专利名称：一种引导骨组织再生的复合膜及其制备方法
技术领域：
本发明涉及属于高分子生物医用材料领域，具体涉及一种表面功能化的引导骨组织再生复合膜及其制备方法。
背景技术：
引导组织再生(guided tissue regeneration, GTR)的概念首先由Nyman等提出，它是指依靠机械屏障等作用，选择性地引导细胞向受损伤的部位附着、增殖，达到组织修复的目的。引导组织再生是80年代在体外、体内及临床实验研究的基础上发展起来的一项促进组织再生性愈合的理论和技术。由此，医用引导组织再生材料作为一种具有引导组织再生功能的新材料在临床医学中将发挥很大的作用，其开发研究正在引起材料和医学界的高度重视。医用引导组织再 生材料可分为生物可降解和不可降解材料两大类。七十年代后期八十年代初期，Nyman, Gottlow及Becket等人相继对不可降解材料聚缩醒、聚四氟乙烯(PTFE)、硅酮膜等进行了研究，这类材料虽然与组织有较好的生物相容性，但因不能被组织吸收，需要二次手术取出材料，增加了创伤机会，难以被患者接受，临床效果也不十分理想。生物可降解材料是目前研究较多的一类材料。由于生物可降解材料选择性地引导组织在受损部位再生后，材料可完全降解或被组织吸收，手术方便且不需要二次手术取出材料，减少了患者的痛苦，是一类较理想很有前景的材料。生物可降解材料按来源不同可分为人工合成高分子聚合物和天然高分子聚合物两大类。合成高分子聚合物包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及PGA和PLA的共聚物(PLGA)、聚碳酸酯等。天然高分子常用的有胶原，壳聚糖，纤维粘连蛋白等。人工合成高分子聚合物一般具有优异的力学性能，较长的降解时间，但是生物活性不足；天然聚合物往往具有较佳的生物活性，能促进细胞粘附，增殖，然而往往力学强度不足，降解过快。
发明内容
发明目的:为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种表面功能化的引导骨组织再生复合膜及其制备方法。技术方案:为实现上述目的，本发明提供了本发明一种引导骨组织再生的复合膜，一种引导骨组织再生的复合膜，包括基底层、中间改性层以及功能化表层；所述基底层为PLGA膜，所述中间改性层是由多巴胺经聚合形成聚多巴胺并吸附至PLGA膜表面形成，所述功能化表层是由I型胶原及胶原/壳聚糖混合物与聚多巴胺中的活跃基团反应形成，如-NH2, -C00H, -OH 等。优选地，所述基底层中的PLGA膜的厚度为10(Γ300微米。优选地，所述I型胶原为鼠尾肌腱I型胶原。通过将本发明中的复合膜覆盖在骨缺损区，使功能化表层面向骨缺损腔，基底层中的PLGA膜朝向软组织面，利用其屏障作用，阻挡生长较快的软组织长入骨缺损区，并选择性地引导成骨细胞向受损伤的部位附着、增殖，达到组织修复的目的。本发明还提供了一种引导骨组织再生的复合膜的制备方法，其制备步骤包括如下:
(1)称取PLGA，将其溶于氯仿中，制得浓度为lg/10mflg/20ml的PLGA氯仿溶液；
(2)将步骤(I)中制得的PLGA氯仿溶液倒入聚四氟乙烯中器皿中，经过梯度升温将溶剂彻底挥发，使PLGA膜形成在聚四氟乙烯中器皿底中；
(3)称取盐酸多巴胺，将其溶于10.5mmol/ri3.5mmol/L的Tris缓冲液中，制得浓度为
2.2 mg/ml 2.5 mg/ml 的溶液；
(4)将步骤(2)中所得PLGA膜竖直浸入步骤(3)中所制得的多巴胺溶液中，2Γ30小时取出用10.5mmol/L 13.5mmol/L的Tris缓冲液漂洗2 5次后干燥；
(5)将I型胶原、壳聚糖分别溶于0.05mol/L^0.08mol/L的醋酸溶液中，制成浓度
5.2mg/mL 5.8mg/mL的溶液，将这两种溶液分别按I型胶原醋酸溶液:壳聚糖醋酸溶液=4:1、2:1、1:1的体积比充分混合；
(6)将步骤(5)中所制得的混合溶液分别倾倒在步骤(4)所得的经多巴胺修饰的PLGA表面，在无菌的环境下室温通风干燥；
(7)将步骤(6)所得膜无菌去离子水漂洗至中性，无菌条件下彻底干燥。作为优选，所述步骤(2 )中将PLGA氯仿溶液倒入聚四氟乙烯中器皿中后，迅速转移至4°C层流柜中，8 10小时后取出，在室温下放置2Γ72小时，再转移至烘箱中旋转2Γ72小时。本发明中，PLGA分子量为100000，LA:GA (乳酸:羟基乙酸)=75:25，特性粘度为0.72 dL/g ;多巴胺为盐酸多巴胺形式，分子量189.64，纯度彡98.0%，壳聚糖分子量100000,95%脱乙酰度。本发明中制备的可降解引导骨组织再生膜利用不同来源的可降解材料的优缺点，设计了一种以PLGA为基底，I型胶原/壳聚糖为表面改性层的复合结构的膜。PLGA固有的惰性疏水性质并不利于表面活性基团的嫁接，所以在本发明中应用多巴胺(DOPA)自聚合并能吸附于合成高分子材料表面，形成共价结合的特性预先对PLGA膜表面改性，从而改善PLGA膜表面的固有惰性，使得胶原/壳聚糖与PLGA结合为一个功能整体。本发明所制备的引导膜以人工合成高分子聚合物为基底材料，通过表面修饰后，嫁接天然聚合物对其表面经功能活化，经功能化改性后的膜表面具备了原合成聚合物没有的纳米结构和活性基团，大大增加了成骨细胞亲和力，有效促进了细胞的粘附，增殖，合成高分子聚合物作为基底，提供了较高的力学强度和可控的降解性能，其表面的预先修饰使得嫁接的天然聚合物得以与基底牢固结合。有益效果:本发明制备的引导骨组织再生膜以PLGA为基底，以胶原和壳聚糖为功能基团嫁接在PLGA表面，使本发明制备的复合膜兼具优异的力学性能和生物活性，并且预先利用多巴胺自聚合且能吸附于材料表面的特性对PLGA进行表面修饰，使得天然聚合物与PLGA牢固结合，避免了以往该领域制备同类复合材料时仅将不同成分材料简单混合所造成的界面结合不稳定的问题，经衰减全反射红外及扫描电镜表征证明，天然聚合物改性后在复合物膜表面成功嫁接了功能活性基团，并使其具备了特殊的纳米形貌。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。实施例1:
一种引导骨组织再生的复合膜，包括基底层、中间改性层以及功能化表层；所述基底层为PLGA膜，所述中间改性层是由多巴胺经聚合形成聚多巴胺并吸附至PLGA膜表面形成，所述功能化表层是由鼠尾肌腱I型胶原及胶原/壳聚糖混合物与聚多巴胺中的活跃基团反应形成，所述PLGA膜的厚度为100微米。该种复合膜的制备方法，其制备步骤包括如下:
(1)称取PLGA，将其溶于氯仿中，制得浓度为lg/10ml的PLGA氯仿溶液；
(2)将步骤(I)中制得的PLGA氯仿溶液倒入聚四氟乙烯中器皿中，迅速转移至4°C层流柜中，10小时后取出，在室温下放置72小时，再转移至烘箱中旋转72小时，经过梯度升温将溶剂彻底挥发，使PLGA膜形成在聚四氟乙烯中器皿底中；
(3)称取盐酸多巴胺，将其溶于10.5mmol/L的Tris缓冲液中，制得浓度为2.2 mg/ml的溶液；
(4)将步骤(2)中所得PLGA膜竖直浸入步骤(3)中所制得的多巴胺溶液中，24小时取出用10.5mmol/L的Tris缓冲液漂洗2次后干燥；
(5)将I型胶原、壳聚糖分别溶于0.05mol/L的醋酸溶液中，制成浓度5.2mg/mL的溶液，将这两种溶液分别按I型胶原醋酸溶液:壳聚糖醋酸溶液=4:1、2:1、1:1的体积比充分混合； (6)将步骤(5)中所制得的混合溶液分别倾倒在步骤(4)所得的经多巴胺修饰的PLGA表面，在无菌的环境下室温通风干燥；
(7)将步骤(6)所得膜无菌去离子水漂洗至中性，无菌条件下彻底干燥。本实施例制出来的复合膜兼具优异的力学性能和生物活性，材料界面结合稳定。实施例2:
一种引导骨组织再生的复合膜，包括基底层、中间改性层以及功能化表层；所述基底层为PLGA膜，所述中间改性层是由多巴胺经聚合形成聚多巴胺并吸附至PLGA膜表面形成，所述功能化表层是由I型胶原及胶原/壳聚糖混合物与聚多巴胺中的活跃基团反应形成，所述PLGA膜的厚度为300微米。该种复合膜的制备方法，其制备步骤包括如下:
(1)称取PLGA，将其溶于氯仿中，制得浓度为lg/20ml的PLGA氯仿溶液；
(2)将步骤(I)中制得的PLGA氯仿溶液倒入聚四氟乙烯中器皿中，迅速转移至4°C层流柜中，8小时后取出，在室温下放置24小时，再转移至烘箱中旋转24小时，经过梯度升温将溶剂彻底挥发，使PLGA膜形成在聚四氟乙烯中器皿底中；
(3)称取盐酸多巴胺，将其溶于13.5mmol/L的Tris缓冲液中，制得浓度为2.5 mg/ml的溶液；
(4)将步骤(2)中所得PLGA膜竖直浸入步骤(3)中所制得的多巴胺溶液中，30小时取出用13.5mmol/L的Tris缓冲液漂洗5次后干燥；
(5)将I型胶原、壳聚糖分别溶于0.08mol/L的醋酸溶液中，制成浓度5.8mg/mL的溶液，将这两种溶液分别按I型胶原醋酸溶液:壳聚糖醋酸溶液=4:1、2:1、1:1的体积比充分混合；
(6)将步骤(5)中所制得的混合溶液分别倾倒在步骤(4)所得的经多巴胺修饰的PLGA表面，在无菌的环境下室温通风干燥；
(7)将步骤(6)所得膜无菌去离子水漂洗至中性，无菌条件下彻底干燥。本实施例制出来的复合膜兼具优异的力学性能和生物活性，材料界面结合稳定。实施例3:
一种引导骨组织再生的复合膜，包括基底层、中间改性层以及功能化表层；所述基底层为PLGA膜，所述中间改性层是由多巴胺经聚合形成聚多巴胺并吸附至PLGA膜表面，所述功能化表层是由鼠尾肌腱I型胶原及胶原/壳聚糖混合物与聚多巴胺中的活跃基团反应形成，所述PLGA膜的厚度为200微米。该复合膜的制备方法，其制备步骤包括如下:
(1)称取PLGA，将其溶于氯仿中，制得浓度为lg/15ml的PLGA氯仿溶液；
(2)将步骤(I)中制得的PLGA氯仿溶液倒入聚四氟乙烯中器皿中，迅速转移至4°C层流柜中，9小时后取出，在室温下放置48小时，再转移至烘箱中旋转48小时，经过梯度升温将溶剂彻底挥发，使PLGA膜形成在聚四氟乙烯中器皿底中；
(3)称取盐酸多巴胺，将其溶于11.5mmol/L的Tris缓冲液中，制得浓度为2.3mg/ml的溶液；
(4)将步骤(2)中所得PLGA膜竖 直浸入步骤(3)中所制得的多巴胺溶液中，27小时取出用11.5mmol/L的Tris缓冲液漂洗3次后干燥；
(5)将I型胶原、壳聚糖分别溶于0.06mol/L的醋酸溶液中，制成浓度5.5mg/mL的溶液，将这两种溶液分别按I型胶原醋酸溶液:壳聚糖醋酸溶液=4:1、2:1、1:1的体积比充分混合；
(6)将步骤(5)中所制得的混合溶液分别倾倒在步骤(4)所得的经多巴胺修饰的PLGA表面，在无菌的环境下室温通风干燥；
(7)将步骤(6)所得膜无菌去离子水漂洗至中性，无菌条件下彻底干燥。本实施例制出来的复合膜兼具优异的力学性能和生物活性，材料界面结合稳定。实施例4:
一种引导骨组织再生的复合膜，包括基底层、中间改性层以及功能化表层；所述基底层为PLGA膜，所述中间改性层是由多巴胺经聚合形成聚多巴胺并吸附至PLGA膜表面，所述功能化表层是由I型胶原及胶原/壳聚糖混合物与聚多巴胺中的活跃基团反应形成，所述PLGA膜的厚度为180微米。复合膜的制备方法，其制备步骤包括如下:
(1)称取PLGA，将其溶于氯仿中，制得浓度为lg/13ml的PLGA氯仿溶液；
(2)将步骤(I)中制得的PLGA氯仿溶液倒入聚四氟乙烯中器皿中，迅速转移至4°C层流柜中，9小时后取出，在室温下放置56小时，再转移至烘箱中旋转32小时，经过梯度升温将溶剂彻底挥发，使PLGA膜形成在聚四氟乙烯中器皿底中；
(3)称取盐酸多巴胺，将其溶于12.5mmol/L的Tris缓冲液中，制得浓度为2.4 mg/ml的溶液；
(4)将步骤(2)中所得PLGA膜竖直浸入步骤(3)中所制得的多巴胺溶液中，28小时取出用12.5mmol/L的Tris缓冲液漂洗4次后干燥；
(5)将I型胶原、壳聚糖分别溶于0.07mol/L的醋酸溶液中，制成浓度5.3mg/mL的溶液，将这两种溶液分别按I型胶原醋酸溶液:壳聚糖醋酸溶液=4:1、2:1、1:1的体积比充分混合；
(6)将步骤(5)中所制得的混合溶液分别倾倒在步骤(4)所得的经多巴胺修饰的PLGA表面，在无菌的环境下室温通风干燥；
(7)将步骤(6)所得膜无菌去离子水漂洗至中性，无菌条件下彻底干燥。本实施例制出来的复合膜兼具优异的力学性能和生物活性，材料界面结合稳定。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明 原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种引导骨组织再生的复合膜，其特征在于:包括基底层、中间改性层以及功能化表层；所述基底层为PLGA膜，所述中间改性层是由多巴胺经聚合形成聚多巴胺并吸附至PLGA膜表面形成，所述功能化表层是由I型胶原或胶原/壳聚糖混合物与聚多巴胺中的活跃基团反应形成。
2.按权利要求1所述的引导骨组织再生的复合膜，其特征在于:所述基底层中的PLGA膜厚度为10(Γ300微米。
3.按权利要求1所述的引导骨组织再生的复合膜，其特征在于:所述I型胶原为鼠尾肌腱I型胶原。
4.一种权利要求1所述的引导骨组织再生的复合膜的制备方法，其特征在于:其制备步骤包括如下: (1)称取PLGA，将其溶于氯仿中，制得浓度为lg/10mflg/20ml的PLGA氯仿溶液； (2)将步骤(I)中制得的PLGA氯仿溶液倒入聚四氟乙烯中器皿中，经过梯度升温将溶剂彻底挥发，使PLGA膜形成在聚四氟乙烯中器皿底中； (3)称取盐酸多巴胺，将其溶于10.5mmol/L^13.5mmol/L的Tris缓冲液中，制得浓度为2.2 mg/ml 2.5 mg/ml 的溶液； (4)将步骤(2)中所得PLGA膜竖直浸入步骤(3)中所制得的多巴胺溶液中，2Γ30小时取出用10.5mmol/L 13.5mmo l/L的Tris缓冲液漂洗2 5次后干燥； (5)将I型胶原、壳聚糖分别溶于0.05mol/L^0.08mol/L的醋酸溶液中，制成浓度5.2mg/mL 5.8mg/mL的溶液，将这两种溶液分别按I型胶原醋酸溶液:壳聚糖醋酸溶液=4:1、2:1、1:1的体积比充分混合； (6)将步骤(5)中所制得的混合溶液分别倾倒在步骤(4)所得的经多巴胺修饰的PLGA表面，在无菌的环境下室温通风干燥； (7)将步骤(6)所得膜无菌去离子水漂洗至中性，无菌条件下彻底干燥。
5.根据权利要求3所述的引导骨组织再生复合膜的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中将PLGA氯仿溶液倒入聚四氟乙烯中器皿中后，迅速转移至4°C层流柜中，8 10小时后取出，在室温下放置2Γ72小时，再转移至烘箱中旋转2Γ72小时。
全文摘要
本发明公开了一种引导骨组织再生的复合膜及其制备方法，所述复合膜包括基底层、中间改性层以及功能化表层；所述基底层为PLGA膜，所述中间改性层是由多巴胺经聚合形成聚多巴胺并吸附至PLGA膜表面形成，所述功能化表层是由I型胶原或胶原/壳聚糖混合物与聚多巴胺中的活跃基团反应形成。该复合膜的制备方法包括制膜、漂洗、风干等一系列步骤。本发明以人工合成高分子聚合物为基底材料，嫁接天然聚合物对其表面经功能活化，经功能化改性后的膜表面具备了原合成聚合物没有的纳米结构和活性基团，增加了成骨细胞亲和力，促进了细胞的粘附，增殖，合成高分子聚合物作为基底，提供了较高的力学强度和可控的降解性能，其表面的预先修饰使得嫁接的天然聚合物得以与基底牢固结合。
文档编号C08J5/18GK103083735SQ20131001819
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者章非敏, 夏阳, 陈刚, 顾宁 申请人:南京医科大学附属口腔医院