能性多糖茶中剂量组TP〈0.01。3)3h粪便湿重(1)模型期各组均明显轻于正常对照组(P<0.01)。(2)给药期11A.与正常对照组相比模型对照组轻于该组(P<0.01)，而生白术水煎剂组、结肠微丸组、多糖功能茶低、中剂量组则重于该组(P<0.01);B.与模型对照组相比，各组均重于该组(P<0.01);C.与西药尼为孚组相比，生白术水煎剂组、多糖功能茶中剂量组重于该组(P<0.01)，生白术结肠微丸组亦重于该组(P<0.05)。此外，生白术各组间比较，结肠微丸组重于挥发油中剂量组及多糖功能茶高剂量组(P<0.05)，同时重于挥发油高剂量组(P<0.01);水煎剂组均重于挥发油各组及多糖功能茶高剂量组(P<0.01);多糖功能茶中剂量组明显重于各组(P<0.01)。(见表2)表23h粪便湿重(g，；±s)正常期模型期给药期正常对照组0.3433±0.06740.3389±0.02700.3550±0.0325模型对照组0.3589±0.04270.1228土0.02610.1970±0.0433大西药尼为孚组0.3747±0.03530.1157±0.01810.3781±0.0387#生白术水煎剂组0.3548土0.05620.1288±0.02620.4144±0.0224*#△生白术结肠微丸组0.3590±0.03600.1247土0.01900.舰l士O.0215*弁众生白术挥发油低剂量组0.3735±0.02990.1155±0.02770.3799±0.0360#VT生白术挥发油中剂量组0.3719±0.03720.ino土o.01930.3694±0.0273#V*▼生白术挥发油高剂量组0.3676±0.03040.1155±0.01880.3775±0.0291#W功能性多糖茶低剂量组0.3499±0.02720.1144±0.01650.3891±0.0261女#T功能性多糖茶中剂量组0.3694±0.03320.1303±0.02760.5333±0.0245*#△▽*▲功能性多糖茶高剂量组0.3455±0.03050.1146±0.02130.3746±0.0339弁V女T注VS正常对照组头P〈0.01;VS模型对照组弁P〈0.01;VS西药尼为孚组厶P〈0.01,众P〈0.05;VS生白术水煎剂组VP〈0.01;VS生白术组*P<0.01,女P〈0.05;VS生白术挥发油各剂量组AP〈0.01;VS功能性多糖茶中剂量组TP〈0.01。4)3h粪便含水量(1)模型期各组均明显小于正常对照组(P<0.01)。(2)给药期-A.与正常对照组相比模型对照组、生白术挥发油各剂量组及功能性多糖茶低剂量组均小于该组(P<0.01),西药尼为孚组亦小于该组(P<0.05)，而功能性多糖茶中、高剂量组则显著大于该组(P<0.01);B.与模型对照组相比除生白术挥发油各剂量组与之无显著差异外，其余各组均大于该组(P<0.01);C.与西药尼为孚组相比功能性多糖茶中、高剂量组及生白术水煎剂组均大于该组，前两者(P<0.01)，后者(P<0.05)，而生白术挥发油各剂量组均小于该组(P<0.01)。此外，生白术各组间比较水煎剂组及多糖功能茶各剂量组均显著大于挥发油各组(P<0.01);水煎剂组均大于多糖功能茶低剂量组而小于多糖功能茶中、高剂量组(P<0.01);多糖功能茶中、高剂量组大于多糖功能茶低剂量组(P<0.01)。(见表3)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注VS正常对照组大P〈0.01，女P〈0.05;VS模型对照组弁P〈0.01;VS西药尼为孚组AP<0.01，*P<0.05;VS生白术水煎剂及组VP〈0.01;vs生白术挥发油各剂量组*P<0.01;VS功能性多糖茶中、髙剂量组VP〈0.01。5)324h粪便湿重(1)模型期各组均明显轻于正常对照组(P<0.01)。(2)给药期A.与正常对照组相比模型对照组、西药尼为孚组及生白术挥发油各剂量组均轻于该组(P<0.01)，而功能性多糖茶中剂量组重于该组(P<0.01);B.与模型对照组相比除生白术挥发油各剂量组外，其余各组均重于该组(P<0.01);C.与西药尼为孚组相比生白术结肠微丸组、功能性多糖茶中高剂量组重于该组(前者P<0.05，后两者P〈0.01)，生白术挥发油各剂量组均轻于该组(P<0.01)。此外，生白术各组间比较水煎剂组、结肠微丸组、多糖功能茶各组均重于挥发油各组(P<0.01)。多糖功能茶中剂量组大于水煎剂组、结肠微丸组及多糖功能茶低剂量组(P<0.01)，同时大于多糖功能茶高剂量组(P<0.05)。(见表4)表43-24h粪便湿重(g,;±s)正常期模型期给药期正常对照组3.0048±0.49023.0512±0.23413.0591±0.3247模型对照组2.9542±0.34581.3689±0.18501.5057±0.2430★西药尼为孚组3.0229±0.47511.3289±0.20062.7719士0.3400*#生白术水煎剂组2.9623±0.22301.3891±0.20472.9484±0.1479#生白术结肠微丸组2.9265±0.11381.3313±0.15572.9784±0.2312#众生白术挥发油低剂量组2.9234±0.16801.3350±0.35181.5405±0.1646*△▽生白术挥发油中剂量组2.9017±0.18291.3756±0.18561.5273±0.1857*△▽生白术挥发油高剂量组2.9334±0.18841.3832±0.07501.5408±0.0920*△▽功能性多糖茶低剂量组2.9973±0.21351.3757±0.25562.9336±0.1832弁*▼功能性多糖茶中剂量组2.9893±0.14151.3921±0.20763.3168±0.2483*#△▽*功能性多糖茶高剂量组2.9642±0.28271.3498±0.22403.0851±0.1608#厶*★注VS正常对照组女P〈0.01;VS模型对照组弁P〈0.01;VS西药尼为孚组AP〈0.01,众P〈0.05;VS生白术水煎剂及组VP〈0.01;VS生白术挥发油各剂量组*P<0.01;VS功能性多糖茶中剂量组TP《0.01，女P〈0.05。6)324h粪便含水量〔1)模型期各组均明显轻于正常对照组(P<0.01)。(2)给药期A.与正常对照组相比模型对照组、生白术挥发油各剂量组小于该组(P<0.01)，功能性多糖茶中剂量组则大于该组(P<0.05);B.与模型对照组相比除生白术挥发油各剂量组外，其余各组均大于该组(P<0.01);C.与西药尼为孚组相比生白术挥发油各剂量组小于该组(P<0.01)，功能性多糖茶中剂量大于该组(P<0.01)。此外，生白术各组间比较水煎剂组、结肠微丸组、多糖功能茶各剂量组均重于挥发油各剂量组(P<0.01);多糖功能茶中剂量组大于水煎剂组、结肠i![丸组及多糖功能茶高剂量组(P<0.01)，同时大于多糖功能茶低剂量组(P<0.05)。(见表5)14表53-24h粪便含水量(％,x±s)正常期模型期给药期正常对照组43.89±5.3643.44±5.2342.47±4.81模型对照组42.7±5.0026.19±2.5136.39±3.54★西药尼为孚组43.68±4.5626.03±1.5842.42±4.86井生白术水煎剂组44.82±4.4827.54±4.7441.88±2.04#生白术结肠微丸组43.43±3.2327.37±1.4841.80±2.21#生白术挥发油低剂量组43.51±2.4627.48±2.0536.16±3.生白术挥发油中剂量组43.25±3.3827.44±2.7636.13±3.生白术挥发油高剂量组44.65±3.3326.75±3.3936.48±2.功能性多糖茶低剂量组43.65±4.4126.41±5.4543.57±5.62#*★功能性多糖茶中剂量组44.06±4.1027.00±2.7347.34±2.61*#△▽*功能性多糖茶高剂量组43.93±1.6826.11±3.3642.78±6.47#*▼注VS正常对照组大P〈0.01;VS模型对照组井P〈0.01;VS西药尼为孚组AP〈0.01，；VS生白术水煎剂及组VP〈0.01;VS生白术挥发油各剂量组*P<0.01;VS功能性多糖茶中剂量组TP〈0.01，女P〈0.05。7)给药期各指标排序及分值(见表6、表7)表6排便评价指标综合积分(S±s)分组积分正常对照组4.60±3.13模型对照组10.60±0.89*西药尼为孚组6.OO土O.71#生白术水煎剂组4.20±1.64#V生白术组5.80±2.77众生白术挥发油低剂量组8.00土1.87M生白术挥发油中剂量组9.40±1.52*VA生白术挥发油高剂量组8.20±0.84众※A功能性多糖茶低剂量组4.40±2.07#令§功能性多糖茶中剂量组1.20土0.45T井※厶&女功能性多糖茶高剂量组3.60±2.()#注VS正常对照组TP〈0.01，*P<0.05;VS模型对照组弁P〈0.01，众P〈0.05;VS西药尼为孚组※P〈0.01,VP<0.05;VS生白术水煎剂组AP〈0.01，女P〈0.05:VS生白术结肠微丸释放剂组&P〈0.01;VS生白术挥发油各组女P〈0.01,令P〈0.05;VS功能性多糖茶低剂量组§P<0.01,0P<0.05。表7排序及积分情况积分口-肛传输时间3h粪便湿重3h粪便含水量3-24h粪便湿重3-24h粪便含水量1功能性多糖茶中剂量组功能性多糖茶中剂量组功能性多糖茶高剂量组功能性多糖茶中剂量组功能性多糖茶中剂量组2正常对照组生白术水煎剂组功能性多糖茶中剂量组功能性多糖茶高剂量组功能性多糖茶低剂量组3功能性多糖茶低剂量组生白术缓释剂组生白术水煎剂组正常对照组功能性多糖茶高剂量组4功能性多糖茶高剂量组功能性多糖茶低剂量组正常对照组生白术组正常对照组5生白术水煎剂组生白术挥发油低剂量组生白术缓释剂组生白术水煎剂组西药尼为孚组6西药尼为孚组西药尼为孚组西药尼为孚组功能性多糖茶低剂量组生白术水煎剂组7生白术挥发油中剂量组生白术挥发油高剂量组功能性多糖茶低剂量组西药尼为孚组生白术组8生白术挥发油低剂量组功能性多糖茶高剂量组生白术挥发油低剂量组生白术挥发油高剂量组生白术挥发油高剂量组9生白术挥发油高剂量组生白术挥发油中剂量组生白术挥发油高剂量组生白术挥发油低剂量组模型对照组10生白术缓释剂组正常对照组生白术挥发油中剂量组生白术挥发油中剂量组生白术挥发油低剂量组11模型对照组模型对照组模型对照组模型对照组生白术挥发油中剂量组(1)Kruskal-Wallis检验比较11组的疗效积分，得出x2=38.369，PO.001,具有显著统计学差异。(2)采用Ma皿-Whitney检验，两两比较各组的小鼠排便评价指标综合积分得出A.与正常对照组相比模型对照组、生白术挥发油中剂量组差于该组(P<0.05)，功能性多糖茶中剂量组均优于该组(P<0.01);B.与模型对照组相比西药尼为孚组、生白术水煎剂组、功能性多糖茶各剂量组均优于该组(P<0.01)，而生白术结肠微丸组、挥发油低、高剂量组亦优于该组(P<0.05);C.与西药尼为孚组相比生白术水煎剂组、功能性多糖茶中剂量组均优于该组(前者P〈160.05，后者P〈0.01);挥发油中、高剂量组差于该组(P<0.05)。此外，生白术各组间比较水煎剂组优于挥发油中、高剂量组及低剂量组(前两者P<0.01，后者P〈0.05);多糖功能茶低、高剂量组优于挥发油各剂量组(P<0.05);多糖功能茶中剂量组优于其余生白术各组(除多糖功能茶高剂量组P〈0.05夕卜，其余P〈0.01)。各组小鼠排便评价指标综合积分排序功能性多糖茶中剂量组〉功能性多糖茶高剂量组>生白术水煎剂组〉功能性多糖茶低剂量组>正常对照组〉生白术组>西药尼为孚组>生白术挥发油低剂量组〉生白术挥发油高剂量组〉生白术挥发油中剂量组>模型对照组4、结论白术(rhizomaatractylodismacrocephalae)，为菊禾斗植物白术(Atractylodesmacrocephalaekoedz)的干燥根茎，性温，味甘、苦，归脾、胃经，具有补脾益胃，燥湿和中之功效。《别录》中云"……土旺则能健运，故食停滞者，有痞积不通者，皆用之(白术)"。《全生指迷方》中载有宽中丸，其功效为通便利肠，组成为白术和橘皮。汪机《本草会编》有云"脾恶湿，湿胜则气不得旋化，津何由生？用白术以除其湿，则气得周流而津液生矣。"这些历代文献都清晰的表明白术具有健脾益气、利湿运腑的多种功效，《中华本草》亦指出脾虚不能为胃行其津液，肠道失润，可重用白术加味"运化脾阳"以行津液而润肠道[3]。目前从临床研究到实验研究学者们对白术具有调节结肠运动已达成共识，但是对于其对作用的有效成分的研究相对较少，且存在较大的争议。白术的主要成分包括挥发油、白术内酯及多糖功能茶[4]。我们在前期研究中发现生白术醇提物、白术内酯类对于DC所致的STC小鼠排便状况无明显改善，而水煎剂却能明显改善小鼠的排便状况。我们在此基础上重点探讨生白术水煎剂中的主要成分多糖功能茶以及白术的另一主要成分挥发油对STC小鼠排便状况的影响，并增设了生白术结肠微丸组，使药物效果直达结肠，以观察其定位释放后的局部作用效果。本实验设11组，正常对照组未以造模也未给予治疗，作为阴性对照；模型对照组仅予造模，不予治疗；西药尼为孚(马来酸曲布美汀)对照组、生白术水煎剂组、生白术结肠微丸组、功能性多糖茶(低、中、高剂量)组、生白术挥发油(低、中、高剂量)组均造模并在治疗期给予相应药物干预。通过观察各组小鼠的排便情况，比较各组疗效。其中从口-肛传输时间上可以看出生白术水煎剂组及多糖功能茶各剂量组均短于西药尼为孚组、生白术挥发油各剂量组，且与正常对照组相比无差异，其中以功能性多糖茶中剂量组效果最佳。粪便湿重和含水量主要反映大肠"变化"和吸收水分的功能，就3h粪便湿重、3-24h粪便湿重和3-24h粪便含水量来看，功能性多糖茶中剂量组效果最佳。而3h粪便含水量则以功能性多糖茶高剂量组为佳。综合五个指标的综合积分我们得出功能性多糖茶中高剂量能较好地治疗DC所致小鼠STC(尤以中剂量最佳)，各项指标能恢复至正常，其中功能性多糖茶中剂量组3h粪便湿重、3-24h粪便湿重和3-24h粪便含水量以及综合积分均明显优于正常组，差异显著。另外，我们在实验中发现生白术水煎剂组与生白术结肠微丸组均对STC有效，但其效果稍逊于功能性多糖茶中高剂量组，推测可能与药物中所含的其他有效成分的干扰等因素有关，而挥发油各组对DC所致小鼠STC无显著治疗作用，与文献报道的不一致[5]。功能性多糖茶的通便作用可能与以下几方面有关①植物多糖功能茶一般多含有很多亲水基团，吸水性强，持水性好，吸水后能将自身膨胀到原来的几倍甚至几十倍，可使粪便松软易于从直肠运到肛门，顺利排出体外；②粪便体积增大而剌激肠壁蠕动，缩短粪便排出体外的时间；③有利于肠道内这些细菌的生长繁殖，促进粪便中细菌量的增加。细菌可分解底物产气，这与临床上用生白术水煎剂后患者诉矢气增多，肠蠕动增强所一致。在治疗期我们未发现有小鼠发生水泻的情况，即使在含水量较大的粪便中仅仅是比较柔软，但没有稀水或者不成形的粪便排出，这与以往不少临床报道相吻合[6]。现代药理研究表明生白术具有增强结肠集团推进性蠕动并能促进胃肠分泌功能[7]，这些作用可能都与其主要成分多糖功能茶有关。生白术通便一般临床用量多用60g/d效果较佳，本项实验也以此作为中剂量组换算，并且发现多糖功能茶中高剂量对STC均有较好的疗效，而有些指标反而是中剂量优于高剂量，这提示功能性多糖茶治疗STC并不是剂量越大越有效，如何确定一个最佳剂量还需进一步研究。综上所述，功能性多糖茶中剂量治疗STC的效果要优于西药尼为孚、生白术水煎剂、生白术结肠微丸，其能加快肠道传输时间、促进排便量、软化粪便，而生白术挥发油对STC无显著治疗作用。我们初步推测生白术治疗STC的有效成分为多糖功能茶，其详细的作用机制有待进一步实验研究。(二)功能性多糖茶对STC小鼠结肠中ICC/nNOS的影响ICC是分布在胃肠道神经末梢与平滑肌之间的一类特殊细胞，它们通过缝隙连接彼此相连，形成三维网络，被认为是肠道平滑肌运动的起搏点及协调者。在胃肠道，c-kit免疫组织化学染色方法标记ICC具有特异性。nNOS在ENS的平滑肌松弛反应中起重要作用。本研究应用抗c-kit和抗nNOS免疫组化方法观察ICC和nNOS在STC小鼠中的分布以及中药生白术干预后的状态，以初步探讨生白术活性成分治疗STC的作用靶点。1、材料181)试剂c-kit(sc-168)兔的多克隆抗体，SantaCruzBiotechnologyInc产品，北京中杉公司分装；nNOS抗体冻干粉(bs-156R)，北京博奥森公司产品。两者均为兔抗的多克隆抗体；SABC免疫组化试剂盒(即用型)一兔IgG，编号SA1022:武汉博士德生物工程有限公司生产；DAB显色试剂盒，编号AR1022:武汉博士德生物工程有限公司生产；多聚赖氨酸，批号ISP8920,Sigma公司生产；柠檬酸三钠(分析纯)，批号20000209，上海试剂一厂生产；柠檬酸(分析纯)，批号20001215，上海试剂一厂生产；中性树胶，批号20050715，上海标本模型厂生产；过氧化氢溶液(分析纯)，批号20060212，上海焱晨化工实业有限公司生产。2)主要试剂的配制中性缓冲甲醛固定液蒸馏水900ml，甲醛溶液lOOml，Na2HP04.12H2032.755g，NaH2P04.2H204.522g;0.01MPBS:氯化钠8.5g、Na2HP04.12H205.8g、NaH2PO4.2H2O0.4g、双蒸水lOOOml，调pH值至7.4。柠檬酸盐缓冲液柠檬酸三钠3g、柠檬酸0.4g、双蒸水1000ml。3%双氧水溶液过氧化氢溶液l份、双蒸水9份。临用前现配，避光保存。多聚赖氨酸溶液多聚赖氨酸与去离子水l:10配制，盛在塑料容器中，置4'C冰箱备用°苏木素染液A液苏木素lg，95%乙醇50ml，碘酸0.1g;B液硫酸铝钾4.4g，蒸馏水350ml;C液柠檬酸0.5g，无水乙醇50ml，甘油50ml，充分搅拌。配制方法A液苏木素溶于乙醇中，加入氧化剂碘酸，震荡、充分搅拌溶解；B液将硫酸铝钾溶于微波炉加热的蒸馏水中配成媒染剂；C液将柠檬酸溶于无水乙醇中，加入甘油充分搅拌均匀。先将A液与B液混合，再将C液加入充分搅拌即可使用。伊红染液曙红Y2g，80%酒精400ml。盐酸乙醇分化液盐酸4ml，70%酒精396ml。0.2%氨水溶液氨水0.8ml，蒸馏水400ml。中性树胶溶液二甲苯与中性树胶等比混合。3)实验器材轮转式切片机YD-202:浙江省金华市益迪医疗设备厂；系统显微镜BX51:Olympus公司；双目生物显微镜GalenIIlLeica公司；JEDA801D形态学图象分析系统江苏捷达科技发展有限公司；恒温水浴箱1255PC-2E:SHELDON公司；19可调电热器丹阳市太阳凤美医用光学厂；超净工作台上海博讯公司医疗设备厂；电热干燥箱202—2型东台电器厂；磁力加热搅拌器79-l:国华仪器厂；SUPOR高压锅苏泊尔饮具股份有限公司；电冰箱BCD-183A:合肥荣事达电冰箱有限公司。2、实验方法1)实验标本的采集小鼠颈推脱臼法处死，立即剖腹，分离肠道，找到盲肠，剪取近端结肠(相当于人的回盲部结肠)8-10mm，再剪取距离肛门IOmm左右的远端结肠(相当于人的乙状结肠)8-10mm，清水中轻轻震荡，除去肠内容物，放入中性缓冲甲醛固定液中固定。2)石蜡切片的制作将标本固定24小时后倒去固定液，流水冲洗2h，将组织内的所含固定液清洗出去。酒精逐级脱水，75。/o乙醇60min，80%乙醇、卯％乙醇、95%乙醇(I)95%乙醇UI)、100%乙醇(I)、100%乙醇(II)各30分钟。二甲苯透明二甲苯(I)15分钟，二甲苯(II)20分钟。最后浸入石蜡(I)(II)各40分钟。用石蜡(ni)包埋组织。石蜡切片4微米，用涂有多聚赖氨酸载玻片贴片，60C恒温箱内烘片60min。3)免疫组化法(1)二甲苯(I)(II)中脱蜡共30分钟。(2)无水酒精(I)(11)、95%乙醇、卯％乙醇、80%乙醇、75%乙醇各5分钟。(3)自来水洗3遍，蒸馏水洗1遍。(4)高压抗原修复将切片置于金属染色架上，放入沸腾的抗原修复液(柠檬酸盐缓冲液)的高压锅中，然后将盖子盖紧，小阀门将会升起来。减压阀开始喷气后持续1.5-2分钟，立即将锅撤离热源，去除热源，置入凉水中，当小阔门沉下去后打开锅盖，自然冷却10分钟。(5)PBS洗3次，每次5分钟。(6)灭活内源性过氧化物酶滴加3n/。H202，室温25分钟。(7)PBS洗3次，每次5分钟。(8)滴加5%BSA封闭液25分钟，甩干。(9)滴加适当稀释的一抗(c-kit为1:300，nNOS为1:200):4。C冰箱过夜。(10)晨起取出，室温复温30分钟。(11)PBS洗3次每次5分钟。(12)滴加二抗，室温60分钟。(13)PBS洗5minX3次。20(14)滴加SABC，室温30分钟。(15)0.01-0.02%Tween-20的PBS洗5分钟X4次。(16)滴加DAB显色，室温显色，镜下控制反应时间，3-10分钟。(17)自来水逐片终止染色，冲洗5分钟。(18)苏木素复染色15分钟。(19)常规脱水透明，封片，显微镜观察。(20)中性树胶溶液封片。用PBS代替一抗做空白对照，用正常山羊血清代替一抗做替代对照。因肠道中己证实有c-kit+细胞和nNOS+细胞的表达，故阳性对照就是自身。4)结果判定使用JEDA801D形态学图像系统软件进行分析，c-kit和nNOS阳性反应细胞的胞浆染成棕黄色，背景呈浅黄色或不着色。每张切片随机取5个视野(放大倍数为10X40)，测量计算出图片中阳性细胞平均光密度值。5)统计学处理实验数据录入SPSS10.0统计软件包，多组间均数的比较采用方差分析F检验，两两比较采用OnewayANOVALSD法，数据以均数士标准差表示。c-kit+细胞平均光密度、nNOS+细胞平均光密度以及小鼠排便评价指标综合积分的相关分析采用Spearman相关分析法。PO.05为有统计学差异，P<0.01为有显著性统计学差异。3、结果1)小鼠结肠组织c-kit+细胞表达及其平均光密度各组小鼠结肠组织均c-kit+表达，c-kit+细胞主要分布于粘膜下神经丛、肌间神经丛区及环行肌与纵行肌层内。(见图1:A、B、C、D，图2:I、J、K、L)(1)近端结肠组织c-kit+细胞平均光密度A.与正常对照组相比模型对照组及挥发油各组小于该组(PO.Ol)，功能性多糖茶中、高剂量组大于该组(前者PO.Ol，后者P0.05)，其余各组与之比较无显著差异；B.与模型对照组相比除挥发油各组外，其余各组均大于该组，差异极显著(PO.01);C.与西药尼为孚组相比功能性多糖茶中、高剂量组大于该组(PO.Ol)，挥发油各组小于该组(P〈0.01);D.生白术各组间相比水煎剂组、结肠微丸组及多糖功能茶各剂量组均大于挥发油各组(PO.01);同时，多糖功能茶中剂量组大于水煎剂组、结肠微丸组及多糖功能茶低、高剂量(PO.01);多糖功能茶高剂量组大于水煎剂组(PO.Ol)，与水煎剂组及多糖功能茶低剂量组比较无显著差异；水煎剂组、结肠微丸组及多糖功能茶低剂量组三组间比较无显著差异。(见表8)(2)远端结肠组织C-kit+细胞平均光密度小鼠远端结肠组织C-kit+平均光密度各组之间分别比较无显著性差异(PX).05)。(见表8)表8小鼠结肠的c-kit+细胞平均光密度<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注VS正常对照组大P〈0.01，众P〈0.05;VS模型对照组弁P〈0.01;VS西药尼为孚组※P〈0.01;VS生白术水煎剂组AP〈0.01;VS生白术组AP〈0.01;VS生白术挥发油各组头P〈0.01;VS功能性多糖茶中剂量组AP〈0.01。2)小鼠结肠nNOS+细胞表达及其平均光密度小鼠结肠组织均有nNOS+细胞表达，nNOS+细胞主要分布于粘膜下神经丛、肌间神经丛区及环行肌与纵行肌层内。(见图hE、F、G、H，图2:M、N、O、P)(1)近端结肠组织nNOS+细胞平均光密度A.与正常对照组相比模型对照组、西药尼为孚组、生白术结肠微丸组、生白术挥发油各组均小于该组(PO.Ol)，同时水煎剂组及多糖功能茶低剂量组亦小于该组(PO.05);B.与模型对照组相比除生白术挥发油各组外，其余各组均大于该组，差异极显著(PO.01);C.与西药尼为孚组相比功能性多糖茶各剂量组均大于该组(其中低剂量组P0.05,中、高剂量组PO.Ol)，生白术挥发油各组均小于该组(PO.01);D.生白术各组间相比水煎剂组、结肠微丸组、多糖功能茶各剂量组均大于挥发油各剂量组(PO.01);多糖功能茶中剂量组大于水煎剂组、结肠微丸组及多糖功能茶低剂量组(PO.01);多糖功能茶高剂量组大于结肠微丸组(P<0.05)，与水煎剂组及多糖功能茶低剂量组比较无显著差异；水煎剂组、组及多糖功能茶低剂量组三组间比较无显著差异。(见表9)(2)远端结肠组织nNOS+细胞平均光密度小鼠远端结肠组织nNOS+细胞平均光密度各组之间分别比较无显著性差异(PX).05)。(表9)表9小鼠结肠的nNOS+细胞平均光密度^nN0S+细胞平均光密度近端结肠远端结肠正常对照组0.2036±0.02830.1272±0.0116模型对照组0.1243±0.0148*0.1303±0.0104西药尼为孚组0.1695±0.0195女#0.1296±0.0105生白术水煎剂组0.1848±0.0169众#0.1299±0.0118生白术组0.1812±0.0228女#0.1264±0.0093生白术挥发油低剂量组0.1339±0.0.1248±0.0084生白术挥发油中剂量组0.1382±0.0159*AVA0.1270±0.0105生白术挥发油高剂量组0.1290±0.0.1272±0.0080功能性多糖茶低剂量组0.1873±0.0192众弁※*0.1269±0.0123功能性多糖茶中剂量组0.*'2092±0.2000#△▽★0.1250±0.0092功能性多糖茶高剂量组0.1985±0.0083*0.1281±0.0140注VS正常对照组女P〈0.01，众P〈0.05;VS模型对照组弁P〈0.01;VS西药尼为孚组AP〈0.01，※P〈0.05;VS生白术水煎剂组VP〈0.01;VS生白术组女P〈0.01，AP〈0.05;VS生白术挥发油各组*P〈0.01;VS功能性多糖茶低剂量组甲P〈0.01。3)c-kit+细胞与nNOS+细胞平均光密度值相关性分析c-kit+细胞与nNOS+细胞平均光密度在近端结肠组织中相关分析显示两者呈显著正相关(产0.894,PO.0O(见图3)，而两者平均光密度在远端结肠组织相关分析显示两者不相关(P>0.05)。4)c-kit+细胞、nNOS+细胞平均光密度与各组小鼠排便评价指标综合积分的相关性分析在统计过程中我们注意到随着小鼠排便评价指标综合积分值降低，近端结肠c-kit+细胞、nNOS+细胞平均光密度值越大。相关性分析显示，近端结肠c-kit+细胞、nNOS+细胞平23均光密度值与小鼠排便评价指标综合积分值呈显著负相关(前者产-O.845,后者^-0.909，P值均小于0.01)(见图4和图5)。远端结肠c-kit+细胞、nNOS+细胞平均光密度值与小鼠排便评价指标积分值不相关(P>0.05)。4、结论ICC以网络状结构形式广泛分布于整个胃肠道，具有节律起搏和传播功能，并作为信息整合中转站，参与ENS信号向平滑肌细胞的传送，从而在胃肠动力的发生与调控中起重要作用；同时ENS运动末梢、肌间丛ICC、SMC三者相互连接形成网络构成胃肠动力的基本功能单位(basicalfunctionalunitofGImotility，BFUGM)[8]。ICC是胃肠慢波(slowwave,SW)活动的起搏器和传导者，也是肠神经作用的首要靶细胞[9]，无论是兴奋性还是抑制性神经元等都对ICC起反应[1()]。随着对胃肠ICC研究的逐步深入，NOS神经元与其之间的关系也日益受到关注[11'12]。免疫组化染色和电镜研究发现，神经轴突和ICC的接触较与平滑肌的接触更紧密，NOS阳性神经元与ICC胞体的接触距离仅为300-500nm之长，神经轴突膨体与ICC的距离大约为20-30nm，通过突触前后膜的特殊连接形成神经元和ICC的紧密关系，并且ICC具有合成NO的能力，作为NO的靶细胞起居间调制作用，对氮能神经递质也有放大作用[13]。NO是胃肠道主要NANC抑制性神经递质之一，它以左旋精氨酸(L-arginine)为底物,由NOS催化合成,NO的释放通过降低慢电波的幅度和持续时间，抑制了平滑肌的收縮[14'15]，因而在胃肠道平滑肌松弛中起主要作用。目前多数学者认为，STC的发生与ICC、ENS密切相关。ICC的缺失及功能丧失可能导致某些胃肠功能紊乱[16]。STC患者结肠组织中ICC呈不规则分布，数量减少且体积显著縮小，导致异常的不规则慢波，平滑肌收縮运动障碍，结肠有效的推进性蠕动幅度与频率减低，因此推测ICC异常改变是STC的病因之一[17'18'19'2()'21'22]。国内外学者研究STC患者乙状结肠肌间丛NOS免疫反应性较对照组明显增强，NO合成或释放增加[23'24'25'26]。但有学者却发现STC大鼠结肠肌间丛内NOS神经元分布较稀疏,数量减少[27]。我们在本实验中发现，小鼠结肠组织c-kit+细胞及nNOS+细胞表达部位基本一致，主要分布于粘膜下神经丛、肌间神经丛区及环行肌与纵行肌层内。在近端结肠组织中，模型对照组两者平均光密度明显小于正常对照组，而经药物治疗后西药尼为孚组、生白术水煎剂组、生白术结肠微丸组、功能性多糖茶各组与模型对照组相比均明显增高，其中尤以中药多糖功能茶中剂量组最为显著(与正常对照组相比，c-kit+细胞平均光密度其值显著大于该组，nNOS+细胞平均光密度值与该组比较无显著差异)，而生白术挥发油各组与模型对照24组相比无显著差异。在统计过程中我们注意到近端结肠c-kit+细胞及nNOS+细胞平均光密度的变化趋势似乎存在某些一致性，并且疗效越好(小鼠排便评价指标综合积分值越低)的组，该组小鼠的两者的平均光密度值变化也越大。我们对三者进行相关性分析发现，小鼠近端结肠组织内c-kit+细胞及nNOS+细胞平均光密度值显著相关，并且两者与第一部分的小鼠排便指标综合积分值间也显著相关。由此我们推断，近端结肠ICC及nNOS的变化是否通过以下几方面相互影响，从而导致结肠动力的变化其一，ICC细胞的减少或功能丧失，可使肠道慢波起搏障碍及电活动传导受阻从而导致肠道动力异常；另一方面，nNOS阳性细胞数目减少或缺失，导致NO合成能力减弱；此外，ICC细胞的减少使其自身产生N0减少，加重了NO的合成障碍，同时ICC的减少/功能异常使其调节NO对胃肠平滑肌的作用减弱，从而导致结肠非推进性收缩幅度和频率增加，结肠不协调运动，肠道内容物通过缓慢，从而出现慢传输型便秘。功能性多糖茶中高剂量有效治疗STC可能正是通过恢复近端结肠这两项指标至甚至超过正常水平从而使小鼠的排便功能恢复至正常。此外，本实验还发现模型对照组小鼠近端结肠组织内ICC与nNOS均较对照组明显减少，且药物治疗后有明显转变，而远端结肠组织内各组两者光密度值无明显差异。相关性分析显示小鼠近端结肠组织内ICC与nNOS平均光密度值及与小鼠排便评价指标平均积分间显著相关，而远端结肠内上述三者均不相关。这提示我们近端结肠可能在全结肠动力的维持与调控中占有主导地位，近端结肠组织内ICC与nNOS的变化可能是STC发生的原因之一。那么近端结肠组织内两者的相关性是本身存在的还是变化中的表现出的一种趋势？如果是表现出的一种趋势，那么两者的变化谁是始发改变，谁是继发改变，还是都由STC所引起，抑或是两者同时变化而导致STC的发生，这仍须深入研究。综上所述，STC小鼠近端结肠存在ICC及nNOS的异常，而功能性多糖茶干预后近端结肠c-kit+细胞及nNOS+细胞反应性增强，因而我们认为ICC及nNOS的变化是STC结肠功能紊乱的原因之一，并且是功能性多糖茶使STC得以改善的途径之一，但其中是否存在某些中间环节抑或其他因素是否干预，仍待进一步深入研究。(三)药效综合结论1、功能性多糖茶中高剂量对DC所致的小鼠STC有较好的治疗作用效果优于西药尼为孚组、生白术水煎剂组、生白术结肠微丸组，个别指标效果优于正常对照组，尤以中剂量效果最佳，而生白术挥发油对小鼠STC无显著治疗作用。2、小鼠近端结肠c-kit+细胞及nNOS+细胞平均光密度强于远端结肠，且近端结肠两者的平均光密度变化与小鼠排便功能变化显著相关，提示近端结肠可能在全结肠动力维持与调控中占主导地位。3、功能性多糖茶中剂量治疗小鼠STC的可能机制是通过恢复近端结肠ICC及nNOS的功能或增加其数量，从而恢复小鼠的正常排便功能，其效果优于西药尼为孚组、生白术水煎剂组、生白术结肠微丸组，而生白术挥发油各剂量对两者无明显影响。4.本研究仅为初步研究。进一步运用其他实验方法研究功能性多糖茶的作用机制对于研究和开发新型的肠道动力药是必要的。参考文献.苗明三.实验动物和动物实验技术.北京中国中医药出版社，1997,143..万景洲，马锦里，刘丼.一种简易的小鼠便秘模型.中国药理学通报，1994;10(1):71-72.[3].国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草.上海上海科学技术出版社(下册)，1996,1893..段启,许冬谨,刘传祥.白术的研究进展.中草药,2008;39(5):附4-6..张印，窦康起.白术不同炮制品对小鼠小肠运动的影响.国医论坛,2005;20(5):13-14.问.滕加林，米杰.生白术通便的临床应用与作用机制.山东中医药大学学报，2000;24(3):184-185..冯广清.白术双向调节胃肠功能的初探.陕西中医函授,2001;(1):24-25..WardSM，SandersKM,HirstGDS.RoleofinterstitialcellsofCajalinneuralcon-trolofgastrointestinalsmoothmuscles.NeurogastroenterolMotil,2004;16(Suppl.l):112—117.DanielEE.CommunicationbetweeninterstialcellsofCajalandgastrointestinalmnscle.NeurogastroenterolMotil，2004;16(1):118-122.IbbaManneschiL,PaciniS，CorsaniL,etal.InterstititalcellsofCajalinthehumanstomach:distributionandrelationshipwithentericinnervation[J].HistolHistopathol,2004，19(4):1153-1164..WangXY，SandersKM，WardSM.RelationshipbetweeninterstitialcellsofCajalandentericmotorneuronsinthemurineproximalcolon[J〗.CellTissueRes,2000;302(3):331-342.[12].HananiM,Fre皿dHR.InterstitialcellsofCajal—theirroleinpacingandsignaltransmissioninthedigestivesystem[J].ActaPhysiolScand,2000;170(3):177-190..KohSD，KimTW,JunJY,etal.RegulationofpacemakercurrentsininterstitialcellsofCajalfrommurinesmallintestinebycyclicnucleotides[J].JPhysio1,2000,527(1):149-162.[14].WandSM,DalzielHH，ThomburyKD,etal.Nonadrenergicnoncholinergicinhibitionandreboundexcitationincaninecolondependonnitricoxide[J].AmPhysicol,1992;262:G237-243.[15].SmithTK，KeefK.Complexcontractilepattenincaninecolonproducedbyspontaneousreleaseofnitricoxide[J].Gastroenterology,1992;102:A516..JainD,MoussaK,TandonM,etal.RoleofinterstitialcellsofCajalinmotilitydisordersofthebowel.AmJGastroenterol,2003;98(3):618-624..HeCL,BurgartL,WangL,etal.DecreasedinterstitialcellofCajalvolumeinpatientswithslow-transitconstipation.Gasteroenterology,2000;118:14-21.TomitaRFujisakiS，IkedaT，etal.Regulationoftheentericnervoussysteminthecolonofpatientswithslow-transitconstipation.Hepatogastroenterology,2002;49(48):1540-1544..LyfordGL，HeCL,SofferE，etal.Pan-colonicdecreaseininterstitialcellsofCajalinpatientswithslowtransitconstipation.Gut,2002;51:496-501..LyfordGL，HeCL,SofferE，etal.IsconstipationcausedbyalossofcolonicinterstitialcellsofCajalGastroenterology,2003;125(l):264-266..TongWD,LiuBH,ZhangLY，etal.DecreasedinterstitialcellsofCajalinthesigmoidcolonofpatientswithslowtransitconstipation,IntJColorectalDis，2004;19(5):467-473.[22].WedelT，SpieglerJ，SoellnerS，etal.EntericnervesandinterstitialcellsofCajalarealteredinpatientswithslow-transitconstipationandmegacolon.Gastroenterology,2002;123:1459-1467.[23〗.Faussone-PellegrinlMS，InfantinoA，MatiniP，etal.Neuronalanomaliesandnormalmusclemorphologyatthehypomotileileocecocolonicregionofpatientsaffecte-dbyidiopathicchronicconstipation'HistolHistopathol，1999;14(4):1119-1134..PorterAJ，WattchowDA,HunterA,etal.Abnormalitiesofnervefibersinthecirc-ularmuscleofpatientswithslowtransitconstipation.IntJColorectalDis,1998;13(5-6):208-216..童卫东，张胜本，张连阳，等.慢传输型便秘神经系统一氧化氮合酶和P物质的分布意义.华人消化杂志,1998;6(5):380-382..何俊堂，刘海峰，房殿春等慢传输型便秘大鼠结肠肌间神经丛胆碱能神经及氮能神经的组化研究.解放军医学杂志，2004;29(10):854-855.权利要求1、一种功能性多糖茶，其特征在于，是由下列重量份的成分组成生白术多糖5～80份，生白术5～80份、生何首乌5～15份及荷叶纳米粉5～15份。2、一种制备权利要求1所述功能性多糖茶的方法，其特征在于，是将配方量的生白术、生何首乌及荷叶混合并超微粉碎，制得的纳米中药粉与生白术多糖混合造粒，干燥后装袋或压制成片得功能性多糖茶。3、根据权利要求2所述的功能性多糖茶的制备方法，其特征在于，生白术多糖按下述制备取生白术粗粉，加20倍重量的水，浸泡后微沸煎煮，滤过，滤渣再加20倍重量水，微沸煎煮lh，滤过，合并两次滤液，加10%(W/W)ZnS04溶液和饱和Ba(0H)2溶液，振摇静置；上清液加Ba(OH)2溶液直至蛋白质沉淀产生完全，倾注法过滤，滤液浓縮，静置过夜，离心除去沉淀，加4倍重量的95%乙醇，静置过夜，离心后倾注法过滤，沉淀用95%乙醇洗涤，减压抽干，真空干燥即得白术多糖。全文摘要本发明公开了一种功能性多糖茶及其制备方法。功能性多糖茶的成分为生白术多糖、生白术、生何首乌、荷叶。是将配方量的生白术、生何首乌及荷叶混合并超微粉碎，制得的纳米中药粉与生白术多糖混合造粒，干燥后装袋或压制成片得功能性多糖茶。本发明选材科学，配方合理，制备工艺简单。制备的功能性多糖茶具有健脾补肾，润肠通便之功效，并能抗衰老、增强人体免疫力。主治中、老年人病后、产后等虚性便秘及习惯性便秘等。疗效平缓、持久；无任何毒副作用，也绝不寒泻药；适应症广，疗效明显，经济安全。是理想的日常保健品。文档编号C08B37/00GK101554197SQ20091002793公开日2009年10月14日申请日期2009年5月12日优先权日2009年5月12日发明者平卜,荣胡申请人:扬州大学