前列腺活组织检查中低级PIN(LG‑PIN)中ERG基因重排和蛋白质过表达的存在的制造方法与工艺

前列腺活组织检查中低级PIN(LG-PIN)中ERG基因重排和蛋白质过表达的存在相关申请提交本申请，其要求2011年2月24日提交的美国临时专利申请No.61/446,300的权益。发明领域本公开内容涉及用于早期阶段检测生物学样品中先前已经可检出的前列腺癌细胞作为癌症病理学的方法。更具体地，本公开内容涉及组合的与ERGFISH测定法偶联的抗ERG免疫组织化学测定法，其导致更有可能鉴定与癌症有关的并且因此预测癌症的低级PIN。发明背景癌症的早期检测是治疗癌症患者中的关键特征。在男性中，前列腺癌是所有人种最普遍的癌症形式。尽管仅在美国每年超过300,000名男性诊断为前列腺癌，但是众所周知，目前可用的测试是不准确的且主观的。因此，许多例前列腺癌发生未确诊，直到疾病进展至后期阶段，包括转移。在过去十年里，前列腺癌的发病率及其关联死亡率两者已经在增加。据估计约50-65%的前列腺癌是局部化的，9-17%已经扩散到前列腺附近的区域，并且20-25%已经转移到身体的其它部位。前列腺癌的筛选主要通过PSA（针对前列腺特异性抗原的血液测试）和DRE（直肠指检（DigitalRectalExam））测试进行。通过检查自针吸活组织检查衍生的组织样品进行癌症确认。这些方法不能区分良性疾病和癌症。不能区分可以导致例如患有良性疾病的患者暴露于不必要的并具有副作用（例如阳痿和失禁）的治疗。此外，估计PSA测试遗漏所有癌症个体的20%-30%。明显需要具有更好的灵敏性和特异性的诊断学。由于前列腺癌发病率的增加以及此病症转移的高速率，急切需要就是在最早阶段检出此疾病，以及能靶向潜在转移性前列腺癌细胞的疗法。理想地，这些治疗类型会适用于早期阶段、局限性前列腺癌以及治疗转移性疾病两者。一个会使男性健康极大受益的领域是是否有可以用于检测低级前列腺上皮内瘤形成（lowgradeprostateintraepithelialneoplasia，LG-PIN）的特异性检测方法。LG-PIN是前列腺细胞中的一种恶性前增殖，其最常在外周区中找到。PIN会在多至16%的已经进行经直肠超声引导前列腺活组织检查的男性中得到鉴定。在PIN中，细胞重排显示在缺少基质侵入的情况下导管和腺构造的保留及随PIN等级升高对基底细胞层的进行性破坏。其它已报告的组织学或生物学变化包括：神经内分泌或分泌分化丧失、核和核仁异常、新血管生成（neovascularity）、升高的增殖潜力和伴有DNA含量变化的遗传不稳定性。随着PIN程度升高，看到升高的核畸变程度以及升高的基底细胞破坏。PIN具有完整的或破碎的基底细胞层，而癌症（PC）缺乏基底细胞层。针对细胞角蛋白的基底细胞特异性免疫染色存在于PIN中，但是在PC区中是缺乏的。从具有最小变化的最低等级（I级）到具有最重度变化的最高等级（III级）分级PIN。大多数医学论文将PIN分类为高级或低级。高级PIN和III级PIN同义使用。PC与高级PIN比低级更为有关。PIN似乎比PC的出现早超过5年。高级PIN的发现与后续活组织检查中前列腺癌的诊断之间有显著关联。HG-PIN在多项研究中与33-100%的病例中的这类后续诊断相关联。在一项研究中，在总共66位男性中检测到PIN：21位具有低级PIN，45位具有高级PIN。重复活组织检查揭示在5/21或24%的低级组中和在26/45或58%的高级组中的PC。如此，检测可以导致癌症形成的低级PIN（与高级PIN相比，其在疾病进展周期中仍然更早）的方法可以用于前列腺癌的早期阶段检测和预后，并且导致针对前列腺癌的更好的治疗方案。发明概述本公开内容提供了用于诊断前列腺癌的改进方法。例如，本发明涉及用于早期阶段诊断受试者中的前列腺癌的方法，包括测定所述受试者中低级前列腺上皮内瘤形成（LG-PIN）的存在，包括：提供来自受试者的样品；使用核酸杂交技术通过检测基因组DNA的染色体重排来检测所述样品中基因融合的存在或缺乏，所述基因融合具有来自雄激素调节基因的转录调节区的5’部分和来自ERG基因的3’部分，以及使用免疫组织化学测定法检测ERG蛋白的过表达，其中样品中基因融合和ERG过表达两者的存在指示受试者中与癌症存在相关或预示癌症的低级PIN，并且其中所述受试者先前测定为在前列腺癌方面呈阴性。在优选的实施方案中，所述雄激素调节基因可以选自包含TMPRSS2、NDRG1、SLC45A3和PSA的组。在其它实施方案中，检测样品中基因融合的存在或缺乏包括使用选自下组的核酸杂交技术来检测基因组DNA的染色体重排：原位杂交（ISH）、微阵列和Southern印迹。在某些实施方案中，这类检测包括检测嵌合mRNA转录物，其具有来自雄激素调节基因的转录调节区的5’部分和来自ERG的3’部分。在本发明的诊断方法中，所述原位杂交是荧光原位杂交（FISH），其利用选自下组的探针进行：从RP11-95I21和CTD-2506J13开发并且在染色体21q22.3上定位的5p探针和从RP11-476D17和RP11-24A11开发并且在染色体21q22.3上定位的ERG3p探针。在例示性方法中，ERG蛋白过表达的检测包括检测源自雄激素调节基因的转录调节区与ERG基因融合的氨基端截短的ERG蛋白。在其它实施方案中，过表达检测包括检测嵌合蛋白，其具有由雄激素调节基因的转录调节区编码的氨基端部分和来自ERG基因的羧基端部分。可以对任何会为了测定前列腺癌而筛选的样品实施本发明的诊断方法。例如，所述样品可以选自下组：组织、血液、尿液、精液、前列腺分泌物和前列腺细胞。在具体的实施方案中，所述基因融合是ARG（包括但不限于TMPRSS2）基因与ERG基因的融合，且其中所述方法进一步包括基于基因融合中基因组缺失的存在或缺乏来表征前列腺细胞的步骤。TMPRSS2-ERG重排是本领域技术人员已知的。在例示性实施方案中，这类基因重排是第21号染色体上TMPRSS2基因与ERG基因之间基因组DNA的缺失。更具体地，所述缺失包括ERG基因外显子1的缺失或包括TMPRSS2基因外显子3的缺失。例如，所述缺失包括如下的缺失，其中介于2.8和2.85兆碱基之间的基因组DNA是缺失的。可以使用FISH测定法检测所述缺失，该FISH测定法使用至少一种经荧光标记的选自下组的探针：RP11-95I21、CTD-2506J13、RP11-476D17和RP11-24A11。在例示性实施方案中，所述缺失指示受试者中的转移性前列腺癌。发明的诊断方法可以进一步包括使用苏木精和曙红（H&E）染色剂将所述前列腺细胞染色以测定与正常的相邻细胞相比具有扩大的核大小而无可见核仁的非典型腔细胞（luminalcell）的存在。或者/另外，所述诊断方法可以进一步包括测定所述前列腺细胞中前列腺特异性抗原（PSA）的存在。如记载的，有利地，发明的诊断方法在其它方法已指示在前列腺癌方面呈阴性的样品的情况下提供前列腺癌的早期鉴定。例如，对最初根据针吸活组织检查测定和/或根据H&E染色测定已经测试为在前列腺癌方面呈阴性的受试者进行所公开的方法。还涵盖针对LG-PIN存在的前列腺细胞测定法，包括：a）获得前列腺细胞的测试样品；b）使用免疫组织化学测定法分析前列腺细胞的样品以测定ERG的表达；c）比较步骤b）中测定的表达水平与对照样品中的水平；d）实施FISH测定法来测定样品中基因融合的存在或缺乏，所述基因融合具有来自雄激素调节基因的转录调节区的5’部分和来自ERG基因的3’部分；并e）如果所述测试样品中前列腺细胞中ERG的表达水平高于对照样品中的，并且如步骤e）中测定的，存在来自雄激素调节基因的转录调节区的5’部分和来自ERG基因的3’部分的基因融合，那么确定所述前列腺细胞会形成癌症或指示所述受试者中的近端[或邻近]癌细胞。进一步涵盖的是用于治疗受试者中的前列腺癌的方法，包括：依照本文中描述的方法测定低级PIN的存在，并对所述受试者...