专利名称：一种炔雌醇类似物的分子印迹聚合物的制备方法
技术领域：
本发明属于分子印迹聚合物制备技术，特别涉及一种对炔雌醇、雌二醇等甾 类激素类药物具有高选择性、高亲和性的富集分离材料的制备方法。
二背景技术：
环境或动物性食品中可能残留的甾类激素对人们的身体健康具有潜在的危 害，成为食品安全领域涉及的重要命题。如雌二醇、炔雌醇(17a-ethinylestradiol , EE2)等，它们的活性明显强于天然甾类激素，因此在医学上广 泛用于避孕药的合成和疾病的治疗，也在牲畜、水产养殖中作为动物的生长促进 剂。这些激素类物质常以药物原形或代谢产物的形式随粪便、尿液等排泄物排出 到环境中，绝大多数激素类药物排出到环境中仍具有活性，可直接污染土壤和水 源。受污染的水源和土壤可能对农作物及野生植物造成二次污染。目前已有报道 环境中甾类激素改变了水生环境中浮游植物的许多性质，例如减少单位环境中种 类数目，减少生物量、细胞密度，增加多样性、平均度，以及改变种类结构。
目前，普遍应用的甾类激素检测技术包括了荧光光语分析，质谱分析，液相 色谱，气相色语，薄层色谱，免疫检测和一些组合分析技术，它们之中除了免疫 方法，大多需要昂贵的投资，繁瑣的样品预处理程序和大量使用有机溶剂。尽管 免疫检测己是非常适用的内源激素分析手段，但在实际应用中也存在专一性和灵 敏性的问题，并且还依赖于大量的动物实验，受到条件限制，如实验成本高，不 可能全面推广，而且费时、费工，重现性、准确性并不理想。因此开发一种迅 速、灵敏和经济的分析检测技术显得十分的迫切。
分子印迹(Molecular Imprinting)是一项近几年来迅速发展的分子识别新技 术。它是通过化学分子的自装配(Self-assembling),合成对特定分子有特异性吸 附的高分子化合物。在分子印迹反应中，首先功能单体和模板分子之间通过化学 键(包括共价键，离子键，氬键，以及范德华力等等)形成复合物，在随后进行 聚合反应中，聚合链的增长和交联将这种复合作用固化，洗脱模板分子，聚合物 分子中就形成能特异性吸附模板分子的洞穴，这种聚合物被称为分子印迹聚合物(Molecular Imprinting Polymer, MIP )。这项技术现在已经用于手性色语与亲和 色谱，固相萃取，模拟生物催化等多个领域。
MIP具有特效的选择性和亲和性，可方便地固定在玻璃、陶瓷、光纤上，用 作固相萃取剂可简化环境样品体系复杂的预处理程序，为样品的采集、富集和分 析提供极大的方便。对毫摩尔水平以下的痕量物质经这一方法预富集处理后，达
到色谨4企测限以上。大大减少样品预处理的时间，真正^:到快速^^测。
目前关于雌二醇的分子印迹技术是以聚合物来检测模板分子，由于洗脱时不 可能将模板分子全部洗脱，会造成"泄漏"，使得结果呈假阳性。
发明内容
技术问题本发明针对上述技术问题，提供一种炔雌醇类似物的分子印迹聚 合物微球的制备方法。该方法制备的MIP对炔雌醇呈现明显的亲和性，且在用于 固相萃取材料时不会因为模板的泄漏而影响结果的准确度。
技术方案 一种炔雌醇类似物的分子印迹聚合物的制备方法，制备步骤为 a.以17-乙基雌二醇为模板，将模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混 合，超声，在氮气气氛下，于60 。C聚合12 24h,得聚合物；所述的功能单体 为甲基丙烯酸，曱基丙烯酸曱酯或丙烯酰胺；所述的交联剂为三羟曱基丙烷三曱 基丙烯酸酯或双甲基丙烯酸乙二醇酯；所述的致孔剂为乙腈或者曱苯。所述的引 发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或过氧化二苯曱酰；所述的模板分子与功能 单体，其摩尔比为1 : 1 ~ 1 : 5;所述的模板分子与交联剂，其摩尔比为1 : 4~ 1 : 8;所述的致孔剂的体积用量和模板分子摩尔量之比为60mL/mmol;所述的引发 剂质量和模板分子摩尔量之比为80mg/mmol; b.将步骤a制备的聚合物离心，弃 去上清液，用曱醇-乙酸混合液浸洗去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模 板分子为止，得到分子印迹聚合物；c.将分子印迹聚合物，真空干燥，得到炔雌 醇类似物分子印迹聚合物。
步骤a中，所述的超声及通氮气，其超声时间为5 min，通氮气时间为10 min。超声是为了分散均匀；通氮气是为了除氧，因为这个引发反应是自由基引 发，不能有氧气存在，并且通氮气能增加孔隙率。
步骤b中，所述的离心，其离心速度为15000 rpm。保证聚合物能完全沉淀。
步骤c中，在真空干燥之前，聚合物用曱醇清洗，以除去残留的乙酸。 有益效果1. 模板不是炔雌醇，而是炔雌醇类似物。由于模板与炔雌醇、雌二醇在色谱 柱上很容易分离开，从而使制备的MIP在用于固相萃取材料时不会因为模板的泄 漏而影响结果的准确度。
2. 制备的MIP对17-乙基雌二醇、炔雌醇、雌二醇呈现明显的亲和性，而相 应的非印迹聚合物(无模板存在下用同样条件制备的聚合物)表现出非常低的亲和 性。
四
图1是本发明制得分子印迹聚合物微球的透射电子显微镜图，显微镜 JEM1010,加速电压80kv,放大倍率40000 x ;
图2是本发明制得印迹及非印迹聚合物微球的静态吸附等温线图。
五具体实施例方式
实施例1
将2.96g ( lmmol)炔雌醇固体粉末溶于装有15mL的乙醇溶液的茄形瓶中， 加入少量Pd/C,电磁搅拌中常温下通入氢气，高效液相跟踪反应进程(检测波长 为280nm,流动相为体积比为8: 2的曱醇-水，流速lmL/min),直至4全测不到 炔雌醇的峰，表示反应完毕。滤出Pd/C，旋干乙醇，加入适量乙醇重结晶，得到 无色针状结晶。
iH陽NMR(CDCl3) 5: 0.92 (s, 3H， 18-CH3), 1.03 (t, 3H， CH2CH3), 2.82(m,2H， 6-CH2)，4.61 (b， 2H， OH-phenol), 6.56 (d, 1H， 4-CH), 6.63 (d, 1H， 2-CH),7.15 (d， 1H， l-CH).液283.2 ([M-H20]+, 100%).
实施例2
将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和0.25 mmol的功能单体曱基丙烯酸 溶解到15 mL含有1 mmol的交联剂三羟曱基丙烷三甲基丙烯酸酯、20 mg的引 发剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min，密封，于60 。C油浴沉 淀聚合12 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的甲醇-乙酸溶液为提取液 去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用曱醇洗涤离心， 离心速度为15000 rpm,弃去上清液，将聚合物置于40 。C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
实施例3将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和0.25 mmol的功能单体曱基丙烯酸 溶解到15 mL含有1 mmol的交联剂三羟曱基丙烷三曱基丙烯酸酯、20 mg的引 发剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min，密封，于60 。C油浴沉 淀聚合16 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的曱醇-乙酸溶液为提取液 去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用曱醇洗涤离心， 离心速度为15000 rpm,弃去上清液，将聚合物置于40 。C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
实施例4
将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和0.25 mmol的功能单体曱基丙烯酸 溶解到15 mL含有1 mmol的交联剂三羟曱基丙烷三甲基丙烯酸酯、20 mg的引 发剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min,密封，于60 。C油浴沉 淀聚合20 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的曱醇-乙酸溶液为提取液 去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用曱醇洗涤离心， 离心速度为15000 rpm,弃去上清液，将聚合物置于40 。C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
实施例5
将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和0.25 mmol的功能单体曱基丙烯酸 溶解到15 mL含有1 mmol的交联剂三羟曱基丙烷三甲基丙烯酸酯、20 mg的引 发剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min,密封，于60 。C油浴沉 淀聚合24 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的曱醇-乙酸溶液为提取液 去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用曱醇洗涤离心， 离心速度为15000 rpm,弃去上清液，将聚合物置于40 。C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
实施例6
将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和0.5 mmol的功能单体曱基丙烯酸 溶解到15 mL含有1 mmol的交联剂三轻曱基丙烷三曱基丙烯酸酯、20 mg的引 发剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min,密封，于60 。C油浴沉 淀聚合24 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的曱醇-乙酸溶液为提取液 去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用曱醇洗涤离心，离心速度为15000 rpm,弃去上清液，将聚合物置于40 °C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
实施例7
将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和0.75 mmol的功能单体曱基丙烯酸 溶解到15 mL含有1 mmol的交联剂三羟曱基丙烷三曱基丙烯酸酯、20 mg的引 发剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min,密封，于60 。C油浴沉 淀聚合24 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的甲醇-乙酸溶液为提取液 去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用曱醇洗涤离心， 离心速度为15000 rpm,弃去上清液，将聚合物置于40 °C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
实施例8
将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和1 mmol的功能单体曱基丙烯酸溶 解到15 mL含有1 mmol的交联剂三羟曱基丙烷三曱基丙烯酸酯、20 mg的引发 剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min,密封，于60 。C油浴沉淀 聚合24 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的曱醇-乙酸溶液为提取液去 除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用曱醇洗涤离心，离 心速度为15000 rpm，弃去上清液，将聚合物置于40 。C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。本实施例所用条件为制备炔雌醇类似物 分子印迹聚合物的最优条件，电镜图见图1。
实施例9
将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和1.25mmo1的功能单体曱基丙烯酸 溶解到15 mL含有1 mmol的交联剂三羟甲基丙烷三曱基丙烯酸酯、20 mg的引 发剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min,密封，于60 。C油浴沉 淀聚合24 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的曱醇-乙酸溶液为提取液 去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用甲醇洗涤离心， 离心速度为15000 rpm，弃去上清液，将聚合物置于40 。C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
实施例10将0.25 mmol的名义模板17-乙基雌二醇和1 mmol的功能单体曱基丙烯酸溶 解到15 mL含有2 mmol的交联剂三羟甲基丙烷三曱基丙烯酸酯、20 mg的引发 剂偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，超声、通氮气10min，密封，于60 °C油浴沉淀 聚合24 h生成白色粉末状聚合物，用体积比为9: 1的曱醇-乙酸溶液为提取液去 除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，然后用曱醇洗涤离心，离 心速度为15000 rpm,弃去上清液，将聚合物置于40 。C真空干燥箱中干燥至衡 重，即得炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
为了验证分子印迹聚合物的印迹效果，做了如下实验
精密称定20 mg上述聚合物分别置于15 mL锥形瓶中，加入10 mL不同浓度 (0.1、 0.5、 1、 2、 3、 4、 5 mmol/L)的17-乙基雌二醇、炔雌醇、雌二醇乙腈溶 液中，密封，室温下振摇24 h,将悬浊液移入10 mL塑料离心管中，以10000转 的转速离心10 min，取上清液定量稀释，在紫外-可见分光光度计中200 400 nm 扫描检测，求吸附量，见图2。计算公式如下
<formula>formula see original document page 8</formula>
Q,吸附量，iamol; A，吸光度；Af,吸附后溶液吸光度；C，溶液浓度， pmol/mL; V,吸附溶液体积，mL。
从图2可见，所得的炔雌醇类似物的分子印迹聚合物对17-乙基雌二醇、炔 雌醇及雌二醇的吸附量明显高于非印迹聚合物，且吸附效果与炔雌醇及其类似物 的结构相似性有关。
权利要求
1.一种炔雌醇类似物的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于制备步骤为a.以17-乙基雌二醇为模板，将模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合，超声，在氮气气氛下，于60℃聚合12～24h，得聚合物；所述的功能单体为甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯或丙烯酰胺；所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或双甲基丙烯酸乙二醇酯；所述的致孔剂为乙腈或者甲苯；所述的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或过氧化二苯甲酰；所述的模板分子与功能单体，其摩尔比为1∶1～1∶5；所述的模板分子与交联剂，其摩尔比为1∶4～1∶8；所述的致孔剂的体积用量和模板分子摩尔量之比为60mL/mmol；所述的引发剂质量和模板分子摩尔量之比为80mg/mmol；b.将步骤a制备的聚合物离心，弃去上清液，用甲醇-乙酸混合液浸洗去除模板分子，直至紫外检测器检测不到模板分子为止，得到分子印迹聚合物；c.将分子印迹聚合物，真空干燥，得到炔雌醇类似物分子印迹聚合物。
2. 如权利要求1所述的炔雌醇类似物分子印迹聚合物微球的制备方法，其 特征是，步骤a中，所述的超声时间为5 min。
3. 如权利要求1所述的炔雌醇类似物分子印迹聚合物微球的制备方法，其 特征是，步骤a中，所述氮气气氛，由通氮气10min保持。
4. 如权利要求1所述的炔雌醇类似物分子印迹聚合物微球的制备方法，其 特征是，步骤b中，所述的离心，其离心速度为15000 rpm。
5. 如权利要求1所述的炔雌醇类似物分子印迹聚合物微球的制备方法，其 特征是，步骤c中，在真空干燥之前，聚合物用曱醇清洗，以除去残留 的乙酸。
全文摘要
一种炔雌醇类似物的分子印迹聚合物的制备方法，制备步骤为a.以17-乙基雌二醇为模板，将模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合，超声，在氮气气氛下，于60℃聚合12～24h，得聚合物；b.将上步制备的聚合物离心，弃去上清液，用甲醇-乙酸混合液浸洗去除模板分子，得到分子印迹聚合物；c.将聚合物真空干燥。由于模板与炔雌醇、雌二醇在色谱柱上很容易分离开，从而使制备的MIP在用于固相萃取材料时不会因为模板的泄漏而影响结果的准确度。制备的MIP对17-乙基雌二醇、炔雌醇、雌二醇呈现明显的亲和性，而相应的非印迹聚合物(无模板存在下用同样条件制备的聚合物)表现出非常低的亲和性。
文档编号C08F220/06GK101565485SQ200910027180
公开日2009年10月28日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者周学敏, 艳 彭, 飞 李, 殷晓佳, 珂 江, 琴 胡, 都述虎 申请人:南京医科大学