含n-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种含N-非取代葡萄糖胺(GlcNH3+)肝素六糖的制备及其纯化。所述方法是以酶解低分子量肝素为原料，通过凝胶色谱和离子交换高效液相色谱等方法分离提纯肝素钠六糖；利用阳离子交换树脂和吡啶中和法制备肝素吡啶六糖；最后用脱N-硫酸化法制备含不同GlcNH3+数目的肝素六糖，并用SAX-HPLC等方法进行分离提纯。本方法可特异性制备出含不同GlcNH3+数目和序列的系列肝素寡糖，为硫酸类肝素中GlcNH3+残基的结构与功能及其与疾病关系的研究提供重要的糖库。
【专利说明】含N-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化
【技术领域】
[0001]本发明是关于制备含GlcNH3+肝素寡糖的方法及其纯化，属于天然产物制备纯化领域。
【背景技术】
[0002]硫酸类肝素中存在12种具代表性的二糖，其中含GlcNAc、GlcNSO3残基的二糖为主要存在形式，而带正电荷的GlcNH3+残基的二糖含量微少，并且它的存在也因细胞与组织的来源不同而异。虽然含GlcNH3+的硫酸类肝素含量微少，但它与病毒的侵入，炎症的发生，脑组织损伤等疾病都有着密切的关系，在生物体内扮演着重要的生物学与病理生理学角色。对含GlcNH3+糖类化合物结构功能的研究，在疾病治疗及新糖类药物开发方面都有重要的意义。
[0003]随着研究的深入，对含不同结构肝素糖链样品的需求也大幅增加。据以往的文献报道，采用分离手段从生物材料中直接获取组分均一、结构明确的糖链非常困难。多采用化学修饰的方法，通过改变溶剂的极性，选择性地脱除肝素长链上不同位置上的硫酸基团，从而获得目标产物。Inoue Y等，使用5%水(或甲醇)/二甲亚砜溶液可选择性地脱除肝素吡啶盐中N位上的硫酸基团Jaseja M等，通过pH=12.5-12.8的NaOH水溶液，a -L-艾杜糖醒酸片段上2S可以定量地脱除；Ayotte L等,使用9:1的Me2SO-水,Hanno B等使用N-甲基吡咯烷酮水溶液可选择性脱除6S ；Dulce P G等使用SO3-Py、SO3-DMF等硫酸化试剂可在糖链上的不同位置进行硫酸化反应，获得各种不同取代类型的多糖。
[0004]迄今为止，制备肝素寡糖的方法步骤繁多，价格昂贵。对硫酸类肝素酶解后得到的寡糖片段的骨架结构直接进行化学修饰的报道很少。批量获取含GlcNH3+肝素寡糖的制备方法更是罕见。本发明用易获得的低分子量肝素为原料，简易的方法，制备出含不同GlcNH3+数目和序列的系列肝素寡糖，为硫酸类肝素中GlcNH3+残基的结构与功能及其与疾病关系的研究提供重要的糖库。
【发明内容】
[0005]本发明实验原材料为酶解的低分子量肝素。利用凝胶色谱分离不同聚合度的肝素钠六糖混合物，除掉流动相中的NH4HCO3后，用SAX-HPLC方法分离收集得到各种肝素钠六糖；脱盐与冷冻干燥之后，利用阳离子交换和吡啶中和法制备调节洗脱液的PH至弱酸性，得到肝素吡啶六糖；后用95%DMS0:5%H20溶剂，选择性地脱除N位上的硫酸根，再用SAX-HPLC方法分离收集得到含不同GlcNH3+数目的肝素六糖。
[0006]本发明的具体技术方案为:
一种含非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化方法，其步骤为:酶解低分子量肝素利用凝胶色谱进行分离；分离后经除流动相、冷冻干燥后得到不同聚合度的肝素钠寡糖混合物；用SAX-HPLC分离收集得到高度硫酸化的肝素钠六糖；把收集到的肝素钠六糖经脱盐与冷冻干燥之后，通过阳离子交换，再用吡啶中和洗脱液的PH至弱酸性，得到肝素吡啶六糖；将肝素吡啶六糖用DMSO =H2O (v/v)=95:5溶剂溶解，选择性地脱除ΛΜ立上的硫酸根，再用SAX-HPLC方法分离收集得到含不同GlcNH3+数目的肝素六糖，经除盐与冷冻干燥之后得到纯化的含不同GlcNH3+数目的肝素六糖。
[0007]具体步骤如下:
1)肝素钠六糖的制备与提纯:酶解低分子量肝素经过聚丙烯酰胺凝胶色谱柱，以0.2MNH4HCO3为流动相，并在UV232nm下测量洗脱液的吸光度；收集肝素钠六糖混合物的洗脱峰，经50-60°C水浴去除NH4HCO3，真空冷冻干燥后得到肝素钠六糖混合物；利用SAX-HPLC，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集高度硫酸化的肝素钠六糖粗品；把收集到的肝素钠六糖粗品在超纯水中透析3天后，冷冻干燥；
2)肝素吡啶六糖的制备:在4°C下，把步骤I)经过透析并冷冻干燥中获得的肝素钠六糖经过H型阳离子交换树脂，去除糖链上的钠离子，所得的洗脱液在室温下用吡啶中和至pH为6-6.5 ;把中和后的洗脱液冷冻干燥，得到肝素吡啶六糖干品；
3)含GlcNH3+肝素寡糖的制备和纯化:把步骤2)中获得的肝素吡啶六糖干品溶于DMSO:H2O (v/v) =95:5溶剂中，经30-60°C水浴15_20min，选择性地脱除肝素链N位上的硫酸根；透析冷冻干燥后，用SAX-HPLC，在NaCl线性梯度洗脱下，分离收集含不同GlcNH3+数目的肝素六糖；把收集到的含不同GlcNH3+数目的肝素六糖，分别透析并冷冻干燥，得到纯化的含不同GlcNH3+数目的肝素六糖。
[0008]步骤3)中水浴条件为30°C水浴20min反应条件下时，得到纯化的含一个、两个和三个GlcNH3+的三种肝素六糖。
[0009]水浴条件为60°C水浴20min反应条件下时，得到纯化的含三个GlcNH3+的肝素六糖。
`[0010]具体操作步骤如下:
1.肝素钠寡糖的制备与提纯
酶解低分子量肝素经过聚丙烯酰胺凝胶色谱柱(BiO-Gel P-1O )，以0.2M NH4HCO3为流动相，并在UV232nm下测量洗脱液的吸光度。收集各个组分，经50-60°C水浴24hX 3去除NH4HCO3,真空冷冻干燥后得到不同聚合度的系列肝素钠六糖混合物。
[0011]利用SAX-HPLC，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集肝素钠六糖。把收集到的肝素钠六糖装入相应规格的透析膜，在超纯水中透析3天后，冷冻干燥。
[0012]SAX-HPLC方法具体参数如下:
色谱柱:ProPac PAl (9X250mm) Sem1-Prep 流速:4ml/min
上样量:< 3mg
流动相:A:pH3.5H20 B:pH3.5 2M NaCl 柱温:室温 检测器:UV检测器 检测波长:232nm 2肝素吡啶寡糖的制备
在4°C下，把步骤I冷冻干燥后获得的肝素钠六糖经过H型阳离子交换树脂，去除糖链上的钠离子，所得的洗脱液在室温下用吡啶中和至PH为6-6.5。把中和后的洗脱液冷冻干燥，得到肝素吡啶寡糖干品。
[0013]含GlcNH3+肝素寡糖的制备与提纯 把步骤2中获得的肝素吡啶寡糖溶于DMSO =H2O (v/v) =95:5溶剂中，一定温度下水浴一段时间，选择性地脱除肝素链N位上的硫酸根。透析冷冻干燥后，用SAX-HPLC，在NaCl线性梯度洗脱下，分离收集含不同GlcNH3+数目的肝素六糖。把收集到的含不同GlcNH3+数目的肝素六糖，透析并冷冻干燥，得到纯化的含不同GlcNH3+数目的肝素六糖。
[0014]SAX-HPLC方法具体参数如下:
色谱柱:ProPac PAl (4X250mm)
流速:lml/min
上样量:< 500ug
流动相:A:pH3.5H20 B:pH3.5 2M NaCl 柱温:室温；
检测器:UV检测器；
检测波长:232nm。
【具体实施方式】
[0015]为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0016]实施例1
以制备含GlcNH3+肝素六糖为例:
I肝素钠六糖的制备与提纯
肝素酶1、IIJII 37°C酶解低分子量肝素(3-8kD)48h (市购的)酶解低分子量肝素经过凝胶色谱柱(Bio-Gel P-1O )，流动相为0.2M NH4HCO3，在紫外232nm处，测量洗脱液的吸光度。收集肝素钠六糖混合物的洗脱峰，后55°C水浴24hX3去除NH4HCO3, -80°C冷冻5h后冷冻干燥。再用SAX-HPLC，在0-0.6M NaCl, 0.6-1.3M NaCl条件下两相线性梯度洗脱，分离并收集高度硫酸化的肝素钠六糖粗品。具体参数如下:
色谱柱:ProPac PAl (9X250mm) Sem1-Prep 流速:4ml/min
流动相:A:pH3.5 H2O B:pH3.5 2M NaCl 柱温:室温 检测器:UV检测器 检测波长:232nm
把收集到的高度硫酸化的肝素钠六糖倒入透析膜(丽:500)，在超纯水中透析3天，去NaCl后，-80°C冷冻5h后冷冻干燥。
[0017]肝素吡啶六糖的制备
在4°C下，把步骤I中获得的高度硫酸化的肝素钠六糖经过H型阳离子交换树脂(Amberlite IR -120 H+)，去除糖链上的钠离子，然后交换上吡啶。具体步骤如下:
(I)根据说明书中树脂的交换量E (即:1克Amberlite IR-120 H+能交换的钠离子摩尔数)计算交换I克肝素钠六糖所需的树脂量。计算方法如下:肝素钠六糖摩尔质量数约为1947g/mol, Imol dp6含有12mol钠离子。
[0018]I 克肝素钠六糖含有钠离子数(mol):(lg+1947g/mol) xl2=0.0062mol I克肝素钠六糖所需树脂量(g):0.0062/E=Yg
(2)选取径高比为I比20的玻璃柱。将Y克树脂浸泡在超纯水中，反复冲洗直至中性后装柱。 [0019](3)将IOOmg肝素钠六糖溶于Iml超纯水中4°C过夜，同时将填好的树脂及3倍树脂体积的超纯水也放在4°C过夜。
[0020](4)在4°C中将(3)中的肝素钠六糖缓慢通过H型阳离子交换树脂，后用3倍树脂体积的4 °C超纯水洗脱；
(5)在室温中，用吡啶将所得的洗脱液在搅拌的状态下，中和至pH为6-6.5。把中和后的洗脱液放_80°C冷冻5h，用真空冷冻干燥机冷冻干燥，得到肝素吡啶六糖纯品。
[0021]含GlcNH3+肝素六糖的制备与提纯
把步骤2中获得的肝素吡啶六糖纯品溶于3ml 95%(v/v) DMSO: 5%(v/v) H2O溶剂，30°C水浴20min，选择性地脱除N位点上的硫酸根，得到含不同GlcNH3+数目的肝素六糖混合物，后倒入透析膜(丽:500)，超纯水中透析3天，后-80°C冷冻5h，用真空冷冻干燥仪冷冻干燥，再用 SAX-HPLC，在 0-0.6M NaCl (2.1-7.1min)，0.6-1.3M NaCl (7.1-47.1min)条件下线性梯度洗脱分离，分别收集含一个GlcNH3+的肝素六糖粗品，含两个GlcNH3+的肝素六糖粗品和含三个GlcNH3+的肝素六糖粗品。具体参数如下:
色谱柱:ProPac PAl (4X250mm)
流速:lml/min 上样量:500ug
流动相:A:pH3.5H20 B:pH3.5 2M NaCl 柱温:室温 检测器:UV检测器 检测波长:232nm
把收集到的这些含不同GlcNH3+数目的肝素六糖分别倒入透析膜(丽:500)，在超纯水中透析3天，后冷冻干燥，得到含三个GlcNH3+的肝素六糖纯品，含两个GlcNH3+的肝素六糖纯品和含一个GlcNH3+的肝素六糖纯品。其摩尔百分比分别为14%，42%，34%。
[0022]含GlcNH3+肝素六糖的表征
把步骤3中获得的含有一个、两个、三个GlcNH3+的肝素六糖，分别在电喷雾(ESI)源高效液相离子肼飞行时间质谱(LCMS-1T-T0F)负离子模式下分析，具体参数如下:色谱柱:
3.5 um Eclipse Plus C18 column (2.1 X 10Omm);流速:0.2 ml ,/mi η ;上样量:10ul ;流动相:A相ρΗ8.8含15mM戊胺的H2O, B相pH8.8 75%/25%(ν/ν)乙腈/水含15mM戊胺；柱温:35°C;检测器:光电二极管阵列，检测波长:190-800nm。质谱全扫描范围:200-1800m/z ;氮气(N2)流速1.5 L/min ;检测电压+1.7Kv ;IT真空度范围:1.8e_002 Pa ;TOF真空度范围:1.6e-004 Pa5CDL温度200°C，加热模块温度200。。。
[0023]在ESI源的LCMS-1T-T0F负离子模式下，都找到了含有一个、两个、三个GlcNH3+的肝素六糖的特征离子峰，他们都带有两个电荷，并且出现了硫酸根丢失和戊胺(PTA)加合的现象(如下表):M3:含三个GlcNH3+的肝素六糖；M2:含两个GlcNH3+的肝素六糖；M1:
【权利要求】
1.一种含非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化方法，其步骤为:酶解低分子量肝素利用凝胶色谱进行分离；分离后经除流动相、冷冻干燥后得到不同聚合度的肝素钠寡糖混合物；用SAX-HPLC分离收集得到高度硫酸化的肝素钠六糖；把收集到的肝素钠六糖经脱盐与冷冻干燥之后，通过阳离子交换，再用吡啶中和洗脱液的PH至弱酸性，得到肝素吡啶六糖；将肝素吡啶六糖用DMSO =H2O (v/v) =95:5溶剂溶解，选择性地脱除ΛΜ立上的硫酸根，再用SAX-HPLC方法分离收集得到含不同GlcNH3+数目的肝素六糖，经除盐与冷冻干燥之后得到纯化的含不同GlcNH3+数目的肝素六糖。
2.如权利要求1所述的制备以及纯化方法:其特征在于，具体步骤如下: 1)肝素钠六糖的制备与提纯:酶解低分子量肝素经过聚丙烯酰胺凝胶色谱柱，以0.2MNH4HCO3为流动相，并在UV232nm下测量洗脱液的吸光度；收集肝素钠六糖混合物的洗脱峰，经50-60°C水浴去除NH4HCO3,真空冷冻干燥后得到肝素钠六糖混合物；利用SAX-HPLC，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集高度硫酸化的肝素钠六糖粗品；把收集到的肝素钠六糖粗品在超纯水中透析3天后，冷冻干燥； 2)肝素吡啶六糖的制备:在4°C下，把步骤I)经过透析并冷冻干燥中获得的肝素钠六糖经过H型阳离子交换树脂，去除糖链上的钠离子，所得的洗脱液在室温下用吡啶中和至pH为6-6.5 ;把中和后的洗脱液冷冻干燥，得到肝素吡啶六糖干品； 3)含GlcNH3+肝素寡糖的制备和纯化:把步骤2)中获得的肝素吡啶六糖干品溶于DMSO =H2O (v/v)=95:5溶剂中，经30_60°C水浴15_20min，选择性地脱除肝素链N位上的硫酸根；透析冷冻干燥后，用SAX-HPLC，在NaCl线性梯度洗脱下，分离收集含不同GlcNH3+数目的肝素六糖；把收集到的含不同GlcNH3+数目的肝素六糖，分别透析并冷冻干燥，得到纯化的含不同GlcNH3+数目的肝素六糖。
3.如权利要求2所述的制备以及纯化方法:其特征在于，步骤3)中水浴条件为30°C水浴20min反应条件下时，得到纯化的含一个、两个和三个GlcNH3+的三种肝素六糖。
4.如权利要求2所述的制备以及纯化方法:其特征在于，步骤3)中水浴条件为60°C水浴20min反应条件下时，得到纯化的含三个GlcNH3+的肝素六糖。
【文档编号】C08B37/10GK103724458SQ201410019945
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】魏峥, 梁群焘, 林江慧, 魏可镁 申请人:福州大学