大白菜抗根肿病CRb基因的连锁分子标记、引物及抗根肿病植株的选择方法与制造工艺

本申请为原发明专利申请“大白菜抗根肿病CRb基因的连锁分子标记、引物及抗根肿病植株的选择方法”的分案申请，其专利申请日：2013年4月16日；专利申请号：2013101322309；发明创造名称：大白菜抗根肿病CRb基因的连锁分子标记、引物及抗根肿病植株的选择方法。技术领域本发明涉及与大白菜抗根肿病基因CRb紧密连锁的分子标记、引物序列以及筛选大白菜抗根肿病植株的方法。

背景技术：
2002年，本课题组获得了1份抗芸薹根肿病的大白菜双单倍体系‘CRShinkiDH’系，研究表明该抗病材料抗芸薹根肿菌生理小种2、4和8（Piao等，ConversionofAFLPmarkerlinkedtoclubrootresistancegeneintoSCARmarker.2002，JKorSocHortSci43:653–665）。进一步研究证明抗根肿病基因为显性单基因，并命名为CRb（Piao等，SCARandCAPSmappingofCRb,ageneconferringresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinChinesecabbage（Brassicarapassp.pekinensis），TheorApplGenet，2004，108:1458-1465）。在芸薹种抗根肿病品种转育过程中，每代都需要采用田间接种根肿病菌的方法鉴定中间材料的基因型，而且环境条件会影响到正确中间材料的选择，这样势必影响转育进程，因此抗病品种转育难的问题还没有彻底解决。分子标记辅助选择技术（MAS）可能是最终解决这一问题的有效途径。目前，只有国内沈阳农业大学朴钟云等（2004）获得了与芸薹种抗根肿病基因CRb连锁的CAPS标记。其中最近的两个侧翼标记TCR05和TCR09，见（Piao等，SCARandCAPSmappingofCRb,ageneconferringresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinChinesecabbage（Brassicarapassp.pekinensis），TheorApplGenet，108:1458-1465），但这些标记与CRb的遗传距离较远。因此，本实验在这两个CAPS标记基础上，开发与大白菜抗根肿病基因CRb紧密连锁的标记，精细定位该基因，从而简化大白菜抗根肿病品种的转育程序。

技术实现要素：
发明目的是：（1）提供与大白菜抗根肿病基因CRb紧密连锁的分子标记；（2）提供由所述标记的全长序列和PCR引物序列；（3）提供在对大白菜抗根肿病基因进行辅助选择的过程中对上述标记进行应用的方法。（4）通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短了育种进程。本发明提供的技术方案如下：1．与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的分子标记：TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74分别具有如下核苷酸序列：（1）TCR25（301bp）：5’-CGTTTAAATTTGTTTATACGATGCAAATTCACTAGTTTATATGATATATATGTATACTATATATATATTTGATATATATATATATATATATATATATTTGGATTGTAACCACCTCGAATTTTGAGATAATTATCATGTGAAAACGAAGACAAAAAAAAATTATGGGCATATTGATTGTATCTAATAAATTAATCATCCGATTAGTATATTCAAAATTAAAAAAAATCTTTATATTTTAAGAGAAATAGTGATAATGTCAAATATAACACACAAAAAAAATTCATATTCTGTTAATGGGACA-3’（2）TCR108（1366bp）:5'-TCTGTCATGTATTATTTAGAACAAAAATATTATTAATATTAATTAACAATATCTTTATATATTTGTCATTTATTTTTATATACTTTTATATACACATACATGTGCACCTTGATGTGAGTACTTTATAAGTATTTACCACTACTGAAATATCTATATTTTTTTTGAAGTTGAAATATTTTTTTCTTAATGCTTCTTTCACTACCGACCAAATTGTAGTGAAATGATTAGTCTTAATAATTTTCTTTTCTTTTTCTTGAACTATTATCCGTTTACAAACTATAATATGAAACCATTGGTTCGACATGACAATTATCTAAAATTTATAACATAAAAATTAACAAATAATAATAATTTTTGGTTTTTACCGAAAAACTAACAAATCAAACATTCTAACAGAAAAAAACCAAAAAATAATTTAAAACCGAACCAATATCTAGATTAAACAGATTTAATGTGTTTTTATTAAAAATAACGAAACTAATAATCACATGCCGCGCAAGGCGCGGATTATTACCTAGTAATTTTAGTAAAAAAAAACATGGCTGTTTTTTTACAGTCATATATATTTTTCTTTGACAATTGATTTGACGTACAGGTATCTGTTCAAAAAATGAGTATCTGACATGACAAAAATAAGATTCAGTTGCATTCGATCTTCTCTTTTTATAGTTGCATTTGATCATTATTTCTATAAAAATACATATGATGCCCAACATGTAGTATTACAAATCGTTATATTTAAATAAGGTAACAAAAATATTTTTTTTATTTAAAAAAACAAAAATATTTTGAAATGCTTTTTCGTTTAGGATTTTAAATAGCCAACTATTAAAATAAAATATAAACCACCGCAAAAGAAAAAAAAGTAACAGCTATCAGAAATTCAGAATATAAAAAACGTATAGGTTCACGGGTCTCCGATATGCCATGGTGGAGTTTCGTAACTACAACTGCATGAAGAGAGCTTTTGAGATGGTTTAAAATTTTAAATCAGTAAAACTGAAAATCGAGAATGTGAATATTTATTATCATTTTCCTTAAATTGTCTATTAAATATCATTAAATTTTAATTTTATTTATCACCAGAAAAGGAAAAGAATCTATAAGATACAGTTAAAAAAAAAGAATCTATAAGATACATATTAGTTGACTGAAAGGAGATTAAATTATAATTAATGTAGACAGAGTACAATGAATTAACATGTTTGATTGGAAAACAGTTTTATATAGTAGTACATTCTTATATATTTAATTTTAAGATTAGAAGTAACACAGAATAAGATACTGATATTATAAAGATGCTTTGACTAGTCAAGGTACACTGTTCCATACGTTTGTGTGCCAAGGAAACATGCATGAGTGCATC-3’(3)TCR116(1520bp):5'-CTATATACCATTTTACAAACACCAAAACTGTTAATAAACTAATCAGTTAAGAAGAGATAAGTTGTTTTAACACCTGTTGCTTTGGCGAAAATCAAAACCAAAACCAAAAAGGGTTTTGCCTTCTTCGAATCCCCAACCAAGCATCTCAACAATCATCTCATGGAAGTAGAACACTGACTCGCGTCCAACCATCTACACAAAAGTCTTTGACTTGATCAACAATCTACACAAAGCTAACGTGTAGAGACTATATAAACATTTACCATATCAGGGTCTAAGACATCGATTGCAAGCAGGCCAGCTCTGTCTTGAGGAACCACAATACTCGTGTTTGCGTCGAGAGTGATCGTTTTACCTGTTCCACATGAAAACGTTTCCTCAGAGAGCTTAAACAAAGCTAAAAGCTAATGACTTTTCTATAAAAAATGAAACTTTTTTTTTTGTTTACCAGTTGAAGGATCGAAGCGAGACCACATCTTTGTCCGAAACTCGTGGTCGGCACCGAAGATTCTGACCCAGACACGCTCTTCTTTCCCGGTGTCATGATCAACGGCGTTGAGAATCGAGCCGGCGATACCCGGGACGAGAAGAACCGGGTCGAGAGTCGGGTCAACGTAGGGTTTCTGGGTTGAAGTCTTGAGCTTTAGAAAGGTCTCTACTGATCGAGTGATCTCTTCCAGTAATAAAGCCATTTGTTGAATCGATTTAAGAAAATCCAATTTGGGGAAATTAGGGTTTGTGTGAGAGATGTGAAGACAAAAGGGTGGAACTTTGGAATTTAAGCCGTACAAGTTAAGGAGGGAAGAAAACAATCTTGTAATCTATATCATTTAAATAAATGATTTAATTTTTCAAATGGATAACGTAAGATTGAAATAATTGATACTTCCAATAACAAATTAATTAATAATTTAATAATATTATCTGGGATTCCATTGGGATTATTAATTATTACGATATATTTATGGTTAATGGGTCACAGGCTTATTATATTTTACACAACCCCCTCTATTTTGTTTCTGTTTTCAATTTGTCTCTGACTTTAGATTTGATCACAGAAGCCCACAACCTCAGGGCTCCCGGTTGAGATATCAGCTGGAAAGTCCGGTTCTGGACTTTCAATTTTGTGGAGACAAACAAACCAGTTACAGGATTGGAAAATAGTTTCTAAACTAAATAAAAATTGAGTTACAAGATTTTTTTAATCAACAAGGTCCCTATCAAGATTGTAAATCTTACATGGAGCCTTGCATTTCAGGAAAAGCAATGTTGTAGCCGGAGGAAAAGTTTATTTATGATCAGACCAACATTGTCTCAACTACTGAGACTGCAAACTGTAACATGATAAACATCAAGCTTTTATTTTCTCAAAGCATACTACTCAAACATCACTTTAAAATGTTAAAAGACTCGAACTTTATTTGGCAACTTTCTGTAGACAGAAATCAACTCAAGTGTGAAAACTTTGATCTTTTTATTCATTTGGAGAATCTGTGTCGATCATGAGGCGAGGAGTAATC-3’（4）TCR30（703bp）：5’-CGTGGATCTCGTCTTCAGGTACACATCATCGCTTCTTGTCTTTGATCAGATTACTGATTTTGAGACAAAAGTTTCCAACTTTCGATCCGTTTTTCTGTGTCCAAACTAAAATACTCTGTTTTTGTTCATGAAACCTCTGTTTCTCATACTAGGATGCTCTGTTTTTGCTCTTAAACCTCTGTTTCTCAAACTAAAGTCTGATCTTTTGATTTTTTTTTTGGCATAAGTGTACAATAGCAATGGCTCGATCTGCGGTTGATGAGACATCAGACTCGGGAGCATTTCAAAGAACTGCTTCAACATTCCGTAACTTCGTCTCAAGAGATTCCAACTCTCAGTTTCCAGCTGAATCTGGAAGATACCATCTTTACATATCGTATGCTTGTCCATGGGCTTCTAGATGCATCTCATACTTGAAGATTAAAGGACTTGACGATGCTATAAGCTTCTCGGTTCGTTGACTCAAAAGCCCTTTTCAAACTGCTTATGTTCATTACAATAATAGTTTCCTTGTTTGGTTTGCATCAGTCTGTTAAACCCATTTGGGGAAGAACAAAAGAAAGTGATGAGCATATGGGATGGGTCTTCCCGGATTCAGACAATGAGGTCGAAGGAGCTGACTCGGACAATCTTAATGGTGCTAAAAGTGTAAGAGAACTCTATGAGATTGCTAGTCCCAACTACACCGGGAAGTATACTGTTC-3’（5）TCR74（333bp）：5’-TTGAACCATAGGAGGGATAGTTGTTATTCATAATTTAATAGGAAAATTTTCAAAATTTTGAGAAATTCATACTAAAATCTTTTGAGAGATGATCAAAATTGTAGTATCTTGTAACAGTTTTTTATATATATATAAAAAAAAAAGGAGACCGGAAACAAAAATGGTTTAATTAATTAATTATTAAAATAACCAAGCCAATTAAAACATTGAAGATTCATATAACTTAGCCCAAAATGAAGAAGTATAAGGCCCAAATAACTAAGATACACAGTGACACTACTACTCCGCGCCAACTAAACGACAGTAATCATCACTCTATCCATCCATCACCAT-3’2．上述标记TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74的特异性扩增引物分别具有如下序列：（1）TCR25：FTCR25:5’-CGTTTAAATTTGTTTATACGATGCA-3’RTCR25:5’-TGTCCCATTAACAGAATATGAATTT-3’以及由TCR25序列开发的所有引物。（2）TCR108FTCR108:5’-TCTGTCATGTATTATTTAGA-3’RTCR108:5’-GATGCACTCATGCATGTTTC-3’以及由TCR30序列开发的所有引物。（3）TCR116FTCR116:5’-CTATATACCATTTTACAAAC-3’RTCR116:5’-GATTACTCCTCGCCTCATGA-3’以及由TCR30序列开发的所有引物。（4）TCR30FTCR30：5’-CGTGGATCTCGTCTTCAGGT-3’RTCR30：5’-GGAACAGTATACTTCCCGGTGT-3’以及由TCR30序列开发的所有引物。（5）TCR74FTCR74：5’-TTGAACCATAGGAGGGATAGTTG-3’RTCR74：5’-ATGGATGATGGATGGATAGAGTG-3’以及由TCR74序列开发的所有引物。3．上述标记TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74在辅助选择中的应用方法为：（1）用CTAB等方法对待测材料进行基因组DNA的提取（2）PCR扩增:a.反应体系：10µL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA;5pmol·L-1primer;1.0mmol·L-1dNTP;1×PCRBuffer;0.5UTaqDNApolymerase;ddH2O补齐10µL，混匀，离心；b.扩增程序：预变性94℃/5min;94℃/30s;60℃/45s;72℃/30s;35个循环后;72℃延伸10min;最后4℃保存。c.电泳：TCR25、TCR30、TCR74：将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合（98%formamide,10mMEDTA,0.001%xylenecyanol和bromphenolblue）。94℃变性6min，之后在DNA测序电泳仪上进行变性聚丙烯酰胺凝胶（6%）电泳，70W条件下电泳1.5小时。电泳结束后，进行银染。TCR108、TCR116:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合（98%formamide,10mMEDTA,0.001%xylenecyanol和bromphenolblue）。之后在琼脂糖凝胶电泳仪上进行琼脂糖凝胶（1%）电泳，100V条件下电泳30分钟。电泳结束后，在紫外灯下观察、成像。d.判断①在使用TCR25的引物的扩增结果中如果能够检测到两条带(301bp和小于301bp），则带有301bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.93%。②在使用TCR108的引物的扩增结果中如果能够检到条带（1366bp），则带有1336bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.96%。③在使用TCR116的引物的扩增结果中如果能够检测到条带（1520bp）,则带有1520bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.92%。④在使用TCR30的引物的扩增结果中如果能够检测到两条带（703bp和小于703bp），则带有703bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.81%。⑤在使用TCR74的引物的扩增结果中如果能够检测到两条带（333bp和小于333bp）,则带有333bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.73%。如果①、②、③、④、⑤5项中的扩增结果均可获得，则待测材料具有大白菜抗根肿病基因CRb的概率为100%。有益效果如下：上述标记TCR25、TCR108、TCR116、TCR34、TCR74与芸薹种抗根肿病基因CRb紧密连锁，可广泛应用于芸薹种抗根肿病基因CRb的分子标记辅助选择育种。本发明通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短育种进程。附图说明图1：大白菜抗根肿病CRb基因的标记连锁图；图2：TCR25、TCR108、TCR116、TCR30和TCR74在亲本及部分F2代个体上的扩增结果；图2中...