一种高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法，该方法是将灰树花发酵液分离的菌丝体通过超声波和复合酶解进行处理、分离得到灰树花多糖。本发明改变了传统的多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了灰树花多糖的提取收率和产品品质，减少了生产中纯化水用量和能源消耗，增加了经济效益。
【专利说明】一种高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体是一种高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法。
【背景技术】
[0002]灰树花[Grifola frondosa(Dicks.Fr.) S.F.Gray]隶属担子菌亚门、层菌纲、非裙菌目、多孔菌科、树花菌属，又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子菌、云蕈、莲花菌等，日本称之为舞茸，美国称之为林鸡。其肉质脆嫩，味如鸡丝，能烹调成多种美味佳肴，且含有多种生理活性物质，是一种极具开发和研究价值的食、药兼用蕈菌。
[0003]灰树花多糖是灰树花众多生物活性物质中最主要的一类活性成分，它系从灰树花的子实体或菌丝体与发酵液中分离得到的一类富含β — 1，6 —及β - 1，3 —糖苷键的真菌多糖。研究表明，灰树花多糖具有非常广泛的生物学活性，在抗肿瘤、降血糖、抗肝炎、抗HIV (艾滋病病毒)以及改善免疫系统功能等方面均有很好的作用；并且在某些方面(如抗肿瘤作用)，灰树花多糖具有明显高于其它食药用真菌多糖的医疗效果，同时还具有用药方便(如口服有效)的优越性，为此，人们对灰树花多糖的研究兴趣愈来愈浓，不断有关于其生物活性及药理功能的动物实验和临床研究报道产生，众多科研工作者也都积极投入到其制备、结构分析、构效关系及生物活性等相关性质的研究中去，使灰树花多糖的相关性质研究已成为当前该领域的研究热点之一。
[0004]我国从80年代初开始对其进行人工栽培驯化，90年代开始商品化生产，发展势头强劲。但是，灰树花子实体的人工栽培周期长、占地面积大、受自然气候条件的影响大、且暴露在环境中易被杂菌污染，大规模的人工栽培难以推广。而天然灰树花子实体产量有限，难以满足灰树花及其系列产品的市场需求，故目前已倾向于利用不受自然条件限制的、可大规模工业化生产的液态深层发酵技术来培养灰树花菌丝体。
[0005]目前国内已有院校展开深层液态发酵生产灰树花的研究，都是以获得灰树花的菌丝体为主要目标展开研究的，而目前国内关于液态发酵生产灰树花的功效成分多糖的相关报道较少。目前关于真菌类原料多糖的提取工艺多为传统的水提醇沉法，即向干燥后的菌丝体加入8 - 20倍重量的水,控制温度80 - 100°C浸泡2 - 4h,静止1- 2h,然后反复浸提
2-3次，然后合并上清液进行浓缩，再用50 -85%的酒精进行醇沉，最终烘干即可得到粗多糖。此工艺的缺点是需加入大量水长时间进行浸提，并且为提高收率需反复浸提2 - 3次，操作周期较长、劳动强度偏大，并且多糖的提取收率多在2 -3%，产品成本比较昂贵。并且分离的上清液作为废液直接弃液排掉，增加了治污成本。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了解决传统多糖的水提醇沉的技术瓶颈，采用此发明能够快速、高效生产出灰树花多糖。
[0007]为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行:
[0008]本发明的高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法包括下述步骤:
[0009]I)分离:将灰树花发酵液经分离，得到灰树花上清液和湿菌丝体；
[0010]2)超声处理:向步骤I)所得的湿菌丝体中加入步骤I)所得2 -5倍质量的灰树花上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理10 - 40min，得到超声处理液；上清液的添加主要是作为水溶性溶液来进行提取菌丝体中的多糖，添加量偏少，提取不完全，收率偏低，并且在超声过程中容易温度偏高，影响设备使用；若添加过多，后期处理需消耗大量的能源，成本偏高；
[0011]3)复合酶解:将步骤2)所得超声处理液调节pH值为4 - 7，控制温度30 - 70°C,然后向其加入相当于干菌丝体重量0.2 - 3%的纤维素酶、和0.2 - 3%的蛋白酶，进行酶解I — 4h，得到酶解液；
[0012]4)分离、浓缩:将步骤3)所得的酶解液进行分离，将分离所得到的上清液经低温浓缩，得到浓缩比重为1.25~1.40(50°C热测)的浓缩浆；
[0013]5)醇沉、烘干:加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度为65-80% (v/v)，静置2-6h，将沉淀物进行真空烘干；烘干至干燥物水分含量为3~8%，即得菌丝体多糖提取物。
[0014]其中，步骤1)、4)所述的分离为离心分离，采用三足离心机或高速离心机等离心设备进行，转速为150 0 - 5000rpm。
[0015]步骤2)超声所用的设备为超声波细胞粉碎机，其他同等超声设备均可；超声的功率为 0.5 - 2.5kw。
[0016]步骤3)所述的纤维素酶的单位酶活为15000 μ /g~25000 μ /g，所述的蛋白酶的单位酶活为47000 μ /g~53000 μ /g。
[0017]所述的低温浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085Mpa。
[0018]所述的真空烘干的温度50-75 °C，真空度不低于0.085Mpa。
[0019]本发明中醇沉次数越多，多糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本发明提取的多糖含量在30 - 60%。
[0020]本发明具有以下几个突出的优点:
[0021]传统的工艺是至少用菌丝体干重的20倍的纯化水进行稀释，而本工艺采用上清液进行稀释，并且添加量只为菌丝体干重的2 -5倍；具有以下优点:1、本发明利用上清液替代纯化水进行稀释，减少了废液排放，减少了治污成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作为溶液稀释时，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代纯化水，节约了纯化水，降低生产成本。
[0022]本发明提取路线简洁，节约了大量的能源消耗:因减少了纯化水的加入量，相应的在后期的分离、浓缩等工序减少了大量的电、蒸汽能源的消耗。
[0023]缩短了操作周期，减少了劳动强度:本发明改变了传统的多次浸提，采用一次短时间处理，是传统处理时间的1/3-1/6，减轻了工人的劳动强度。
[0024]提高了提取收率:传统的水提多糖的提取收率在2_3%，此发明用超声和酶解加剧了菌丝体胞内产物的溶出度，本发明提取多糖收率在4-7%，比传统工艺提升了 I倍多。
[0025]提升了产品品质:因本发明采用超声和复合酶解处理菌丝体，将部分菌丝体的蛋白降解成可溶性的小分子物质，减少了在醇沉过程中杂质蛋白的含量，提升了多糖的产品品种，采用本发明提取多糖含量多在40%以上，比传统工艺提升了 30%以上。
[0026]采用本发明可根据市场需求和产品标准，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含量可在30 - 60%。
【具体实施方式】
[0027]以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。本发明使用于普遍的灰树花菌，其来源不受实施例的限制，实施例中使用的菌种编号为CGMCC N0.4179的灰树花菌种仅是为了举例说明本发明的技术方案。
[0028]实施例1
[0029]本发明高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法按下述步骤进行:
[0030]1、灰树花发酵液的制备 :灰树花菌种购买于中科院微生物研究所(其菌种编号为CGMCC N0.4179)。将活化好的灰树花摇瓶菌株按接种量10%接种于种子培养基(1L)，其中种子培养基组成为葡萄糖1.8%、蛋白胨0.5%、黄豆饼粉I %、磷酸二氢钾0.3%、七水硫酸镁0.15%、豆油0.02%，调节pH值5.5，通风比为1:0.3vvm，罐压0.03Mpa，26~28°C振荡培养7天即得灰树花种子液；将种子液按接种量15%接入发酵培养基(50L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2.5%、蛋白胨0.3%、黄豆饼粉1.5%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.2%、豆油0.03%，调节pH值5.5 ;通风比为1:0.5vvm，罐压0.03Mpa, 26~28°C培养6天，发酵至发酵液有菌球大量增加，滤液浑浊；还原糖降至最低0.3%并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染，即得灰树花发酵液。其中上述培养基组成中的均表示g/100ml。
[0031]2、灰树花发酵液分离:取上述灰树花发酵液1Kg通过高速离心机2000rpm进行分离，得到灰树花上清液液9.35Kg和0.65Kg的湿菌丝体(含水量为80% )。
[0032]3、超声处理:向步骤2所得的0.65Kg湿菌丝体中加入2.35Kg的灰树花上清液进行稀释，搅拌均匀后进行1.5kw超声处理20min，得到超声处理液3Kg。
[0033]4、复合酶解:将步骤3所得超声处理液调节pH值为5.5，在水浴控制温度45 °C，然后向其缓慢加入纤维素酶2.1g (购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶1.9g(购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活50000 μ /g，下同)并不断搅拌，搅拌均匀后计时进行酶解2h，得到酶解液。
[0034]5、分离、浓缩:将步骤4所得的酶解液用高速离心机4000rpm进行分离，将分离所得到的上清液2.5Kg用旋转蒸发仪低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到浓缩比重为1.3(50°C热测)的浓缩浆65g。
[0035]6、醇沉、烘干:向65g浓缩浆的中加入250ml的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度72% (v/v)，缓慢搅拌均匀后静置2h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60°C，真空度0.09MPa ;烘干Ih得灰树花菌丝体多糖提取物16.5g。检测水分含量为3.7%，多糖含量为44%，多糖提取收率为5.58%。
[0036]本发明中的多糖提取收率是按干菌粉计算的，即多糖提取收率=灰树花菌丝体多糖提取物质量*多糖含量/ [湿菌丝体质量* (1-湿菌丝体含水量)]*100 %
[0037]实施例2
[0038]本发明高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法按下述步骤进行:
[0039]1、灰树花发酵液的制备:灰树花菌种购买于中科院微生物研究所(其菌种编号为CGMCC N0.4179)。将活化好的灰树花摇瓶菌株按接种量14% (v/v)接种于种子培养基(20L)，其中种子培养基组成为葡萄糖2.0 %、蛋白胨0.3 %、黄豆饼粉I %、磷酸二氢钾
0.3%、七水硫酸镁0.15%、豆油0.02%，调节pH值5.5，通风比为1:0.3vvm，罐压0.03Mpa,26~28°C振荡培养7天即得灰树花种子液；将种子液按接种量18% (v/v)接入发酵培养基(100L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2.5%、蛋白胨0.5%、黄豆饼粉1.5%、磷酸二氢钾
0.2%、七水硫酸镁0.2%、豆油0.03%，调节pH值5.5 ;通风比为1:0.5vvm，罐压0.03Mpa,26~28°C培养5天，发酵至发酵液有菌球大量增加，滤液浑浊；还原糖降至最低0.3%并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染，即得灰树花发酵液。其中上述培养基组成中的”均表示 g/100ml。
[0040]2、灰树花发酵液分离:取上述灰树花发酵液20Kg通过高速离心机2000rpm进行分离，得到灰树花上清液液18.7Kg和1.3Kg的湿菌丝体(含水量为78% )。
[0041]3、超声处理:向步骤2所得的1.3Kg湿菌丝体中加入3.7Kg的灰树花上清液进行稀释，搅拌均匀后进行2.0kw
[0042]超声处理30min，得到超声处理液5Kg。
[0043]4、复合酶解:将步骤3所得超声处理液调节pH值为5.0，在水浴控制温度55°C，然后向其缓慢加入纤维素酶4.5g (购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶4.2g (购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活50000 μ /g，下同)并不断搅拌，搅拌均匀后计时进行酶解2h，得到酶解液。
[0044]5、分离、浓缩:将步骤4所得的酶解液用高速离心机4000rpm进行分离，将分离所得到的上清液3.SKg用旋转蒸发仪低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到浓缩比重为1.4(50°C热测)的浓缩浆120g。
[0045]6、醇沉、烘干:向120g浓缩浆的中加入400ml的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度73% (v/v)，缓慢搅拌均匀后静置2.5h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60°C，真空度0.09MPa ;烘干Ih得灰树花菌丝体多糖提取物38.5g。检测水分含量为
3.3%，多糖含量为41%，多糖提取收率为5.52%。
【权利要求】
1.一种灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于该方法包括下述步骤: 1)分离:将灰树花发酵液经分离，得到灰树花上清液和湿菌丝体； 2)超声处理:向步骤I)所得的湿菌丝体中加入步骤I)所得2-5倍质量的灰树花上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理10-40min，得到超声处理液； 3)复合酶解:将步骤2)所得超声处理液调节pH值为4-7，控制温度30-70°C，然后向其加入相当于干菌丝体重量0.2-3%的纤维素酶、和0.2-3%的蛋白酶，进行酶解l-4h，得到酶解液； 4)分离、浓缩:将步骤3)所得的酶解液进行分离，将分离所得到的上清液经低温浓缩，得到浓缩比重为1.25~1.40的浓缩浆； 5)醇沉、烘干:加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度为65-80% (v/v)，静置2-6h，将沉淀物进行真空烘干；烘干至干燥物水分含量为3~8%，SP得菌丝体多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的分离为离心分离，转速为1500-5000rpm。
3.根据权利要求1所述的灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的纤维素酶的单位酶活为15000 μ /g~25000 μ /g，所述的蛋白酶的单位酶活为47000 μ /g~53000 μ/g。
4.根据权利要求1所 述的灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的低温浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085Mpa。
5.根据权利要求1所述的灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的真空烘干的温度50-75°C，真空度不低于0.085Mpa。
【文档编号】C08B37/00GK104072632SQ201410337687
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】徐玲, 徐国华, 王文风, 王英燕, 杨亚威, 秦建丽, 张芙蓉 申请人:江苏阜丰生物科技有限公司