酿酒酵母ZG27(MATa/α)及其应用的制作方法与工艺

酿酒酵母ZG27(MATa/α)及其应用(一)技术领域本发明涉及一种酿酒酵母，特别涉及一株联产乙醇和麦角醇的酿酒酵母ZG27(MATa/α)。(二)

背景技术：
发展生物质可再生能源是许多国家应对传统化石能源枯竭和环境问题的战略选择。当前，燃料乙醇是世界范围内最先实现工业化的生物能源，主要通过酿酒酵母发酵糖蜜、淀粉和纤维原料生产。2006年起，我国已成为世界第三大燃料乙醇生产国家。由于土地和水资源限制、生产过程能耗高及废料处理等难题的存在，目前我国燃料乙醇的生产企业面临着沉重的生产成本压力。只有创新生产工艺，进一步提高燃料乙醇的生产水平，才能有效降低生产成本，进而提升其社会经济效益。燃料乙醇的生产成本的构成主要是原料和乙醇蒸馏能耗，选育和利用高乙醇产量(乙醇发酵终浓度在15％以上)和高糖醇转化率的酵母菌株被认为是提高原料利用效率和降低蒸馏能耗的重要途径。除乙醇外，酵母细胞还是麦角固醇等生物活性物质的重要来源。麦角固醇是酿酒酵母细胞膜的重要成分，也是维生素D2和氧化可的松等固醇类药物的前体物质。目前商业化的麦角固醇主要也是在酵母和青霉等真菌中提取获得。如果能将乙醇发酵后的废酵母菌体用于麦角固醇的提取利用，这无疑会进一步降低燃料乙醇的生产成本。酿酒酵母的乙醇和麦角固醇产量是一种复杂性状，涉及多基因和生理过程的共同调控。麦角固醇含量与酵母细胞耐受乙醇、香草醛和D-柠檬烯等多种胁迫因子有密切的关系。近几年的研究表明，大范围的基因组结构变异，如染色体片段缺失、扩增和重组会引起全局基因表达和多种表型性状的变化。基于这些认识，本发明提出一种基于基因组变构的创新方法来选育同时高产乙醇和麦角固醇的酿酒酵母菌株。(三)

技术实现要素：
本发明目的是提供一种同时高产乙醇和麦角固醇的酿酒酵母菌株--酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZG27(MATa/α)，适应于浓醪乙醇或麦角固醇生产，也可用于乙醇和麦角固醇的联产生产工艺。本发明采用的技术方案是：本发明涉及一株新菌株--酿酒酵母菌株(Saccharomycescerevisiae)ZG27(MATa/α)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2014年4月1日，保藏编号为CCTCCNO:M2014111，邮编430072。本发明还提供一种所述酿酒酵母ZG27(MATa/α)在生产乙醇和麦角固醇中的应用，具体所述的应用为：将酿酒酵母ZG27(MATa/α)接种至发酵培养基中，于33℃、100-200rpm条件下发酵培养，将发酵液分离纯化，获得乙醇和麦角固醇；所述发酵培养基是将玉米粉和木薯粉按质量比1：2混合后，加入自来水，采用α-淀粉酶和糖化酶双酶法制成发酵培养基；所述自来水与玉米粉和木薯粉总质量比为2-3:1。进一步，所述酿酒酵母ZG27(MATa/α)在接种前，先接种至YPD固体培养基，30℃培养2天进行斜面活化，获得斜面菌体；然后再将斜面菌体接种至YPD液体培养基，于30℃条件下培养18-30h，获得种子液，将种子液离心，收集酵母细胞，将酵母细胞以0.9-6×1010个/L的接种量接种至发酵培养基。进一步，本发明所述发酵培养基按如下方法制备：将玉米粉和木薯粉按质量比1：2混合后作为物料，加入自来水，同时按32KNU/g物料的比例加入α-淀粉酶，边搅拌边加热至90℃，再在95℃保温2h进行液化，取出冷却至65℃时，按1AUG/g物料加入糖化酶，在60℃保温4-10h，过滤，滤液即为发酵培养基；所述自来水与玉米粉和木薯粉总质量比为2-3:1。进一步，本发明所述分离纯化的方法为：发酵液经4000-6000rpm离心后，获得上清液和酵母菌体，向酵母菌体中加入醇碱溶液，在95℃水浴3h，然后加入正庚烷抽提0.5h，得到麦角固醇提取液；所述每100mL醇碱溶液是由25gNaOH溶在60mlddH2O中，加无水乙醇至100mL制成，所述醇碱溶液加入量以酵母细胞数计为3mL醇碱溶液/1×109个；取上清液经0.45μm硝酸纤维素滤膜过滤后，取滤液获得乙醇。本发明所述酿酒酵母ZG27(MATa/α)的筛选步骤如下(示意图见图1)：(1)出发菌株ZTW1的基因组变构酿酒酵母ZTW1(CCTCCM2013061)在YPD斜面活化后接种至含有30-65μg/mL多菌灵的YPD液体培养基中，在30℃温度下培养18h(初始菌浓度约为2×107细胞/mL)。离心收集酵母细胞(3×108细胞)转接至10mL的酵母产孢培养基中，于28℃培养3-5天。接着以12000rpm的转速离心收集子囊孢子。对约2×108个子囊进行蜗牛酶处理破壁释放孢子后将其置于25mL液体YPD中进行随机杂交，获得基因组结构变异突变株。(2)高产乙醇和麦角固醇突株的筛选对步骤(1)所述的杂交子(约3×108细胞)进行5000rpm离心5min收集，转接至10mL含有20％(v/v)乙醇的YPD中培养2h，吸取培养液涂布至含7mMCuSO4的YPD固体平板(每个平板涂50μL)。在平板上随机挑取若干个最先长出的菌落，对其进行抗逆性，乙醇发酵性能、麦角固醇含量和基因组结构变异检测，从中选取既高产乙醇又高产麦角固醇的突变株。其中突变株ZG27在乙醇耐性、乙醇产量、糖醇转化率和麦角固醇产量较亲株均有显著的提高。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供高产乙醇和麦角固醇的酿酒酵母ZG27(MATa/α)及其应用，本发明的育种方法可以引起酵母基因组的大范围结构变异，并且通过CuSO4平板的辅助筛选获得了多株同时高产乙醇和麦角固醇的突变株，麦角固醇提高幅度较以往方法具明显优势。运用此方法构建酿酒酵母突变株ZG27(MATa/α)与出发菌株酿酒酵母ZTW1相比，ZG27(MATa/α)在普通生长条件下麦角固醇含量提高了90％以上，可达到9.6mg/g干重；在高浓度乙醇发酵条件下乙醇产量提高5％以上，发酵末期麦角固醇产量提高40％以上。这些优势可使其应用于单独的浓醪乙醇或麦角固醇生产，也可用于乙醇和麦角固醇的联产生产工艺，从而减少乙醇生产过程中的能耗、提高原料利用率和产品附加值，降低乙醇生产成本。(四)附图说明图1为突变株构建示意图。图2为突变株的麦角固醇含量和乙醇产量变化图。图3为突变株ZG27与亲株ZTW1的胁迫耐性比较，每幅图从左至右，第一列为5×107细胞/mL样品，第二列为5×106细胞/mL，第三列为5×105细胞/mL样品。图4为突变株ZG27与亲株ZTW1的基因组结构比较，a为突变株ZG27与亲株的染色体电泳图，泳道ZTW1代表亲株ZTW1的染色体条带，泳道ZG27代表突变株ZG27的染色体条带；b为ZG27和ZTW1的比较基因组杂交图，其中区域c代表3号染色体的DNA相对拷贝数，区域d代表9号染色体的DNA相对拷贝数。图5为突变株ZG27与亲株ZTW1的乙醇发酵性能和麦角固醇产量比较，a为乙醇产量和葡萄糖消耗量图，b为每单位体积培养基中酵母活细胞数图，c为单位体积麦角固醇产量图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：YPD液体培养基组成：酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然，YPD固体培养基为在YPD液体培养基中添加终浓度20g/L的琼脂。实施例1：高产乙醇和麦角固醇突变株ZG27的构建(1)斜面活化：将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZTW1(CCTCCM2013061)接种至YPD固体培养基，30℃培养2天进行斜面活化，获得斜面菌体。(2)酿酒酵母孢子：将经固体YPD斜面活化的酵母菌株ZTW1接种至含有终浓度35μg/mL多菌灵(即N-(2-苯骈咪唑基)-氨基甲酸甲酯)的25mL的YPD液体培养基中，30℃培养18h，初始菌浓度约为2×107细胞/mL。6000rpm离心，收集3×108个酵母细胞，并转接至10mL的10g/L醋酸钾水溶液中(pH6.0)，在28℃产孢5天。12000rpm转速下离心5min收集子囊孢子，加入2mL、20g/L的蜗牛酶，在30℃、200rpm的条件下振荡对子囊进行破壁，12000rpm转速下离心10min，收集游离孢子后接至25mL的YPD液体培养基中，于30℃下培养2天，让孢子进行随机杂交。5000rpm离心5min，收集3×108的杂交子，转接至10mL含有20％(v/v)乙醇的YPD液体培养基中，30℃培养2h，吸取培养液涂布至含终浓度7mMCuSO4的YPD固体培养基(每个平板涂50μL)，30℃培养5天，在平板上随机挑取35个最先长出的菌落，对其进行麦角固醇含量和乙醇发酵性能检测(图2)。(3)酵母菌株的乙醇发酵性能比较将步骤(2)挑取的菌落接种至50mL的YPD液体培养基中，30℃培养18h，作为种子液。将种子液离心，收集酵母细胞(9×109)接种至含有300mL发酵培养基的1L锥形瓶中，每个锥形瓶盖8层无菌纱布，于摇床中发酵70h(温度33℃；转速100rpm)。发酵液12000rmp离心后，取上清用高效液相色谱(HPLC)方法检测，仪器为Agilent1100(PaloAlto,CA,USA)。色谱柱为Bio-Rad的AminexHPX-87H，柱温为60℃，流动相为4mM的硫酸。同样条件下以酿酒酵母ZTW1作为对照，结果见图2所示。发酵培养基是玉米粉和木薯粉按质量比1：2混合后通过双酶(液化酶和糖化酶)法制得，具体步骤为：按质量比2:1称取1.4kg的木薯粉和0.7kg玉米粉作为物料，加入4.6kg自来水混匀，同时按32KNU/g物料的比例加入液化酶(即α-淀粉酶，购自北京诺维信)，边搅拌边加热至90℃，随后在95℃烘箱保温2h进行液化，冷却至65℃时按1AUG/g物料加入糖化酶(购自北京诺维信)，在60℃保温4h，过滤，滤液即为发酵培养基。(4)麦角固醇和乙醇测定方法将步骤(2)挑取的菌落接种至50mL的YPD液体培养基中，30℃培养18h，离心，获得上清液，并收集约1×109酵母细胞，用无菌水清洗2遍后，重悬在3mL的醇碱溶液中(25gNaOH溶在60mlddH2O中，加无水乙醇至100mL)。在95℃水浴锅中皂化3h，用5mL正庚烷抽提0.5h。麦角固醇测定通过配备ZorbaxSB-C18column(250×4.6mm；Agilent,PaloAlto,CA,USA)色谱柱和紫外检测器的Agilent1100machine高效液相色谱仪，在282nm检测，流动相为95％甲醇和5％超纯水。上清液经0.45μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤后，滤液用高效液相色谱(HPLC)方法检测乙醇含量，仪器为Agilent1100(PaloAlto,CA,USA)。色谱柱为Bio-Rad的AminexHPX-87H，柱温为60℃，流动相为4mM的硫酸。同样条件下以酿酒酵母ZTW1作为对照，结果见图2所示。结果表明：在含CuSO4平板上挑出的35株突变株中共有9株菌株(编号分别为4,6,8,9,15,17,24,27和33)较亲株具有更高的乙醇和麦角固醇产量(图2)，其中编号为27的菌株具有最高麦角固醇含量，其乙醇产量较亲株提高了5.3％，麦角固醇产量提高了1.08倍，命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZG27(MATa/α)。实施例2：突变株ZG27的抗逆性和基因组变异(1)酵母菌株的多种胁迫耐受性能测定将酿酒酵母ZTW1和酿酒酵母ZG27(MATa/α)接种至25mLYPD液体培养基中，于30℃条件下培养18h(初始细胞量约为3×106细胞/mL)。酵母细胞用生理盐水稀释至5×107细胞/mL，随后再将其分别稀释10倍和100倍，在每个浓度中吸取4μL分别点样在YPD平板和含有抑制物的YPD平板，抑制物分别为18％(v/v)乙醇，8mM过氧化氢，6mM硫酸铜，6g/L乙酸，1.4M氯化钠，低pH(pH2.5)和1.5g/L香草醛。图3显示酿酒酵母ZG27(MATa/α)在乙醇、过氧化氢和铜离子耐性上要高于亲株ZTW1。(2)基因组结构变异检测方法利用脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)和比较基因组杂交技术(array-comparativegenomichybridization,aCGH)，可以比较酿酒酵母ZG27(MATa/α)相对于酿酒酵母ZTW1的基因组结构变异情况。PFGE使用美国伯乐(Bio-Rad)的CHEF-DRII型电泳仪进行，程序为：200V(6V/cm)，60-120s脉冲间隔，电泳时间26h，电场角度为120°，缓冲液为0.5×TBE。电泳结束后，凝胶块在0.5μg/mL溴化乙锭水溶液中染色半小时，然后在凝胶成像系统中观察。aCGH分析使用罗氏NimbleGenS.cerevisiaeWhole-GenomeTilingarrays(385k)芯片。酵母基因组经超声打断(200–1000bp)后分别标记上Cy5和Cy3在芯片上杂交。杂交信号用AxonGenePix4000B生物芯片扫描器检测，杂交数据利用软件NimbleScan进行提取和分析。图4中a显示的酿酒酵母ZG27(MATa/α)与酿酒酵母ZTW1的脉冲场凝胶电泳结果，可以看出无论在染色体长度和数目上两菌株都存在差异；图4中b显示的是ZG27和ZTW1的比较基因组杂交结果，区域c表示在酿酒酵母ZG27(MATa/α)的3号染色体的DNA拷贝数要低于酿酒酵母ZTW1的3号染色体，区域d表示酿酒酵母ZG27(MATa/α)在9号染色体的31kb到378kb区域的DNA拷贝数要高于酿酒酵母ZTW19号染色体相应区域的拷贝数。这些结果证实了本发明提供的方法能引起酵母菌株大范围的基因组结构变异，这也表明了酿酒酵母ZG27(MATa/α)是在遗传物质上与酿酒酵母菌株ZTW1是有根本性区别的。实施例3：酿酒酵母ZG27(MATa/α)用于乙醇和麦角固醇的联产发酵将酿酒酵母ZG27(MATa/α)接种至YPD固体培养基，30℃培养2天进行斜面活化，获得斜面菌体；挑取斜面菌体接种至50mLYPD液体培养基中，于30℃条件下培养18h(初始细胞量约为3×106细胞/mL)作为种子液。将种子液离心，收集酵母细胞(9×109)接种至含有300mL发酵培养基(将实施例1中自来水与物料的质量比改为2.4:1，其它同实施例1)的1L锥形瓶中，每个锥形瓶盖8层无菌纱布，于摇床中发酵60h(温度33℃；转速100rpm)。采用实施例1所述方法检测麦角固醇含量和乙醇含量。同样条件下以酿酒酵母ZTW1作为对照。发酵液中CFU(单位体积活菌个数)的计算方法为：在每瓶发酵液中间隔12h吸取100μL发酵液，用无菌水稀释10万倍，然后涂布在YPD平板上，在30℃条件下培养2天，进行菌落计数。与出发菌株ZTW1相比，ZG27(MATa/α)的在发酵结束时乙醇产量提高了5.3％(图5中a)，发酵末期CFU提高了29％(图5中c)，麦角固醇产量提高了43％(图5中c)。实施例4：ZG27用于乙醇和麦角固醇的联产发酵将酿酒酵母ZG27(MATa/α)接种至50mLYPD液体培养基中，于30℃条件下培养18h(初始细胞量约为3×106细胞/mL)作为种子液。将种子液离心，收集酵母细胞(2×1010)接种至含有300mL发酵培养基(将实施例1中自来水与物料的质量比改为2.0:1，在60℃保温10h，其它同实施例1)的1L锥形瓶中，每个锥形瓶盖8层无菌纱布，于摇床中发酵75h(温度33℃；转速100rpm)，其它操作同实施例1。同样条件下以酿酒酵母ZTW1作为对照。发酵结束后，与出发菌株ZTW1相比，ZG27(MATa/α)的乙醇产量为126.4g/L，较亲株提高了6.8％；麦角固醇产量为74.9mg/L，较亲株提高了45％。实施例5：ZG27用于乙醇和麦角固醇的联产发酵将酿酒酵母ZG27(MATa/α)接种至50mLYPD液体培养基中，于30℃条件下培养18h(初始细胞量约为3×106细胞/mL)作为种子液。将种子液离心，收集酵母细胞(4×1010)接种至含有300mL发酵培养基(将实施例1中自来水与物料的质量比改为2.2:1，在60℃保温10h，其它同实施例1)的1L锥形瓶中，每个锥形瓶盖8层无菌纱布，于摇床中发酵70h(温度33℃；转速100rpm)。同样条件下以酿酒酵母ZTW1作为对照。发酵结束后，与出发菌株ZTW1相比，ZG27(MATa/α)的乙醇产量为127.1g/L，较亲株提高了7.4％；麦角固醇产量为81.5mg/L，较亲株提高了46％。