本发明属于饲料微生物技术领域，特别涉及一种以豆粕、麸皮、玉米粉为基质，利用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌进行固态发酵制备益生菌剂的应用技术。
背景技术：
现有益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或酸豆奶，或者将其采用液态发酵后，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。在采用液态发酵时，会产生大量的废水污染环境，后处理比较困难，机器设备操作也较为繁琐。由于益生菌能够改善宿主微生态平衡，提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及代谢产物，因此，现在对益生菌的研究已经非常深入和细致化，并且已经广泛应用于工业、农业、环保、家庭等各个项领域。目前，将益生菌制品应用于动物微生物制剂、添加至动物饲料中也已较为常见；例如，公开号为CN103202391A的发明专利《一种有效预防及改善牛乳房炎的复合乳酸菌微生态制剂》，公开了一种由保藏号为CGMCCNo.6736的干酪乳杆菌HM-09、保藏号为CGMCCNo.6741的植物乳杆菌HM-10和沸石粉按质量份数组合而成的复合微生态制剂，能有效的降低体细胞数，预防减少隐性牛乳房炎发病率；公开号为CN103243043A的发明专利《一株用于改善次等猪苗养殖的优良凝结芽孢杆菌及其应用》，公开了一种保藏号为CGMCCNo.6729的凝结芽孢杆菌，通过应用这种菌株，可有效的改善猪苗的健康状况、提高次等猪苗养殖的生产性能。公开号为CN103421711A的发明专利《用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌》公开了用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌HM-66、干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCCNo.6733、CGMCCNo.6735、CGMCCNo.6744和CGMCCNo.5470；通过这几种菌株的应用能有效改善饲料的酸香味、色泽和口感等感官特征。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种利用凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)HM-09和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HM-10等菌对豆粕、麸皮和玉米粉基质进行分段固态发酵的方法，利用此方法发酵出的益生菌剂产品具有特殊的酸香味，且含有的活菌数高，豆粕蛋白质的降解率也高，还能够调节动物肠道微生物菌群，促进肠道吸收、增强机体免疫力，改善生产性能，提高饲料的利用率，有效抑制养殖后期机体粪便和残饵料的腐烂，改善环境卫生，降低氨氮和亚硝酸盐的产生，降低整个养殖成本。本发明是通过下述技术方案实现的：一种利用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌制备的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤：种子液的制备：将凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中30-38℃，170转摇床培养20-24h；将植物乳杆菌HM-10与干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)HM-09于恒温箱中30-38℃培养20-24h；所述凝结芽孢杆菌HM-09、植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09的种子培养基为：蛋白胨2-5％，葡萄糖2-5％，加水至100％，pH7.0-7.2；发酵培养条件：将凝结芽孢杆菌HM-09种子液添加到固体培养基中进行混合后发酵0-16h,再接种植物乳杆菌HM-10种子液与干酪乳杆菌HM-09种子液继续发酵12-36h，共计发酵时间12-52h，发酵过程中控制发酵温度为30-38℃，湿度为60-80％,发酵结束其游离氨基态氮含量在480umol/g以上；所述固体培养基为：25-30％豆粕，25-30％麸皮，2-5％玉米粉，水分含量40-50％,初始pH6.8-7.2。所述凝结芽孢杆菌HM-09种子液的添加量为固体培养基总重量的3-6％，植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的2-4％，干酪乳杆菌HM-09种子液的添加量为固体培养基总重量的4-6％。益生菌剂中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数(1.45-2.98)×109CFU/g，植物乳杆菌HM-10活菌数(1.55-2.65)×109CFU/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数(3.31-9.98)×109CFU/g。本发明产品在饲料中的添加量为25-60g/kg。有益效果本发明利用凝结芽孢杆菌HM-09和植物乳杆菌HM-10等为发酵菌剂对豆粕、麸皮和玉米粉进行混合固态发酵，降低了发酵生产成本，处理方便，污染小，并且设备结构简单、易操作，是一种可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术；采用凝结芽孢杆菌HM-09进行前期发酵，可以产生大量乳酸及乙酸等酸味小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等，提高了产品的适口性；本发明在固态发酵一段时间后添加了植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09进行混合发酵，能够高效利用干酪乳杆菌HM-09菌调节肠内菌群平衡、促进机体消化吸收的功能，同时还能够利用干酪乳杆菌促进细胞分裂的作用，产生抗体免疫，增强机体免疫；所述植物乳杆菌在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，因此利用此特性，在养殖后期能很好的抑制底部粪便和残饵料的腐烂，降低氨氮和亚硝酸盐的产生，大量减少化工降解素的用量，使养殖成本降低；利用分段固态发酵的方法生产的益生菌制剂中含有大量的活菌，因此，协同各菌种的特性，能够有效调节动物肠道微生物菌群，促进肠道吸收、增强机体免疫力，改善断奶仔猪菌群失调性腹泻，提高饲料的利用率，降低整个养殖成本。本发明产品用于早期断奶乳猪的饲喂时能有效降低乳猪的腹泻率30％以上，饲料的转化率提高了25-30％。具体实施方式下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。本发明所提供的凝结芽孢杆菌HM-09、植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09于2012年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCCNo.6729、CGMCCNo.6741和CGMCCNo.6736；保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；实施例1一种利用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌制备的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤：种子液的制备：凝结芽孢杆菌HM-09、植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09从冻藏的甘油管中接种到装有液体种子的培养基中，所述凝结芽孢杆菌HM-09的种子培养条件：37℃，170转摇床培养24h；植物乳杆菌HM-10与干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃培养24h；其中种子培养基为：蛋白胨2％，葡萄糖2％，加水至100％，pH7.0-7.2。固态发酵发酵培养条件：将凝结芽孢杆菌HM-09种子液添加到固体培养基中进行混合后发酵12h,再接种植物乳杆菌HM-10种子液和干酪乳杆菌HM-09种子液继续发酵24h，共计发酵时间36h，发酵过程中控制发酵温度为37℃，湿度为70％,发酵结束其游离氨基态氮含量为489umol/g；所述固体培养基为：29％豆粕，29％麸皮，2％玉米粉，水分含量40％，初始pH7.0，115℃高压灭菌25min。所述凝结芽孢杆菌HM-09种子液的添加量为固体培养基总重量的5％，植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的3％，干酪乳杆菌HM-09种子液的添加量为固体培养基总重量的5％。益生菌剂中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数2.98×109CFU/g，植物乳杆菌HM-10活菌数2.07×109CFU/g，干酪乳杆菌HM-09的活菌数5.98×109CFU/g。本发明产品在饲料中的添加量为45g/kg。实施例2:一种利用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌制备的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤：种子液的制备：将凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中37℃，170转摇床培养24h；将植物乳杆菌HM-10与干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃培养24h。其中种子培养基为：蛋白胨2％，葡萄糖2％，加水至100％，pH7.0-7.2；发酵培养条件：将凝结芽孢杆菌HM-09种子液添加到固体培养基中进行混合后发酵16h,再接种植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09种子液继续发酵15h，共计发酵时间31h，发酵过程中控制发酵温度为37℃，湿度为80％，发酵结束其游离氨基态氮含量在486umol/g；固体培养基为：29％豆粕，29％麸皮，2％玉米粉，水分含量40％，初始pH7.0，115℃高压灭菌25min。凝结芽孢杆菌HM-09种子液的添加量为固体培养基总重量的3％，植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的2％，干酪乳杆菌HM-09种子液的添加量为固体培养基总重量的6％。益生菌剂中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数1.45×109CFU/g，植物乳杆菌HM-10活菌数1.55×109CFU/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数9.98×109CFU/g。本发明产品在饲料中的添加量为30g/kg。实施例3一种利用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌制备的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤：种子液的制备：将凝结芽孢杆菌HM-09于恒温箱中37℃，170转摇床培养24h；将植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃培养24h。凝结芽孢杆菌HM-09、植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09的种子培养基为：蛋白胨2％，葡萄糖2％，加水至100％，pH7.0-7.2；发酵培养条件：将凝结芽孢杆菌HM-09种子液添加到固体培养基中进行混合后发酵6h,再接种干酪乳杆菌HM-09和植物乳杆菌HM-10种子液继续发酵36h，共计发酵时间42h，发酵过程中控制发酵温度为37℃，湿度为60％,发酵结束其游离氨基态氮含量在460umol/g；固体培养基为：29％豆粕，29％麸皮，2％玉米粉，水分含量40％，初始pH7.0，115℃高压灭菌25min。凝结芽孢杆菌HM-09种子液的添加量为固体培养基总重量的6％，植物乳杆菌HM-10的种子液添加量为固体培养基总重量的4％，干酪乳杆菌HM-09种子液的添加量为固体培养基总重量的4％。益生菌剂中凝结芽孢杆菌HM-09活菌数3.18×109CFU/g，植物乳杆菌HM-10活菌数2.65×109CFU/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数3.31×109CFU/g。本发明产品在饲料中的添加量为60g/kg。使用效果实验应用本发明实施例1的益生菌剂在断奶仔猪中的使用效果试验：试验动物选择养殖场平均体重为(10.5±0.45)kg的健康乳猪120头，经统计分析体重差异不显著。采用单因子随机化设计，将120头健康乳猪，按公母各半，随机分成2组(对照组和试验组)，每组6个重复，每个重复10头猪。试验组添加实施例1制得的本发明产品45g/kg，对照组不添加本发明产品。连续饲喂20天，与对照组相比，使用发明饲料添加剂可获得如下效果：项目试验组对照组始重(kg)10.4510.65末重(kg)20.5719.59日采食量(g)720.1705.2日增重(g)506447料肉比1.421.58腹泻率(头)624试验结果表明：乳猪饲喂含有本发明益生菌剂的饲料后，日采食量增加，日增重提高了，同时还降低了乳猪的料肉比，腹泻率也显著降低了。