胰岛素-肠促胰岛素缀合物的制作方法

相关申请的交叉参照

本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/783,491的优先权，其内容通过引用以其全文结合到本申请中。

通过引用结合以电子方式提交的材料

随本申请共同提交并鉴定如下的计算机-可读序列表通过引用以其全文予以结合：一份文件名为“27137_pct_sl.txt”的983kbascii(文本)，于2014年3月5日创建。

背景

胰岛素是一种用于治疗青少年-发病型糖尿病和晚期成人-发病型糖尿病的行之有效的疗法。所述肽经生物合成为低效力的较大线性前体(约2%-9%的天然胰岛素)，称为胰岛素原。胰岛素原经蛋白水解，通过选择性除去35-残基连接肽(c肽)转化为胰岛素。得到的经胰岛素"a链"(seqidno:1)和"b链"(seqidno:2)链之间的二硫键形成的异源双链体，代表总共51个氨基酸，对于胰岛素受体具有高效力(nm范围)。相对于相关的胰岛素-样生长因子1受体，天然胰岛素对于胰岛素受体具有约100倍的选择性亲和力，但对于两种不同的胰岛素受体同工型(称为a&b)显示出很少的选择性。

胰岛素-样生长因子1和2是单链线性肽激素，其在它们的a和b链序列中是高度同源的，与天然胰岛素共享约50%的同源性。igfa和b链通过"c-肽"连接，其中两个igf的c-肽在大小和氨基酸序列方面不同，第一个的长度为12个氨基酸，而第二个长度为8个氨基酸。人igf-1是一种70个氨基酸(aa)的碱性肽，其具有seqidno:3中所示的蛋白序列，并与胰岛素原具有43%的同源性(rinderknecht等(1978)j.biol.chem.253:2769-2776)。人igf-2是一种具有seqidno:4中所示的蛋白序列的67个氨基酸的碱性肽。igf在胰岛素b受体同工型表现出比a-受体同工型少得多的活性。

申请人先前已经鉴定基于igf-l的胰岛素肽类似物(其中b-链的天然gln-phe二肽被tyr-leu替代)，其显示在胰岛素受体上的高活性(见pct/us2009/068713，其公开结合到本文中)。这样的类似物(在此称为igfyl类似物肽)比胰岛素更容易合成并能够开发对于胰岛素和igf-1受体的共激动剂类似物，和选择性胰岛素受体特异性类似物。而且，这些胰岛素类似物也可被配制为依据本公开的单链胰岛素激动剂。

先前已制备包含胰岛素a和b链的单链胰岛素类似物(见ep1,193,272和us2007/0129284)。然而，单链高效胰岛素激动剂也可通过插入作为连接胰岛素b和a肽的连接肽的igf-lc-肽，或其类似物制备。c-肽序列的各个氨基酸的选择性突变产生相对于igf-1受体为对胰岛素具有高选择性的肽。

肠促胰岛素是一组胃肠激素，其参与广泛种类的生理学功能，包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空，和肠道生长，以及食物摄入量的调节。前高血糖素原是一种158个氨基酸的前体多肽，其在不同的组织中被加工以形成许多不同的肽。肠促胰岛素包括许多高血糖素原-衍生的肽，包括胰高血糖素(seqidno:701)、胰高血糖素-样肽-1(glp-1；氨基酸7-36被作为seqidno:703和氨基酸7-35被作为seqidno:704提供)、胰高血糖素-样肽-2(glp-2；seqidno:708)和泌酸调节肽(oxm；seqidno:706)。

胰高血糖素是一种29个氨基酸的肽，其对应于前高血糖素原的氨基酸33-61，同时glp-1被生产为一种37个-氨基酸的肽，其对应于前高血糖素原的氨基酸72-108。glp-1(7-36)酰胺(seqidno:703；c末端是精氨酸酰胺)或glp-1(7-37)酸(seqidno:704；c末端是甘氨酸)是glp-1的生物学有效形式，其在glp-1受体显示基本上相当的活性。

胰高血糖素是挽救生命的药物，其用于急性治疗严重的低血糖症。已报道泌酸调节肽具有抑制食欲和降低体重的药理学能力。使用glp-1受体激动剂或稳定的glp-1类似物的临床研究已证明这一家族的肽是对ii型糖尿病的有效的治疗。

此外，胃抑制多肽(gip)也被称为葡萄糖-依赖性促胰岛素肽，并且是激素的分泌素家族的一个成员。gip衍生自一种由gip基因编码的153-氨基酸的前蛋白并作为生物活性的42-氨基酸肽(seqidno:707)循环。gip基因在小肠以及唾液腺中表达并且是一种胃酸分泌的弱抑制剂。除了其在胃中的抑制效果，在葡萄糖的存在下，gip当以生理学剂量给予时，促进由胰腺β胰岛细胞的胰岛素释放。gip被认为作为肠因子发挥作用，其刺激胰腺胰岛素的释放并可在维持葡萄糖稳态中发挥生理作用。

本文公开的缀合物在胰岛素肽和肠促胰岛素之间形成，包括例如胰高血糖素相关肽，其中缀合物在胰岛素受体和对应的肠促胰岛素受体二者中具有激动活性。更特别地，预期胰高血糖素相关肽(例如，gip、glp-1或胰高血糖素)的缀合产生胰岛素肽活性的有益的修饰。例如，预期在胰高血糖素受体具有激动活性的肽连接于胰岛素肽促使缀合物靶向肝，因为胰高血糖素受体主要位于肝中。缀合物靶向肝是合乎需要的，因为肝主要参与葡萄糖生产而不是利用。因此肝的靶向可以是一种关闭葡萄糖生产比当胰岛素接触其它组织如肌肉或脂肪时发生的更安全的途径，其中除了关闭葡萄糖生产外，它还刺激导致低血糖症的更高风险的葡萄糖利用。此外，还有存在于胰腺的α细胞上的胰高血糖素受体。复合物释放到α细胞中可抑制额外的胰高血糖素生产或使α细胞对低血糖症更敏感。申请人还期望胰高血糖素存在于胰高血糖素-胰岛素缀合物中可用作对偶联的胰岛素活性的缓冲剂，以提供更为基准的活性，因而避免血葡萄糖水平的峰值。

类似地，期望胰岛素肽与其它胰高血糖素相关肽(包括肠促胰岛素glp-1和gip和在glp-1和/或gip受体上具有活性的其它相关肽)的缀合物将产生具有有益特性的缀合物。例如，glp-胰岛素缀合物可靶向下丘脑，以降低食欲以及减少血葡萄糖。作为选择或者另外地，glp-胰岛素缀合物可以靶向β细胞以驱动合成代谢反应(增加胰岛素的胰岛β细胞生产)。

胰高血糖素相关肽-胰岛素肽缀合物也适合于进一步的结构增强，设想这样的结构增强通过使用前药化学以产生提高的治疗指数；通过血浆蛋白如白蛋白的连接，或其它修饰，包括聚乙二醇化和酰化延长作用的持续时间；和通过糖基化增强物理稳定性。使用c-肽接头的单链胰岛素类似物的制剂也提供一个新颖的结构位置，在这个位置这些化学修饰中的许多可以成功地布置。胰岛素缀合物的主要用途应是治疗胰岛素-依赖性糖尿病。

概述

提供胰岛素激动剂/肠促胰岛素缀合物，其中缀合物在胰岛素受体和对应的肠促胰岛素受体二者具有激动活性。缀合物的胰岛素肽组分可以是天然胰岛素或任何已知的在胰岛素受体具有活性的胰岛素类似物，包括例如在公布的国际申请wo96/34882、wo2010/080607、wo2010/080609、wo2011/159882、wo/2011/159895和美国专利号6,630,348中公开的任何胰岛素肽，其公开内容通过引用结合到本文中。缀合物的肠促胰岛素组分可以是如本文公开的任何胰高血糖素相关肽，包括例如天然胰高血糖素、glp-1、gip或任何已知的肠促胰岛素或胰高血糖素相关肽，其在一个或多个肠促胰岛素受体上具有活性。适合于依据本公开的用途的胰高血糖素相关肽包括，例如，在公布的国际申请wo2009/155258、wo2009/058734、wo2011/094337、wo2009/148089、wo2011/163473和wo2010/071807中公开的任何胰高血糖素相关肽，其公开内容以其全文明确地结合到本文中。

依据一个实施方案，胰高血糖素相关肽的羧基末端直接经由肽键(形成融合肽)，或者间接通过间隔区连接于胰岛素肽的n-末端。依据一个实施方案，提供通过胰高血糖素或glp-1与胰岛素的融合形成的缀合物，其在注射到正常小鼠中时显示在缀合物的各自的受体的高效、平衡的活性，和葡萄糖降低能力。在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽的c-末端区通过独立地选自在选自a链的a9、a14和a15位置，b链的位置b1、b2、b10、b22、b28或b29的氨基酸侧链，b链的n-末端α胺，a或b链的羧基末端和在连接单链胰岛素类似物的a链和b链的连接部分的任何位置的氨基酸的侧链的位置共价连接于胰岛素肽。

如本文所用的，提及胰高血糖素相关肽的c-末端区时，意欲涵盖胰高血糖素肽的天然c-末端或加入到胰高血糖素类似物的天然c-末端或胰高血糖素类似物的c-末端氨基酸(其相对于天然胰高血糖素序列，通过分别在c-末端缺失氨基酸已被缩短)的任何氨基酸。例如天然胰高血糖素相关肽的c-末端可通过1-3个氨基酸来延长，然后将所述氨基酸通过c-末端区的氨基酸的侧链，或者通过c-末端羧基连接于胰岛素肽。在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽的羧基末端区共价连接于胰岛素肽的b链的氨基末端区。在一个实施方案中，胰岛素肽是一种单链胰岛素类似物。在一个实施方案中，胰岛素肽是其中胰高血糖素相关肽的羧基末端区共价连接于胰岛素肽的b链的氨基末端的单链胰岛素类似物。

在一个实施方案中，缀合物的胰岛素肽是一种包含经由分子间二硫键彼此连接的a链和b链的双链胰岛素类似物。在进一步的实施方案中，缀合物包含双链胰岛素类似物，其中第一和第二胰高血糖素相关肽在选自b链的氨基末端，a链的羧基末端区，和b链的羧基末端区的位置共价连接于胰岛素肽。在一个实施方案中，第一和第二胰高血糖素相关肽具有对胰高血糖素、glp-1和gip受体的不同的亲和力/选择性。

在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽选自天然胰高血糖素、天然glp-1和天然gip。在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽是在一个或多个选自胰高血糖素受体、glp-1受体或gip受体的肠促胰岛素受体具有活性的天然胰高血糖素或胰高血糖素类似物。在一个实施方案中，缀合物的胰高血糖素相关肽组分包含

(i)氨基酸序列：

x1-x2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-z(seqidno:839)，另外具有1-3个氨基酸修饰，其中

x1和/或x2是一种非-天然(相对于seqidno:701)氨基酸，其降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，

z选自–cooh、-asn-cooh、asn-thr-cooh，和y-cooh，其中y是1-2个氨基酸，且另外其中

(1)内酰胺桥在位置i的氨基酸和在位置i+4的氨基酸连接侧链，其中i是12、16、20或24或

(2)在胰高血糖素相关肽的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或所有的氨基酸被α,α-二取代的氨基酸取代；

和所述胰高血糖素相关肽具有胰高血糖素激动剂活性；

(ii)seqidno:701的氨基酸序列，其被修饰以包含至少一个选自以下的氨基酸修饰：

用荷电的氨基酸取代位置28的asn；

用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的荷电氨基酸取代位置28的asn；

在位置28用asn、asp或glu取代；

在位置28用asp取代；

在位置28用glu取代；

用荷电的氨基酸取代位置29的thr；

用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的荷电的氨基酸取代位置29的thr；

在位置29用asp、glu或lys取代；

在位置29用glu取代；

在位置29后面插入1-3个荷电的氨基酸；

在位置29后面插入glu或lys；

在位置29后面插入gly-lys或lys-lys；或其组合；

且至少一个选自组a或组b的氨基酸修饰，或其组合；

其中组a是氨基酸修饰，选自用glu取代在位置15的asp，和用thr或aib取代位置16的ser；和

其中组b是选自以下的氨基酸修饰：

用非-天然氨基酸取代位置1的his，所述非-天然氨基酸降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，

用非-天然氨基酸取代位置2的ser，所述非-天然氨基酸降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，

用phe或val取代位置10的tyr；

用arg取代位置12的lys；

用ala或aib取代位置20的gln

用glu取代位置21的asp；

用ala或aib取代位置24的gln；

用leu或nle取代位置27的met；

在位置27-29缺失氨基酸；

在位置28-29缺失氨基酸；

在位置29缺失氨基酸；

或其组合；

且其中所述胰高血糖素相关肽具有胰高血糖素激动剂活性；

(iii)seqidno:701的胰高血糖素相关肽，其被修饰以包含

(a)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，

(b)(1)在位置i和i+4的氨基酸侧链之间或在位置j和j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i是12、13、16、17、20或24，且其中j是17，或

(2)在类似物的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或所有的氨基酸被α,α-二取代的氨基酸取代，

(c)在位置27、28和29的一个、两个或全部的氨基酸修饰，和

(d)1-6个另外的氨基酸修饰，

其中用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少；

(iv)x1x2x3gtftsdx10sx12ylx15x16x17x18ax20x21fx23x24wlx27x28x29(seqidno:72)的序列，其中

x1选自his、d-his、(脱-氨基)his、羟基-his、乙酰基-his、同型-his或α,α-二甲基咪唑乙酸(dmia)、n-甲基his、α-甲基his，和咪唑乙酸；

x2选自ser、d-ser、ala、d-ala、val、gly、n-甲基ser、氨基异丁酸(aib)和n-甲基ala；

x3选自gln、glu、orn和nle；

x10选自tyr、val和trp；

x12选自ser、lys、瓜氨酸、orn和arg；

x15选自asp、glu、半胱氨酸、高谷氨酸和高半胱氨酸；

x16选自ser、gly、glu、gln、高谷氨酸和高半胱氨酸；

x17选自arg、gln、lys、cys、orn、高半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸；

x18选自arg、ala、lys、cys、orn、高半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸；

x20选自gln、lys、arg、orn和瓜氨酸；

x21选自gln、glu、asp、lys、cys、orn、高半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸；

x23选自val和ile；

x24选自ala、gln、glu、lys、cys、orn、高半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸；

x27选自met、val、leu和nle；

x28选自asn、arg、瓜氨酸、orn、lys和asp；和

x29选自thr、gly、lys、cys、orn、高半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸；或seqidno:72的类似物，其中所述类似物与seqidno:72的不同之处在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28和29的1-3个氨基酸修饰，其中所述胰高血糖素相关肽在glp-1受体显示至少20%的天然glp-1的活性；

(v)与seqidno:701的不同之处在于不超过10个氨基酸修饰的氨基酸，所述氨基酸修饰包括在位置16、20、21和/或24用aib取代一个或多个氨基酸，和在位置1和/或2提供降低的对由二肽基肽酶iv裂解的敏感性的氨基酸修饰，其中所述胰高血糖素相关肽在glp-1受体显示至少20%的天然glp-1的活性。

在一个实施方案中，缀合物的胰岛素肽包含a链和b链，其中所述a链包含序列

givx4x5ccx8x9x10cx12lx14x15lx17x18ycx21-r13(seqidno:19)，且所述b链包含序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45(seqidno:20)，其中

x4是谷氨酸或天冬氨酸；

x5是谷氨酰胺或谷氨酸

x8是组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；

x9是丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x10是异亮氨酸或丝氨酸；

x12是丝氨酸或天冬氨酸；

x14是酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x15是谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；

x17是谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；

x18是甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；

x21选自选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸，和甲硫氨酸；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x33选自天冬氨酸和谷氨酸；

x34选自丙氨酸和苏氨酸；

x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；

x42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；

x45是酪氨酸或苯丙氨酸；

r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n-末端胺；和

r13是cooh或conh2。在一个实施方案中，缀合物包含选自seqidno:132、seqidno:135、seqidno:139和seqidno:140的序列或其通过1、2、3、4或5个氨基酸修饰而不同于seqidno:132、seqidno:135、seqidno:139或seqidno:140的类似物。在一个实施方案中，缀合物包含通过1、2或3个氨基酸取代而不同于seqidno:132、seqidno:135、seqidno:139或seqidno:140的序列。

在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物包含连接于b链的n-末端α胺或连接于选自a链的a9、a14和a15的位置或b链的b1、b2、b10、b22、b28或b29位置的氨基酸侧链或连接于单链胰岛素类似物的连接部分的氨基酸侧链的亲水部分。作为选择，或者另外地，亲水部分可在任何氨基酸位置19、20、23、24、27、32、43或c-末端区连接于胰高血糖素相关肽。

在一个实施方案中，亲水部分是聚乙烯链和在进一步的实施方案中，当胰岛素肽是单链胰岛素类似物时，聚乙烯链共价连接于胰岛素肽组分的连接部分的氨基酸侧链。在一个实施方案中，胰岛素肽是单链胰岛素，其中连接b链和a链的连接部分包含长度不超过17个氨基酸的氨基酸序列并包含序列gygsssx57x58(seqidno:21)、gagsssrr(seqidno:22)或gygsssx57x58apqt；(seqidno:69)，其中x57和x58独立地为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸，而由x57或x58指定的氨基酸任选地还包含在那个位置连接于氨基酸的侧链的亲水部分。在一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇链。

酰基化或烷基化可增加胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物肽在循环中的半衰期。酰基化或烷基化可有利地在胰岛素受体上延迟作用的起效和/或延长作用的持续时间。胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物肽可在相同的氨基酸位置(在那里亲水部分被连接(包括，例如在连接部分的位置8))，或在不同的氨基酸位置被酰基化或烷基化。

本公开还涵盖包含胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物和药学上可接受的载体的药用组合物。依据一个实施方案，提供药用组合物，其包含优选地以至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的纯度水平存在的本文公开的任何胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物，和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。这样的组合物可包含至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高浓度的如本文公开的单链胰岛素激动剂肽。在一个实施方案中，药用组合物包含经灭菌和任选地在各种包装容器内贮存的水性溶液。在其它实施方案中，药用组合物包含冻干粉末。药用组合物还可作为药剂盒的一部分包装，所述药剂盒包括对患者施用组合物的一次性装置。容器或药剂盒可标明在环境室温或在冷冻低温下贮存。

依据一个实施方案，提供在胰岛素依赖性患者中调节血葡萄糖水平的改进的方法。方法包含给予患者控制糖尿病的治疗有效量的单链胰岛素激动剂肽，或其衍生物的步骤。

附图简述

图1是制备人胰岛素的两个步骤合成策略的示意概略图。程序的细节在实施例1中提供。

图2是比较合成人胰岛素相对于纯化天然胰岛素的胰岛素受体特异性结合的图。合成胰岛素通过图1详述的途径生产，其中a⁷-b⁷键是形成的第一个二硫化物。如通过图中提出的数据所指明的，两个分子具有类似的结合活性。

图3是比较天然胰岛素和a19胰岛素类似物(胰岛素(p-nh2-f)¹⁹)的相对的胰岛素受体结合的图。如通过图中提出的数据所指明的，两个分子具有类似的结合活性。

图4是比较天然胰岛素和igf1(y^b16l^b17)类似物的相对的胰岛素受体结合的图。如通过图中提出的数据所指明的，两个分子具有类似的结合活性。

图5是人胰岛素原(a链，seqidno:1；b链，seqidno:2和c链，seqidno:141)和胰岛素-样生长因子i和ii(igfi；seqidno:3和igfii；seqidno:4)氨基酸序列的比对。比对显示这3种肽共享高水平的序列同一性(*表示没有对应的氨基酸的空位和破折号(-)表示在胰岛素中存在相同的氨基酸)。

图6提出用单链胰岛素类似物形成的一组glp1和胰高血糖素融合肽的序列。更特别地，提出显示出glp-1-胰岛素缀合物(glp1-dp8；seqidno:132)和胰高血糖素-胰岛素缀合物(glu-dp8；seqidno:135)的序列。提供这两个序列的进一步的修饰，其中1)在位置a19的酪氨酸被丙氨酸取代以有效地消除胰岛素活性：glp-胰岛素a-链ala19(glp1-dp8a19；seqidno:133)和胰高血糖素-胰岛素a-链ala19(glu-dp8a19；seqidno:136))；2)在位置22的苯丙氨酸被丙氨酸取代以有效地消除glp-1活性：glp1ala22(seqidno:134))；3)谷氨酰胺在位置3被谷氨酸取代以消除胰高血糖素活性(胰高血糖素e3；seqidno:137)；和4)丝氨酸在位置16被谷氨酸取代以增加glp-1和胰高血糖素活性(胰高血糖素e16(seqidno:138))。

图7提出在胰岛素和glp1受体的合成的glp1-dp8缀合物(相对于天然胰岛素、igf-1和天然胰高血糖素)经色谱法分离池部分的ec50值。glp1-dp8缀合物的结构示于图6。池1显示在胰岛素受体与天然胰岛素的几乎相同的活性。所有3个池显示在glp1受体的高活性。因此，池1的缀合物在它们的两个各自的受体显示与天然胰岛素和天然glp1同样高的效力。

图8提出在胰岛素、胰高血糖素和glp1受体的合成的glu-dp8缀合物(相对于天然胰岛素、igf-1和天然胰高血糖素)经色谱法分离池部分的ec50值。glu-dp8缀合物的结构示于图6。池1在胰岛素受体显示与天然胰岛素类似的活性，而胰高血糖素序列的存在减轻缀合物在胰岛素受体的活性。池1和3显示在胰高血糖素受体的高活性。所有3个池在glp-1受体显示差的活性。因此，池1的缀合物在胰岛素和胰高血糖素显示高的效力，但保留对glp1受体的选择性。

图9a-9c显示天然胰岛素和glu-dp8和glp1-dp8缀合物对血葡萄糖水平的体内作用。小鼠以两个剂量(12nmol/kg或60nmol/kg)的天然胰岛素(图9a)，或者以3个不同的浓度(12nmol/kg、60nmol/kg和300nmol/kg)给予的所述缀合物、glp1-dp8(图9b)或glu-dp8(图9c)之一经皮下注射。缀合物显示出较平缓的血葡萄糖下降和比天然胰岛素更长的半衰期(更长的作用持续时间)。另外glp1-dp8(图9b)在葡萄糖降低方面比glu-dp8(图9c)更具活性，这被认为是由于胰高血糖素对胰岛素活性的缓冲作用所致。

图10提供glp1-dp8和glp1-dp8a19(glp1-dp8，其中胰岛素a链的位置19已被修饰为丙氨酸)在胰岛素受体的体外活性。a19位的丙氨酸取代有效地消除胰岛素在胰岛素受体的活性。ec50值表明胰岛素和glp1-dp8二者均为有效胰岛素受体激动剂，而glp-1和glp1-dp8a19在胰岛素受体具有差的活性。

图11提出glu-dp8和glu-dp8a19、一种经修饰以消除胰高血糖素活性的胰高血糖素-胰岛素缀合物(glue3-dp8；其中胰高血糖素肽的位置3已被修饰为谷氨酸)、和维持在胰高血糖素受体的活性的修饰(glue16-dp8；其中位置16已被修饰为谷氨酸)的体外胰岛素受体活性(ec50值)。在位置3的谷氨酸取代的胰高血糖素已知有效地消除胰高血糖素活性。胰岛素在a19位置的取代丙氨酸已知有效地消除在胰岛素受体的胰岛素活性。ec50值表明胰岛素和glu-dp8二者均为有效胰岛素受体激动剂，而胰高血糖素和glu-dp8a19在胰岛素受体具有差的活性。glue3-dp8和glue16-dp8在胰岛素受体也显示高的效力。

图12提出glu-dp8、glue3-dp8和glue16-dp8、glu-dp8a19和glp-1-dp8的体外胰高血糖素受体活性(ec50值)。胰高血糖素的在位置3的谷氨酸取代已知有效地消除胰高血糖素活性，和胰岛素在a19位置的丙氨酸取代已知有效地消除在胰岛素受体的胰岛素活性。胰高血糖素在位置16的谷氨酸取代产生胰高血糖素和glp-1的共激动剂。ec50值表明，胰高血糖素、glu-dp8和glue16-dp8是有效的胰高血糖素受体激动剂，而glp-1和glp1-dp8，和glue3-dp8在胰高血糖素受体具有差的活性。因此，缀合物显示出期望的活性。

图13提出glp-1、glp-1-dp8、glp-1a22-dp8、glp-1-dp8a19、glu-dp8，和glue16-dp8的体外glp-1受体活性(ec50值)。glp-1a22-dp8表示胰岛素和glp-1的缀合物，其中位置22已用丙氨酸取代，一种已知有效地消除glp-1活性的修饰。ec50值表明glp-1、glp1-dp8和glp1-dp8a19是有效的glp-1受体激动剂，而glp-1a22-dp8、glu-dp8，和glue16-dp8在glp-1受体具有差的活性。因此，缀合物显示出期望的活性。

图14a-14b提出所列缀合物对给予dp8(图14a)或glp1-dp8a19(图14b)(相对于天然胰岛素)的c57bl/6小鼠中血葡萄糖水平的体内效果。dp8或glp1-dp8a19以两个浓度(60毫微摩尔/kg或300毫微摩尔/kg)给予。dp8成功地降低血葡萄糖，而glp1-dp8a19未能显著降低血葡萄糖水平。

图15a-15c提出所列缀合物对给予glu-dp8a19(图15a)或glp1a22-dp8(图15b)或glue3/dp8(图15c)(相对于天然胰岛素)的c57bl/6小鼠中血葡萄糖水平的体内效果。glu-dp8a19缀合物缺乏胰岛素活性，但仍引起因胰高血糖素刺激的胰岛素分泌所致的体内血葡萄糖降低。作为在位置22取代的结果，glp1a22-dp8已减少胰高血糖素活性，然而缀合物的胰岛素组分提供减少血葡萄糖的活性，以致缀合物具有约1/5的胰岛素活性。由于在位置e3的取代，glue3/dp8具有减少的胰高血糖素活性，然而缀合物具有相对于天然胰岛素稍有钝化的降低葡萄糖的活性。

详细描述

定义

在描述和要求的本发明中，依据下文提出的定义将使用以下术语。

本文所用的术语"约"意指大于或小于该值或值范围的10%，但不打算指定任何值或值的范围至这个更宽泛的定义。术语"约"在每个值或值的范围之前也意欲涵盖所述绝对值或值的范围的实施方案。

本文所用的术语"氨基酸"涵盖含有氨基和羧基官能团二者的任何分子，其中氨基和羧酸基团被连接到相同的碳(α碳)。α碳任选地可具有一个或两个另外的有机取代基。为了本公开的目的，未指明其立体化学的氨基酸的名称意欲涵盖或者l或d形式的氨基酸，或者外消旋混合物。然而，在其中氨基酸由其三个字母代码指定，并包括一个上标数字的情况下，d形式的氨基酸通过包括三个字母代码之前的小写字母d和上标数字指定(例如，dlys^-1)，其中缺乏小写字母d的名称(例如，lys^-1)意欲指定天然l形式的氨基酸。在这种命名法中，上标数字的包括指定该氨基酸在胰岛素类似物序列中的位置，其中位于胰岛素类似物序列内的氨基酸由从n-末端连续地编号的正上标数字指定。或者在n-末端或者通过侧链连接于胰岛素类似物肽的另外的氨基酸用0开始并以负整数值递增编号，因为它们被从胰岛素类似物序列进一步除去。

本文所用的术语"羟基酸"指已被修饰以用羟基替代α碳氨基的氨基酸。

本文所用的术语“非-编码氨基酸”涵盖不是任何以下20个氨基酸的l-异构体的任何氨基酸：ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp、tyr。

“生物活性多肽”指能够在体外和/或体内发挥生物学作用的多肽。

如本文所用的，对肽的一般称谓意欲涵盖已修饰氨基和羧基末端的肽。例如，命名标准氨基酸的氨基酸序列意欲涵盖在n-和c-末端的标准氨基酸以及在n-末端对应的羟基酸和/或被修饰以包含代替末端羧酸的酰胺基的对应c-末端氨基酸。

本文所用的“酰基化”氨基酸是包含酰基的氨基酸，其对于天然存在的氨基酸为非-天然的，不管它是由哪个手段产生的。生产酰基化氨基酸和酰基化肽的示例性方法是本领域已知的并包括在夹杂到肽或肽合成中之前酰化氨基酸，接着使肽化学酰基化。在某些实施方案中，酰基使得肽具有以下作用的一或多种：(i)在循环中延长的半衰期，(ii)延迟的起效作用，(iii)延长的作用持续时间，(iv)对蛋白酶，如dpp-iv的改进的抗性，和(v)在igf和/或胰岛素肽受体的增加的效力。

如本文所用的，“烷基化”氨基酸是包含烷基的氨基酸，其对于天然存在的氨基酸而言为非-天然的，不管它是由哪个手段产生的。生产烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域已知的并包括在夹杂到肽或肽合成中之前烷基化氨基酸，接着使肽化学烷基化。不受任何特定的理论的束缚，相信肽的烷基化将达到与肽的酰基化类似的(如果不是相同的)效果，例如，在循环中延长的半衰期，延迟的起效作用，延长的作用持续时间，对蛋白酶，如dpp-iv的改进的抗性，和在igf和/或胰岛素受体的增加的效力。

如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的制药载体，如磷酸缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水或水/油乳液，和各种类型的湿润剂。该术语也涵盖通过us联邦政府管理局批准的或us药典所列的用于动物，包括人的任何试剂。

本文所用的术语"药学上可接受的盐"指保留母体化合物的生物学活性的化合物的盐，且其不是生物或其它方面不需要的。本文公开的许多化合物能够借助于其中氨基和/或羧基类似的存在，形成酸和/或碱盐。

药学上可接受的碱加成盐可从无机和有机碱制备。衍生自无机碱的盐，包括仅仅为示例性的，钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括，但不限于，伯胺、仲胺和叔胺的盐。

药学上可接受的酸加成盐可从无机和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯-磺酸、水杨酸等。

如本文所用的，术语"亲水部分"指任何容易溶于水或容易吸收水的化合物，且其为哺乳动物体内耐受的而没有毒性作用(即是生物相容的)。亲水部分的实例包括聚乙二醇(peg)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲氧唑啉(polymethoxazoline)、聚乙氧唑啉(polyethyloxazoline)、聚羟基乙基甲基丙烯酸酯、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺，及其衍生的纤维素如羟基甲基纤维素或羟基乙基纤维素和共聚物，以及天然聚合物包括，例如，白蛋白、肝磷脂和右旋糖酐。

如本文所用的，术语"治疗"包括预防特定疾病或病症，或减轻与特定疾病或病症有关的症状和/或预防或消除所述症状。例如，如本文所用的术语"治疗糖尿病"将一般指维持接近正常水平的葡萄糖血水平并可根据给定的情况，包括增加或降低血葡萄糖水平。

本文所用的胰岛素类似物的"有效的"量或"治疗有效量"指无毒的但足以提供所需效果的胰岛素类似物的量。例如人们期望的效果将是预防或治疗高血糖症。为"有效的"量将根据个体的年龄和一般身体状况，给药模式等，自患者至患者之间而变化。因此，不可能总是指定精确的"有效量"。然而，在任何个体病例中，适宜的"有效"量可通过本领域普通技术人员使用常规实验测定。

术语"胃肠外"意指不通过消化道但通过一些其它途径如鼻内、吸入、皮下、肌内、脊柱内，或静脉内。

贯穿本申请，所有通过字母和数字提及特定氨基酸位置(如位置a5)时，指在各自的天然人胰岛素a链(seqidno:1)或b链(seqidno:2)的或者a链(如位置a5)或者b链(如位置b5)的位置，或在任何其类似物的对应的氨基酸位置的氨基酸。例如，本文提及“位置b28”而没有任何进一步的详细论述时，将意指胰岛素类似物b链的相应的位置b27，其中seqidno:2的第一氨基酸已经缺失。类似地，加入到天然b链的n-末端的氨基酸从b0开始编号，接着随着氨基酸被加入到n-末端，负值数字增加(例如，b-1、b-2…)。可供选择地，对在单链类似物的连接部分的氨基酸位置的任何提及，在参照igf1(seqidno:17)的天然c链中获得。例如，天然c链的位置9(或“位置c9”)具有丙氨酸残基。

本文所用的术语"天然胰岛素肽"意欲指定包含seqidno:1的a链和seqidno:2的b链的51个氨基酸的异源双链体，以及包含seqidnos:1和2的单链胰岛素类似物。本文所用的术语"胰岛素肽"在缺乏进一步描述性语言时，意欲涵盖包含seqidno:1的a链和seqidno:2的b链的51个氨基酸的异源双链体，以及其单链胰岛素类似物(包括例如在公布的国际申请wo96/34882和美国专利号6,630,348中公开的那些，其公开内容通过引用结合到本文中)，包括包含天然a链和/或b链的修饰的类似物及其衍生物的异源双链体和单链类似物。这样的修饰的类似物包括氨基酸在位置a19、b16或b25的修饰至选自a5、a8、a9、a10、a12、a14、a15、a17、a18、a21、b1、b2、b3、b4、b5、b9、b10、b13、b14、b17、b20、b21、b22、b23、b26、b27、b28、b29和b30的位置的4-氨基苯丙氨酸或一个或多个氨基酸取代或位置b1-4和b26-30的任何或所有的缺失。如本文定义的胰岛素肽也可以是通过插入或取代非-肽部分，如逆倒位片段(retroinversofragment)，或结合非-肽键如氮杂肽键(azapeptidebond)(co由nh取代)或假肽键(如用ch2取代的nh)或酯键(例如，缩肽，其中一个或多个酰胺(-conhr-)键被酯(coor)键替代)衍生自天然存在的胰岛素的类似物。

"a19胰岛素类似物"是具有在天然胰岛素a链的位置19取代天然酪氨酸残基的4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸的胰岛素肽。

如本文所用的"igf^b16b17类似物肽"是包含a链和b链异源双链体，以及其单链胰岛素类似物的通用术语，其中a链包含seqidno:19的肽序列和b链包含seqidno:20的序列以及那些序列的类似物，其中a链和/或b链的类似物包含1-3另外的氨基酸取代，前提是b链不包含seqidno:2的序列并包含在位置b16的酪氨酸和在位置b17的亮氨酸。

"igfyl类似物"是包含seqidno:19的igfa链和seqidno:36的igfb链的肽。

如本文所用的，术语"单链胰岛素类似物"涵盖一组结构上-相关的蛋白，其中胰岛素或igfa和b链，或其类似物或衍生物，彼此共价连接以形成一个线性多肽链。如在本文所公开的，单链胰岛素类似物包含经由连接部分将b链的羧基末端连接于a链的氨基末端的共价键。

如本文所用的术语"胰岛素a链"，在缺乏进一步描述性语言时，意欲涵盖seqidno:1的21个氨基酸的序列以及其功能类似物和衍生物，包括a19胰岛素类似物的a链和本领域技术人员已知的其它类似物，包括通过一个或多个氨基酸在选自a4、a5、a8、a9、a10、a12、a14、a15、a17、a18、a21的位置的插入、缺失或取代，修饰seqidno:1的序列。

如本文所用的术语"胰岛素b链"，在缺乏进一步描述性语言时，意欲涵盖seqidno:2的30个氨基酸的序列，以及修饰的天然b链的功能类似物，包括修饰在位置b16或b25的氨基酸为4-氨基苯丙氨酸或选自b1、b2、b3、b4、b5、b9、b10、b13、b14、b17、b20、b21、b22、b23、b25、b26、b27、b28、b29和b30的位置的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代或位置b1-4和b26-30的任何或所有的缺失。

本文所用的术语"同一性"涉及两个或更多个序列之间的相似性。同一性通过将相同的残基数除以残基总数并乘以100的乘积得到百分率来测量。因此，完全相同序列的两个拷贝具有100%的同一性，而相对于彼此具有氨基酸缺失、添加，或取代的两个序列具有较低程度的同一性。本领域技术人员将认识到，几种计算机程序，例如使用算法的那些，如blast(基本局部比对搜索工具,altschul等(1993)j.mol.biol.215:403-410)可被用来测定序列同一性。

术语"胰高血糖素相关肽"指在任何一个或多个胰高血糖素、glp-1、glp-2，和gip受体具有生物学活性的那些肽(作为激动剂或拮抗剂)并包含与天然胰高血糖素、天然泌酸调节肽、天然毒蜥外泌肽-4、天然glp-1、天然glp-2，或天然gip的至少一个共享至少40%序列同一性(例如，45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%)的氨基酸序列。除非另外说明，任何对胰高血糖素相关肽的氨基酸位置的提及(如对于前药部分、缀合物部分、亲水聚合物的连接、酰基化或烷基化)指相对于天然胰高血糖素氨基酸序列(seqidno:701)的位置。

如本文所用的，提及胰高血糖素相关肽的c-末端区时，意欲涵盖胰高血糖素肽的天然c-末端或分别相对于天然胰高血糖素序列已通过添加一个或多个在c-末端的氨基酸延伸的胰高血糖素类似物的c-末端延伸的任何氨基酸，或已通过缺失一个或多个氨基酸缩短的胰高血糖素类似物的末端氨基酸。在胰高血糖素相关肽的c-末端区缀合的胰岛素肽意欲包括对c-末端区的氨基酸侧链的连接或通过c-末端羧酸部分的连接。

术语"glp-1激动剂"指刺激glp-1受体活性的化合物，如通过camp生产，使用经验证的体外模型分析法所测量的，如在公布的国际申请号wo2007/056362(2007年5月18日公开)的实施例13中描述的分析法，其公开内容通过引用特别地结合到本申请中。

如本文所用的术语“天然胰高血糖素”指由seqidno:701序列组成的肽，术语“天然gip”指由seqidno:707序列组成的肽，和术语“天然glp-1”是指定glp-1(7-36)酰胺(由seqidno:703序列组成)、glp-1(7-37)酸(由seqidno:704序列组成)或这两个化合物的混合物的通用术语。如本文所用的，在缺乏任何进一步的指定的情况下，对“胰高血糖素”或“gip”或“glp-1”的通用称谓意欲分别指天然胰高血糖素或天然gip或天然glp-1。

如本文所用的术语"胰高血糖素肽"是指定seqidno:701的天然胰高血糖素肽以及具有相对于天然胰高血糖素序列的一个或多个氨基酸修饰，任选地包括但不限于在氨基酸位置1、2、5、7、8、10、12、13、14、16、17、18、24、28和29取代的修饰的衍生物的通用术语。一般来说，所有用数字提及的特定氨基酸位置(如位置28)指在天然胰高血糖素(seqidno:701)的位置的氨基酸或在任何其类似物的位置的对应的氨基酸。例如，提及“位置28”将意指其中seqidno:701的第一氨基酸已经缺失的胰高血糖素类似物的对应位置27。类似地，提及“位置28”将意指其中一个氨基酸已在seqidno:701的n-末端之前被添加的胰高血糖素类似物的对应位置29。

如本文所用的术语"glp-1肽"是指定天然glp-1以及具有相对于天然glp-1序列的一个或多个氨基酸修饰的经修饰的衍生物的通用术语。

如本文所用的术语"衍生物"意欲涵盖对化合物(例如，氨基酸)的化学修饰，包括体外化学修饰，如通过在多肽侧链的一个或多个位置引入基团，如在酪氨酸残基中的硝基，或在酪氨酸残基中的碘，或通过将游离羧基转化为酯基或转化为酰胺基，或通过将氨基经酰化转化为酰胺，或通过酰化羟基变为酯，或通过使伯胺烷基化变为仲胺或亲水部分与氨基酸侧链的连接。其它衍生物通过多肽的氨基酸残基侧链的氧化或还原而获得。

本文所用的术语igfa链，在缺乏进一步描述性语言时，意欲涵盖天然igf1或igf2(分别为seqidnos:5和7)的21个氨基酸的序列，以及本领域技术人员已知的其功能类似物，包括seqidno:5和7的序列通过在选自a5、a8、a9、a10、a12、a14、a15、a17、a18、a21的位置的一个或多个氨基酸取代的修饰。

本文所用的术语"igfylb链"，在缺乏进一步描述性语言时，意欲涵盖包含seqidno:20的氨基酸序列，以及igfylb链的类似物及其衍生物，包括在位置b16或b25的氨基酸的修饰至在选自b1、b2、b3、b4、b5、b9、b10、b13、b14、b17、b20、b21、b22、b23、b26、b27、b28、b29和b30的位置的4-氨基苯丙氨酸或一个或多个氨基酸取代或位置b1-4和b26-30的任何或所有的缺失。

如本文所用的，术语分子对第一受体相对于第二受体的“选择性”指以下比率：分子在第二受体的ec50除以分子在第一受体的ec50。例如，在第一受体具有1nm的ec50和在第二受体具有100nm的ec50的分子对于第一受体具有相对于第二受体的100-倍选择性。

本文所用的氨基酸“修饰”指氨基酸的取代，或氨基酸通过向所述氨基酸添加和/或从所述氨基酸除去化学基团的衍生化，和包括用通常在人蛋白中发现的20种氨基酸的任何一种，以及非典型或非-天然存在的氨基酸取代。非典型的氨基酸的商业来源包括sigma-aldrich(milwaukee,wi)、chempepinc.(miami,fl)，和genzymepharmaceuticals(cam桥,ma)。非典型的氨基酸可从商业供应商购得，重新合成，或经化学修饰的或从天然存在的氨基酸衍化。

本文所用的氨基酸"取代"指一个氨基酸残基用不同的氨基酸残基的替换。

如本文所用的，术语"保守的氨基酸取代"在此被定义为以下五组之一中的交换：

i.小的脂族、非极性或弱极性残基：

ala、ser、thr、pro、gly；

ii.极性、带负电荷的残基及其酰胺：

asp、asn、glu、gln、半胱氨酸和高半胱氨酸；

iii.极性、带正电荷的残基:

his、arg、lys；鸟氨酸(orn)

iv.大的、脂族、非极性残基：

met、leu、ile、val、cys、正亮氨酸(nle)、高半胱氨酸

v.大的芳族残基：

phe、tyr、trp、乙酰基苯丙氨酸

如本文所用的，通用术语"聚乙二醇链"或"peg链"，指由通式h(och2ch2)noh表示的环氧乙烷和水的、呈支链或直链的缩合聚合物的混合物，其中n是至少2。"聚乙二醇链"或"peg链"用于与一个数字后缀组合以指明其近似平均分子量。例如，peg-5,000指具有总分子量均数约5,000道尔顿的聚乙二醇链。

本文所用的术语"聚乙二醇化的"等术语指通过连接聚乙二醇链至所述化合物，而已从其天然状态进行修饰的化合物。"聚乙二醇化多肽"是具有共价连接于多肽的peg链的多肽。

本文所用的"接头"是连接两个彼此独立的实体的键、分子或分子群。接头可提供两个实体的最佳间距，或者可以进一步提供允许两个实体彼此分开的不稳定的连键。不稳定的连键包括光可裂解基团、酸-不稳定部分,碱-不稳定部分和酶-可裂解基团。

如本文所用的"二聚体"是包含通过接头彼此共价连接的两个亚单位的复合物。术语二聚体，当缺乏任何定性的语言使用时，涵盖同源二聚体和异源二聚体二者。同源二聚体包含两个相同的亚单位，而异源二聚体包含两个不同的亚单位，尽管两个亚单位是彼此基本上类似的。

本文所用的术语"c1-cn烷基"，其中n可以是从1到6，表示具有从1至指定数目的碳原子的分支或线性烷基。典型的c1-c6烷基包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、乙丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。

本文所用的术语"c2-cn链烯基"，其中n可以是从2到6，表示具有从2至指定数目的碳原子和至少一个双键的烯属不饱和分支或线性基团。这样的基团的实例包括，但不限于，1-丙烯基、2-丙烯基(-ch2-ch=ch2)、1,3-丁二烯基、(-ch=chch=ch2)、1-丁烯基(-ch=chch2ch3)、己烯基、戊烯基等。

术语"c2-cn链炔基"，其中n可以是从2至6，指具有从2至n个碳原子和至少一个三键的不饱和分支或线性基团。这样的基团的实例包括，但不限于，1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。

本文所用的术语"芳基"指具有一个或两个芳环的单-或双环碳环系统，包括，但不限于，苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。芳环的大小和取代基或连接基团的存在由存在的指定数目的碳指明。例如，术语"(c1-c3烷基)(c6-c10芳基)"指通过1-3个成员的烷基链连接于母体部分的5-10元芳基。

本文所用的术语"杂芳基"指含有一个或两个芳环和在芳环中含有至少一个氮、氧，或硫原子的单-或双环环系统。杂芳基环的大小和取代基或连接基团的存在由存在的指定数目的碳指明。例如，术语"(c1-cn烷基)(c5-c6杂芳基)"指通过1-n个成员的烷基链连接于母体部分的5或6元杂芳基。

如本文所用的，术语“卤代”指由氟、氯、溴和碘组成的一个或多个成员的基团。

本文所用的术语"患者"未进一步指定时意欲涵盖任何温血脊椎动物、驯养的动物(包括例如，但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物)和人。

本文所用的术语“分离的”意指从其天然环境中分开的。在某些实施方案中，类似物通过重组方法制得和类似物从宿主细胞分离。

本文所用的术语“纯化的”，涉及这样一种形式的分子或化合物的分离，即其基本上不含正常与天然或自然环境中分子或化合物有关的污染物并作为从原始组成的其它组分分离的结果，且意味着具有增加的纯度。术语"纯化的多肽"在此被用来描述一种已从其它化合物分离的多肽，包括，但不限于核酸分子、脂质和碳水化合物。

"拟肽"指具有不同于现有肽的通用结构的结构，但以类似于现有肽的方式，例如，通过模仿该肽的生物活性发挥功能的化学化合物。拟肽典型地包含天然存在的氨基酸和/或非天然氨基酸，但也可包含对肽主链的修饰。例如拟肽可包括含有插入或取代非-肽部分的天然存在的氨基酸序列，如逆倒位片段(retroinversofragment)，或结合非-肽键如氮杂肽键(azapeptidebond)(co由nh取代)或假肽键(如用ch2取代的nh)或酯键(例如，缩肽，其中一个或多个酰胺(-conhr-)键被酯(coor)键替代)。可供选择地，拟肽可能没有任何天然存在的氨基酸。

本文所用的术语"荷电氨基酸"或“荷电残基”指包含在生理ph的水性溶液中带负电荷(即，去质子化)或带正电荷(即，质子化)的侧链的氨基酸。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸，和高谷氨酸，而带正电荷的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。荷电氨基酸包括通常在人蛋白中发现的20种氨基酸，以及非典型的或非-天然存在的氨基酸的荷电氨基酸。

本文所用的术语"酸性氨基酸"指包含第二个酸性部分(并非氨基酸的α羧酸)，包括例如，侧链羧酸或磺酸基团的氨基酸。

本文所用的术语"患者"未进一步指定时意欲涵盖任何温血脊椎动物、驯养的动物(包括例如，但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物)和人。

缩写：

胰岛素类似物将缩写如下：

胰岛素a和b链将用大写字母a表示a链和大写字母b表示b链来命名，其中上标0(例如，a⁰或b⁰)将指定碱基序列是胰岛素序列(a链:seqidno:1，b链seqidno:2)和上标1(例如，a¹或b¹)将指定碱基序列是igf-1序列(a链:seqidno:5，b链seqidno:6)。偏离天然胰岛素和igf序列的修饰在a或b链的名称后面的括号中指明(例如，[b¹(h5,h10,y16,l17):a¹(h8,n18,n21)])，伴有在各自的a或b链指明取代的单字母氨基酸缩写和指明取代位置的数字(使用天然胰岛素数字编号方式)。a和b链之间的冒号表示双链胰岛素，而一个破折号表示共价键，因此为单链类似物。在单链类似物中，连接部分将被包括在a和b链之间和标号c¹指天然igf1c肽，seqidno:17。提及连接部分时的标号“位置c8”指定位于对应于seqidno:17的第八氨基酸的位置的氨基酸。

实施方案

本文公开胰岛素肽和胰高血糖素相关肽的缀合物。在一个实施方案中，缀合物包含胰岛素肽和胰高血糖素相关肽直接或者通过接头的共价键。在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽共价连接于胰岛素a链或b链的氨基或羧基末端。在另一个实施方案中，一个或两个胰高血糖素相关肽的c-末端区通过独立地选自在选自a链的a9、a14和a15位置，b链的b1、b2、b10、b22、b28或b29位置的氨基酸侧链，在a或b链的n-末端α胺，b链的羧基末端或在单链胰岛素类似物的连接a链和b链的连接部分的任何位置(包括例如在位置c8)的氨基酸的侧链的位置，共价连接于胰岛素肽。在另一个实施方案中，胰岛素肽的n-末端或c-末端在选自10、20、24、28和29的位置共价连接于胰高血糖素相关肽的氨基酸的侧链。

在另一个实施方案中，一个或两个胰高血糖素相关肽通过独立地选自以下的位置共价连接于胰岛素肽：b链的n-末端α胺，b链的羧基末端或在连接单链胰岛素类似物的a链和b链的连接部分的任何位置，包括例如在位置c8。在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽的羧基末端区共价连接于单链胰岛素肽类似物的b链的n-末端α胺。在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽的羧基末端共价连接于双链或单链胰岛素肽类似物的b链的n-末端α胺。

依据一个实施方案，胰岛素肽是双链胰岛素，其中a链和b链彼此经由链间二硫键连接。在一个实施方案中，缀合物包含双链胰岛素肽，其中胰高血糖素相关肽的羧基末端区共价连接于胰岛素肽a链的氨基末端。在一个实施方案中，缀合物包含双链胰岛素肽，其中胰岛素肽的a链或b链的羧基末端共价连接于胰高血糖素相关肽的氨基末端。在一个实施方案中，缀合物包含双链胰岛素肽，其中胰高血糖素相关肽的羧基末端共价连接于胰岛素肽的b链的氨基末端。在一个实施方案中，缀合物包含双链胰岛素肽，其中胰岛素肽的b链的羧基末端共价连接于胰高血糖素相关肽的氨基末端。

在另一个实施方案中，缀合物包含双链胰岛素类似物和第一和第二胰高血糖素相关肽，其中每个胰高血糖素相关肽在选自b链的氨基末端、a链的羧基末端，和b链的羧基末端的位置独立地共价连接于胰岛素肽。在一个实施方案中，缀合物包含双链胰岛素肽，其中第一胰高血糖素相关肽的羧基末端区共价连接于胰岛素肽的b链的氨基末端，而胰岛素肽的b链的羧基末端共价连接于第二胰高血糖素相关肽的氨基末端。在一个实施方案中，第一和第二胰高血糖素相关肽是不同的并具有在选自胰高血糖素、glp-1和gip受体的两个不同的受体的活性。在一个实施方案中，第一胰高血糖素相关肽在胰高血糖素受体具有活性和第二胰高血糖素相关肽在glp-1受体具有活性。在一个实施方案中，第一和/或第二胰高血糖素相关肽是在选自胰高血糖素、glp-1和gip受体的两个受体上具有活性的共激动剂。

在一个实施方案中，缀合物表示融合蛋白，其中胰高血糖素相关肽的羧基末端区直接或者通过肽接头连接于胰岛素肽b链的氨基末端。在一个实施方案中，缀合物包含单链胰岛素类似物，其中胰高血糖素相关肽的羧基末端区共价连接于单链胰岛素类似物的氨基末端。在一个实施方案中，缀合物包含单链胰岛素类似物，其中单链胰岛素肽的羧基末端共价连接于胰高血糖素相关肽的氨基末端。

在一些或任何实施方案中，本发明公开的缀合物的胰岛素肽是天然胰岛素，包含seqidno:1的a链和seqidno:2的b链，或天然胰岛素类似物，包括例如包含seqidnos:1和2的单链胰岛素类似物。在一个实施方案中，胰岛素肽是igf^b16b17类似物肽。依据本公开，胰岛素类似物涵盖包含a链和b链的多肽，其中胰岛素类似物与天然胰岛素的不同之处在于在选自a5、a8、a9、a10、a12、a14、a15、a17、a18、a21、b1、b2、b3、b4、b5、b9、b10、b13、b14、b17、b20、b21、b22、b23、b26、b27、b28、b29和b30的位置的一个或多个氨基酸取代或位置b1-4和b26-30的任何或所有的缺失。

在一个实施方案中，缀合物的胰高血糖素相关肽组分是选自天然胰高血糖素(seqidno:701)、天然glp-1(seqidno:703)和天然gip(seqidno:707)的肽。在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽是胰高血糖素肽或glp-1肽。在某些实施方案中，本公开的缀合物的胰高血糖素相关肽是包含基于seqidno:701的氨基酸序列但不同于seqidno:701的氨基酸序列的天然人胰高血糖素(seqidno:701)的类似物，不同之处在于胰高血糖素类似物的氨基酸序列包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，和在一些情况下，16或更多个(例如，17、18、19、20、21、22、23、24、25等)指定的或任选的氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，本公开的肽包含相对于天然人胰高血糖素序列(seqidno:701)的总共1，最多2，最多3，最多4，最多5，最多6，最多7，最多8，最多9，或最多10个另外的氨基酸修饰(例如，除了指定的氨基酸修饰)。例如，在一个实施方案中，胰高血糖素(seqidno:701)的类似物包含(a)包含在位置1的咪唑侧链的氨基酸，(b)在位置2的dpp-iv保护的氨基酸，(c)在9、10、12、16、20或37-43的任何位置的酰基化氨基酸或烷基化氨基酸，(d)在16、17、18、19、20和21的一个或多个位置的α螺旋稳定的氨基酸，和(e)相对于seqidno:701的最多10个另外的氨基酸修饰。在一个实施方案中，本公开提供胰高血糖素类似物，其包含带有最多10另外的氨基酸修饰(除了在(a)-(d)中指定的氨基酸修饰)的(a)-(d)。在一些或任何实施方案中，修饰为在本文描述的那些中的任何一种，例如，酰基化、烷基化、聚乙二醇化、在c-末端的截短，在位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28和29的一个或多个位置的氨基酸取代。

胰岛素肽

本公开的缀合物的胰岛素肽组分可包含人胰岛素的天然b和a链序列(分别为seqidnos:1和2)或任何已知当在异源双链体中彼此连接时显示胰岛素激动剂活性的其类似物或衍生物。这样的类似物包括，例如，具有a-链和b-链的蛋白，其在具有不破坏胰岛素类似物的胰岛素活性的一个或多个氨基酸缺失，一个或多个氨基酸取代，和/或一个或多个氨基酸插入方面不同于人胰岛素的a-链和b-链。

在一个实施方案中，胰岛素肽是胰岛素类似物，其中：

(a)在位置b28的氨基酸残基用asp、lys、leu、val，或ala取代，和在位置b29氨基酰基残基是lys或pro；

(b)在任何位置b27、b28、b29，和b30的氨基酸残基缺失或被非天然氨基酸取代。在一个实施方案中，提供包含在位置b28取代的asp或在位置28取代的lys和在位置b29取代的脯氨酸的胰岛素类似物。另外的胰岛素类似物公开于chance,等,美国专利号5,514,646；chance,等,美国专利申请系列号08/255,297；brems,等,proteinengineering,5:527-533(1992)；brange,等,epo公布号214,826(公布的mar.18,1987)；和brange,等,结构生物学的当前观点(currentopinioninstructuralbiology),1:934-940(1991)中，其公开内容通过引用专门结合到本文中。

胰岛素类似物也可具有用酸性形式替换的酰胺化氨基酸。例如，asn可用asp或glu替换。同样地，gln可用asp或glu替换。特别是，asn(a18)、asn(a21)，或asp(b3)，或那些残基的任何组合，可被asp或glu替换。同样，gln(a15)或gln(b4)，或二者，可被或者asp或者glu替换。

本文提供包含人胰岛素，或其类似物或衍生物的b链和a链的本文公开的单链胰岛素激动剂，其中b链的羧基末端经由连接部分连接于a链的氨基末端。在一个实施方案中，a链是选自以下的氨基酸序列：giveqcctsicslyqlenycn(seqidno:1)、givdeccfrscdlrrlemyca(seqidno:5)或giveeccfrscdlalletyca(seqidno:7)和b链包含序列fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)、gpetlcgaelvdalylvcgdrgfyfnkpt(seqidno:6)或ayrpsetlcggelvdtlylvcgdrgfyfsrpa(seqidno:8)，或其具有对应于b26、b27、b28、b29和b30的1-5个氨基酸缺失的羧基缩短的序列，和其中每个序列被修饰以在对应于天然胰岛素的选自a5、a8、a9、a10、a14、a15、a17、a18、a21、b1、b2、b3、b4、b5、b9、b10、b13、b14、b20、b22、b23、b26、b27、b28、b29和b30的位置包含1-5个氨基酸取代的那些序列的类似物(见示于图5中的肽比对)。在一个实施方案中，氨基酸取代是保守的氨基酸取代。在这些位置没有不利地影响胰岛素所需活性的合适的氨基酸取代是本领域技术人员已知的，如例如在mayer,等,胰岛素结构和功能，生物聚合物(insulinstructureandfunction,biopolymers).2007；88(5):687-713中证实的，其公开内容通过引用结合到本文中。

另外的氨基酸序列可添加到b链的氨基末端或添加到本发明的单链胰岛素激动剂的a链的羧基末端。例如，一系列带负电荷的氨基酸可添加到b链的氨基末端，包括例如长度1-12、1-10、1-8或1-6个氨基酸的肽和包含一个或多个带负电荷的氨基酸包括例如谷氨酸和天冬氨酸。在一个实施方案中，b链氨基末端延伸包含1-6个荷电氨基酸。在一个实施方案中，b链氨基末端延伸包含序列gx61x62x63x64x65k(seqidno:26)或x61x62x63x64x65rk(seqidno:27)，其中x61、x62、x63x64和x65独立地为谷氨酸或天冬氨酸。在一个实施方案中，b链包含序列geeeeekgpehlcgahlvdalylvcgdx42gfy(seqidno:28)，其中x42选自丙氨酸赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。依据一个实施方案，本文公开的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物包含代替a链上的c-末端羧酸酯的c-末端酰胺或酯。

高效力胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物也可基于使用在公布的国际申请号wo2010/080607(其公开内容通过引用专门结合到本文中)描述的修饰的igfi和igfii序列，作为胰岛素肽组分来制备。更特别地，包含用酪氨酸亮氨酸二肽取代在对应于天然胰岛素的b16和b17位置的天然igf氨基酸的igfi和igfii的类似物具有在胰岛素受体的10倍增加的效力。

依据一个实施方案胰，用于本公开的岛素肽包含r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45(seqidno:20)的b链序列和givx4x5ccx8x9x10cx12lx14x15lx17x18x19cx21-r13(seqidno:29)的a链序列，其中

x4是谷氨酸或天冬氨酸；

x5是谷氨酰胺或谷氨酸；

x8是组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；

x9是丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x10是异亮氨酸或丝氨酸；

x12是丝氨酸或天冬氨酸；

x14是酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x15是谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；

x17是谷氨酰胺,谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸或赖氨酸、鸟氨酸；

x18是甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x21选自选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸，和甲硫氨酸；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；

x34选自丙氨酸和苏氨酸；

x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；

x42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；

x45是酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺或苯丙氨酸；

r22选自ayrpse(seqidno:14),fvnq(seqidno:12)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和键；和r13是cooh或conh2。在一个实施方案中，a链和b链通过链间二硫键，包括在天然胰岛素的a和b链之间形成的那些彼此连接。在备选的天然实施方案中，a和b链连接在一起作为线性单链-胰岛素肽。

在一个实施方案中，缀合物包含胰岛素肽，其中a链包含序列giveqccx1sicslyqlenx2cx3(seqidno:30)和所述b链序列包含序列x4lcgx5x6lvealylvcgergff(seqidno:31)，其中

x1选自苏氨酸和组氨酸；

x2是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x3选自天冬酰胺和甘氨酸；

x4选自组氨酸和苏氨酸；

x5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸。

依据一个实施方案，提供胰岛素类似物，其中胰岛素肽的a链包含序列giveqccx8x9icslyqlenycx21-r13(seqidno:73)或giveqccx8sicslyqlx17nx19cx21(seqidno:32)和b链包含序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45yt-z1-b1(seqidno:142)，其中

x8选自苏氨酸和组氨酸；

x9是缬氨酸或酪氨酸；

x17是谷氨酰胺或谷氨酸；

x19是酪氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸或4-氨基-苯丙氨酸；

x21是天冬酰胺或甘氨酸；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x33选自天冬氨酸和谷氨酸；

x34选自丙氨酸和苏氨酸；

x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；

x42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；

x45是酪氨酸或苯丙氨酸；

r22选自fvnq(seqidno:12)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺,谷氨酰胺和n-末端胺；

z1是二肽选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸，和脯氨酸-赖氨酸；和

b1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。

依据一个实施方案，提供胰岛素类似物，其中胰岛素肽的a链包含序列giveqccx8sicslyqlx17nx19cx21(seqidno:32)和b链包含序列x25lcgx29x30lvealylvcgergff(seqidno:33)，其中

x8选自苏氨酸和组氨酸；

x17是谷氨酸或谷氨酰胺；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x21是天冬酰胺或甘氨酸；

x25选自组氨酸和苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸。在进一步的实施方案中，b链包含序列x22vnqx25lcgx29x30lvealylvcgergffyt-z1-b1(seqidno:34)，其中

x22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；

x25选自组氨酸和苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

z1是二肽选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸，和脯氨酸-赖氨酸；和

b1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。

依据一些实施方案，a链包含序列giveqccx8sicslyqlx17nx19cx23(seqidno:32)或givdeccx8x9scdlx14x15lx17x18x19cx21-r13(seqidno:35)，和b链包含序列x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgdx42gfx45(seqidno:36)，其中

x8是组氨酸或苯丙氨酸；

x9和x14独立地为选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x15精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；

x17是谷氨酸或谷氨酰胺；

x18是甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x21是丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；

x23是天冬酰胺或甘氨酸；

x25选自组氨酸和苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x33选自天冬氨酸和谷氨酸；

x34选自丙氨酸和苏氨酸；

x42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；

x45酪氨酸；和

r13是cooh或conh2。

在进一步的实施方案中，a链包含序列givdeccx8x9scdlx14x15lx17x18x19cx21-r13(seqidno:35)，和b链包含序列x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgdx42gfx45(seqidno:36)，其中

x8是组氨酸；

x9和x14独立地为选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x15精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；

x17是谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；

x18是甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x21是丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；

x23是天冬酰胺或甘氨酸；

x25选自组氨酸和苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x33选自天冬氨酸和谷氨酸；

x34选自丙氨酸和苏氨酸；

x42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；

x45酪氨酸或苯丙氨酸和

r13是cooh或conh2。在进一步的实施方案中，a链包含序列givdecchx9scdlx14x15lx17mx19cx21-r13(seqidno:37)，和b链包含序列x25lcgax30lvdalylvcgdx42gfx45(seqidno:38)，其中

x9、x14和x15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸；

x17是谷氨酸或谷氨酰胺；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x21是丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；

x25选自组氨酸和苏氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；

x42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；

x45酪氨酸或苯丙氨酸和

r13是cooh或conh2。在一个实施方案中，b链选自hlcgaelvdalylvcgdx42gfy(seqidno:39、gpehlcgaelvdalylvcgdx42gfy(seqidno:40)、gpehlcgaelvdalylvcgdx42gfyfnpkt(seqidno:41)和gpehlcgaelvdalylvcgdx42gfyfnkpt(seqidno:42)，其中x42选自鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸。在进一步的实施方案中，a链包含序列givdecchx9scdlx14x15lqmycn-r13(seqidno:43)，其中x9、x14和x15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸。

在另一个实施方案中，a链包含序列givdeccx8rscdlyqlenx19cn-r13(seqidno:44)和b链包含序列r22-x25lcgshlvdalylvcgdx42gfx45(seqidno:45)

其中

x8是苏氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x42是丙氨酸、鸟氨酸或精氨酸；

x45酪氨酸组氨酸、天冬酰胺或苯丙氨酸；

r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和键；和r13是cooh或conh2，和

r13是cooh或conh2。

在另一个实施方案中，a链包含序列giveqcchsicslyqlenx19cx21-r13(seqidno:46)或givdecchrscdlrrlemx19cx21-r13(seqidno:47)；且b链包含序列fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)，或

gpetlcgaelvdalylvcgdrgfyfnpkt(seqidno:48)

其中

x19是酪氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸或4-氨基-苯丙氨酸；

x21是丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；

x26和x27各自是丙氨酸；和

x42精氨酸。

单链胰岛素肽激动剂

如本文公开的，连接部分可被用来连接人胰岛素a和b链，或其类似物或衍生物，其中b链的b25氨基酸的羧基末端直接连接于连接部分的第一末端，其中连接部分的第二末端通过插入连接部分直接连接于a链的a1氨基酸的氨基末端。

依据一个实施方案，胰岛素肽是包含通用结构b-lm-a的单链胰岛素激动剂，其中b表示胰岛素b链，a表示胰岛素a链，和lm表示连接b链的羧基末端至a链的氨基末端的连接部分。用于连接b链至a链的合适的连接部分在本文的标题单链-胰岛素类似物的连接部分(linkingmoietiesforsinglechain-insulinanalogs)和各自的副标题“肽接头(peptidelinkerse)”和“非-肽接头(non-peptidelinkers)”下公开。在一个实施方案中，连接部分包含连接肽，和更特别地，在一个实施方案中，肽表示igf-1c肽的类似物。另外的示例性肽接头包括但不限于序列x51x52gsssx57x58(seqidno:49)或x51x52gsssx57x58apqt(seqidno:50)，其中x51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸，x52是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸和x57或x58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸，任选地具有连接于连接部分(即，在x57或x58位置)的位置7或8的氨基酸侧链的亲水部分。连接部分的氨基酸位置基于igf1(seqidno:17)的天然c链中的对应位置指定。在另一个实施方案中，肽连接部分包含29个连续的氨基酸序列，其具有与ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51(seqidno:68)的大于70%、80%、90%的序列同一性，其中x50和x51独立地为选自精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，连接部分是非-肽接头，其包含大约长度为8-16个氨基酸序列的相对短的双功能非-肽聚合物接头。在一个实施方案中，非-肽接头具有结构：；其中m是范围从10至14的整数和连接部分直接连接于b链的b25氨基酸。依据一个实施方案，非-肽连接部分是约4-20、8-18、8-16、8-14、8-12、10-14、10-12或11-13个单体的聚乙二醇接头。

在一个实施方案中，提供胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物，其包含具有结构：ib-lm-ia的胰岛素肽，其中ib包含序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45(seqidno:20)，lm是如本文公开的共价连接ib至ia的连接部分，和ia包含序列givx4x5ccx8x9x10cx12lx14x15lx17x18x19cx21-r13(seqidno:29)，其中

x4是谷氨酸或天冬氨酸；

x5是谷氨酰胺或谷氨酸；

x8是组氨酸或苯丙氨酸；

x9和x14独立地为选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x10是异亮氨酸或丝氨酸；

x12是丝氨酸或天冬氨酸；

x14是酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x15精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；

x17是谷氨酸或谷氨酰胺；

x18是甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x21是丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；

x25选自组氨酸和苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x33选自天冬氨酸和谷氨酸；

x34选自丙氨酸和苏氨酸；

x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；

x42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；

r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n-末端胺；和

r13是cooh或conh2，另外其中在指定x45的氨基酸直接连接于连接部分，lm(即，如本文所用的指定ib-lm-ia意欲表示，在b链羧基末端和a链的氨基末端直接连接于连接部分lm，而没有任何另外的插入的氨基酸)。

在一个实施方案中，连接部分(lm)包含长度不超过17个氨基酸的氨基酸序列。在一个实施方案中，连接部分包含序列x51x52gsssx57x58(seqidno:49)或x51x52gsssx57x58apqt(seqidno:50)，其中x51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸，x52是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸和x57或x58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸，任选地具有在连接部分的位置7或8(即，在x57或x58位置)连接于氨基酸的侧链的亲水部分。连接部分的氨基酸位置基于igf1(seqidno:17)的天然c链的对应的位置指定。

在另一个实施方案中，连接部分包含29个连续的氨基酸序列，直接连接于b链的羧基末端氨基酸，其中所述29个连续的氨基酸序列具有与ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51(seqidno:68)的大于70%、80%、90%序列同一性，其中x50和x51独立地为选自精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，连接肽包含总共29-158或29-58个氨基酸和包含序列seqidno:68。在另一个实施方案中，连接部分包含29个连续的氨基酸序列,直接连接于b链的羧基末端氨基酸，其中所述29个连续的氨基酸序列具有与ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51(seqidno:68)的大于90%序列同一性，其中x50和x51独立地为选自精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，连接部分包含序列ssssrapppslpspsrlpgpsdtpilpqk(seqidno:51)或sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpqr(seqidno:52)，任选地含有一个或两个氨基酸取代。

依据一个实施方案，提供单链胰岛素激动剂多肽，其包含人胰岛素，或其类似物或衍生物的b链和a链，其中天然b链的最后5个羧基氨基酸被缺失(即，b26-b30)，和氨基酸b25通过插入的连接部分连接于a链的氨基酸a1。在一个实施方案中，连接部分包含结构：；其中m是范围从10-14的整数和连接部分直接连接于b链的b25氨基酸。

在一个实施方案中，提供胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物，其包含具有通用式ib-lm-ia的胰岛素肽，其中ib包含序列gpehlcgax30lvdalylvcgdx42gfyfnx48x49(seqidno:40)；

lm包含序列ssssrapppslpspsrlpgpsdtpilpqk(seqidno:51)、sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpqr(seqidno:52)、gygsssrr(seqidno:18)或gagsssrr(seqidno:22)；和

ia包含序列givdeccx8x9scdlx14x15lx17x18x19cx21-r13(seqidno:35)，其中

x8是组氨酸或苯丙氨酸；

x9精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x14和x15二者均为精氨酸；

x17是谷氨酸；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；

x21是丙氨酸或天冬酰胺；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x42选自丙氨酸、鸟氨酸和精氨酸；

r13是cooh。

用于单链胰岛素类似物的连接部分

肽接头

依据一个实施方案，连接部分是6-18、8-18、8-17、8-12、8-10、13-17或13-15个氨基酸(或其氨基酸类似物或衍生物)的肽或拟肽。在一个实施方案中，连接部分是6-18、8-18、8-17、8-12、8-10、13-17或13-15氨基酸的肽或拟肽，其中肽连接部分包含两个或更多个邻近的碱性氨基酸残基。依据一个实施方案，连接部分是8-17个非-天然氨基酸的序列，其包含序列x51x52x53x54x55x56x57x58(seqidno:9)，其中x51、x52、x53、x54、x55和x56独立地为任何氨基酸或氨基酸类似物或其衍生物，和x57和x58是碱性氨基酸。在一个实施方案中，连接部分是长度8-17个氨基酸的非-天然多肽并包含序列x51x52x53x54x55x56rr(seqidno:10)，其中x52是非-芳族氨基酸，包括例如丙氨酸。在一个实施方案中，连接部分的长度是8-17个氨基酸并包含序列x51x52gsssrr(seqidno:53)，其中x51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，脯氨酸和甲硫氨酸，和x52是非-芳族氨基酸，包括例如丙氨酸。在一个实施方案中，连接部分的长度是8-17个氨基酸并包含通过单氨基酸取代的不同于x51x52gsssrr(seqidno:53)的序列，其中氨基酸取代是在其侧链被聚乙二醇化的氨基酸，另外其中x51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，脯氨酸和甲硫氨酸，和x52是非-芳族氨基酸，包括例如丙氨酸。

依据一个实施方案，连接部分是igf1c链序列(gygsssrrapqt；seqidno:17)的衍生物。在一个实施方案中，衍生物是不同于通过赖氨酸、半胱氨酸鸟氨酸、高半胱氨酸，或乙酰基-苯丙氨酸残基的单氨基酸取代的seqidno:17的肽，和在进一步的实施方案中，赖氨酸、半胱氨酸鸟氨酸、高半胱氨酸，或乙酰基-苯丙氨酸氨基酸被聚乙二醇化。在一个进一步的实施方案中，连接部分是通过单赖氨酸取代的不同于seqidno:17的肽。在一个特定的实施方案中，取代在seqidno:17的位置8进行。申请人已发现，igf1c链序列及其类似物作为连接部分的应用将生成单链胰岛素多肽，其具有接近的野生型胰岛素活性。而且，igf1c链序列类似物作为连接部分的应用，其中igf1c链序列的位置2被修饰，或从igf1c链序列缺失羧基末端4个氨基酸，产生对胰岛素有选择性(即，在胰岛素受体具有与igf-1受体比较的更高结合和/或活性)的单链胰岛素多肽。在一个实施方案中，单链胰岛素多肽在胰岛素受体具有相对于igf-1受体的5x、10x、20x、30x、40x，或50x的更高亲和力或活性。

依据一个实施方案，连接部分是igf1c链序列(gygsssrrapqt；seqidno:17)的衍生物并包含通过1-3个氨基酸取代，或1-2个氨基酸取代而不同于gygsssrr(seqidno:18)或gagsssrrapqt(seqidno:23)的非-天然序列。在一个实施方案中，至少一个氨基酸取代是赖氨酸或半胱氨酸取代，和在一个实施方案中，氨基酸取代是保守的氨基酸取代。在一个实施方案中，连接部分是包含非-天然氨基酸序列的8-17个氨基酸的肽(或拟肽)，所述非-天然氨基酸序列通过1个氨基酸取代而不同于gygsssrr(seqidno:18)或gagsssrrapqt(seqidno:23)，包括例如用赖氨酸或半胱氨酸取代。在一个实施方案中，连接部分包含序列gygsssrr(seqidno:18)或gagsssrrapqt(seqidno:23)。在一个实施方案中，连接部分包含序列gagsssrx58apqt(seqidno:54)、gygsssx57x58apqt(seqidno:69)，或通过单氨基酸取代而不同于seqidno:54的氨基酸，其中x57精氨酸和x58是精氨酸、鸟氨酸或赖氨酸，和在进一步的实施方案中，聚乙二醇链在所述连接部分的位置8连接于氨基酸的侧链。在另一个实施方案中，连接部分包含序列gx52gsssrx58apqt(seqidno:55)，其中x52是任何非-芳族氨基酸，包括例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸，和x58表示具有共价连接于其侧链的聚乙烯链的氨基酸。在一个实施方案中，x58是聚乙二醇化的赖氨酸。

在另一个实施方案中，连接部分是包含序列gx52gsssrr(seqidno:56)的8-17个氨基酸序列，其中x52是任何氨基酸、seqidno:31的拟肽，或其通过在seqidno:31的1、3、4、5、6、7或8的任何位置单氨基酸取代而不同于seqidno:31的类似物，前提是当连接肽长于8个氨基酸时，x52不是酪氨酸。依据一个实施方案，连接部分包含选自以下的8-17个氨基酸的序列：gygsssrr(seqidno:18)、gagsssrr(seqidno:22)、gagsssrra(seqidno:57)、gagsssrrap(seqidno:58)、gagsssrrapq(seqidno:59)、gagsssrrapqt(seqidno:23)、pygsssrr(seqidno:61)、pagsssrr(seqidno:62)、pagsssrra(seqidno:63)、pagsssrrap(seqidno:64)、pagsssrrapq(seqidno:65)、pagsssrrapqt(seqidno:66)。依据一个实施方案，连接部分包含通过单聚乙二醇化的氨基酸，包括例如聚乙二醇化的赖氨酸或聚乙二醇化的半胱氨酸氨基酸取代而不同于gygsssrr(seqidno:18)、gagsssrr(seqidno:22)、gagsssrra(seqidno:57)、gagsssrrap(seqidno:58)、gagsssrrapq(seqidno:59)、gagsssrrapqt(seqidno:23)、pygsssrr(seqidno:61)、pagsssrr(seqidno:62)、pagsssrra(seqidno:63)、pagsssrrap(seqidno:64)、pagsssrrapq(seqidno:65)、pagsssrrapqt(seqidno:66)的氨基酸序列。在一个实施方案中，聚乙二醇化的氨基酸是在连接部分的位置8。

在一个实施方案中，一个称为c-末端肽(ctp:sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpqr；seqidno:52)的肽序列，其当蛋白在真核细胞表达系统中表达时易于o-连接的高糖基化，可被用作接头肽。令人惊讶地，申请人已经发现，ctp肽可被用来连接胰岛素的b和a链，以形成单链胰岛素类似物，同时仍以天然胰岛素原c-肽不能的方式维持高的体外效力。在一个实施方案中，制备包含胰岛素肽的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物，所述胰岛素肽具有经由ctp肽连接于a链的氨基末端的b链的羧基末端。在另一个实施方案中，提供作为带有共价连接于b-链的c-末端和/或b链的氨基末端的ctp的双链构件的胰岛素类似物。体外和体内的特征鉴定揭示，在糖基化的缺乏下，ctp修饰的胰岛素类似物具有高效力，因而提供一种基于糖基化的延长胰岛素作用的机制，一种延长持续时间的蛋白的天然途径。

申请人已经发现ctp肽的原始序列似乎并不是至关重要的。因此，在一个实施方案中，连接部分包含具有共享类似的氨基酸含量的至少18个氨基酸长度的肽。在一个实施方案中，连接部分包含(seqidno:68)的类似物，其中所述类似物通过1、2、3、4、5或6个氨基酸取代而不同于(seqidno:68)。在一个实施方案中，连接肽包含ctp肽，其中氨基酸取代在选自(seqidno:68)的位置1、2、3、4、10、13、15，和21的一个或多个位置进行。在一个实施方案中，连接部分包含直接连接于b链的羧基末端氨基酸的29个连续的氨基酸序列，其中所述29个连续的氨基酸序列具有与ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51(seqidno:68)的大于60、80或90%序列同一性，前提是序列不包含与包含在seqidno53内的15氨基酸序列相同的15氨基酸序列。在另一个实施方案中，连接部分包含直接连接于b链的羧基末端氨基酸的29个连续的氨基酸序列，其中包含29个连续的氨基酸序列的至少58%的氨基酸选自丝氨酸和脯氨酸。

在另一个实施方案中，连接部分包含直接连接于b链的羧基末端氨基酸的29个连续的氨基酸序列，其中所述29个连续的氨基酸序列具有与ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51(seqidno:68)的大于70%、80%、90%的序列同一性，其中x50和x51独立地为选自精氨酸和赖氨酸，前提是序列不包含与seqidno53中包含的15氨基酸序列相同的15氨基酸序列。在另一个实施方案中，连接部分包含直接连接于b链的羧基末端氨基酸的29个连续的氨基酸序列，其中所述29个连续的氨基酸序列是(seqidno:52)的类似物，其中所述类似物不同于(seqidno:52)之处仅仅是1、2、3、4、5或6个氨基酸修饰，和在进一步的实施方案中，氨基酸修饰是保守的氨基酸取代。在另一个实施方案中，连接部分包含直接连接于b链的羧基末端氨基酸的29个连续的氨基酸序列，其中所述29个连续的氨基酸序列是(seqidno:52)的类似物，其中所述类似物不同于(seqidno:52)之处仅仅在于1,2或3个氨基酸取代。

申请人也已发现，ctp肽的多个拷贝可用作单链类似物中的连接肽和/或连接于单链或双链胰岛素类似物的b链的氨基末端。ctp肽的多个拷贝在序列中可以是相同的或可以不同并可以头至尾或头至头取向来排列。依据一个实施方案，提供胰岛素类似物，其包含具有序列(ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51)n(seqidno:68)的ctp肽，其中n是选自1、2、3和4的整数和x50和x51独立地选自精氨酸和赖氨酸。

在一个实施方案中，ctp肽包含序列ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51(seqidno:68)，其中x50和x51独立地选自精氨酸和赖氨酸。在另一个实施方案中，ctp肽包含选自ssssrapppslpspsrlpgpsdtpilpqk(seqidno:51)、sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpqr(seqidno:52)或ssssrapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seqidno:67)的序列，和在进一步的实施方案中，ctp肽包含序列ssssrapppslpspsrlpgpsdtpilpqk(seqidno:53)。

糖基化

在新生体内蛋白生产期间，包含糖基化位点的胰岛素类似物可经历进一步的处理，称为翻译后修饰，其中糖(糖基)残基可在称为糖基化的过程中经酶法加入。生成的携带共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。因此，携带糖基化位点的蛋白不必糖基化。依据一个实施方案，提供其已被修饰以包含肽序列的胰岛素激动剂类似物，所述肽序列当在真核表达系统中表达时易于高糖基化。

非-天然和天然糖基化序列是本领域技术人员已知的并包括n-连接的糖基化位点，和o-连接的糖基化位点。n-连接的糖基化位点是用作碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的酶连接的识别位点的肽序列。三肽o-连接的糖基化序列包括天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸，其中x是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，在多肽中的这些三肽序列的任何一个的存在建立一个有效的糖基化位点。o-连接的糖基化是用作碳水化合物部分与羟基氨基酸，最常见是丝氨酸或苏氨酸侧链的酶连接的识别位点的肽序列，虽然5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可使用。在一个实施方案中，o-连接的糖基化糖是n-乙酰基半乳糖胺、半乳糖，或木糖。许多o-连接的糖基化位点是本领域已知的并文献中已有报道。见,例如，tenhagen等(11029)j.biol.chem.274(39):27867-74；hanisch等(2001)glycobiology11:731-740；和tenhagen等(2003)glycobiology13:1r-16r。

依据一个实施方案，提供生产高糖基化胰岛素类似物的方法。该方法包括提供包含编码胰岛素类似物的基因的真核宿主细胞，这种类似物已被修饰为包括非-天然糖基化位点(例如，ctp肽序列)并在允许表达胰岛素类似物基因的条件下培养细胞。在一个实施方案中，宿主细胞表达人糖基化酶，以致在宿主细胞中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)显示与人细胞相同的蛋白糖基化作用(见uspatentapplicationpublicationnos.2004/0018590和2002/0137134，其公开内容通过引用结合到本文中)。依据一个实施方案，真核宿主细胞选自酵母(例如，pichiapastoris)或哺乳动物(cho或hek293)细胞。

依据一个实施方案，提供胰岛素类似物，其中糖基化位点已被引入胰岛素肽。在一个实施方案中，提供或者双链或者单链类似物的胰岛素类似物，其中包含糖基化位点的肽已连接于胰岛素b链的羧基末端。在一个实施方案中，提供包含连接部分的单链胰岛素类似物，所述连接部分共价地连接胰岛素b链的羧基末端至胰岛素a链的氨基末端，其中连接部分包含大于18个残基的氨基酸序列并包含一个或多个糖基化位点。在进一步的实施方案中，提供包含两个肽序列的胰岛素类似物，每个肽序列含有至少一个糖基化位点(或者相同或者不同)。在一个实施方案中，含有糖基化位点的第一肽序列连接于b链的n末端和含有糖基化位点的第二肽序列连接于a或b链的c-末端。在一个实施方案中，胰岛素类似物是单链类似物，其中连接b链和a链的连接部分包含第二肽序列。

在一个实施方案中，通过将氨基酸序列添加到碱基胰岛素类似物中引入糖基化位点。更特别地,申请人已发现称为c-末端肽(ctp:sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpqr；seqidno:52)的肽序列(当蛋白在真核细胞表达系统中表达时，其趋向于o-连接的高糖基化)，可共价连接于胰岛素类似物，而不破坏固有的胰岛素类似物的体外活性。

依据一个实施方案，提供胰岛素类似物，其包含a链和b链和ctp肽，其中ctp肽是与(seqidno:52)具有至少60、70、80、85、90，或95%序列同一性的肽。在一个实施方案中，ctp肽是包含18-29个氨基酸序列的肽，其与(seqidno:52)的18-29个氨基酸的区共享至少80、82、84、86、88、90、92、94、96或98%序列同一性。在一个实施方案中，ctp肽包含(seqidno:52)的类似物，其中所述类似物通过1、1-2、3-4、4-6或最多8个氨基酸取代而不同于(seqidno:52)。在一个实施方案中，氨基酸取代是在(seqidno:52)的一个或多个选自1-4、7-15、18、20、21、24和27的位置。在一个实施方案中，氨基酸取代是在(seqidno:52)的一个或多个选自1、2、3、4、10、13、15，和21的位置。在一个实施方案中，氨基酸取代是在(seqidno:52)的一个或多个选自7、8、9、12、14、18、20、24和27的位置。在一个实施方案中，ctp肽包含29个氨基酸的序列，其通过1-2个氨基酸取代而不同于seqidno:68。在进一步的实施方案中，ctp肽包含seqidno:52的片段，其中片段表示与在seqidno:52中包含的氨基酸序列相同的18-28个连续的氨基酸序列。在一个实施方案中，ctp肽由seqidno:68、seqidno:52或seqidno:51组成。

依据一个实施方案，ctp肽包含序列ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51(seqidno:68)的肽，其中x50和x51独立地为精氨酸或赖氨酸，或通过一个或两个氨基酸修饰而不同于ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51(seqidno:68)的肽。在一个实施方案中，ctp肽是29个氨基酸的序列，其包含选自ssssrapppslpspsrlpgpsdtpilpqk(seqidno:51)、sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpqr(seqidno:52)和ssssrapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seqidno:67)的序列。在一个实施方案中，ctp肽包含序列(ssssx50apppslpspsrlpgpsdtpilpqx51)n(seqidno:68)，其中n是选自1、2、3和4的整数，和在进一步的实施方案中，n是1或2。在进一步的实施方案中，第一ctp肽连接于b链的n-末端和第二ctp肽连接于b链的羧基末端，其中第一和第二ctp肽包含独立地选自seqidno:51、seqidno:52、seqidno:68和seqidno:67的序列。

非-肽接头

在一个实施方案中，连接部分是大约8-18个氨基酸序列长度的相对短的双功能非-肽聚合物接头。依据一个实施方案，非-肽连接部分是约4-20、8-18、8-16、8-14、10-14、10-12或11-13个单体的聚乙二醇接头。在一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然b链的最后5个羧基氨基酸缺失，和氨基酸b25经共价键直接连接于连接部分。连接部分的第二末端共价连接于a链的氨基酸a1，因而经由连接部分连接b和a链。在一个实施方案中，连接部分是包含至少10个但不超过16个单体单位的线性聚乙二醇连接部分和在另一个实施方案中，聚乙二醇连接部分包含至少12个但不超过16个单体单位，和在进一步的实施方案中，聚乙二醇连接部分包含至少10个但不超过14个单体单位。

依据一个实施方案，聚乙二醇连接部分包含结构：

其中m是范围从6-18、8-16、10-14或11-13的整数。在一个实施方案中，m是选自10、11、12、13或14的整数。在一个实施方案中，m是12。

在一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然b链的最后5个羧基氨基酸缺失，和氨基酸b25经由连接部分连接于a链的氨基酸a1，所述连接部分包含至少8个但不超过16个单体单位的聚乙二醇和1-4个氨基酸的氨基酸序列。依据一个实施方案，连接部分包含1-4氨基酸的序列和共价连接于所述1-4个氨基酸序列的长度为至少8个但少于14个单体单位的线性聚乙二醇，前提是氨基酸序列不是ytpk(seqidno:70)或fnkp(seqidno:71)。在另一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然b链的最后5个羧基氨基酸缺失，和氨基酸b25经由连接部分连接于a链的氨基酸a1，所述连接部分包含长度为至少8个但少于14个单体单位和2-5个氨基酸序列的聚乙二醇。2-5个氨基酸的序列可位于b链和聚乙二醇链之间或a链和聚乙二醇链之间。然而，当2-5个氨基酸的序列位于b链和聚乙二醇链之间时，氨基酸序列不是ytpkt(seqidno:16)或fnkpt(seqidno:76)。

在一个实施方案中，连接部分包含通用结构：w1-z1-y1

其中

w1和y1独立地为键、x46、x46x47、x46x47x48、x46x47x48x49(seqidno:24)或x46x47x48x49x50(seqidno:13)，前提是w1不是ytpk(seqidno:70)或fnkp(seqidno:71)和z1表示以下通用结构的聚乙二醇

其中m是范围从6-14的整数，和x46、x47、x48、x49和x50各自独立地为任何氨基酸。在一个实施方案中，x46、x47、x48、x49和x50独立地为胰岛素或igf-1的相对于位置b26-b30的任何非-天然氨基酸。在一个实施方案中，x46、x47、x48、x49和x50独立地为选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，和在进一步的实施方案中，x46、x47、x48、x49和x50独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一个实施方案中，w1是键和y1是x46、x46x47或x46x47x48(seqidno:15)，其中x46、x47和x48各自是丙氨酸和z是4-14个单体单位的聚乙二醇。在一个实施方案中，y1是键和w1是x46、x46x47或x46x47x48(seqidno:15)，其中x46、x47和x48各自是丙氨酸和z是4-14个单体单位的聚乙二醇。

在一个实施方案中，提供单链胰岛素类似物，其包含a链和具有除去氨基酸b26-b30(相对于天然胰岛素序列)的c-末端截短的b链，其中所述a链和b链是人胰岛素序列，或其类似物或衍生物，另外其中b链的b25氨基酸的羧基末端直接连接于连接部分的第一末端和连接部分的第二末端直接连接于a链的a1氨基酸的氨基末端。在一个实施方案中，截短的b链包含seqidno:20的序列，其中b25氨基酸直接连接于连接肽的n末端。在该实施方案中

连接部分包含或者

a)6-16个单体单位的聚乙二醇；

b)长度为至少8个氨基酸和不超过17个氨基酸的非-天然氨基酸序列；或者

c)所述聚乙二醇和1-4个氨基酸的非-天然氨基酸序列的组合；

胰岛素肽的聚乙二醇化

申请人已发现，亲水部分与本文公开的胰岛素单链类似物的共价键提供具有延缓起效,延长持续时间和显示活性的基础概况的类似物。在一个实施方案中，本文公开的胰岛素肽被进一步修饰以包含共价连接于选自a链的a9、a14和a15的位置或在b链的n-末端α胺(如在对于胰岛素基b链的位置b1或对于igf-1基b链的位置b2)的氨基酸侧链或在b链的位置b1、b2、b10、b22、b28或b29的氨基酸侧链或在连接a链和b链的连接部分的任何位置的亲水部分。在示例性实施方案中，这种亲水部分在任何这些位置共价连接于lys、cys、orn、高半胱氨酸，或乙酰基-苯丙氨酸残基。在一个实施方案中，亲水部分共价连接于连接部分的氨基酸的侧链。

示例性亲水部分包括，例如，分子量约1,000道尔顿-约40,000道尔顿，或约20,000道尔顿-约40,000道尔顿的聚乙二醇(peg)。另外的合适的亲水部分包括，聚丙二醇、聚氧乙烯多元醇(例如，pog)、聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯葡萄糖、聚氧乙烯甘油(pog)、聚氧化烯(polyoxyalkylenes)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、单-(c1-c10)烷氧基-或芳基氧基-聚乙二醇、羧基甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(或者均聚物或者无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(propropyleneglycol)均聚物(ppg)和其它聚环氧烷(polyakyleneoxides)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、结肠酸或其它多糖聚合物、聚蔗糖(ficoll)或右旋糖酐及其混合物。

依据一些实施方案，亲水部分，例如，聚乙二醇链具有选自范围约500-约40,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，亲水部分，例如peg，具有选自范围约500-约5,000道尔顿，或约1,000-约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，亲水部分，例如，peg具有约10,000-约20,000道尔顿的分子量。在另外的其它示例性实施方案中，亲水部分，例如，peg,具有约20,000-约40,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，亲水部分，例如peg，具有约20,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，提供胰岛素肽，其中类似物的一个或多个氨基酸被聚乙二醇化，且共价连接的peg链的合并分子量为约20,000道尔顿。

在一个实施方案中，右旋糖酐被用作亲水部分。右旋糖酐是葡萄糖亚单位的多糖聚合物，主要由α1-6个连键连接。右旋糖酐可以许多分子量范围获得，例如，约1kd-约100kd，或从约5、10、15或20kd-约20、30、40、50、60、70、80或90kd。

构思了线性或分支聚合物。产生的缀合物的制剂可以基本上为单分散或多分散的，和可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分/每肽。

在一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇(peg)链，任选地连接于氨基酸的侧链，在选自a链的a9、a14和a15位置，b链的b1、b2、b10、b22、b28或b29位置,在b链的n-末端α胺，或在连接a链和b链的单链胰岛素类似物的连接部分的任何位置，包括例如在位置c8。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含8-12个氨基酸的肽连接部分，其中连接部分的氨基酸之一具有共价连接于其侧链的聚乙烯链。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含8-12个氨基酸的肽连接部分，其中连接部分的氨基酸经聚乙二醇化且在选自a链的a9、a14和a15位置，b链的b1、b2、b10、b22、b28或b29位置的一个或多个氨基酸也经聚乙二醇化。在一个实施方案中，共价连接的peg链(s)的总分子量为约20,000道尔顿。

在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含8-12个氨基酸的连接部分，其中连接部分的氨基酸之一具有共价连接于其侧链的20,000道尔顿的聚乙烯链。在另一个实施方案中，胰岛素类似物包含8-12个氨基酸的肽连接部分，其中连接部分的氨基酸之一具有共价连接于其侧链的聚乙烯链和第二peg链连接于b链的n-末端α胺(如在对于胰岛素基b链的位置b1或对于igf-1基b链的位置b2)或在b链的位置b1、b2和b29的氨基酸侧链。在一个实施方案中，当两个peg链连接于胰岛素肽时，每个peg链具有约10,000道尔顿分子量。在一个实施方案中，当peg链连接于8-12个氨基酸的连接部分时，peg链连接在连接部分的位置c7或c8和在一个实施方案中，peg链连接在连接部分的位置c8。在一个实施方案中，当两个peg链连接于单链胰岛素类似物时，一个peg链连接在位置c8，而第二peg连接在a9、a14、a15、b1、b2、b10、b22、b28或b29。

在用于使蛋白与活化的聚合物分子反应的任何合适的条件下，亲水部分如聚乙二醇可连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物。可采用本领域已知的任何方式，包括经由酰基化、还原烷基化、michael加成、巯基烷基化或其它化学选择性缀合/连接方法，通过peg部分上的反应性基团(例如，醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、顺丁烯二酰亚胺或肼基)至目标化合物的反应性基团(例如，醛、氨基、酯。硫醇、α-卤代乙酰基、顺丁烯二酰亚胺或肼基)。可被用来连接水溶性聚合物至一个或多个蛋白的活化基团包括但不限于砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、氮杂环丙烷、氧杂环丙烷和5-吡啶基。如果通过还原烷基化连接到肽，选择的聚合物应具有单反应性醛，以便控制聚合度。见，例如，kinstler等,adv.drug.de肝yrev.54:477-485(2002)；roberts等,adv.drugdeliveryrev.54:459-476(2002)；和zalipsky等,adv.drugdeliveryrev.16:157-182(1995)。

酰基化

在一些实施方案中，胰岛素类似物被修饰以包含酰基。酰基可经共价直接连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸，或经由间隔区直接连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸，其中间隔区位于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸和酰基之间。胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物可在相同的氨基酸位置(在那里亲水部分被连接)，或在不同的氨基酸位置被酰基化。例如，酰基化可发生在任何位置，包括a或b链的任何氨基酸以及在连接部分内的位置，前提是由非-酰基化胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物显示的活性在酰基化时保留。非限制性实例包括在a链的位置a14和a15，对于胰岛素基b链的位置b1或对于igf-1基b链的位置b2或b链的位置b10、b22、b28或b29或在连接部分的任何位置的酰基化。

在本发明的一个特殊方面，胰岛素类似物被修饰以通过胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸侧链的胺、羟基，或硫醇的直接酰基化包含酰基。在一些实施方案中，胰岛素类似物通过氨基酸的侧链胺、羟基，或硫醇直接酰基化。在某些实施方案中，酰基化在位置b28或b29(依据天然胰岛素a和b链序列的氨基酸编号)。在这点上，可以提供胰岛素类似物，其已被一个或多个氨基酸取代在a或b链序列，包括例如在位置a14、a15、b1、b2、b10、b22、b28或b29(依据天然胰岛素a和b链序列的氨基酸编号)或在与包含侧链胺、羟基，或硫醇的氨基酸的连接部分的任何位置被修饰。在本发明的一些特殊实施方案中，胰岛素肽的直接酰基化通过氨基酸的侧链胺,羟基，或硫醇在位置b28或b29(依据天然胰岛素a和b链序列的氨基酸编号)发生。

依据一个实施方案，酰基化胰岛素类似物包含肽和酰基之间的间隔区。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物共价连接于间隔区，其共价连接于酰基。在一些示例性实施方案中，胰岛素肽被修饰以通过间隔区的胺,羟基，或硫醇的酰基化而包含酰基，所述间隔区在位置b28或b29(依据天然胰岛素a或b链序列的氨基酸编号)，或在间隔区部分的任何位置连接于氨基酸的侧链。间隔区连接的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸可以是包含允许连接间隔区的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链-nh2、-oh，或-cooh(例如，lys、orn、ser、asp，或glu)的氨基酸是合适的。

在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物和酰基之间的间隔区是包含侧链胺,羟基，或硫醇(或包含含有侧链胺、羟基，或硫醇的氨基酸的二肽或三肽)的氨基酸。在某些实施方案中，间隔区包含亲水双功能间隔区。在特定实施方案中，间隔区包含氨基聚(烷氧基)羧酸酯。在这点上，间隔区可包含，例如，nh2(ch2ch2o)n(ch2)mcooh，其中m是从1-6的任何整数和n是从2-12的任何整数，例如，8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(dioxaoctanoicacid)，其可从peptidesinternational,inc.(louisville,ky)经市售获得。在一个实施方案中，亲水双功能间隔区包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基，硫醇，和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，亲水双功能间隔区包含羟基和羧酸酯。在其它实施方案中，亲水双功能间隔区包含胺基团和羧酸酯。在其它实施方案中，亲水双功能间隔区包含硫羟基和羧酸酯。

在一些实施方案中，肽胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物和酰基之间的间隔区是疏水性双功能间隔区。疏水性双功能间隔区是本领域已知的。见，例如，bioconjugatetechniques,g.t.hermanson(academicpress,sandiego,ca,1996)，其通过引用以其全文结合到本文中。依据某些实施方案，双功能间隔区可以是合成或天然存在的氨基酸，其包含长度为3-10个原子的氨基酸主链(例如，6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸，和8-氨基辛酸)。可供选择地，间隔区可以是具有长度为3-10个原子(例如，6-10个原子)的肽主链的二肽或三肽间隔区。连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的二肽或三肽间隔区的每个氨基酸可以独立地选自：天然存在的和/或非-天然存在的氨基酸，包括，例如，天然存在的氨基酸(ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、arg、ser、thr、val、trp、tyr)的任何d或l异构体，或选自以下的非-天然存在的氨基酸的任何d或l异构体：β-丙氨酸(β-ala)、n-α-甲基-丙氨酸(me-ala)、氨基丁酸(abu)、α-氨基丁酸(γ-abu)、氨基己酸(ε-ahx)、氨基异丁酸(aib)、氨基甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(ams)、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸n-甲氧基-n-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-asp)、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔-丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-n-戊酸(瓜氨酸，cit)、β-环己基丙氨酸(cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(dab)、二氨基丙酸(dpr)、二羟基苯丙氨酸(dopa)、二甲基噻唑烷(dmta)、γ-谷氨酸(γ-glu)、高丝氨酸(hse)、羟基脯氨酸(hyp)、异亮氨酸n-甲氧基-n-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(meile)、4-哌啶甲酸(isonipecoticacid)(isn)、甲基-亮氨酸(meleu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲烷脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(met(o))、甲硫氨酸-砜(met(o2))、正亮氨酸(nle)、甲基-正亮氨酸(me-nle)、正缬氨酸(nva)、鸟氨酸(orn)、对-氨基苯甲酸(paba)、青霉胺(pen)、甲基苯丙氨酸(mephe)、4-氯代苯丙氨酸(phe(4-cl))、4-氟代苯丙氨酸(phe(4-f))、4-硝基苯丙氨酸(phe(4-no2))、4-氰基苯丙氨酸((phe(4-cn))、苯基甘氨酸(phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(sar)、硒代半胱氨酸(sec)、u-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(achpa)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(ahppa)、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-羧酸(tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(thi)、u-苄基-磷酸酪氨酸、o-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、o-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁基胺、甲基-缬氨酸(meval)、1-氨基-1-环己烷羧酸(acx)、氨基戊酸、β-环丙基-丙氨酸(cpa)、炔丙基甘氨酸(prg)、烯丙基甘氨酸(alg)、2-氨基-2-环己基-丙酸(2-cha)、叔丁基甘氨酸(tbg)、乙烯基甘氨酸(vg)、1-氨基-1-环丙烷羧酸(acp)、1-氨基-1-环丙烷羧酸(acpe)、烷基化3-巯基丙酸、1-氨基-1-环丁烷羧酸(acb)。在某些实施方案中，二肽间隔区选自：ala-ala、β-ala-β-ala、leu-leu、pro-pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸，和γ-glu-γ-glu。

肽胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物可被修饰以通过任何大小的长链烷烃的酰基化包含酰基并可包含任何长度的碳链。长链烷烃可以是线性或分支的。在某些方面，长链烷烃是c4-c30烷烃。例如，长链烷烃可以是c4烷烃、c6烷烃、c8烷烃、c10烷烃、c12烷烃、c14烷烃、c16烷烃、c18烷烃、c20烷烃、c22烷烃、c24烷烃、c26烷烃、c28烷烃，或c30烷烃的任何一种。在某些实施方案中，长链烷烃包含c8-c20烷烃，例如，c14烷烃、c16烷烃，或c18烷烃。

在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的胺、羟基，或硫羟基用胆固醇酸酰基化。在特定的实施方案中，肽通过烷基化脱-氨基cys间隔区，即烷基化3-巯基丙酸间隔区连接于胆固醇酸。肽经由胺、羟基，和硫醇的酰基化的合适方法是本领域已知的。见，例如，miller,biochembiophysrescommun218:377-382(1996)；shimohigashi和stammer,intjpeptproteinres19:54-62(1982)；和previero等,biochimbiophysacta263:7-13(1972)(对于通过羟基的酰化方法)；和san和silvius,jpeptres66:169-180(2005)(对于通过硫醇的酰化方法)；bioconjugatechem."蛋白的化学修饰：历史和应用(chemicalmodificationsofproteins:historyandapplications)"1,2-12页(1990);hashimoto等,pharmacueticalres."胰岛素的棕榈酰衍生物的合成及其生物学活性(synthesisofpalmitoylderivativesofinsulinandtheirbiologicalactivity)"vol.6,no:2pp.171-176(1989)。

酰基化肽胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的酰基可具有任何大小，例如，任何长度的碳链，并可以是线性或分支的。在本发明的一些特殊实施方案中，酰基是c4-c30脂肪酸。例如，酰基可以是c4脂肪酸、c6脂肪酸、c8脂肪酸、c10脂肪酸、c12脂肪酸、c14脂肪酸、c16脂肪酸、c18脂肪酸、c20脂肪酸、c22脂肪酸、c24脂肪酸、c26脂肪酸、c28脂肪酸，或c30脂肪酸的任何一种。在某些实施方案中，酰基是c8-c20脂肪酸，例如，c14脂肪酸或c16脂肪酸。

在备选的实施方案中，酰基是胆酸。胆酸可以是任何合适的胆酸，包括，但不限于，胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘胆酸，和胆固醇酸。

烷基化

在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物被修饰以包含烷基。烷基可以被共价地直接连接于胰岛素类似物的氨基酸，或经由间隔区直接连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸，其中间隔区位于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸和烷基之间。烷基可通过醚、硫醚，或氨基键连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物。例如，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物可在相同的氨基酸位置(在那里亲水部分被连接)，或在不同的氨基酸位置被烷基化。烷基化可在胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物内的任何位置进行，包括例如在b链的c-末端区或在连接部分的位置，前提是保留胰岛素活性。在本发明的特殊方面，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物被修饰以通过胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸侧链的胺、羟基，或硫醇的直接烷基化而包含烷基。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物通过氨基酸的侧链胺、羟基，或硫醇被直接烷基化。在本发明的一些特殊实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的直接烷基化通过氨基酸的侧链胺、羟基，或硫醇在位置a14、a15、b1(对于胰岛素基b链)、b2(对于igf-1基b链)、b10、b22,b28或b29(依据天然胰岛素的a和b链的氨基酸编号)发生。

在本发明的一些实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物包含肽和烷基之间的间隔区。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物共价连接于间隔区，后者共价连接于烷基。在一些示例性实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物被修饰以通过间隔区的胺、羟基，或硫醇的烷基化来包含烷基，其中间隔区连接于位置a14、a15、b1(对于胰岛素碱db链)、b2(对于igf-1基b链)、b10、b22、b28或b29(依据天然胰岛素的a和b链的氨基酸编号)的氨基酸的侧链。间隔区被连接的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸可以是包含允许连接间隔区的部分的任何氨基酸(例如，单一α-取代的氨基酸或α,α-二取代的氨基酸)。包含侧链-nh2、-oh，或-cooh(例如，lys,orn,ser,asp，或glu)的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的氨基酸是合适的。在某些实施方案中，肽胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物和烷基之间的间隔区是包含侧链胺、羟基，或硫醇的氨基酸或包含含有侧链胺,羟基，或硫醇的氨基酸的二肽或三肽。

在其中α胺被烷基化的情况下，间隔区氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔区氨基酸可以是疏水性氨基酸，例如，gly、ala、val、leu、ile、trp、met、phe、tyr。可供选择地，间隔区氨基酸可以是酸性残基，例如，asp和glu。在示例性实施方案中，间隔区氨基酸可以是疏水性氨基酸，例如，gly、ala、val、leu、ile、trp、met、phe、tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。可供选择地，间隔区氨基酸可以是酸性残基，例如，asp和glu，前提是烷基化在酸性残基的α胺上发生。在其中间隔区氨基酸的侧链胺被烷基化的情况下，间隔区氨基酸是包含侧链胺的氨基酸，例如，式i的氨基酸(例如，lys或orn)。在这种情况下，对于间隔区氨基酸的α胺和侧链胺二者的烷基化的可能的，以致肽被二烷基化。本发明的实施方案包括这样的二烷基化分子。

在一些实施方案中，间隔区包含亲水双功能间隔区。在特定实施方案中，间隔区包含氨基聚(烷氧基)羧酸酯。在这点上，间隔区可包含，例如，nh2(ch2ch2o)n(ch2)mcooh，其中m是从1-6的任何整数和n是从2-12的任何整数例如，8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可从peptidesinternational,inc.(louisville,ky)经市售获得。在某些实施方案中，肽胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物和烷基之间的间隔区是亲水双功能间隔区。在某些实施方案中，亲水双功能间隔区包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、硫醇，和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，亲水双功能间隔区包含羟基和羧酸酯。在其它实施方案中，亲水双功能间隔区包含胺基团和羧酸酯。在其它实施方案中，亲水双功能间隔区包含硫羟基和羧酸酯。

间隔区(例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水双功能间隔区，或疏水性双功能间隔区)的长度是3-10个原子(例如，6-10个原子、(例如，6、7、8、9，或10个原子))。在更特别的实施方案中，间隔区的长度为约3-10个原子(例如，6-10个原子)和烷基是c12-c18烷基，例如，c14烷基、c16烷基，以致间隔区和烷基的总长度是14-28个原子，例如，约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27，或28个原子。在某些实施方案中，间隔区和烷基的长度是17-28(例如，19-26、19-21)个原子。

依据一个实施方案，双功能间隔区是包含合成的或非-天然存在的氨基酸的氨基酸主链，其长度是3-10个原子(例如，6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸，和8-氨基辛酸)。可供选择地，间隔区可以是具有长度为3-10个原子(例如，6-10个原子)的肽主链的二肽或三肽间隔区。连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的二肽或三肽间隔区可包含天然存在的和/或非-天然存在的氨基酸，包括，例如，本文讲述的任何氨基酸。在某些实施方案中，间隔区总体上包含负电荷，如包含一个或两个带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，肽间隔区选自：ala-ala、β-ala-β-ala、leu-leu、pro-pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸，和γ-glu-γ-glu。在一个实施方案中，二肽间隔区是γ-glu-γ-glu。

经由胺、羟基，和硫醇的肽烷基化的合适方法是本领域已知的。例如，可以使用williamson醚合成以形成胰岛素肽和烷基之间的醚键。此外，肽与烷基卤化物的亲水取代反应可得到醚、硫醚，或氨基键的任何一种。烷基化肽胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的烷基可具有任何大小，例如，任何长度的碳链，并可为线性或分支的。在本发明的某些实施方案中，烷基是c4-c30烷基。例如，烷基可以是c4烷基、c6烷基、c8烷基、c10烷基、c12烷基、c14烷基、c16烷基、c18烷基、c20烷基、c22烷基、c24烷基、c26烷基、c28烷基，或c30烷基中的任何一种。在某些实施方案中，烷基是c8-c20烷基，例如，c14烷基或c16烷基。

在一些特定实施方案中，烷基包含胆酸的类固醇部分，例如，胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘胆酸，和胆固醇酸。

当长链烷烃通过胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物或间隔区烷基化时，长链烷烃可具有任何大小并可包含任何长度的碳链。长链烷烃可以是线性或分支的。在某些方面，长链烷烃是c4-c30烷烃.例如，长链烷烃可以是c4烷烃、c6烷烃、c8烷烃、c10烷烃、c12烷烃、c14烷烃、c16烷烃、c18烷烃、c20烷烃、c22烷烃、c24烷烃、c26烷烃、c28烷烃，或c30烷烃中的任何一种。在某些实施方案中，长链烷烃包含c8-c20烷烃，例如，c14烷烃、c16烷烃，或c18烷烃。

此外，在一些实施方案中，烷基化可在胰岛素类似物和胆固醇部分之间发生。例如，胆固醇的羟基可置换长链烷烃的离去基团，以形成胆固醇-胰岛素肽产物。

控制释放制剂

可供选择地，本文描述的胰岛素/肠促胰岛素缀合物可被修饰成贮库形式，以致以关于时间和身体的部位的控制方式给予，其中本公开的缀合物被释放进入体内(见，例如，美国专利号4,450,150)。本公开的缀合物的贮库形式可以是，例如，一种可植入的组合物，其包含本公开的缀合物和多孔或非-多孔材料，如聚合物，其中本公开的缀合物被包封或扩散到整个材料和/或降解的非-多孔材料中。然后将贮库植入到身体内的所需部位，而本公开的缀合物以预定的速率从植入物释放。

可供选择地，大的贮库聚合物可连接于自裂解的二肽单元，后者共价连接于如本文描述的缀合物。在该实施方案中，贮库聚合物在其应用的位点有效地螯合胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物，直至其随后以预定的速率，经由非-酶促反应从单链类似物裂解。使用自裂解二肽的胰岛素类似物的贮库制剂已在公布的国际申请号wo2010/080607中描述，其公开内容结合到本文中。在一个实施方案中，提供胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物，其包含二肽前药单元，其中二肽前药单元连接于大的聚合物如peg或右旋糖酐。在一个实施方案中，包含大的贮库聚合物(包括例如，peg)的自裂解的二肽单元连接于连接部分的氨基酸的侧链，包括例如，在连接部分的位置c8的氨基酸。

可制备包含单链类似物的药用组合物并被配制以具有所需体内释放曲线。在一些方面，药用组合物是立即释放、控制释放、缓慢释放、延长释放、延迟释放，或双相释放制剂。配制用于控制释放的肽或缀合物的方法是本领域已知的。见，例如，jpharm374:46-52(2009)和国际专利申请公布号wo2008/130158、wo2004/033036；wo2000/032218；和wo1999/040942。速溶组合物还可包含，例如，胶束或脂质体，或一些其它包囊形式，或可以延长释放形式配制以提供延长的储存和/或递药效果。公开的药物制剂可依据任何给药方案配制，包括，例如，每天(每天1次，每天2次，每天3次，每天4次，每天5次，每天6次)、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每两周、每3周、每月，或每两月。

依据一个实施方案，贮库聚合物选自本领域技术人员已知的生物相容的聚合物。贮库聚合物典型地具有选自范围约20,000-120,000道尔顿的大小。在一个实施方案中，贮库聚合物具有选自范围约40,000-100,000或约40,000-80,000道尔顿的大小。在一个实施方案中，贮库聚合物具有约40,000、50,000、60,000、70,000或80,000道尔顿的大小。合适的贮库聚合物包括但不不限于右旋糖酐、聚丙交酯、聚乙交酯、己内酯-基聚合物、聚(己内酯)、聚酸酐、聚胺、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚对二氧杂环已酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚膦腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、甲壳素、壳聚糖、透明质酸，和共聚物、三元共聚物及其混合物，和可生物降解的聚合物及其共聚物，包括己内酯-基聚合物、聚己内酯和包括聚对苯二甲酸丁二醇酯的共聚物。在一个实施方案中，贮库聚合物选自聚乙二醇、右旋糖酐、聚乳酸、聚乙醇酸，以及乳酸和乙醇酸的共聚物，和在一个特定的实施方案中，贮库聚合物是聚乙二醇。在一个实施方案中，贮库聚合物是聚乙二醇和连接于二肽单元的贮库聚合物的合并分子量为约40,000-80,000道尔顿。

依据一个实施方案，提供包含结构u-j的自裂解的二肽单元，其中u是氨基酸或羟基酸和j是n-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，一个或多个二肽单元通过酰胺键连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物，所述酰胺键通过选自胰岛素组分的b链的n-末端氨基，胰高血糖素相关肽组分的n-末端，或存在于缀合物中的氨基酸侧链氨基的一个或多个氨基形成。依据一个实施方案，一个或多个二肽单元在选自缀合物的n-末端氨基，或存在于对应于天然胰岛素的位置a19、b16或b25的位置的4-氨基-苯丙氨酸残基的芳族胺的侧链氨基，或单链胰岛素类似物的连接部分的氨基酸的侧链，或缀合物的胰高血糖素相关肽或胰岛素肽组分的n-末端的氨基，连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物。

在一个实施方案中，二肽前药单元包含式x的通用结构：

其中

r1、r2、r4和r8独立地为选自h、c1-c18烷基、c2-c18链烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2⁺)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)，和c1-c12烷基(w)c1-c12烷基，其中w是选自n、s和o的杂原子，或r1和r2与它们连接的原子一起形成c3-c12环烷基或芳基；或r4和r8与它们连接的原子一起形成c3-c6环烷基；

r3选自c1-c18烷基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)nh2、(c1-c18烷基)sh、(c0-c4烷基)(c3-c6)环烷基、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7，和(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)或r4和r3与它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环基环；

r5是nhr6或oh；

r6是h、c1-c8烷基或r6和r2与它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环基环；和

r7选自h和oh。在一个实施方案中，当前药单元连接于胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的n-末端胺和r4和r3与它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环基环时，则至少一个r1和r2不是h。

胰高血糖素相关肽

申请人已发现已在胰高血糖素、glp1和gip受体改变活性的胰高血糖素的类似物。任何这些类似物可用作本文描述的缀合物中的胰高血糖素相关肽。更特别地，胰高血糖素相关肽可以是本文描述的1型、2型或3型胰高血糖素肽的任何一种。

1型胰高血糖素相关肽

在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽是1型胰高血糖素相关肽，其在本文和在国际专利申请号pctus2009/47437(在2009年6月16日提交)和国际专利申请公布号wo2008/086086(于2008年7月17日公布)中有描述，其内容通过引用以其全文结合到本文中。

在以下涉及1型胰高血糖素相关肽的章节(seqidnos:801-915)中提及的生物学序列对应于国际专利申请号pctus2009/47437中概括的seqidnos:1-115。

活性

1型胰高血糖素相关肽保留相对于天然胰高血糖素肽(seqidno:801)的胰高血糖素受体活性。例如，胰高血糖素相关肽可保留天然胰高血糖素的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%活性、80%活性、85%活性，或90%的活性(计算为胰高血糖素相关肽对比胰高血糖素的ec50s的反比，例如，如通过camp生产，使用通常描述于实施例7中的分析法所测定的)。在某些实施方案中，1型胰高血糖素相关肽具有与胰高血糖素相同或比胰高血糖素更大的活性(与本文的术语“效力”同义地使用)。在某些实施方案中，本文描述的胰高血糖素相关肽显示不超过约100%、1000%、10,000%、100,000%，或1,000,000%的天然胰高血糖素肽的活性。

改进稳定性

天然胰高血糖素在水性溶液中，特别是在生理ph下显示差的稳定性，并随着时间的推移具有聚集和沉淀的趋向。相反，在一些实施方案中，于25℃24小时后，在6和8之间，或在6和9之间的ph，例如，在ph7，与天然胰高血糖素比较，1型胰高血糖素相关肽显示至少2-倍、5-倍，或甚至更高的稳定性。

因此，在一些实施方案中，1型胰高血糖素相关肽已经相对于his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-asn-thr(seqidno:801)的野生型肽进行修饰，以改进肽在水性溶液中，特别是在从约5.5-约8.0的ph范围内的稳定性,同时保留天然肽的生物学活性。

例如，本文描述的任何1型胰高血糖素相关肽的稳定性可通过使亲水部分连接于肽而进一步改进。这样的基团的引入也增加作用的持续时间，例如如通过延长在循环中的半衰期所测定的。亲水部分在本文被进一步描述。

用荷电残基修饰

在一些实施方案中，通过用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的荷电氨基酸取代天然非-荷电氨基酸，或通过将荷电氨基酸添加到肽的氨基或羧基末端，将电荷加入到1型胰高血糖素相关肽来改进稳定性。

依据一些实施方案，由于通过将荷电氨基酸引入肽的c-末端部分的氨基酸取代和/或添加，和在一些实施方案中在位置c-末端至seqidno:801的位置27修饰肽这一事实，1型胰高血糖素相关肽改进了稳定性。任选地，1、2或3个荷电氨基酸可被引入c-末端部分内，和在一些实施方案中引入c-末端至位置27。依据一些实施方案，在位置28和/或29的天然氨基酸用荷电氨基酸取代，和/或1-3个荷电氨基酸被加入到肽的c-末端，例如在位置27、28或29之后。在示例性实施方案中，1、2、3或所有的荷电氨基酸是带负电荷的。在其它实施方案中，1、2、3或所有的荷电氨基酸是带正电荷的。

在特定的示例性实施方案中，1型胰高血糖素相关肽可包含任何一个或两个以下的修饰：用e取代n28；用d取代n28；用d取代t29；用e取代t29；在位置27、28或29之后插入e；在位置27、28或29之后插入d。例如，d28e29、e28e29、e29e30、e28e30、d28e30。

依据一个示例性实施方案，1型胰高血糖素相关肽包含seqidno:811的氨基酸序列，或其含有相对于天然胰高血糖素的1-3个另外的氨基酸修饰的类似物(本文参照胰高血糖素激动剂所述)，或其胰高血糖素激动剂类似物。seqidno:811表示修饰的1型胰高血糖素相关肽，其中在天然蛋白的位置28的天冬酰胺残基已用天冬氨酸取代。在另一个示例性实施方案中，1型胰高血糖素相关肽包含seqidno:838的氨基酸序列，其中天然蛋白在位置28的天冬酰胺残基已用谷氨酸取代。其它示例性实施方案包括seqidnos:824、825、826、833、835、836和837的1型胰高血糖素相关肽。

改进稳定性

任何1型胰高血糖素相关肽可另外地显示改进的稳定性和/或减少的降解，例如，于25℃24小时后保留至少95%的原始肽。1型胰高血糖素相关肽可包括改变其药物特性的另外的修饰，例如增加的效力，在循环中的延长的半衰期，增加的保质期，减少沉淀或聚集，和/或减少降解，例如，减少裂解的发生或储存后的化学变性。

在更进一步的示例性实施方案中，任何前述1型胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以通过修饰在seqidno:801的位置15的氨基酸改进稳定性，以减少肽随时间推移的降解，尤其是在酸性或碱性缓冲液中。在示例性实施方案中，在位置15的asp用glu、同型-glu、半胱氨酸，或同型-半胱氨酸取代。

可供选择地，本文描述的任何1型胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以通过修饰在seqidno:801的位置16的氨基酸改进稳定性。在示例性实施方案中，在位置16的ser用thr或aib取代，或在本文关于1型胰高血糖素相关肽(其在胰高血糖素受体提高效力)描述的任何氨基酸取代。这样的修饰减少asp15-ser16之间的肽键的裂解。

在一些实施方案中，本文描述的任何1型胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以通过修饰任何1、2、3，或所有4个位置20、21、24，或27的各个氨基酸位置减少降解。示例性实施方案包括用ser、thr、ala或aib在位置20取代gln，用glu在位置21取代asp，用ala或aib在位置24取代gln，用leu或nle在位置27取代met。由于甲硫氨酸的氧化，除去或取代甲硫氨酸减少降解。由于gln或asn的脱酰胺作用，除去或取代gln或asn减少降解。除去或取代asp减少降解，所述降解通过asp的脱水以形成环状琥珀酰亚胺中间体，接着异构化为异-天冬氨酸而发生。

提高效力

依据另一个实施方案，提供已在胰高血糖素受体提高效力的1型胰高血糖素相关肽，其中肽包含在天然胰高血糖素(seqidno:801)的位置16的氨基酸修饰。通过非限制性实例，这样的提高的效力可通过在位置16用谷氨酸或用另一个具有4个原子长度的侧链的带负电荷的氨基酸，或可供选择地用任何一个谷氨酰胺、高谷氨酸，或高半胱氨酸，或具有含有至少一个杂原子(如n、o、s、p)的侧链的荷电氨基酸和用约4(或3-5)个原子的侧链长度取代天然存在的丝氨酸提供。用谷氨酸在位置16取代丝氨酸提高在胰高血糖素受体的胰高血糖素活性至少2-倍、4-倍、5-倍和最多10-倍以上。在某些实施方案中，1型胰高血糖素相关肽保留对胰高血糖素受体相对于glp-1受体，例如，至少5-倍、10-倍，或15-倍选择性的选择性。

dpp-iv抗性

在一些实施方案中，本文公开的1型胰高血糖素相关肽在位置1或2被进一步修饰，以减少对由二肽基肽酶iv的裂解的敏感性。更特别地,在一些实施方案中，1型胰高血糖素相关肽的位置1和/或位置2用本文描述的dpp-iv抗性氨基酸取代。在某些实施方案中，类似物肽的位置2用氨基异丁酸取代。在某些实施方案中，类似物肽的位置2用选自d-丝氨酸、d-丙氨酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸，和-氨基丁酸的氨基酸取代。在另一个实施方案中，1型胰高血糖素相关肽的位置2用选自d-丝氨酸、甘氨酸，和氨基异丁酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，在位置2的氨基酸不是d-丝氨酸。

在胰高血糖素相关肽的位置1和/或位置2的氨基酸修饰后，胰高血糖素活性的减少可通过在胰高血糖素相关肽(约氨基酸12-29)的c-末端部分中的α-螺旋结构的稳定来恢复。α螺旋结构可通过，例如，共价或非-共价分子内桥(例如，在位置“i”和“i+4”的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i是从12至25的整数)的形成，围绕位置12-29用α螺旋-稳定氨基酸取代和/或插入氨基酸(例如，α,α-二取代的氨基酸)来稳定，如本文进一步描述的。

在位置3的修饰

胰高血糖素受体活性可通过在位置3的氨基酸修饰(依据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，例如用酸性、碱性，或疏水性氨基酸取代在位置3的天然存在的谷氨酰胺而减少。例如在位置3用谷氨酸、鸟氨酸，或正亮氨酸取代基本上减少或破坏胰高血糖素受体活性。

通过用如本文描述的谷氨酰胺类似物修饰在位置3的gln，可实现在胰高血糖素受体的活性的维持或提高。例如，胰高血糖素激动剂可包含seqidno:863、seqidno:869、seqidno:870、seqidno:871、seqidno:872、seqidno:873和seqidno:874的氨基酸序列。

用c-末端酰胺和酯提高glp-1活性

通过用电荷-中性基团，如酰胺或酯置换c-末端氨基酸的羧酸，提供在glp-1受体的提高的活性。相反地，保留在肽的c-末端的天然羧酸维持1型胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体比对glp-1受体的相对更大的选择性(例如，大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或20-倍)。

进一步的修饰和组合

可对1型胰高血糖素相关肽进行另外的修饰，这可进一步增加溶解性和/或稳定性和/或胰高血糖素活性。1型胰高血糖素相关肽可供选择地包含基本上不影响溶解性或稳定性，且基本上不降低胰高血糖素活性的其它修饰。在示例性实施方案中，1型胰高血糖素相关肽可包含相对于天然胰高血糖素序列的总共最多11，或最多12，或最多13，或最多14个氨基酸修饰。例如，保守的或非-保守的取代，加成或缺失可在任何位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29进行。

1型胰高血糖素相关肽的示例性修饰包括但不限于：

(a)非-保守的取代、保守的取代、加成或缺失，同时保留至少部分胰高血糖素激动剂活性，例如，在2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29的一个或多个位置的保守的取代，在位置10用val或phe取代tyr，在位置12用arg取代lys，用ala取代这些位置的一个或多个；

(b)缺失位置29和/或28，和任选的位置27的氨基酸，同时保留至少部分胰高血糖素激动剂活性；

(c)修饰在位置15的天冬氨酸，例如，通过用谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或高半胱氨酸取代，这可减少降解；或修饰在位置16的丝氨酸，例如，通过苏氨酸、aib、谷氨酸的取代或用另一个具有4个原子长度的侧链的带负电荷氨基酸，或可供选择地用任何一个谷氨酰胺、高谷氨酸，或高半胱氨酸取代，这同样可减少由于asp15-ser16键的裂解引起的降解；

(d)如在位置16、17、20、21、24、29、40或在c-末端氨基酸添加亲水部分，例如如本文描述的水溶性聚合物聚乙二醇，这可增加稳定性和/或半衰期；

(e)修饰在位置27的甲硫氨酸，例如，通过用亮氨酸或正亮氨酸取代，以减少氧化性降解；

(f)在位置20或24修饰gln，例如通过用ser、thr、ala或aib取代，以减少通过gln的脱酰胺作用发生的降解

(g)修饰在位置21的asp，例如通过用glu取代，以减少通过asp的脱水以形成环状琥珀酰亚胺中间体，接着异构化为异-天冬氨酸而发生的降解；

(h)如本文描述的在位置1或2修饰，这改进对dpp-iv裂解的抗性，任选地与在位置“i”和“i+4”之间的分子内桥如内酰胺桥组合，其中i是从12-25，例如，12、16、20、24的整数；

(i)如本文描述的酰化或烷基化胰高血糖素相关肽，这可增加在胰高血糖素受体和/或glp-1受体的活性，增加在循环中的半衰期和/或延长作用的持续时间和/或延迟作用的起效，任选地与添加亲水部分组合，另外地或可供选择地，任选地与选择性地减少在glp-1肽的活性的修饰组合，例如，在位置7的thr的修饰，如用缺乏羟基的氨基酸，例如，abu或ile取代在位置7的thr；缺失氨基酸c-末端至在位置27的氨基酸(例如，缺失在位置28和29的一个或两个氨基酸，产生长度27或28个氨基酸的肽)；

(j)如本文描述的c-末端延伸；

(k)如本文描述的同源二聚或异源二聚体；和

(a)至(k)的组合。

在一些实施方案中，1型胰高血糖素相关肽的示例性修饰包括至少一个选自组a的氨基酸修饰和一个或多个选自组b和/或组c的氨基酸修饰，其中组a是：

用荷电的氨基酸取代位置28的asn；

用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸，和高半胱氨酸的荷电氨基酸取代位置28的asn；

在位置28用asn、asp或glu取代；

在位置28用asp取代；

在位置28用glu取代；

用荷电的氨基酸取代位置29的thr；

用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸，和高半胱氨酸的荷电的氨基酸取代位置29的thr；

在位置29用asp、glu或lys取代；

在位置29用glu取代；

在位置29后面插入1-3个荷电的氨基酸；

在位置29后面插入glu或lys；

在位置29之后插入gly-lys或lys-lys；

或其组合；

其中组b是：

用glu取代在位置15的asp；

用thr或aib取代在位置16的ser；

和其中组c是：

用非-天然氨基酸取代位置1的his，所述非-天然氨基酸降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，

用非-天然氨基酸取代位置2的ser，所述非-天然氨基酸降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，

用arg取代位置12的lys；

用ser、thr、ala或aib取代位置20的gln；

用glu取代位置21的asp；

用ser、thr、ala或aib取代位置24的gln；

用leu或nle取代位置27的met；

缺失在位置27-29的氨基酸；

缺失在位置28-29的氨基酸；

缺失在位置29的氨基酸；

或其组合。

在示例性实施方案中，在位置12的lys用arg取代。在其它示例性实施方案中，在位置29和/或28，和任选地在位置27的氨基酸缺失。

在一些特定实施方案中，胰高血糖素相关肽包含(a)在位置1和/或2赋予dpp-iv抗性的氨基酸修饰，例如，用dmia在位置1，或aib在位置2取代，(b)在位置12-29内，例如在位置16和20的分子内桥，或在位置16、20、21，和24的氨基酸用α,α二取代的氨基酸的一个或多个取代，任选地(c)连接于亲水部分例如peg，例如，通过cys在位置24、29或在c-末端氨基酸，任选地(d)用例如nle取代met的在位置27的氨基酸修饰，任选地(e)在位置20、21和24减少降解的氨基酸修饰，和任选地(f)连接于seqidno:820。在某些实施方案中，当胰高血糖素相关肽连接于seqidno:820时，在位置29的氨基酸是thr或gly。在其它特定实施方案中，胰高血糖素相关肽包含(a)asp28glu29，或glu28glu29，或glu29glu30，或glu28glu30或asp28glu30，和任选地(b)用例如thr或aib取代ser的在位置16的氨基酸修饰，和任选地(c)用例如nle取代met的在位置27的氨基酸修饰，和任选地(d)在位置20、21和24减少降解的氨基酸修饰。在特定实施方案中，胰高血糖素相关肽是t16、a20、e21、a24、nle27、d28、e29。

在一些实施方案中，1型胰高血糖素相关肽包含氨基酸序列：

x1-x2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-z(seqidno:839)，另外具有1-3个氨基酸修饰，

其中x1和/或x2是一种减少胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性(或增加胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv裂解的抗性)的非-天然氨基酸，其中z选自-cooh(天然存在的c-末端羧酸酯)、-asn-cooh、asn-thr-cooh，和y-cooh，其中y是1-2个氨基酸，和其中分子内桥，优选地共价键，连接在位置i的氨基酸和在位置i+4的氨基酸的侧链，其中i是12、16、20或24。

在一些实施方案中，分子内桥是内酰胺桥。在某些实施方案中，在seqidno:839的位置i和i+4的氨基酸是lys和glu，例如，glu16和lys20。在某些实施方案中，x1选自：d-his、n-甲基-his、α-甲基-his、咪唑乙酸、脱-氨基-his、羟基-his、乙酰基-his、同型-his，和α,α-二甲基咪唑乙酸(dmia)。在其它实施方案中，x2选自：d-ser、d-ala、gly、n-甲基-ser、val，和α,氨基异丁酸(aib)。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽在任何氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40、在c-末端延伸内，或在c-末端氨基酸共价连接于亲水部分。在示例性实施方案中，这种亲水部分在任何这些位置共价连接于lys、cys、orn、高半胱氨酸，或乙酰基-苯丙氨酸残基。示例性亲水部分包括，例如，约1,000道尔顿-约40,000道尔顿，或约20,000道尔顿-约40,000道尔顿的分子量的聚乙二醇(peg)。

在其它实施方案中，i型胰高血糖素相关肽包含氨基酸序列：x1-x2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-z(seqidno:839)，其中x1和/或x2是一种减少胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性(或增加胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的抗性)的非-天然氨基酸，其中胰高血糖素相关肽的位置16、20、21，和24的1、2、3、4或更多个位置用α,α-二取代的氨基酸取代，和其中z选自-cooh(天然存在的c-末端羧酸酯)、-asn-cooh、asn-thr-cooh，和y-cooh，其中y是1-2个氨基酸。

对前述1型胰高血糖素相关肽或类似物的其它示例性氨基酸修饰包括用缺乏羟基的氨基酸，例如，氨基丁酸(abu)、ile在位置7取代thr，任选地，与包含共价(任选地,通过间隔区)连接于酰基或烷基的侧链的氨基酸取代或添加组合，所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸是非-天然的，用arg取代位置12的lys；用glu取代位置15的asp；用thr或aib取代位置16的ser；用ser、thr、ala或aib取代位置20的gln；用glu取代位置21的asp；用ser、thr、ala或aib取代位置24的gln；用leu或nle取代位置27的met；用荷电的氨基酸取代位置28的asn；用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸，和高半胱氨酸的荷电氨基酸取代位置28的asn；用asn、asp或glu在位置28取代；用asp在位置28取代；用glu在位置28取代；用荷电的氨基酸取代位置29的thr；用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸，和高半胱氨酸的荷电的氨基酸取代位置29的thr；在位置29用asp、glu或lys取代；在位置29用glu取代；在位置29后面插入1-3个荷电的氨基酸；在位置30(即，在位置29之后)插入glu或lys；任选地在位置31插入lys；添加seqidno:820至c-末端，任选地，其中在位置29的氨基酸是thr或gly；共价连接于亲水部分的氨基酸取代或添加；或其组合。

以上提及的增加胰高血糖素受体活性，保留部分胰高血糖素受体活性，改进稳定性，增加稳定性，或减少降解的1型胰高血糖素激动剂所描述的任何修饰可单独地或组合应用于1型胰高血糖素相关肽。

1型胰高血糖素相关肽的实施方案的实例

依据一些实施方案，seqidno:801的天然胰高血糖素肽通过用带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代在位置28和/或29的天然氨基酸和任选地添加带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)至肽的羧基末端来修饰。在备选的天然实施方案中，seqidno:801的天然胰高血糖素肽通过用带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代在位置29的天然氨基酸和任选地添加一个或两个带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)在肽的羧基末端上来修饰。依据一些实施方案，提供具有改进的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物，其中类似物包含seqidno:834的氨基酸序列，前提是至少一个在位置28，或29的氨基酸用酸性氨基酸取代和/或另外的酸性氨基酸被添加到seqidno:834的羧基末端。在某些实施方案中，酸性氨基酸独立地选自asp、glu、半胱氨酸和高半胱氨酸。

依据一些实施方案，提供具有改进溶解性和稳定性的胰高血糖素激动剂，其中激动剂包含seqidno:833的氨基酸序列，其中在位置27、28或29的至少一个氨基酸用非-天然氨基酸残基取代(即存在于类似物的位置27、28或29的至少一个氨基酸是不同于存在于seqidno:801的对应位置的氨基酸的酸性氨基酸)。依据一些实施方案，提供包含序列seqidno:833的胰高血糖素激动剂，前提是当在位置28的氨基酸是天冬酰胺和在位置29的氨基酸是苏氨酸时，所述肽还包含1-2个加入到胰高血糖素相关肽的羧基末端的独立地选自lys、arg、his、asp或glu的氨基酸。依据一些实施方案，存在于天然肽的位置27的甲硫氨酸残基被改变为亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。

在一些实施方案中，提供seqidno:833的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24的1-6个氨基酸不同于seqidno:801的对应的氨基酸。依据另一个实施方案，提供seqidno:833的胰高血糖素类似物，其中1-3个选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24的氨基酸不同于seqidno:801的对应的氨基酸。在另一个实施方案中，提供seqidno:807、seqidno:808或seqidno:834的胰高血糖素类似物，其中1-2个选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24的氨基酸不同于seqidno:801的对应的氨基酸，和在进一步的实施方案中，那些1-2个不同的氨基酸表示相对存在于天然序列(seqidno:801)中的氨基酸的保守的氨基酸取代。在某些实施方案中，提供seqidno:811或seqidno:813的胰高血糖素相关肽，其中胰高血糖素相关肽还包含选自位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27或29的位置的1、2或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、27或29的取代是保守的氨基酸取代。

在一些实施方案中，提供包含seqidno:801的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中类似物通过具有不同于位置2的丝氨酸的氨基酸和通过具有取代位置28或29的天然氨基酸的酸性氨基酸或将酸性氨基酸加入到seqidno:801的肽羧基末端，而不同于seqidno:801。在某些实施方案中，酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施方案中，提供seqidno:809、seqidno:812,seqidno:813或seqidno:832的胰高血糖素类似物，其中类似物通过在位置2的取代而不同于母体分子。更特别地，类似物肽的位置2用选自d-丝氨酸、丙氨酸、d-丙氨酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。

在另一个实施方案中，提供包含seqidno:801的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中类似物通过具有在位置1的并非组氨酸的氨基酸和通过具有取代位置28或29的天然氨基酸的酸性氨基酸或将酸性氨基酸添加到seqidno:801的肽的羧基末端而不同于seqidno:801。在某些实施方案中，酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施方案中，提供seqidno:809、seqidno:812,seqidno:813或seqidno:832的胰高血糖素类似物，其中类似物通过在位置1的取代而不同于母体分子。更特别地，类似物肽的位置1用选自dmia、d-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和同型-组氨酸的氨基酸取代。

依据一些实施方案，修饰的胰高血糖素相关肽包含选自seqidno:809、seqidno:812、seqidno:813和seqidno:832的序列。在进一步的实施方案中，提供包含序列seqidno:809、seqidno:812、seqidno:813或seqidno:832的胰高血糖素相关肽，所述序列还包含1-2个加入到seqidno:809、seqidno:812、seqidno:813或seqidno:832的c-末端的氨基酸，其中另外的氨基酸独立地为选自lys、arg、his、aspglu、半胱氨酸或高半胱氨酸。在某些实施方案中，加入到羧基末端的另外的氨基酸选自lys、arg、his、asp或glu或在进一步的实施方案中，另外的氨基酸是asp或glu。

在另一个实施方案中，胰高血糖素相关肽包含seqidno:7或其胰高血糖素激动剂类似物的序列。在一些实施方案中，肽包含选自seqidno:808、seqidno:810、seqidno:811、seqidno:812和seqidno:813的序列。在另一个实施方案中，肽包含选自seqidno:808、seqidno:810和seqidno:811的序列。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽包含seqidno:808、seqidno:810和seqidno:811的序列，所述序列还包含另外的加入到胰高血糖素相关肽的c-末端的选自asp和glu的氨基酸。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽包含seqidno:811或seqidno:813的序列，和在进一步的实施方案中，胰高血糖素相关肽包含序列seqidno:811。

依据一些实施方案，提供包含修饰的胰高血糖素相关肽的胰高血糖素激动剂，所述胰高血糖素相关肽选自：

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-xaa-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-xaa-xaa-xaa-r(seqidno:834)，nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-asp-thr-r(seqidno:811)和nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-xaa-tyr-leu-glu-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-asp-thr-r(seqidno:813)，

其中在位置15的xaa是asp、glu、半胱氨酸、高谷氨酸或高半胱氨酸，在位置28的xaa是asn或酸性氨基酸和在位置29的xaa是thr或酸性氨基酸和r是酸性氨基酸、cooh或conh2，前提是酸性酸残基存在于位置28、29或30之一。在某些实施方案中，r是cooh，和在另一个实施方案中，r是conh2。

本公开也涵盖胰高血糖素融合肽，其中第二肽已融合于胰高血糖素相关肽的c-末端，以提高胰高血糖素相关肽的溶解性和稳定性。更特别地，融合胰高血糖素相关肽可包含含有以下胰高血糖素相关肽的胰高血糖素激动剂类似物：nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-xaa-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-xaa-xaa-xaa-r(seqidno:834)，其中r是酸性氨基酸或键和连接于胰高血糖素相关肽的羧基末端氨基酸的seqidno:820(gpssgappps)、seqidno:821(krnrnnia)或seqidno:822(krnr)的氨基酸序列。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽选自seqidno:833、seqidno:807或seqidno:808，其还包含连接于胰高血糖素相关肽的羧基末端氨基酸的seqidno:820(gpssgappps)、seqidno:821(krnrnnia)或seqidno:822(krnr)的氨基酸序列。在某些实施方案中，胰高血糖素融合肽包含seqidno:802、seqidno:803、seqidno:804、seqidno:805和seqidno:806或其胰高血糖素激动剂类似物，其还包含连接于胰高血糖素相关肽的氨基酸29的seqidno:820(gpssgappps)、seqidno:821(krnrnnia)或seqidno:822(krnr)的氨基酸序列。依据一些实施方案，融合肽还包含在位置16、17、21、24、29、在c-末端延伸内，或在c-末端氨基酸连接于氨基酸的peg链，其中peg链选自500-40,000道尔顿的范围。在某些实施方案中，seqidno:820(gpssgappps)、seqidno:821(krnrnnia)或seqidno:822(krnr)的氨基酸序列通过肽键结合于胰高血糖素相关肽的氨基酸29。在某些实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素相关肽部分包含选自seqidno:810、seqidno:811和seqidno:813的序列。在某些实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素相关肽部分包含seqidno:811或seqidno:813的序列，其中peg链分别在位置21、24、29、在c-末端延伸内或在c-末端氨基酸被连接。

在另一个实施方案中，融合肽的胰高血糖素相关肽序列包含seqidno:811的序列，其还包含连接于胰高血糖素相关肽的氨基酸29的seqidno:820(gpssgappps)、seqidno:821(krnrnnia)或seqidno:822(krnr)的氨基酸序列。在某些实施方案中，胰高血糖素融合肽包含选自seqidno:824、seqidno:825和seqidno:826的序列。典型地，本发明的融合肽将具有带标准羧酸基团的c-末端氨基酸。然而，那些序列的类似物(其中c-末端氨基酸具有取代羧酸的酰胺)也作为实施方案被涵盖在内。依据一些实施方案，融合胰高血糖素相关肽包含选自seqidno:810、seqidno:811和seqidno:813的胰高血糖素激动剂类似物，其还包含连接于胰高血糖素相关肽的氨基酸29的seqidno:823(gpssgappps-conh2)的氨基酸序列。

本发明的胰高血糖素激动剂可被进一步地修饰，以改进肽在水性溶液中的溶解性和稳定性，同时保留胰高血糖素相关肽的生物学活性。依据一些实施方案，在一个或多个选自seqidno:811的肽的位置16、17、20、21、24和29的位置引入亲水基团，或其胰高血糖素激动剂类似物，以改进ph稳定的胰高血糖素类似物的溶解性和稳定性。更特别地，在一些实施方案中，seqidno:810、seqidno:811、seqidno:813，或seqidno:832的胰高血糖素相关肽被修饰以包含一个或多个共价连接存在于胰高血糖素相关肽的位置21和24的氨基酸侧链的亲水基团。

依据一些实施方案，seqidno:811的胰高血糖素相关肽被修饰以含有在位置16、17、20、21、24和/或29的一个或多个氨基酸取代，其中天然氨基酸用具有适合于与亲水部分(包括例如，peg)交联的侧链的氨基酸取代。天然肽可用天然存在的氨基酸或合成(非-天然存在的)氨基酸取代。合成或非-天然存在的氨基酸指天然不出现在体内，但却可结合到本文描述的肽结构中的氨基酸。

在一些实施方案中，提供seqidno:810、seqidno:811或seqidno:813的胰高血糖素激动剂，其中天然胰高血糖素肽序列已被修饰为在位置16、17、21、24、29、在天然序列的c-末端延伸内或在c-末端氨基酸的至少一个位置含有天然存在的或合成的氨基酸，其中氨基酸替代还包含亲水部分。在某些实施方案中，取代在位置21或24，和在进一步的实施方案中，亲水部分是peg链。在某些实施方案中，seqidno:811的胰高血糖素相关肽用至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链用硫醇反应性试剂，包括例如，马来酰亚胺基、乙烯基砜、2-吡啶基硫基、卤代烷基，和卤代酰基进一步修饰。这些硫醇反应性试剂可包含羧基、酮基、羟基，和醚基以及其它亲水部分如聚乙二醇单位。在备选的实施方案中，天然胰高血糖素肽用赖氨酸取代，和取代赖氨酸残基的侧链使用胺反应性试剂例如亲水部分(如聚乙二醇)的羧酸或醛的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)进一步修饰。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽选自seqidno:814、seqidno:815、seqidno:816、seqidno:817、seqidno:818和seqidno:819。

依据一些实施方案，聚乙二醇化的胰高血糖素相关肽包含两个或更多个共价连接于胰高血糖素相关肽的聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000-约5,000道尔顿。在某些实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含seqidno:806的肽，其中peg链共价连接于位置21和位置24的氨基酸残基，和其中两个peg链的合并的分子量为约1,000-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含seqidno:806的肽，其中peg链共价连接于位置21和位置24的氨基酸残基，和其中两个peg链的合并的分子量为约5,000-约20,000道尔顿。

聚乙二醇链可以呈直链的形式或其可以是分支的。依据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自范围约500-约40,000道尔顿的平均分子量。在某些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约500-约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有约20,000-约40,000道尔顿的分子量。

上述任何胰高血糖素相关肽可被进一步修饰以包括在胰高血糖素相关肽的c-末端部分(氨基酸位置12-29)内的共价或非-共价分子内桥或α螺旋-稳定氨基酸。依据一些实施方案，胰高血糖素相关肽包含以上讨论的任何一个或多个修饰，除了用α,α-二取代的氨基酸(例如，aib)在位置16、20、21，或24(或其组合)的氨基酸取代外。依据另一个实施方案，除了分子内桥外，胰高血糖素相关肽还包含以上讨论的任何一个或多个修饰，例如，在胰高血糖素相关肽的位置16和20的氨基酸侧链之间的内酰胺。

依据一些实施方案，胰高血糖素相关肽包含氨基酸序列seqidno:877，其中在位置3的xaa是包含结构i、ii，或iii的侧链的氨基酸：

结构i

结构ii

结构iii

其中r¹是c0-3烷基或c0-3杂烷基；r²是nhr⁴或c1-3烷基；r³是c1-3烷基；r⁴是h或c1-3烷基；x是nh、o，或s；和y是nhr⁴、sr³或or³。在某些实施方案中，x是nh或y是nhr⁴。在某些实施方案中，r¹是c0-2烷基或c1杂烷基。在某些实施方案中，r²是nhr⁴或c1烷基。在某些实施方案中，r⁴是h或c¹烷基。在示例性实施方案中，提供包含结构i的侧链的氨基酸，其中，r¹是ch2-s，x是nh，和r²是ch3(乙酰氨基甲基-半胱氨酸、c(acm))；r¹是ch2，x是nh，和r²是ch3(乙酰基二氨基丁酸、dab(ac))；r¹是c0烷基，x是nh，r²是nhr⁴，和r⁴是h(氨基甲酰基二氨基丙酸、dap(脲))；或r¹是ch2-ch2，x是nh，和r²是ch3(乙酰基鸟氨酸、orn(ac))。在示例性实施方案中，提供包含结构ii的侧链的氨基酸，其中r¹是ch2，y是nhr⁴，和r⁴是ch3(甲基谷氨酰胺,q(me))；在示例性实施方案中，提供包含结构iii的侧链氨基酸，其中，r¹是ch2和r⁴是h(甲硫氨酸-亚砜，m(o))；在特定实施方案中，在位置3的氨基酸用dab(ac)取代。例如，胰高血糖素激动剂可包含seqidno:863、seqidno:869、seqidno:871、seqidno:872、seqidno:873和seqidno:874的氨基酸序列。

在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽是seqidno:877的胰高血糖素相关肽的类似物。在特定方面，类似物包含本文描述的任何氨基酸修饰，包括，但不限于：用荷电的氨基酸取代位置28的asn；用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸，和高半胱氨酸的荷电氨基酸取代位置28的asn；在位置28用asn、asp或glu取代；在位置28用asp取代；在位置28用glu取代；用荷电的氨基酸取代位置29的thr；用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸，和高半胱氨酸荷电的氨基酸取代位置29的thr；在位置29用asp、glu或lys取代；在位置29用glu取代；在位置29后面插入1-3个荷电的氨基酸；在位置29后面插入glu或lys；在位置29之后插入gly-lys或lys-lys；和其组合。

在某些实施方案中，seqidno:877的胰高血糖素相关肽的类似物包含在1、2、3，或所有位置16、20、21和24的α,α-二取代的氨基酸，如aib。在某些实施方案中，seqidno:877的胰高血糖素相关肽的类似物包含以下的一个或多个：用非-天然氨基酸取代位置1的his，其降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，用非-天然氨基酸取代位置2的ser，其降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，用缺乏羟基的氨基酸(例如，abu或ile)取代在位置7的thr；用phe或val取代位置10的tyr；用arg取代位置12的lys；用glu取代在位置15的asp，用thr或aib取代在位置16的ser；用ala或aib取代位置20的gln；用glu取代位置21的asp；用ala或aib取代位置24的gln；用leu或nle取代位置27的met；在位置27-29缺失氨基酸；在位置28-29缺失氨基酸；在位置29缺失氨基酸；添加seqidno:820的氨基酸序列至c-末端，其中在位置29的氨基酸是thr或gly，或其组合。

依据特异性实施方案，胰高血糖素相关肽包含seqidnos:862-867和869-874的任何一个的氨基酸序列。在某些实施方案中，包含seqidno:877的胰高血糖素相关肽的类似物包含亲水部分，例如，peg，共价连接于16、17、20、21、24和29的任何位置或在c-末端氨基酸的氨基酸。

在某些实施方案中，包含seqidno:877的胰高血糖素相关肽的类似物包含含有任选地通过间隔区共价连接于酰基或烷基的侧链的氨基酸，所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸而言是非-天然的。在一些实施方案中，酰基是c4-c30脂肪酰基。在其它实施方案中，烷基是c4-c30烷基。在特定方面，酰基或烷基共价连接于位置10的氨基酸侧链。在某些实施方案中，在位置7的氨基酸是ile或abu。

胰高血糖素激动剂可以是包含seqidnos:801-919的任何氨基酸序列的肽，任选地具有保留胰高血糖素激动剂活性的最多1、2、3、4，或5个另外的修饰。在某些实施方案中，胰高血糖素激动剂包含seqidnos:859-919的任何氨基酸。

2型胰高血糖素相关肽

在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽是2型胰高血糖素相关肽，其在本文和在国际专利申请号pctus2009/47447(于2009年6月16日提交)、美国临时申请号61/090,448，和美国申请号61/151,349中描述，其内容通过引用以其全部结合到本文中。在以下章节提及的涉及2型胰高血糖素相关肽的生物学序列(seqidnos:1001-1262)对应于国际专利申请号pctus2009/47447中的seqidnos:1-262。

活性

天然胰高血糖素不激活gip受体，且通常在glp-1受体具有天然-glp-1的约1%活性。本文描述的天然胰高血糖素序列的修饰产生2型胰高血糖素相关肽，其可显示相当于或优于天然胰高血糖素(seqidno:1001)的活性的有效胰高血糖素活性，相当于或优于天然gip(seqidno:1004)的活性的有效gip活性，和/或相当于或优于天然glp-1的活性的有效glp-1活性。在这点上，2型胰高血糖素相关肽可以是胰高血糖素/gip共激动剂、胰高血糖素/gip/glp-1三重-激动剂、gip/glp-1共激动剂，或gip激动剂胰高血糖素相关肽中的一种，如本文进一步描述的。

在一些实施方案中，本文描述的2型胰高血糖素相关肽显示对于gip受体激活活性约100nm或更少，或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nm或更少的ec50。在一些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽显示对于胰高血糖素受体激活约100nm或更少，或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nm或更少的ec50。在一些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽显示对于glp-1受体激活约100nm或更少，或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nm或更少的ec50。受体激活可通过测定在过度表达受体的hek293细胞中的camp引入的体外分析法测定，例如如在实施例7中所述，分析hek293细胞与dna编码受体和连接于camp反应元件的荧光素酶基因的共转染。

在一些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽显示在胰高血糖素受体和gip受体二者(“胰高血糖素/gip共激动剂”)的活性。与gip受体比较，这些2型胰高血糖素相关肽已经失去对于胰高血糖素受体的天然胰高血糖素的选择性。在某些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽在gip受体的ec50少于(不同(更高或更低)于)其在胰高血糖素受体的ec50的约50-倍,40-倍,30-倍或20-倍。在某些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽的gip效力少于(不同(更高或更低)于)其胰高血糖素的效力的约500-、450-、400-、350-、300-、250-、200-、150-、100-、75-、50-、25-、20-、15-、10-，或5-倍。在某些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽在gip受体的ec50除以2型胰高血糖素相关肽在胰高血糖素受体的ec50的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10，或5。在某些实施方案中，已例如通过在位置7的氨基酸修饰，缺失c-末端氨基酸至位置27或28的氨基酸，产生27-或28-氨基酸肽，或其组合，显著减少或破坏glp-1活性。

在另一方面，2型胰高血糖素相关肽在胰高血糖素、gip和glp-1受体显示活性(“胰高血糖素/gip/glp-1三重-激动剂”)。与glp-1和gip受体二者比较，这些2型胰高血糖素相关肽已失去天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的选择性。在某些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽在gip受体的ec50少于(不同(更高或更低)于)其各自在胰高血糖素和glp-1受体的ec50的约50-倍,40-倍,30-倍或20-倍。在某些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽的gip效力少于(不同(更高或更低)于)其胰高血糖素和glp-1效力的约500-、450-、400-、350-、300-、250-、200-、150-、100-、75-、50-、25-、20-,15-,10-，或5-倍。在某些实施方案中，该三重-激动剂在gip受体的ec50除以该三重-激动剂在glp-1受体的ec50的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。

在还一个方面，2型胰高血糖素相关肽在glp-1和gip受体显示活性，但其中胰高血糖素活性，已例如通过在位置3的氨基酸修饰被显著减少或破坏(“gip/glp-1共激动剂”)。例如，在该位置用酸性、碱性，或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)的取代减少胰高血糖素活性。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽在gip受体的ec50少于(不同(更高或更低)于)其在glp-1受体的ec50的约50-倍,40-倍,30-倍或20-倍。在某些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽的gip效力少于(不同(更高或更低)于)其glp-1效力的约25-、20-、15-、10-，或5-倍。在某些实施方案中，这些2型胰高血糖素相关肽具有约10%或更少的天然胰高血糖素在胰高血糖素受体的活性，例如约1-10%，或约0.1-10%，或大于约0.1%但少于约10%。在某些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽在gip受体的ec50除以2型胰高血糖素相关肽在glp-1受体的ec50的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10，或5，且不少于1。在某些实施方案中，2型胰高血糖素相关肽的gip效力与2型胰高血糖素相关肽glp-1效力相比的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10，或5，且不少于1。

在进一步的方面，2型胰高血糖素相关肽在gip受体显示活性，其中胰高血糖素和glp-1活性已例如，通过在位置3用glu和位置7用ile的氨基酸修饰而被显著减少或破坏(“gip激动剂胰高血糖素肽”)。在某些实施方案中，这些2型胰高血糖素相关肽具有天然胰高血糖素在胰高血糖素受体的约10%或更少的活性，例如约1-10%，或约0.1-10%，或大于约0.1%、0.5%，或1%但少于约1%、5%，或10%。在某些实施方案中，这些2型胰高血糖素相关肽也具有天然glp-1在glp-1受体的约10%或更少的活性，例如约1-10%，或约0.1-10%，或大于约0.1%,0.5%，或1%，但少于约1%,5%，或10%。

修饰

本文公开的关于2型胰高血糖素相关肽的修饰允许处理胰高血糖素(seqidno:1001)，以创立显示增加的gip活性、胰高血糖素活性，和/或glp-1活性的胰高血糖素相关肽。

影响gip活性的修饰

提高在gip受体的活性通过在位置1的氨基酸修饰提供。例如，用大的、芳族氨基酸，任选的tyr、phe、trp、氨基-phe、硝基-phe、氯代-phe、磺基-phe、4-吡啶基-ala、甲基-tyr，或3-氨基tyr取代位置1的his。在位置1的tyr与在对应于氨基酸12-29区内的α螺旋的稳定化组合提供激活gip受体以及glp-1受体和胰高血糖素受体的2型胰高血糖素相关肽。α螺旋结构可通过例如，形成共价或非-共价分子内桥，或在围绕位置12-29取代和/或插入具有α螺旋-稳定氨基酸(例如，α,α-二取代的氨基酸)的氨基酸来稳定。

提高在gip受体的活性也通过在位置27和/或28，和任选地在位置29的氨基酸修饰来提供，例如，用大的、脂族氨基酸(任选的leu)取代位置27的met，在位置28的asn被一种小的脂族氨基酸(任选的ala)取代，和在位置29的thr被一种小的脂族氨基酸(任选的gly)取代。用lag在位置27-29取代提供在那些位置的相对于天然mnt序列的增加的gip活性。

提高在gip受体的活性也通过在位置12的氨基酸修饰来提供。例如，用大的、脂族非极性氨基酸(任选的ile)在位置12取代。提高在gip受体的活性也通过在位置17和/或18的氨基酸修饰来提供。例如，位置17用极性残基(任选的gln)取代，和位置18被一种小的脂族氨基酸(任选的ala)取代。用qa在位置17和18取代提供在那些位置的相对于天然rr序列的增加的gip活性。

在gip受体的增加的活性通过允许在从12至29的位置的氨基酸侧链之间形成分子内桥的修饰来提供。例如，分子内桥可通过在位置i和i+4的两个氨基酸侧链之间或在位置j和j+3之间，或在位置k和k+7之间的共价键形成。在示例性实施方案中，所述桥在位置12和16、16和20、20和24、24和28，或17和20之间。在其它实施方案中，非-共价相互作用如盐桥可在这些位置带正电荷和带负电荷的氨基酸之间形成。

增加gip受体活性的上述任何修饰可分别或组合应用。增加gip受体活性的修饰的组合一般来说提供比单独采取任何这样的修饰更高的gip活性。

影响胰高血糖素活性的修饰

在一些实施方案中，提高胰高血糖素效力通过在天然胰高血糖素(seqidno:1001)的位置16的氨基酸修饰来提供。通过非限制性实例，这样的提高的效力可通过用谷氨酸或用另一个具有4个原子长度的侧链的带负电荷的氨基酸，或可供选择地用任何一个谷氨酰胺、高谷氨酸、或高半胱氨酸，或具有含有至少一个杂原子(如n、o、s、p)的侧链且侧链长度为约4(或3-5)个原子的荷电氨基酸取代在位置16的天然存在的丝氨酸提供。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽保留其对胰高血糖素受体相对于glp-1受体的原始选择性。

胰高血糖素受体活性可通过在位置3的氨基酸修饰，例如用酸性、碱性，或疏水性氨基酸取代位置3的天然存在的谷氨酰胺而减少。例如在位置3用谷氨酸、鸟氨酸，或正亮氨酸取代基本上减少或破坏胰高血糖素受体活性。

维持或提高在胰高血糖素受体的活性可通过在位置3用谷氨酰胺类似物修饰gln而实现，如本文所述。例如，胰高血糖素激动剂可包含seqidnos:1243-1248、1250、1251，和1253-1256的任何一个的氨基酸序列。

通过在位置1和2的氨基酸修饰已经减少的胰高血糖素活性的恢复通过稳定胰高血糖素相关肽或其类似物的c-末端部分(氨基酸12-29)的α螺旋结构的修饰来提供。例如，分子内桥可通过在位置i和i+4的两个氨基酸侧链之间或在位置j和j+3之间，或在位置k和k+7之间的共价键形成。在其它实施方案中，非-共价相互作用如盐桥可在这些位置带正电荷和带负电荷的氨基酸之间形成。在另外的其它实施方案中，一个或多个α,α-二取代的氨基酸被插入或取代到在保留所需活性的位置的这个c-末端部分(氨基酸12-29)中。例如，1、2、3或所有位置16、20、21或24被α,α-二取代的氨基酸，例如，aib取代。

影响glp-1活性的修饰

提高在glp-1受体的活性通过用电荷-中性基团，如酰胺或酯置换c-末端氨基酸的羧酸提供。

提高在glp-1受体的活性也通过稳定在胰高血糖素的c-末端部分(围绕氨基酸12-29)的α-螺旋结构来提供，例如，通过在两个氨基酸的侧链之间形成分子内桥，或用α螺旋-稳定的氨基酸(例如，α,α-二取代的氨基酸)取代和/或插入围绕位置12-29的氨基酸，如本文进一步描述的。在示例性实施方案中，氨基酸对12和16、13和17、16和20、17和21、20和24或24和28(氨基酸对，其中i=12、16、20或24)的侧链彼此连接和因此稳定胰高血糖素α螺旋。在某些实施方案中，桥或接头的长度为约8(或约7-9)个原子，特别是当桥在位置i和i+4之间时。在某些实施方案中，桥或接头的长度为约6(或约5-7)个原子，特别是当桥在位置j和j+3之间时。

在一些实施方案中，分子内桥通过(a)用谷氨酸或用另一个具有4个原子长度的侧链的带负电荷的氨基酸，或可供选择地用任何一个谷氨酰胺、高谷氨酸，或高半胱氨酸，或具有含有至少一个杂原子(如n、o、s、p)的侧链且侧链长度为约4(或3-5)个原子的荷电氨基酸取代位置16天然存在的丝氨酸，和(b)用另一个具有或者荷电的或者具有氢-键的能力，且至少约5(或约4-6)个原子长度的侧链的亲水氨基酸，例如，赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸，或鸟氨酸取代位置20的天然存在的谷氨酰胺形成。在位置16和20的这样的氨基酸侧链可形成盐桥或可被共价连接。在某些实施方案中，两个氨基酸彼此结合以形成内酰胺环。

在一些实施方案中，在胰高血糖素相关肽的c-末端部分的α螺旋结构的稳定通过并非内酰胺桥的分子内桥形成而实现。例如，合适的共价结合方法包括烯烃复分解反应，羊毛硫氨酸(lanthionine)-基环化、二硫化物桥或修饰的含硫桥形成中的任何一个或多个，使用α,ω-二氨基烷烃系链(tethers)，形成金属-原子桥，和采用肽环化的其它方式以稳定α螺旋。

在另外的其它实施方案中，一个或多个α,α-二取代的氨基酸被插入或取代到保留所需活性的位置的这个c-末端部分(氨基酸12-29)。例如，1、2、3或所有位置16、20、21或24用α,α-二取代的氨基酸，例如，aib取代。增加的在glp-1受体的活性通过如本文描述的在位置20的氨基酸修饰来提供。增加的在glp-1受体的活性也通过添加gpssgappps(seqidno:1095)或xgpssgappps(seqidno:1096)至c-末端提供。通过修饰在位置18、28或29，或在位置18和29的氨基酸，可进一步增加在这样的类似物中的glp-1活性，如本文描述的。glp-1效力的进一步的适度增加通过将位置10的氨基酸修饰为大的、芳族氨基酸残基(任选trp)提供。在glp-1受体的效力可用丙氨酸取代位置18的天然精氨酸而进一步提高。

减少在glp-1受体的活性例如，通过如本文描述的在位置7的氨基酸修饰来提供。

提及增加glp-1受体活性的2型胰高血糖素相关肽的上述任何修饰可分别或组合应用。增加glp-1受体活性的修饰的组合一般来说提供比单独采取任何这样的修饰更高的glp-1活性。例如，本发明提供包含在位置16、在位置20，和在c-末端羧酸基团的修饰，任选地具有在位置16和20的氨基酸之间的共价键的胰高血糖素相关肽；包含在位置16和在c-末端羧酸基团的修饰的胰高血糖素相关肽；包含在位置16和20的修饰,任选地具有在位置16和20的氨基酸之间的共价键的胰高血糖素相关肽；和包含在位置20和在c-末端羧酸基团的修饰的胰高血糖素相关肽。

改进dpp-iv抗性的修饰

在位置1和/或2的修饰可增加肽对二肽基肽酶iv(dppiv)裂解的抗性。例如，位置1和/或位置2可用如本文描述的dpp-iv抗性氨基酸取代。在某些实施方案中，在位置2的氨基酸用n-甲基丙氨酸取代。

已观察到在位置2(如aib在位置2)的修饰和在一些情况下在位置1的修饰(例如，在位置1的dmia)可减少胰高血糖素活性，有时是显著的；令人惊讶地，胰高血糖素活性的这种减少可通过稳定胰高血糖素的c-末端部分(围绕氨基酸12-29)中的α-螺旋结构，例如，通过形成如本文描述的两个氨基酸的侧链之间的共价键而恢复。在某些实施方案中，共价键在位置“i”和“i+4”，或位置“j”和“j+3”的氨基酸之间，例如，在位置12和16、16和20、20和24、24和28，或17和20之间。在示例性实施方案中，这种共价键是在位置16的谷氨酸和位置20的赖氨酸之间的内酰胺桥。在某些实施方案中，这种共价键是并非内酰胺桥的分子内桥，如本文描述的。

减少降解的修饰

在更进一步的示例性实施方案中，任何2型胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以通过修饰在seqidno:1001的位置15和/或16的氨基酸改进稳定性，以减少肽随时间推移，尤其是在酸性或碱性缓冲液中的降解。这样的修饰减少asp15-ser16肽键的裂解。在示例性实施方案中，在位置15的氨基酸修饰是缺失asp或用谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或高半胱氨酸取代asp。在其它示例性实施方案中，在位置16的氨基酸修饰是缺失ser或用thr或aib取代ser。在其它示例性实施方案中，在位置16的ser用谷氨酸或用另一个具有侧链长度为4个原子的带负电荷的氨基酸，或可供选择地用谷氨酰胺、高谷氨酸，或高半胱氨酸的任何一个取代。

在一些实施方案中，存在于天然肽的位置27的甲硫氨酸残基被修饰，例如通过缺失或取代。这样的修饰可防止肽的氧化降解。在某些实施方案中，在位置27的met用亮氨酸、异亮氨酸或正亮氨酸取代。在一些特定实施方案中，在位置27的met用亮氨酸或正亮氨酸取代。

在一些实施方案中，在位置20和/或24的gln例如通过缺失或取代来修饰。这样的修饰可减少通过gln的脱酰胺作用发生的降解。在某些实施方案中，在位置20和/或24的gln用ser、thr、ala或aib取代。在某些实施方案中，在位置20和/或24的gln用lys、arg、orn，或瓜氨酸取代。

在一些实施方案中，在位置21的asp，例如通过缺失或取代来修饰。这样的修饰可减少通过asp的脱水发生的降解，以形成环状琥珀酰亚胺中间体，接着异构化为异-天冬氨酸。在某些实施方案中，位置21用glu、高谷氨酸或高半胱氨酸取代。在一些特定实施方案中，位置21用glu取代。

α螺旋结构的稳定性

2型胰高血糖素相关肽的c-末端部分的α-螺旋结构(围绕氨基酸12-29)的稳定性提供提高的glp-1和/或gip活性并恢复已由在位置1和/或2的氨基酸修饰减少的胰高血糖素活性。可通过例如，形成共价或非-共价分子内桥，或围绕位置12-29用α螺旋-稳定氨基酸(例如，α,α-二取代的氨基酸)取代和/或插入氨基酸，稳定α螺旋结构。gip激动剂的α-螺旋结构的稳定性可如本文所述实现。

示例性实施方案

依据本发明的一些实施方案，具有gip激动剂活性的胰高血糖素(seqidno:1001)的类似物包含具有以下方面的seqidno:1001：(a)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，(b)稳定类似物的c-末端部分的α螺旋结构(氨基酸12-29)的修饰，和(c)任选地，1-10(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个另外的氨基酸修饰。在某些实施方案中，类似物显示本文描述的天然gip在gip受体的至少约1%活性或在gip受体的任何其它活性水平。

在某些实施方案中，稳定α螺旋结构的修饰是提供或引入分子内桥，包括，例如共价分子内桥，如在本文描述的任何那些的修饰。在一些实施方案中，共价分子内桥是内酰胺桥。这些实施方案的类似物的内酰胺桥可以是如本文描述的内酰胺桥。见例如，在章节“α螺旋结构的稳定性”中内酰胺桥的讲述。例如，内酰胺桥可以是在位置i和i+4的氨基酸侧链之间或在位置j和j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i是12、13、16、17、20或24，且其中j是17。在某些实施方案中，内酰胺桥可以在位置16和20的氨基酸之间，其中在位置16和20的氨基酸之一用glu取代和在位置16和20的另一个氨基酸用lys取代。

在可供选择的实施方案中，稳定α螺旋结构的修饰是在类似物的位置16、20、21，和24的1、2、3，或4个α,α-二取代的氨基酸的引入。在一些实施方案中，α,α-二取代的氨基酸是aib。在某些方面，α,α-二取代的氨基酸(例如，aib)是在位置20，而在位置16的氨基酸用带正电荷的氨基酸，例如，本文描述的式iv的氨基酸取代。式iv的氨基酸可以是同型lys、lys、orn，或2,4-二氨基丁酸(dab)。

在本发明的特定方面，在位置1的氨基酸修饰是用缺乏咪唑侧链的氨基酸，如大的、芳族氨基酸(例如，tyr)取代his。

在某些方面，胰高血糖素的类似物包含位置27、28和29的1个、2个或所有位置的氨基酸修饰。例如，在位置27的met可用大的脂族氨基酸(任选的leu)取代，在位置28的asn可用小的脂族氨基酸(任选的ala)取代，在位置29的thr可用小的脂族氨基酸(任选的gly)取代，或前述两种或三种的组合。在特定实施方案中，胰高血糖素的类似物包含在位置27的leu、在位置28的ala，和在位置29的gly或thr。

在本发明的某些实施方案中，胰高血糖素的类似物包含在位置29的氨基酸的c-末端的1-21个氨基酸延伸。所述延伸可例如包含seqidno:1095或1096的氨基酸序列。另外地或可供选择地，胰高血糖素的类似物可包含延伸的1-6个氨基酸是带正电荷的氨基酸的延伸。带正电荷的氨基酸可以是式iv的氨基酸，包括，但不限于lys、同型lys、orn，和dab。

在一些实施方案中，胰高血糖素的类似物如本文所述被酰基化或烷基化。例如，酰基或烷基可在类似物的位置10或40连接于胰高血糖素的类似物(有或无间隔区)，如本文进一步描述的。类似物可另外地或可供选择地被修饰以包含如本文进一步描述的亲水部分。而且，在一些实施方案中，类似物包含以下修饰的任何一种或组合：

(a)用d-ser、ala、d-ala、gly、n-甲基-ser、aib、val，或α-氨基-n-丁酸取代位置2的ser；

(b)用trp、lys、orn、glu、phe，或val取代位置10的tyr：

(c)酰基与在位置10的lys的连接；

(d)用arg或ile取代位置12的lys；

(e)用glu、gln、高谷氨酸、高半胱氨酸、thr、gly，或aib取代位置16的ser；

(f)用gln取代位置17的arg；

(g)用ala、ser、thr，或gly取代位置18的arg；

(h)用ser、thr、ala、lys、瓜氨酸、arg、orn，或aib取代位置20的gln；

(i)用glu、高谷氨酸、高半胱氨酸取代位置21的asp；

(j)用ile取代位置23的val；

(k)用asn、ser、thr、ala，或aib取代位置24的gln；

(l)和在任何位置2、5、9、10、11、12.13、14、15、16、81920、21.24、27、28，和29的保守的取代。

在示例性实施方案中，具有gip激动剂活性的胰高血糖素的类似物(seqidno:1001)包含以下修饰：

(a)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，

(b)在位置i和i+4的氨基酸侧链之间或在位置j和j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i是12、13、16、17、20或24，且其中j是17，

(c)在位置27、28和29的1个、2个或所有位置的氨基酸修饰，例如，在位置27和/或28的氨基酸修饰，和

(d)1-9或1-6个另外的氨基酸修饰，如1、2、3、4、5、6、7、8或9个另外的氨基酸修饰，

和用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少。

这些实施方案的类似物的内酰胺桥可以是如本文描述的内酰胺桥。例如，内酰胺桥可以在位置16和20的氨基酸之间，其中在位置16和20的氨基酸之一用glu取代和在位置16和20的另一个氨基酸用lys取代。依据这些实施方案，类似物可包含，例如，seqidnos:1005-1094的任何氨基酸序列。

在其它示例性实施方案中，具有gip激动剂活性的胰高血糖素的类似物(seqidno:1001)包含以下修饰：

(a)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，

(b)在类似物的位置16、20、21和24的一个、两个、三个，或所有的氨基酸被α,α-二取代的氨基酸取代，

(c)在位置27、28和29的一个、两个，或所有位置的氨基酸修饰，例如，在位置27和/或28的氨基酸修饰，和

(d)1-9或1-6个另外的氨基酸修饰，如1、2、3、4、5、6、7、8或9个另外的氨基酸修饰，

和用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少。

这些实施方案的类似物的α,α-二取代的氨基酸可以是任何α,α-二取代的氨基酸，包括，但不限于，用选自甲基、乙基、丙基，和正丁基的相同或不同基团，或用环辛烷或环庚烷(例如，1-氨基环辛烷-1-羧酸)二取代的氨基异-丁酸(aib)、氨基酸。在某些实施方案中，α,α-二取代的氨基酸是aib。在某些实施方案中，在位置20的氨基酸被α,α-二取代的氨基酸取代，例如，aib。依据这些实施方案，类似物可包含，例如，seqidnos:1099-1141、1144-1164、1166-1169，和1173-1178的任何氨基酸序列。

在还有的其它示例性实施方案中，具有gip激动剂活性的胰高血糖素的类似物(seqidno:1001)包含以下修饰：

(a)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，

(b)在位置16的ser的氨基酸取代用式iv的氨基酸进行：

[式iv],

其中n是1-16，或1-10，或1-7，或1-6，或2-6，r1和r2的每一个独立地选自h、c1-c18烷基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)nh2、(c1-c18烷基)sh、(c0-c4烷基)(c3-c6)环烷基、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7，和(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)，其中r7是h或oh，和式iv的氨基酸侧链包含游离氨基，

(c)用α,α-二取代的氨基酸在位置20的gln的氨基酸取代，

(d)在位置27、28和29的一个、两个，或所有位置的氨基酸修饰，例如，在位置27和/或28的氨基酸修饰，和

(e)1-9或1-6个另外的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9的另外的氨基酸修饰，

和用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少。

这些实施方案的类似物的式iv氨基酸可以是任何氨基酸，例如，式iv的氨基酸，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，或16。在某些实施方案中，n是2、3、4，或5，在这样的情况下，氨基酸分别是dab、orn、lys，或同型lys。

这些实施方案的类似物的α,α-二取代的氨基酸可以是任何α,α-二取代的氨基酸，包括，但不限于用选自甲基、乙基、丙基，和正丁基的相同或不同的基团，或用环辛烷或环庚烷(例如，1-氨基环辛烷-1-羧酸)二取代的氨基异-丁酸(aib)、氨基酸。在某些实施方案中，α,α-二取代的氨基酸是aib。依据这些实施方案，类似物可包含，例如，seqidnos:1099-1165的任何氨基酸序列。

在还有的其它示例性实施方案中，具有gip激动剂活性的胰高血糖素的类似物(seqidno:1001)包含：

(a)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，和

(b)在位置29的氨基酸的c-末端的约1-约21氨基酸延伸，其中该延伸的至少一个氨基酸被酰基化或烷基化，

其中用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少。

在一些实施方案中，酰基化或烷基化氨基酸是式i、ii，或iii的氨基酸。在更特别的实施方案中，式i的氨基酸是dab、orn、lys，或同型lys。同样，在一些实施方案中，约1-约21氨基酸的延伸包含gpssgappps(seqidno:1095)或xgpssgappps(seqidno:1096)的氨基酸序列，其中x是任何氨基酸，或gpssgapppk(seqidno:1170)或xgpssgapppk(seqidno:1171)或xgpssgapppsk(seqidno:1172)，其中x是gly或小的、脂族或非-极性或弱极性氨基酸。在某些实施方案中，约1-约21个氨基酸可包含含有一个或多个相对于seqidno:1095、1096、1170、1171或1172的保守取代的序列。在某些实施方案中，酰基化或烷基化氨基酸位于c-末端-延长的类似物的位置37、38、39、40、41、42，或43。在某些实施方案中，酰基化或烷基化氨基酸位于c-末端-延长的类似物的位置40。

在一些实施方案中，具有gip激动剂活性的类似物还包含位置27、28和29的一个、两个或所有位置的氨基酸修饰，例如，在位置27和/或28的氨基酸修饰。

在任何以上示例性实施方案中，赋予gip激动剂活性的在位置1的氨基酸修饰可以用缺乏咪唑侧链的氨基酸取代his。在位置1的氨基酸修饰可以例如是用大的、芳族氨基酸取代his。在某些实施方案中，大的芳族氨基酸是在本文描述的任何那些，包括，例如tyr。

同样，关于上述示例性实施方案，位置27、28，和29的一个、两个，或所有位置的氨基酸修饰可以是在本文描述的这些位置的任何修饰。例如，在位置27的met可以用大的脂族氨基酸(任选的leu)取代，在位置28的asn可以用小的脂族氨基酸(任选的ala)取代，和/或在位置29的thr可以用小的脂族氨基酸(任选的gly)取代。可供选择地，类似物可包含在位置27和/或28的这样的氨基酸修饰。

以上示例性实施方案的类似物还可包含1-9或1-6个另外的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个另外的氨基酸修饰，例如，本文描述的任何修饰，其增加或降低在gip、glp-1，和胰高血糖素受体的任何一种的活性，改进稳定性，改进作用的持续时间或在循环中的半衰期，延迟作用的起效，或增加稳定性。类似物还可包含，例如，在位置12的氨基酸修饰，任选地用ile取代，和/或在位置17和18的氨基酸修饰，任选地在位置17用q和在位置18用a取代，和/或添加gpssgappps(seqidno:1095)或xgpssgappps(seqidno:1096)，或含有相对于seqidno:1095或1096的一个或多个保守的取代的序列至c-末端。类似物可包含一个或多个以下的修饰：

(i)用d-ser、ala、d-ala、gly、n-甲基-ser、aib、val，或α-氨基-n-丁酸取代位置2的ser；

(ii)用trp、lys、orn、glu、phe，或val取代位置10的tyr；

(iii)酰基至位置10的lys的连键；

(iv)用arg取代位置12的lys；

(v)用glu、gln、高谷氨酸、高半胱氨酸、thr、gly，或aib取代位置16的ser；

(vi)用gln取代位置17的arg；

(vii)用ala、ser、thr，或gly取代位置18的arg；

(viii)用ala、ser、thr、lys、瓜氨酸、arg、orn，或aib取代位置20的gln；

(ix)用glu、高谷氨酸、高半胱氨酸取代位置21的asp；

(x)用ile取代位置23的val；

(xi)用asn、ala、ser、thr，或aib取代的位置24gln；和

(xii)在2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28，和29的任何位置的保守的取代。

在一些实施方案中，类似物包含修饰(i)-(xii)的组合。作为选择或者另外地，类似物可包含在位置3的氨基酸修饰(例如，使用glu的gln氨基酸取代)，其中类似物具有胰高血糖素在胰高血糖素受体的少于1%的活性。作为选择或者另外地，类似物可包含在位置7的氨基酸修饰(例如，用缺乏羟基的氨基酸，例如，abu或ile的thr的氨基酸取代)，其中类似物具有glp-1在glp-1受体的少于约10%的活性。

关于示例性实施方案，类似物可共价连接于亲水部分。在某些实施方案中，类似物共价连接于任何氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40，或c-末端的亲水部分。在某些实施方案中，类似物包含c-末端延伸(例如，seqidno:1095的氨基酸序列)和包含亲水部分的氨基酸的添加，以致亲水部分共价连接于位置40的类似物。

在更进一步的示例性实施方案中，具有gip激动剂活性的胰高血糖素的类似物包含依据seqidnos:1227,1228,1229或1230的任何一个的氨基酸序列，其还包含以下修饰：

(a)任选地，在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，

(b)在位置29的氨基酸的c-末端的约1-约21氨基酸延伸，其中延伸的至少一个氨基酸被酰基化或烷基化，和

(d)最多6个另外的氨基酸修饰，

其中用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少。在一些方面，酰基化或烷基化氨基酸是式i、ii，或iii的氨基酸。在更特别的实施方案中，式i的氨基酸是dab、orn、lys，或同型lys。同样，在一些实施方案中，约1-约21氨基酸包含gpssgappps(seqidno:1095)或xgpssgappps(seqidno:1096)的氨基酸序列，其中x是任何氨基酸，或gpssgapppk(seqidno:1170)或xgpssgapppk(seqidno:1171)或xgpssgapppsk(seqidno:1172)，其中x是gly或小的脂族或非-极性或弱极性氨基酸。在某些实施方案中，约1-约21个氨基酸可包含含有相对于seqidno:1095、1096、1170、1171或1172的一个或多个保守取代的序列。在一些实施方案中，酰基化或烷基化氨基酸位于c-末端-延长的类似物的位置37、38、39、40、41、42，或43。在某些实施方案中，酰基化或烷基化氨基酸位于c-末端延长的类似物的位置40。在任何以上示例性实施方案中，赋予gip激动剂活性的在位置1的氨基酸可以是缺乏咪唑侧链的氨基酸。

以上示例性实施方案的类似物还可包含1-6个另外的氨基酸修饰，例如，本文描述的任何修饰，其增加或降低gip、glp-1，和胰高血糖素受体的任何一个的活性，改进稳定性，改进持续时间作用或在循环中的半衰期，延迟作用的起效，或增加稳定性。

在某些方面，在以上示例性实施方案中描述的胰高血糖素类似物，包含位置27、28和29的一个、两个，或所有位置的另外的氨基酸修饰。在这些位置的修饰可以是本文描述的相对于这些位置的任何修饰。例如，相对于seqidno:1227、1228、1229或1230，位置27可用大的脂族氨基酸(例如，leu、ile或正亮氨酸)或met取代，位置28可用另一个小的脂族氨基酸(例如，gly或ala)或asn取代，和/或位置29可用另一个小的脂族氨基酸(例如，ala或gly)或thr取代。可供选择地，类似物可包含在位置27和/或28的这样的氨基酸修饰。

所述类似物还可包含一个或多个以下的另外的修饰：

(i)在位置2的氨基酸是d-ser、ala、d-ala、gly、n-甲基-ser、aib、val，或α-氨基-n-丁酸的任何一个；

(ii)在位置10的氨基酸是tyr、trp、lys、orn、glu、phe，或val；

(iii)酰基至位置10的lys的连键；

(iv)在位置12的氨基酸是ile、lys或arg；

(v)在位置16的氨基酸是ser、glu、gln、高谷氨酸、高半胱氨酸、thr、gly，或aib的任何一个；

(vi)在位置17的氨基酸是gln或arg；

(vii)在位置18的氨基酸是ala、arg、ser、thr，或gly的任何一个；

(viii)在位置20的氨基酸是ala、ser、thr、lys、瓜氨酸、arg、orn，或aib的任何一个或另一个α,α-二取代的氨基酸；

(ix)在位置21的氨基酸是glu、asp、高谷氨酸、高半胱氨酸的任何一个；

(x)在位置23的氨基酸是val或ile；

(xi)在位置24的氨基酸是gln、asn、ala、ser、thr，或aib的任何一个；和

(xii)在2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28，和29的任何位置的一个或多个保守的取代。

在一些实施方案中，类似物包含修饰(i)-(xii)的组合。作为选择或者另外地，类似物可包含在位置3的氨基酸修饰(例如，用glu的氨基酸取代gln)，其中类似物具有胰高血糖素在胰高血糖素受体的少于1%的活性。作为选择或者另外地，类似物可包含在位置7的氨基酸修饰(例如，用缺乏羟基的氨基酸，例如，abu或ile的氨基酸取代thr)，其中类似物具有glp-1在glp-1受体的少于约10%的活性。

在以上示例性实施方案中，其中类似物包含酰基或烷基，类似物可经由如本文描述的间隔区连接于酰基或烷基。间隔区，例如，可以是3-10个原子的长度并可以是，例如，氨基酸(例如，6-氨基己酸、本文描述的任何氨基酸)、二肽(例如，ala-ala、βala-βala、leu-leu、pro-pro、γglu-γglu)、三肽，或亲水性或疏水性双功能间隔区。在某些方面，间隔区和酰基或烷基的总长度为约14-约28个原子。在某些实施方案中，氨基酸间隔区不是γ-glu。在某些实施方案中，二肽间隔区不是γ-glu-γ-glu。

在一些非常特殊的实施方案中，本发明的类似物包含选自seqidnos:1099-1141、1144-1164、1166、1192-1207、1209-1221和1223或选自seqidnos:1167-1169、1173-1178和1225的氨基酸序列。

在更进一步的示例性实施方案中，具有gip激动剂活性的胰高血糖素的类似物包含酰基或烷基(例如，对于天然存在的氨基酸而言为非-天然的酰基或烷基)，其中酰基或烷基连接于间隔区，其中(i)间隔区连接于类似物的位置10的氨基酸侧链；或(ii)所述类似物包含在位置29的氨基酸的c-末端的1-21氨基酸延伸和间隔区连接于对应于位置37-43之一的氨基酸侧链，其中用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少

在这样的实施方案中，类似物可包含具有以下方面的seqidno:1001的氨基酸序列：(i)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，(ii)位置27、28，和29的一个、两个，或所有位置的氨基酸修饰，(iii)以下的至少一个：

(a)包含在位置i和i+4的氨基酸侧链之间或在位置j和j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥的类似物，其中i是12、13、16、17、20或24，且其中j是17；

(b)在类似物的位置16、20、21和24的一个、两个、三个，或所有的氨基酸用α,α-二取代的氨基酸取代；或

(c)类似物包含(i)用式iv的氨基酸对位置16的ser的氨基酸取代：

[式iv],

其中n是1-7，其中r1和r2的每一个独立地选自h、c1-c18烷基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)nh2、(c1-c18烷基)sh、(c0-c4烷基)(c3-c6)环烷基、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7，和(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)，其中r7是h或oh，和式iv的氨基酸侧链包含游离氨基；和(ii)用α,α-二取代的氨基酸对位置20的gln的氨基酸取代，和(iv)最多6个另外的氨基酸修饰。

这些实施方案的类似物的α,α-二取代的氨基酸可以是任何α,α-二取代的氨基酸，包括，但不限于氨基异-丁酸(aib)、用选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同的基团，或用环辛烷或环庚烷(例如，1-氨基环辛烷-1-羧酸)的二取代的氨基酸。在某些实施方案中，α,α-二取代的氨基酸是aib。

这些实施方案的类似物的式iv的氨基酸可以是任何氨基酸，例如，式iv的氨基酸，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，或16。在某些实施方案中，n是2、3、4，或5，在这样的情况下，氨基酸分别是dab、orn、lys，或同型lys。在任何以上示例性实施方案中，赋予gip激动剂活性的在位置1的氨基酸修饰可以是用缺乏咪唑侧链的氨基酸取代的his。

同样，关于以上示例性实施方案，位置27、28，和29的一个、两个，或所有位置的氨基酸修饰可以是在本文描述的这些位置的任何修饰。例如，在位置27的met可以用大的脂族氨基酸(任选的leu)取代，在位置28的asn可以用小的脂族氨基酸(任选的ala)取代，和/或在位置29的thr可以用小的脂族氨基酸(任选的gly)取代。可供选择地，类似物可包含在位置27和/或28的这样的氨基酸修饰。

所述类似物还可包含，例如，在位置12的氨基酸修饰，任选地用ile取代，和/或在位置17和18的氨基酸修饰，任选地在位置17用q和在位置18用a取代，和/或添加gpssgappps(seqidno:1095)或xgpssgappps(seqidno:1096)，或含有相对于seqidno:1095或1096的一个或多个保守取代的序列至c-末端。类似物可包含一个或多个以下的修饰：

(i)用d-ser、ala、d-ala、gly、n-甲基-ser、aib、val，或α-氨基-n-丁酸取代位置2的ser；

(ii)用trp、lys、orn、glu、phe，或val取代位置10的tyr；

(iii)酰基至位置10的lys的连键；

(iv)用arg取代位置12的lys；

(v)用glu、gln、高谷氨酸、高半胱氨酸、thr、gly、lys，或aib取代位置16的ser；

(vi)用gln取代位置17的arg；

(vii)用ala、ser、thr，或gly取代位置18的arg；

(viii)用ala、ser、thr、lys、瓜氨酸、arg、orn，或aib取代位置20的gln；

(ix)用glu、高谷氨酸、高半胱氨酸取代位置21的asp；

(x)用ile取代位置23的val；

(xi)用asn、ala、ser、thr，或aib取代位置24的gln；和

(xii)在任何位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28，和29的保守的取代。

在一些实施方案中，类似物包含修饰(i)-(xii)的组合。作为选择或者另外地，类似物可包含在位置3的氨基酸修饰(例如，使用glu的氨基酸取代gln)，其中类似物具有胰高血糖素在胰高血糖素受体的少于1%的活性。作为选择或者另外地，类似物可包含在位置7的氨基酸修饰(例如，用缺乏羟基的氨基酸，例如，abu或ile的氨基酸取代thr)，缺失氨基酸c-末端至在位置27或28的氨基酸，产生27-或28-氨基酸肽，或其组合，其中类似物具有glp-1在glp-1受体的少于约10%的活性。

关于示例性实施方案，类似物可共价连接于亲水部分。在某些实施方案中，类似物在任何氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40，或c-末端共价连接于亲水部分。在某些实施方案中，类似物包含c-末端延伸(例如，seqidno:1095的氨基酸序列)和添加包含亲水部分的氨基酸，以致亲水部分在位置40共价连接于类似物。

在一些实施方案中，亲水部分共价连接于类似物的lys、cys、orn、高半胱氨酸，或乙酰基-苯丙氨酸。lys、cys、orn、高半胱氨酸，或乙酰基-苯丙氨酸，对于胰高血糖素序列(seqidno:1001)而言，可以是天然的氨基酸或它可以是替换seqidno:1001的天然氨基酸的氨基酸。在某些实施方案中，其中亲水部分连接于cys，连接亲水部分的键可包含结构

。

至于包含亲水部分的类似物，亲水部分可以是在本文描述的任何那些亲水部分。见例如，在章节“亲水部分的连键”中的讲述。在一些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇(peg)。在某些实施方案中，peg具有约1,000道尔顿-约40,000道尔顿，例如，约20,000道尔顿-约40,000道尔顿的分子量。

在示例性实施方案中，其中类似物包含酰基或烷基，其经由间隔区连接于类似物，间隔区可以是如本文描述的任何间隔区。间隔区，例如，可以是3-10个原子的长度并可以是，例如，氨基酸(例如，6-氨基己酸、本文描述的任何氨基酸)、二肽(例如，ala-ala、βala-βala、leu-leu、pro-pro、γglu-γglu)，三肽，或亲水性或疏水性双功能间隔区。在某些方面，间隔区和酰基或烷基的总长度为约14-约28个原子。在某些实施方案中，氨基酸间隔区不是γ-glu。在某些实施方案中，二肽间隔区不是γ-glu-γ-glu。

酰基或烷基是任何如本文描述的酰基或烷基，例如对于天然存在的氨基酸而言为非-天然的酰基或烷基。在一些实施方案中，酰基或烷基是c4-c30脂肪酰基，例如，c10脂肪酰基或烷基，c12脂肪酰基或烷基，c14脂肪酰基或烷基，c16脂肪酰基或烷基，c18脂肪酰基或烷基，c20酰基或烷基，或c22酰基或烷基，或c4-c30烷基。在特定实施方案中，酰基是c12-c18脂肪酰基(例如，c14或c16脂肪酰基)。

在一些实施方案中，类似物的位置29的氨基酸的c-末端的约1-约21氨基酸延伸包含gpssgappps(seqidno:1095)或xgpssgappps(seqidno:1096)的氨基酸序列，其中x是任何氨基酸，或gpssgapppk(seqidno:1170)或xgpssgapppk(seqidno:1171)或xgpssgapppsk(seqidno:1172)，其中x是gly或小的、脂族或非-极性或弱极性氨基酸。在某些实施方案中，约1-约21个氨基酸可包含含有相对于seqidno:1095、1096、1170、1171或1172的一个或多个保守取代的序列。在一些实施方案中，酰基化或烷基化氨基酸位于c-末端-延长的类似物的位置37、38、39、40、4、42，或43。在某些实施方案中，酰基化或烷基化氨基酸位于c-末端-延长的类似物的位置40。在某些实施方案中，酰基或烷基共价连接于是天然至seqidno:1001、1227、1228、1229或1230的氨基酸或它可连接于取代的氨基酸。在某些实施方案中，酰基或烷基共价连接于对于seqidno:1095、1096、1171或1172而言是天然的氨基酸。

gip激动剂可以是包含任何氨基酸序列，例如，seqidnos:1005-1094的氨基酸序列的肽，任选地具有最多1、2、3、4，或5个另外的保留gip激动剂活性的修饰。在某些实施方案中，gip激动剂包含seqidnos:1099-1262的任何氨基酸。

3型胰高血糖素相关肽

在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽是3型胰高血糖素相关肽，其在本文和在国际专利申请号pct/us2009/47438(于2009年6月16日提交)、国际专利申请公布号wo2008/101017(于2008年8月21日公布)，和美国临时申请号61/090,412和美国申请号61/177,476中描述，其内容通过引用以其全文结合到本文中。

在以下章节提及的涉及3型胰高血糖素相关肽的一些生物序列(seqidnos:89-108,114-128和146-656)对应于国际专利申请号pct/us2009/47438中的seqidnos:89-108、114-128和146-656。

活性

3型胰高血糖素相关肽可以是在胰高血糖素受体显示增加活性的肽，和在进一步的实施方案中，显示提高的生理物理稳定性和/或水性稳定性。此外，在一些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽已失去天然胰高血糖素对胰高血糖素受体(对比glp-1受体)的选择性，并因而代表那两种受体的共激动剂。在3型胰高血糖素相关肽内的经选择的氨基酸修饰可控制肽在glp-1受体对比胰高血糖素受体的相对活性。因此，3型胰高血糖素相关肽可以是在胰高血糖素受体比glp-1受体具有更高活性的胰高血糖素/glp-1共激动剂，一种在两种受体具有大致相等活性的胰高血糖素/glp-1共激动剂，或在glp-1受体比胰高血糖素受体具有更高活性的胰高血糖素/glp-1共激动剂。这后一类共激动剂可被工程改造以在胰高血糖素受体显示很少的甚或没有活性，且还保留与天然glp-1相同或比天然glp-1更好的效力激活glp-1受体的能力。任何这些共激动剂也可包括赋予提高生理物理稳定性和/或水溶性的修饰。

可进行3型胰高血糖素相关肽的修饰以产生具有无论何处在glp-1受体相对于天然glp-1的从至少约1%(包括至少约1.5%、2%、5%、7%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%)至约200%或更高活性和无论何处在胰高血糖素受体相对于天然胰高血糖素的从至少约1%(包括约1.5%、2%、5%、7%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%)至约500%或更高活性的胰高血糖素相关肽。天然胰高血糖素的氨基酸序列是seqidno:701，glp-1(7-36)酰胺的氨基酸序列是seqidno:703，和glp-1(7-37)酸的氨基酸序列是seqidno:704。

3型胰高血糖素相关肽可以是在胰高血糖素受体，或glp-1受体，或二者具有增加或降低的活性的胰高血糖素相关肽。3型胰高血糖素相关肽可以是具有改变的对胰高血糖素受体对比glp-1受体的选择性的胰高血糖素相关肽。如本文公开的，也提供显示改进的溶解性和/或稳定性的高效3型胰高血糖素相关肽。

影响胰高血糖素活性的修饰

在胰高血糖素受体增加的活性通过天然胰高血糖素(seqidno:701)的在位置16的氨基酸修饰提供。在某些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽是已相对于his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-asn-thr(seqidno:701)的野生型肽进行修饰，以提高肽在胰高血糖素受体的效力的胰高血糖素激动剂。通常在天然胰高血糖素(seqidno:701)的位置16存在的丝氨酸可用选择的酸性氨基酸取代，以就其在已验证的体外模型分析(见实施例7)中刺激camp合成的能力而言，提高胰高血糖素的效力。更特别地，这种取代提高类似物在胰高血糖素受体的至少2-倍、4-倍、5-倍，和最多10-倍以上的效力。这种取代也提高类似物相对于天然胰高血糖素在glp-1受体的至少5-倍、10-倍，或15-倍的活性，但维持对胰高血糖素受体超过glp-1受体的选择性。

通过非限制性实例，这样的提高的效力可通过用谷氨酸或用具有侧链长度为4个原子的另一个带负电荷的氨基酸，或可供选择地用任何一个谷氨酰胺、高谷氨酸，或高半胱氨酸，或具有含有至少一个杂原子(如n、o、s、p)的侧链且侧链长度为约4(或3-5)个原子的荷电氨基酸，取代位置16的天然存在的丝氨酸来提供。依据一些实施方案，天然胰高血糖素的在位置16的丝氨酸残基用选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、高半胱氨酸、苏氨酸，或甘氨酸的氨基酸取代。依据一些实施方案，天然胰高血糖素的在位置16的丝氨酸残基用选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和高半胱氨酸的氨基酸取代，和在一些实施方案中，丝氨酸残基用谷氨酸取代。

在一些实施方案中，提高的效力的3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:90、seqidno:91、seqidno:92、seqidno:93、seqidno:94、seqidno:95的肽或seqidno:93的胰高血糖素激动剂类似物。依据一些实施方案，提供具有在胰高血糖素受体相对于野生型胰高血糖素的提高效力的3型胰高血糖素相关肽，其中肽包含seqidno:95、seqidno:96、seqidno:97或seqidno:98的序列，其中胰高血糖素相关肽保留其对胰高血糖素受体相对于glp-1受体的选择性。在某些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽具有对包含seqidno:96、seqidno:97、seqidno:98的肽或其胰高血糖素激动剂类似物的胰高血糖素受体的提高的特异性，其中羧基末端氨基酸保留其天然羧酸基团。依据一些实施方案，3型胰高血糖素相关肽包含nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-asn-thr-cooh(seqidno:98)的序列，其中肽在胰高血糖素受体显示相对于天然胰高血糖素的约5倍提高的效力，如通过实施例7的体外camp分析所测定的。

胰高血糖素受体活性可通过在位置3的氨基酸修饰，例如取代位置3的天然存在的谷氨酰胺而被减少、维持，或提高。在某些实施方案中，用酸性、碱性，或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)取代位置3的氨基酸已显示基本上减少或破坏胰高血糖素受体活性。用例如，谷氨酸、鸟氨酸，或正亮氨酸取代的类似物在胰高血糖素受体具有天然胰高血糖素的约10%或更少的活性，例如约1-10%，或约0.1-10%，或大于约0.1%但少于约10%,同时显示glp-1在glp-1受体的至少20%的活性。例如，本文描述的示例性类似物具有天然胰高血糖素的约0.5%、约1%或约7%的活性，同时显示glp-1在glp-1受体的至少20%的活性。特别是，任何3型胰高血糖素相关肽，包括本文描述的胰高血糖素类似物、胰高血糖素激动剂类似物、胰高血糖素共激动剂，和胰高血糖素/glp-1共激动剂分子，可被修饰以含有在位置3的修饰，例如，用glu取代gln，以产生具有高选择性，例如，对glp-1受体与对胰高血糖素受体的选择性比较的10倍选择性的肽。

在另一个实施方案中，任何3型胰高血糖素相关肽在位置3的天然存在的谷氨酰胺可用在胰高血糖素受体没有活性的实质损失的谷氨酰胺类似物取代，和在一些情况下，具有提高的胰高血糖素受体活性，如本文描述的。在特定实施方案中，在位置3的氨基酸用dab(ac)取代。例如，胰高血糖素激动剂可包含seqidno:595、seqidno:601、seqidno:603、seqidno:604、seqidno:605，和seqidno:606的氨基酸序列。

已观察到在位置2的修饰(如aib在位置2)和在一些情况下在位置1修饰可减少胰高血糖素活性。胰高血糖素活性的这种减少可通过稳定胰高血糖素的c-末端部分中的α-螺旋，例如通过本文描述的手段，例如，通过在位置“i”和“i+4”，例如，12和16、16和20，或20和24的氨基酸侧链之间的共价键来恢复。在某些实施方案中，这种共价键是在位置16的谷氨酸和在位置20的赖氨酸之间的内酰胺桥。在某些实施方案中，这种共价键是并非内酰胺桥的分子内桥。例如，合适的共价结合方法包括烯烃复分解反应，羊毛硫氨酸(lanthionine)-基环化、二硫化物桥或修饰的含硫桥形成中的任何一个或多个，使用α,ω-二氨基烷烃系链(tethers)，形成金属-原子桥，和采用肽环化的其它方式。

影响glp-1活性的修饰

提高在glp-1受体的活性通过用电荷-中性基团，如酰胺或酯置换c-末端氨基酸的羧酸来提供。在一些实施方案中，这些3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:108的序列，其中羧基末端氨基酸具有代替在天然氨基酸上发现的羧酸基团的酰胺基团。这些3型胰高血糖素相关肽在胰高血糖素和glp-1受体二者具有强活性并因此用作两种受体的共激动剂。依据一些实施方案，3型胰高血糖素相关肽是胰高血糖素和glp-1受体共激动剂，其中肽包含seqidno:108的序列，其中在位置28的氨基酸是asn或lys和在位置29的氨基酸是thr-酰胺。

在glp-1受体的增加的活性通过稳定胰高血糖素的c-末端部分中的α螺旋(如围绕残基12-29)的修饰来提供。在某些实施方案中，这样的修饰允许两个氨基酸的侧链之间的分子内桥的形成，这两个氨基酸由3个插入氨基酸(即，在位置“i”的氨基酸和在位置“i+4”的氨基酸，其中i是12和25之间的任何整数)，由两个插入的氨基酸(即在位置“j”的氨基酸和在位置“j+3”的氨基酸，其中j是12和27之间的任何整数)，或由6个插入的氨基酸(即在位置“k”的氨基酸和在位置“k+7”的氨基酸，其中k是12和22之间的任何整数)分开。在示例性实施方案中，桥或接头的长度为约8(或约7-9)个原子并在位置12和16，或在位置16和20，或在位置20和24，或在位置24和28的氨基酸侧链之间形成。两个氨基酸侧链可通过非-共价键，例如，氢-键、离子相互作用，如形成盐桥，或通过共价键彼此连接。

依据一些实施方案，3型胰高血糖素相关肽显示胰高血糖素/glp-1受体共激动剂活性并包含选自seqidno:99、101,102和103的氨基酸序列。在某些实施方案中，侧链彼此共价连接，和在一些实施方案中，两个氨基酸彼此结合以形成内酰胺环。

在一些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:108的胰高血糖素相关肽类似物，其中肽包含在氨基酸位置12和16之间或在氨基酸位置16和20之间形成的分子内内酰胺桥。在某些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:108的序列，其中分子内内酰胺桥在氨基酸位置12和16之间，在氨基酸位置16和20之间，或在氨基酸位置20和24之间形成，且在位置29的氨基酸是甘氨酸，其中seqidno:29的序列连接于seqidno:108的c-末端氨基酸。在进一步的实施方案中，在位置28的氨基酸是天冬氨酸。

在一些特定实施方案中，3型胰高血糖素相关肽的c-末端部分中α螺旋结构的稳定通过形成并非内酰胺桥的分子内桥实现。例如，合适的共价结合方法包括烯烃复分解反应，羊毛硫氨酸(lanthionine)-基环化、二硫化物桥或修饰的含硫桥形成中的任何一个或多个，使用α,ω-二氨基烷烃系链(tethers)，形成金属-原子桥，和采用肽环化的其它方式以稳定α螺旋。

而且，提高在glp-1受体的活性可通过稳定胰高血糖素相关肽的c-末端部分中的α-螺旋结构(围绕氨基酸12-29)，通过在保留所需活性的位置有目的地引入一个或多个α,α-二取代的氨基酸而实现。这样的肽在此可被考虑为缺乏分子内桥的肽。在一些方面，α-螺旋的稳定以这种不引入分子内桥如盐桥或共价键的方式实现。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽的位置16、17、18、19、20、21、24或29的1、2、3、4或更多个位置用α,α-二取代的氨基酸取代。例如，在缺乏盐桥或内酰胺时，用氨基异-丁酸(aib)取代3型胰高血糖素相关肽的位置16提高glp-1活性。在某些实施方案中，位置16、20、21或24的1、2、3或更多个位置用aib取代。

提高在glp-1受体的活性可通过在位置20的氨基酸修饰实现。在某些实施方案中，在位置20的谷氨酰胺用具有或者荷电的或者具有对氢-键合能力的侧链，并且为至少约5(或约4-6)个原子长度的另一个亲水氨基酸(例如，赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸，或鸟氨酸)替换。

包含seqidno:78的c-末端延伸的3型胰高血糖素相关肽显示在glp-1受体增加的活性。在这样的包含seqidno:78的3型胰高血糖素相关肽中的glp-1活性可如本文描述的，通过修饰在位置18、28或29，或在位置18和29的氨基酸而进一步增加。glp-1效力的进一步的适度增加可通过修饰在位置10的氨基酸为trp而实现。

增加glp-1受体活性的修饰的组合可提供比单独采取的任何这样的修饰更高的glp-1活性。例如，3型胰高血糖素相关肽可包含在位置16，在位置20，和在c-末端羧酸基团的修饰，任选地具有在位置16和20的氨基酸之间的共价键；可包含在位置16和在c-末端羧酸基团的修饰；可包含在位置16和20的修饰，任选地具有在位置16和20的氨基酸之间的共价键；或可包含在位置20和在c-末端羧酸基团的修饰；任选地前提是在位置12的氨基酸不是arg；或任选地前提是在位置9的氨基酸不是glu。

影响稳定性的修饰

添加亲水部分

3型胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以改进肽在生理学ph下，在水性溶液中的溶解性和稳定性，同时保留相对于天然胰高血糖素的高生物活性。如在此讨论的亲水部分可连接于如在此进一步讨论的3型胰高血糖素相关肽。依据一些实施方案，期望包含seqidno:97或seqidno:98的3型胰高血糖素相关肽在位置17、21，和24引入亲水基团，以改进高效胰高血糖素类似物在具有生理学ph的溶液中的溶解性和稳定性。引入这样的基团也增加作用的持续时间，例如如通过在循环中延长的半衰期所测定的。

在一些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含选自seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106和seqidno:107的序列，其中所述3型胰高血糖素相关肽在位置16、17、21或24之一的氨基酸的侧链残基还包含聚乙二醇链，所述聚乙二醇链具有选自范围约500-约40,000道尔顿的分子量。在某些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约500-约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有约10,000-约20,000道尔顿的分子量。在还有的其它示例性实施方案中，聚乙二醇链具有约20,000-约40,000道尔顿的分子量。依据一些实施方案，亲水基团包含聚乙烯(peg)链。更特别地，在一些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:94或seqidno:95的序列，其中peg链共价连接存在于3型胰高血糖素相关肽的位置21和24的氨基酸侧链，而3型胰高血糖素相关肽的羧基末端氨基酸具有羧酸基团。依据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自范围约500-约10,000道尔顿的平均分子量。

依据一些实施方案，聚乙二醇化的3型胰高血糖素相关肽包含共价连接于3型胰高血糖素相关肽的两个或更多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000-约5,000道尔顿。在某些实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含由seqidno:93或seqidno:93的胰高血糖素激动剂类似物组成的肽，其中peg链共价连接于位置21和位置24的氨基酸残基，和其中两个peg链的合并的分子量为约1,000-约5,000道尔顿。

荷电c-末端

包含seqidno:20的3型胰高血糖素相关肽的稳定性可例如，通过引入一个、二个、三个或更多个荷电氨基酸至seqidno:108的胰高血糖素相关肽的c-末端部分，优选地在位置c-末端至位置27而进一步改进。这样的荷电氨基酸可通过用荷电氨基酸，例如在位置28或29取代天然氨基酸，或可供选择地通过例如在位置27、28或29之后添加荷电氨基酸而引入。在示例性实施方案中，1、2、3或所有的荷电氨基酸是带负电荷的。另外的修饰，例如保守的取代，可对仍允许其保留胰高血糖素活性的3型胰高血糖素相关肽进行。在某些实施方案中，提供seqidno:108的3型胰高血糖素相关肽的类似物，其中类似物通过在位置17-26的1-2个氨基酸取代而不同于seqidno:108，并且在一些实施方案中，类似物通过在位置20的氨基酸取代而不同于seqidno:108的肽。

酰基化/烷基化

依据一些实施方案，胰高血糖素相关肽被修饰以包含酰基或烷基，例如，c4-c30酰基或烷基。在某些实施方案中，本发明提供3型胰高血糖素相关肽，其被修饰以包含共价连接于胰高血糖素相关肽的位置10的氨基酸的酰基或烷基。胰高血糖素相关肽还可包含在3型胰高血糖素相关肽的位置10的氨基酸和酰基或烷基之间的间隔区。任何前述的3型胰高血糖素相关肽可包含两个酰基或两个烷基，或其组合。在本发明的特别方面，酰基化3型胰高血糖素相关肽包含seqidnos:534-544和546-549的任何氨基酸序列。

c-末端截短

在一些实施方案中，本文描述的3型胰高血糖素相关肽通过截短或缺失胰高血糖素肽的c-末端的一个或两个氨基酸(即，位置29和/或28)，而不影响在胰高血糖素和glp-1受体的活性和/或效力被进一步修饰。在这点上，3型胰高血糖素相关肽可包含天然胰高血糖素肽(seqidno:1)的氨基酸1-27或1-28，任选地具有本文描述的一个或多个修饰。在某些实施方案中，截短的3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:550或seqidno:551。在另一个实施方案中，截短的胰高血糖素激动剂肽包含seqidno:552或seqidno:553。

c-末端延伸

依据一些实施方案，本文公开的3型胰高血糖素相关肽通过添加第二肽至胰高血糖素相关肽，例如，seqidno:78、seqidno:117或seqidno:118的羧基末端进行修饰。在某些实施方案中，具有选自seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106、seqidno:107、seqidno:109、seqidno:110、seqidno:111，和seqidno:69的序列的3型胰高血糖素相关肽通过肽键共价结合于第二肽，其中第二肽包含选自seqidno:78、seqidno:117和seqidno:118的序列。在进一步的实施方案中，在包含c-末端延伸的3型胰高血糖素相关肽中，天然胰高血糖素相关肽的位置29的苏氨酸被甘氨酸替换。具有取代位置29的苏氨酸的甘氨酸和包含seqidno:78的羧基末端延伸的3型胰高血糖素相关肽在glp-1受体的效力为被修饰以包含seqidno:78的羧基末端延伸的天然胰高血糖素的4倍。在glp-1受体的效力可通过丙氨酸取代位置18的天然精氨酸而进一步提高。

因此，3型胰高血糖素相关肽可具有seqidno:117(krnrnnia)或seqidno:118的羧基末端延伸。依据一些实施方案，3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:81或seqidno:108，其还包含连接于胰高血糖素相关肽的氨基酸29的seqidno:117(krnrnnia)或seqidno:118的氨基酸序列。更特别地，3型胰高血糖素相关肽包含选自seqidno:98、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102和seqidno:103的序列，其还包含连接于胰高血糖素相关肽的氨基酸29的seqidno:117(krnrnnia)或seqidno:118的氨基酸序列。更特别地，胰高血糖素相关肽包含选自连接于3型胰高血糖素相关肽的氨基酸29的seqidno:98、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106、seqidno:109、seqidno:110、seqidno:111、seqidno:112、seqidno:72和seqidno:120的序列，所述序列还包含seqidno:78(gpssgappps)或seqidno:79的氨基酸序列。在某些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:121的序列。

以上描述的关于增加或降低胰高血糖素受体活性和增加glp-1受体活性的3型胰高血糖素相关肽的任何修饰可分别或组合应用。示例性修饰包括但不限于：

(a)改进稳定性，例如，通过引入一个、二个、三个或更多个荷电氨基酸至天然胰高血糖素的c-末端部分，优选地在位置c-末端至位置27。这样的荷电氨基酸可通过用例如在位置28或29的荷电氨基酸取代天然氨基酸，或可供选择地通过例如在位置27、28或29之后添加荷电氨基酸而引入。在示例性实施方案中，1、2、3或所有的荷电氨基酸是带负电荷的。在其它实施方案中，1、2、3或所有的荷电氨基酸是带正电荷的。这样的修饰增加稳定性，例如在约5.5和8之间的给定的ph，例如，ph7下，当于25℃24小时后测定时，提供相对于天然胰高血糖素的至少2-倍、5-倍、10-倍、15-倍、25-倍、30-倍或更大的稳定性。

(b)通过如在肽的位置16、17、20、21、24或29，或在c-末端氨基酸添加如本文描述的亲水部分例如聚乙二醇链，增加稳定性和作用的持续时间或在循环中的半衰期。

(c)通过修饰在位置15的天冬氨酸，例如，通过缺失天冬氨酸或用谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或高半胱氨酸取代，增加稳定性。在5.5-8范围的ph下，尤其是在酸性或碱性缓冲液中，这样的修饰可减少降解或裂解，例如，于25℃24小时后保留至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的原始肽。

(d)通过修饰在位置27的甲硫氨酸，例如，通过用亮氨酸或正亮氨酸取代，增加稳定性。这样的修饰可减少氧化降解。通过修饰在位置20或24的gln，例如通过用ser、thr、ala或aib取代，也可增加稳定性。这样的修饰可减少由gln的脱酰胺作用发生的降解。可通过修饰在位置21的asp，例如通过用glu取代来增加稳定性。这样的修饰可减少由asp的脱水发生的降解，以形成环状琥珀酰亚胺中间体，接着异构化为异-天冬氨酸。

(e)通过用本文描述的dpp-iv抗性氨基酸，修饰在位置1或2的氨基酸和包括用n-甲基-丙氨酸修饰在位置2的氨基酸，增加对二肽基肽酶iv(dppiv)裂解的抗性。

(f)不影响活性的保守的或非-保守的取代、添加或缺失，例如，在2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29的一个或多个位置的保守取代；在27、28或29的一个或多个位置的缺失；或缺失氨基酸29任选地与代替c-末端羧酸基团的c-末端酰胺或酯组合；

(g)添加如本文描述的c-末端延伸；

(h)例如，通过如本文描述的胰高血糖素相关肽的酰基化或烷基化，增加在循环中的半衰期和/或延长作用的持续时间和/或延迟作用的起效；

(i)如本文描述的同源二聚化或异源二聚化。

其它修饰包括用大的、芳族氨基酸(例如，tyr、phe、trp或氨基-phe)取代位置1的his；用ala取代位置2的ser；用val或phe取代位置10的tyr；用arg取代位置12的lys；用glu取代位置15的asp；用thr或aib取代位置16的ser。

含有用大的、芳族氨基酸(例如，tyr)对位置1的his的非-保守取代的具有glp-1活性的3型胰高血糖素相关肽可保留glp-1活性，只要α-螺旋经由分子内桥，例如在本文描述的任何那些来稳定的。

缀合和融合

3型胰高血糖素相关肽可，任选地经由共价键和任选地经由接头，连接于缀合物部分。3型胰高血糖素相关肽也可以是融合肽或蛋白的部分，其中第二肽或多肽已经融合至3型胰高血糖素相关肽的末端，例如，羧基末端。更特别地，融合3型胰高血糖素相关肽可包含seqidno:72,seqidno:97或seqidno:98的胰高血糖素激动剂，其还包含连接于胰高血糖素相关肽的氨基酸29的seqidno:78(gpssgappps)、seqidno:117(krnrnnia)或seqidno:118(krnr)的氨基酸序列。在某些实施方案中，seqidno:78(gpssgappps)、seqidno:117(krnrnnia)或seqidno:118(krnr)的氨基酸序列通过肽键结合于3型胰高血糖素相关肽的氨基酸29。申请人已发现在包含毒蜥外泌肽-4的c-末端延伸肽(例如，seqidno:78或seqidno:79)的3型胰高血糖素相关肽融合肽中，用甘氨酸取代位置29的天然苏氨酸残基极大地增加glp-1受体活性。这种氨基酸取代可用于与本文公开的关于3型胰高血糖素相关肽的其它修饰结合，以提高胰高血糖素类似物对glp-1受体的亲和力。例如，t29g取代可与s16e和n20k氨基酸取代，任选地与氨基酸16和20之间的内酰胺桥，和任选地与如本文所述的peg链的添加组合。

在一些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含seqidno:121的序列。在某些实施方案中，胰高血糖素融合肽的3型胰高血糖素相关肽部分选自seqidno:72、seqidno:90、seqidno:91、seqidno:92，和seqidno:93，其中peg链，当存在于位置17、21、24，或c-末端氨基酸，或在21和24二者时，选自500-40,000道尔顿的范围。更特别地，在一些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽区段选自seqidno:95、seqidno:96，和seqidno:122，其中peg链选自500-5,000的范围。在某些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽是包含seqidno:72和seqidno:80的序列的融合肽，其中seqidno:80的肽连接于seqidno:72的羧基末端。

依据一些实施方案，seqidno:98的3型胰高血糖素相关肽的另外的化学修饰，赋予其中在胰高血糖素和glp-1受体的相对活性实质上是等同的点的增加的glp-1受体效力。因此，在一些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含含有代替存在于天然氨基酸上羧酸基团的酰胺基的末端氨基酸。3型胰高血糖素相关肽在各自的胰高血糖素和glp-1受体的相对的活性可通过对3型胰高血糖素相关肽的进一步的修饰而调节，以产生显示在胰高血糖素受体约40%-约500%或更大活性的天然胰高血糖素和在glp-1受体约20%-约200%或更大天然glp-1的活性的类似物，例如相对于胰高血糖素在glp-1受体的正常活性的50-倍、100-倍或更大的增加。

示例性实施方案

依据一些实施方案，提供包含seqidno:72的序列的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与seqidno:72的不同之处在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28，和29的1-3个氨基酸，其中所述胰高血糖素相关肽显示天然glp-1在glp-1受体的至少20%的活性。

依据一些实施方案，提供胰高血糖素/glp-1受体共激动剂，其包含序列：

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-xaa-xaa-arg-arg-ala-xaa-asp-phe-val-xaa-trp-leu-met-xaa-xaa-r(seqidno:81)，其中在位置15的xaa选自由asp、glu、半胱氨酸、高谷氨酸和高半胱氨酸组成的一组氨基酸，在位置16的xaa选自由ser、glu、gln、高谷氨酸和高半胱氨酸组成的一组氨基酸，在位置20的xaa是gln或lys，在位置24的xaa是gln或glu，在位置28的xaa是asn、lys或酸性氨基酸，在位置29的xaa是thr、gly或酸性氨基酸，和r是cooh或conh2，前提是当位置16是丝氨酸，位置20是lys，或可供选择地当位置16是丝氨酸时，位置24是glu和位置20或者位置28是lys。在某些实施方案中，胰高血糖素/glp-1受体共激动剂包含seqidno:81的序列，其中在位置28的氨基酸是天冬氨酸和在位置29的氨基酸是谷氨酸。在另一个实施方案中，在位置28的氨基酸是天然天冬酰胺，在位置29的氨基酸是甘氨酸，及seqidno:79或seqidno:80的氨基酸序列共价连接于seqidno:81的羧基末端。

在一些实施方案中，提供包含seqidno:81的序列的共激动剂，其中另外的酸性氨基酸被添加到肽的羧基末端。在进一步的实施方案中，胰高血糖素类似物的羧基末端氨基酸具有替代天然氨基酸的羧酸基团的酰胺。在某些实施方案中，胰高血糖素类似物包含选自seqidno:85、seqidno:86、seqidno:87和seqidno:88的序列。

依据一些实施方案，提供seqidno:81的胰高血糖素相关肽类似物，其中所述类似物与seqidno:81的不同之处在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27的1-3个氨基酸，前提是当在位置16的氨基酸是丝氨酸时，位置20是赖氨酸，或者内酰胺桥在位置24的氨基酸和在位置20或者位置28的氨基酸之间形成。依据一些实施方案，类似物与seqidno:81的不同之处在于选自位置1、2、3、21和27的1-3个氨基酸。在某些实施方案中，seqidno:81的胰高血糖素肽类似物与该序列的不同之处在于1-2个氨基酸，或在一些实施方案中，不同之处在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27的单一氨基酸，前提是当在位置16的氨基酸是丝氨酸时，位置20是赖氨酸，或者内酰胺桥在位置24的氨基酸和在位置20或者位置28的氨基酸之间形成。

依据另一个实施方案，提供相对选择性的glp-1受体激动剂，其包含序列nh2-his-ser-xaa-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-xaa-xaa-arg-arg-ala-xaa-asp-phe-val-xaa-trp-leu-met-xaa-xaa-r(seqidno:83)，其中在位置3的xaa选自由glu、orn或nle组成的一组氨基酸，在位置15的xaa选自由asp、glu、半胱氨酸、高谷氨酸和高半胱氨酸组成的一组氨基酸，在位置16的xaa选自由ser、glu、gln、高谷氨酸和高半胱氨酸组成的一组氨基酸，在位置20的xaa是gln或lys，在位置24的xaa是gln或glu，在位置28的xaa是asn、lys或酸性氨基酸，在位置29的xaa是thr、gly或酸性氨基酸，和r是cooh、conh2、seqidno:78或seqidno:79，前提是当位置16是丝氨酸时，位置20是lys，或可供选择地当位置16是丝氨酸时，位置24是glu和位置20或者位置28是lys。在某些实施方案中，在位置3的氨基酸是谷氨酸。在某些实施方案中，在位置28和/或29取代的酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽，包括共激动剂肽，包含seqidno:81的序列，其还包含加入到肽的羧基末端的另外的酸性氨基酸。在进一步的实施方案中，胰高血糖素类似物的羧基末端氨基酸具有替代天然氨基酸的羧酸基团的酰胺。

依据一些实施方案，提供胰高血糖素/glp-1受体共激动剂，其包含选自以下的修饰的胰高血糖素相关肽：

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-xaa-xaa-arg-arg-ala-xaa-asp-phe-val-xaa-trp-leu-met-xaa-xaa-r(seqidno:82)，其中在位置15的xaa选自由asp、glu、半胱氨酸、高谷氨酸和高半胱氨酸组成的一组氨基酸，在位置16的xaa选自由ser、glu、gln、高谷氨酸和高半胱氨酸组成的一组氨基酸，在位置20的xaa是gln或lys，在位置24的xaa是gln或glu和在位置28的xaa是asn、asp或lys，r是cooh或conh2，在位置29的xaa是thr或gly，和r是cooh、conh2、seqidno:78或seqidno:79，前提是当位置16是丝氨酸时，位置20是lys，或可供选择地当位置16是丝氨酸时，位置24是glu和位置20或者位置28是lys。在某些实施方案中，r是conh2，在位置15的xaa是asp，在位置16的xaa选自由glu、gln、高谷氨酸和高半胱氨酸组成的一组氨基酸，在位置20和24的xaas各自是gln，在位置28的xaa是asn或asp和在位置29的xaa是thr。在某些实施方案中，在位置15和16的xaas各自是glu，在位置20和24的xaas各自是gln，在位置28的xaa是asn或asp，在位置29的xaa是thr和r是conh2。

已报道天然胰高血糖素肽的某些位置可被修饰同时保留母肽的至少一些活性。因此，申请人期望位于seqidno:99的肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29的一个或多个氨基酸可用不同于存在于天然胰高血糖素肽的氨基酸取代，并仍保留在胰高血糖素受体的活性。在某些实施方案中，存在于天然肽的位置27的甲硫氨酸残基被改换为亮氨酸或正亮氨酸，以防止肽的氧化降解。在另一个实施方案中，在位置20的氨基酸用lys、arg、orn或瓜氨酸取代和/或位置21的氨基酸用glu、高谷氨酸或高半胱氨酸取代。

在一些实施方案中，提供seqidno:108的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、27、28或29的1-6个氨基酸不同于seqidno:701的对应的氨基酸，前提是当在位置16的氨基酸是丝氨酸时，位置20是lys，或可供选择地当位置16是丝氨酸时，位置24是glu和位置20或者位置28是lys。依据另一个实施方案，提供seqidno:108的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27、28或29的1-3个氨基酸不同于seqidno:701的对应的氨基酸。在另一个实施方案中，提供seqidno:96、seqidno:97或seqidno:99的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20或21的1-2个氨基酸不同于seqidno:701的对应的氨基酸，和在进一步的实施方案中，1-2个不同的氨基酸表示相对存在于天然胰高血糖素序列(seqidno:701)的氨基酸的保守的氨基酸取代。在某些实施方案中，提供seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102或seqidno:103的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽还包含在选自位置2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27或29的位置的1、2或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，在位置2、5、7、10、11、13、14、16、17、18、19、20、21、27或29的取代是保守的氨基酸取代。

依据一些实施方案，提供包含seqidno81的序列变体的胰高血糖素/glp-1受体共激动剂，其中分别选自变体的位置16、17、18、20、21、23、24、27、28和29的1-10个氨基酸不同于seqidno:701的对应氨基酸。依据一些实施方案，提供seqidno81的序列的变体，其中变体通过一个或多个选自gln17、ala18、glu21、ile23、ala24、val27和gly29的氨基酸取代而不同于seqidno:81。依据一些实施方案，提供包含seqidno81序列的变体的胰高血糖素/glp-1受体共激动剂，其中选自变体的位置17-26的1-2个氨基酸不同于seqidno:701的对应氨基酸。依据一些实施方案，提供seqidno81序列的变体，其中变体通过选自gln17、ala18、glu21、ile23和ala24的氨基酸取代而不同于seqidno:81。依据一些实施方案，提供seqidno81序列的变体，其中变体通过在位置18氨基酸取代而不同于seqidno:81，其中取代的氨基酸选自ala、ser、thr和gly。依据一些实施方案，提供seqidno81序列的变体，其中变体通过在位置18的ala的氨基酸取代而不同于seqidno:81。这样的变化被seqidno:72涵盖。在另一个实施方案中，提供包含seqidno81序列的变体的胰高血糖素/glp-1受体共激动剂，其中选自变体的位置17-22的1-2个氨基酸不同于seqidno:701的对应氨基酸，和在进一步的实施方案中，提供seqidno81的变体，其中变体通过在位置20和21的1或2个氨基酸取代而不同于seqidno:81。

依据一些实施方案，提供胰高血糖素/glp-1受体共激动剂，其包含序列：

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-xaa-xaa-arg-arg-ala-xaa-xaa-phe-val-xaa-trp-leu-met-xaa-xaa-r(seqidno:123)，其中在位置15的xaa是asp、glu、半胱氨酸、高谷氨酸或高半胱氨酸，在位置16的xaa是ser、glu、gln、高谷氨酸或高半胱氨酸，在位置20的xaa是gln、lys、arg、orn或瓜氨酸，在位置21的xaa是asp、glu、高谷氨酸或高半胱氨酸，在位置24的xaa是gln或glu，在位置28的xaa是asn、lys或酸性氨基酸，在位置29的xaa是thr或酸氨基酸和r是cooh或conh2。在某些实施方案中，r是conh2。依据一些实施方案，提供胰高血糖素/glp-1受体共激动剂，其包含seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:114、seqidno:115或seqidno:116的变体，其中变体通过在位置20的氨基酸取代而不同于所述序列。在某些实施方案中，对位置20的氨基酸取代选自lys、arg、orn或瓜氨酸。

在一些实施方案中，提供包含seqidno:82的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中类似物与seqidno:82的不同之处在于位置2具有并非丝氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，丝氨酸残基用氨基异丁酸、d-丙氨酸取代，和在一些实施方案中，丝氨酸残基用氨基异丁酸取代。这样的修饰抑制由二肽基肽酶iv的裂解，同时保留母体化合物的固有的效力(如母体化合物的至少75、80、85、90、95%或更高的效力)。在某些实施方案中，例如，通过引入一个、二个、三个或更多个荷电氨基酸至天然胰高血糖素的c-末端部分，优选地在位置27的c-末端位置，增加类似物的溶解性。在示例性实施方案中，1、2、3或所有的荷电氨基酸是带负电荷的。在另一个实施方案中，类似物还包含对在位置28或29的天然氨基酸的酸性氨基酸取代或将酸性氨基酸添加到seqidno:82的肽的羧基末端。

在一些实施方案中，本文公开的胰高血糖素类似物在位置1或2被进一步修饰，以减少对由二肽基肽酶iv的裂解的敏感性。在某些实施方案中，提供seqidno:97、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102或seqidno:103的胰高血糖素类似物，其中类似物通过在位置2的取代而不同于母体分子并显示出对由二肽基肽酶iv的裂解的减少的敏感性(即，抗性)。更特别地，在一些实施方案中，类似物肽的位置2用选自d-丝氨酸、d-丙氨酸、缬氨酸、氨基n-丁酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。在某些实施方案中，类似物肽的位置2用选自d-丝氨酸、d-丙氨酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。在另一个实施方案中，类似物肽的位置2用选自d-丝氨酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，在位置2的氨基酸不是d-丝氨酸。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽包含seqidno:127或seqidno:128的序列。

在一些实施方案中，提供seqidno:97、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102或seqidno:103的胰高血糖素类似物，其中类似物通过在位置1的取代而不同于母体分子并显示出对由二肽基肽酶iv的裂解的减少的敏感性(即，抗性)。更特别地，类似物肽的位置1用选自d-组氨酸、α,α-二甲基咪唑乙酸(dmia)、n-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和同型-组氨酸的氨基酸取代。在另一个实施方案中，提供包含seqidno:82的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中类似物与seqidno:82的不同之处在于位置1具有并非组氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，例如，通过引入一个、二个、三个或更多个荷电氨基酸至天然胰高血糖素的c-末端部分，优选地在位置27的c-末端位置，增加类似物的溶解性。在示例性实施方案中，1、2、3或所有的荷电氨基酸是带负电荷的。在另一个实施方案中，类似物还包含对天然氨基酸在位置28或29的酸性氨基酸取代或将酸性氨基酸添加到seqidno:82的肽的羧基末端。在某些实施方案中，酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

在一些实施方案中，胰高血糖素/glp-1受体共激动剂包含seqidno:108的序列，其还包含一个氨基酸或选自seqidno:78、seqidno:117和seqidno:118的肽的另外的羧基末端延伸。在其中单氨基酸被加入到seqidno:108的羧基末端的实施方案中，氨基酸典型地选自20个常见氨基酸之一，和在一些实施方案中，另外的羧基末端氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸的酰胺基团。在某些实施方案中，另外的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。

在备选的实施方案中，提供胰高血糖素/glp-1受体共激动剂，其中肽包含至少一个在谷氨酸残基和赖氨酸残基的侧链之间形成的内酰胺环，其中谷氨酸残基和赖氨酸残基通过3个氨基酸分开。在一些实施方案中，携带胰高血糖素肽的内酰胺的羧基末端氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸的酰胺基团。更特别地，在一些实施方案中，提供胰高血糖素和glp-1共激动剂，其包含选自以下的修饰的胰高血糖素肽：

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-xaa-xaa-r(seqidno:66)

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-arg-arg-ala-lys-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-xaa-xaa-r(seqidno:109)

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-lys-asp-phe-val-glu-trp-leu-met-xaa-xaa-r(seqidno:111)

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-glu-trp-leu-met-lys-xaa-r(seqidno:112)

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-arg-arg-ala-lys-asp-phe-val-glu-trp-leu-met-asn-thr-r(seqidno:104)

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-glu-trp-leu-met-lys-thr-r(seqidno:105)

nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-arg-arg-ala-lys-asp-phe-val-glu-trp-leu-met-lys-thr-r(seqidno:106)

其中在位置28的xaa=asp，或asn，在位置29的xaa是thr或gly，r选自cooh、conh2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、seqidno:78、seqidno:117和seqidno:118，和内酰胺桥在位置12的lys和在位置16的glu之间(对于seqidno:109)，在位置16的glu和在位置20的lys之间(对于seqidno:110)，在位置20的lys和在位置24的glu之间(对于seqidno:111)，在位置24的glu和在位置28的lys之间(对于seqidno:112)，在位置12的lys和在位置16的glu之间和在位置20的lys和在位置24的glu之间(对于seqidno:104)，在位置12的lys和在位置16的glu之间和在位置24的glu和在位置28的lys之间(对于seqidno:105)和在位置16的glu和在位置20的lys之间和在位置24的glu和在位置28的lys之间(对于seqidno:106)形成。在某些实施方案中，r选自cooh、conh2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸，在位置28的氨基酸是asn，和在位置29的氨基酸是苏氨酸。在某些实施方案中，r是conh2，在位置28的氨基酸是asn和在位置29的氨基酸是苏氨酸。在另一个实施方案中，r选自seqidno:78、seqidno:79和seqidno:80和在位置29的氨基酸是甘氨酸。

在进一步的实施方案中，胰高血糖素/glp-1受体共激动剂选自seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105和seqidno:106，其中肽还包含一个氨基酸或选自seqidno:78、seqidno:117和seqidno:118的肽的另外的羧基末端延伸。在某些实施方案中，末端延伸包含seqidno:78、seqidno:79或seqidno:80的序列和胰高血糖素相关肽包含seqidno:72的序列。在某些实施方案中，胰高血糖素/glp-1受体共激动剂包含seqidno:81的序列，其中在位置16的氨基酸是谷氨酸，在位置20的氨基酸是赖氨酸，在位置28的氨基酸是天冬酰胺，及seqidno:78或seqidno:79的氨基酸序列连接于seqidno:81的羧基末端。

在其中单氨基酸被加入到seqidno:108的羧基末端的实施方案中，氨基酸典型地选自20个常见氨基酸之一，和在一些实施方案中，氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸的酰胺基团。在某些实施方案中，另外的氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸和甘氨酸。在其中胰高血糖素激动剂类似物还包含羧基末端延伸的实施方案中，所述延伸的羧基末端氨基酸，在一些实施方案中，以酰胺基团或酯基而不是以羧酸封端。

在另一个实施方案中，胰高血糖素/glp-1受体共激动剂包含序列：nh2-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-asn-thr-xaa-conh2(seqidno:107)，其中在位置30的xaa表示任何氨基酸。在某些实施方案中，xaa选自20个常见氨基酸之一，和在一些实施方案中，氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。这种肽的稳定性可通过将peg链共价连接于seqidno:107的位置17、21、24或30的氨基酸侧链而进一步增强。在进一步的实施方案中，肽包含选自seqidno:78、seqidno:117和seqidno:118的肽的另外的羧基末端延伸。依据一些实施方案，胰高血糖素/glp-1受体共激动剂包含seqidno:129、seqidno:130和seqidno:131的序列。

可进行对seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106、seqidno:107和seqidno:121的胰高血糖素序列的另外的内在位点特异性修饰，以得到一组具有可变程度的glp-1激动作用的胰高血糖素激动剂。因此，已制备在每个受体具有基本上相同的体外效力的肽并对它们进行了特征鉴定。类似地，在两种受体的每一种具有10倍选择性提高效力的肽已被鉴定和表征。如上所注明的，用谷氨酸取代位置16的丝氨酸残基提高天然胰高血糖素在胰高血糖素和glp-1受体二者的效力，但维持对胰高血糖素受体的约10倍的选择性。另外通过用谷氨酸取代位置3的天然谷氨酰胺(seqidno:128)生成显示对glp-1受体的约10倍选择性的胰高血糖素类似物。

胰高血糖素/glp-1共激动剂肽的稳定性可在生理ph的水性溶液中进一步提高，同时通过在肽的位置16、17、21和24引入亲水基团，或通过在胰高血糖素/glp-1共激动剂肽的羧基末端添加单一修饰的氨基酸(即、氨基酸被修饰以包含亲水基团)，维持相对于天然胰高血糖素的高生物活性。依据一些实施方案，亲水基团包含聚乙烯(peg)链。更特别地，在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含seqidno:98、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105或seqidno:106的序列，其中peg链共价连接于胰高血糖素肽在位置16、17、21、24、29的氨基酸的侧链或c-末端氨基酸，前提是当肽包含seqidno:98、seqidno:99、seqidno:100或seqidno:101时，聚乙二醇链共价连接于位置17、21或24的氨基酸残基，当肽包含seqidno:102或seqidno:103时，聚乙二醇链共价连接于位置16、17或21的氨基酸残基，和当肽包含seqidno:104,seqidno:105或seqidno:106时，聚乙二醇链共价连接于位置17或21的氨基酸残基。

在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含seqidno:99、seqidno:100或seqidno:101的序列，其中peg链共价连接于胰高血糖素肽在位置17、21、24的氨基酸侧链，或c-末端氨基酸，和肽的羧基末端氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸基团的酰胺基团。在某些实施方案中，胰高血糖素/glp-1受体共激动剂肽包含选自seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106和seqidno:107的序列，其中peg链共价连接于胰高血糖素肽的seqidno:100、seqidno:101和seqidno:107在位置17、21或24，或在seqidno:102和seqidno:103的位置16、17或21或在seqidno:104、seqidno:105和seqidno:106的位置17或21的氨基酸侧链。在另一个实施方案中，胰高血糖素/glp-1受体共激动剂肽包含seqidno:99或seqidno:107的序列，其中peg链共价连接于胰高血糖素肽在位置17、21或24的氨基酸的侧链或c-末端氨基酸。

在一些实施方案中，胰高血糖素肽选自seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106，和seqidno:107，其进一步被修饰以包含共价连接于胰高血糖素肽在位置17或21的氨基酸侧链的peg链。在某些实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素/glp-1受体共激动剂还包含seqidno:78、seqidno:117或seqidno:79的序列。

在另一个实施方案中，胰高血糖素相关肽包含seqidno:72或seqidno:120的序列，其还包含连接于seqidno:72或seqidno:120的c-末端氨基酸的seqidno:78、seqidno:79或seqidno:80的c-末端延伸，和任选地还包含共价连接于肽在位置17、18、21、24或29的氨基酸的侧链或c-末端氨基酸的peg链。在另一个实施方案中，胰高血糖素相关肽包含seqidno:72或seqidno:120的序列，其中peg链共价连接于胰高血糖素相关肽在位置21或24的氨基酸的侧链和所述肽还包含seqidno:78或seqidno:79的c-末端延伸。

在另一个实施方案中，胰高血糖素相关肽包含seqidno:72，或seqidno:81或seqidno:82的序列，其中另外的氨基酸被加入到seqidno:81或seqidno:82的羧基末端，和peg链共价连接于加入的氨基酸的侧链。在进一步的实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素类似物还包含连接于seqidno:81或seqidno:82的c-末端氨基酸的eqidno:78或seqidno:79的c-末端延伸。在另一个实施方案中，胰高血糖素相关肽包含seqidno:107的序列，其中peg链共价连接于胰高血糖素相关肽在位置30的氨基酸的侧链和所述肽还包含连接于seqidno:107的c-末端氨基酸的seqidno:78或seqidno:79的c-末端延伸。

聚乙二醇链可呈现直链的形式或它可以是分支的。依据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自范围约500-约10,000道尔顿的平均分子量。在某些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约1,000-约5,000道尔顿的平均分子量。在备选的天然实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约10,000-约20,000道尔顿的平均分子量。依据一些实施方案，聚乙二醇化的胰高血糖素相关肽包含共价连接于胰高血糖素相关肽的两个或更多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000-约5,000道尔顿。在某些实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含由seqidno:93或seqidno:93的胰高血糖素激动剂类似物组成的肽，其中peg链共价连接于位置21和位置24的氨基酸残基，和其中两个peg链的合并的分子量为约1,000-约5,000道尔顿。

在某些示例性实施方案中，胰高血糖素肽包含具有最多10个氨基酸修饰的seqidno:701的氨基酸序列并包含在位置10被酰基化或烷基化的氨基酸。在某些实施方案中，在位置10的氨基酸用c4-c30脂肪酸酰基化或烷基化。在某些方面，在位置10的氨基酸包含对于天然存在的氨基酸为非-天然的酰基或烷基。

在某些实施方案中，包含在位置10的被酰基化或烷基化的氨基酸的胰高血糖素肽包含稳定的α螺旋。因此，在某些方面，胰高血糖素肽包含如本文描述的酰基或烷基和分子内桥，例如，在位置i的氨基酸和在位置i+4的氨基酸的侧链之间的共价分子内桥(例如，内酰胺桥)，其中i是12、16、20或24。作为选择或者另外地，胰高血糖素肽包含如本文描述的酰基或烷基和胰高血糖素肽的16、20、21和/或24的1、2、3或更多个位置被α,α-二取代的氨基酸，例如，aib取代。在一些情况下，非-天然胰高血糖素肽包含在位置16的glu和在位置20的lys，其中任选地内酰胺桥连接glu和lys，并且任选地，胰高血糖素肽还包含一个或多个选自以下的修饰：在位置17的gln、在位置18的ala、在位置21的glu、在位置23的ile，和在位置24的ala。

同样，在其中胰高血糖素相关肽包含在位置10的被酰基化或烷基化的氨基酸的任何实施方案中，胰高血糖素相关肽还可包含代替c-末端α羧酸酯的c-末端酰胺。

在一些实施方案中，包含如本文描述的酰基或烷基的胰高血糖素相关肽还包含在位置1、在位置2，或在位置1和2的氨基酸取代，其中氨基酸取代获得dpp-iv蛋白酶抗性。在某些特异性实施方案中，胰高血糖素相关肽是包含含有在位置10的如本文描述的酰基化或烷基化氨基酸的seqidnos:72的肽。这些实施方案的酰基或烷基可以是本文描述的任何酰基或烷基。例如，酰基可以是c4-c30(例如，c8-c24)脂肪酰基和烷基可以是c4-c30(例如，c8-c24)烷基。

酰基或烷基连接的氨基酸可以是本文描述的任何氨基酸，例如，式i(例如，lys)、式ii和式iii的任何氨基酸。

在一些实施方案中，酰基或烷基直接连接于位置10的氨基酸。在某些实施方案中，酰基或烷基经由间隔区(例如，为3-10个原子长度的间隔区，例如，氨基酸或二肽)连接于位置10的氨基酸。用于连接酰基或烷基的合适的间隔区是本文描述的。

在某些方面，胰高血糖素类似物包含至少一个氨基酸修饰和最多15个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氨基酸修饰)，或最多10个氨基酸修饰。在某些实施方案中，包含至少一个氨基酸修饰和最多10个氨基酸修饰的类似物表示保守的氨基酸修饰。保守的氨基酸修饰是本文描述的。

因此，在一些方面，胰高血糖素类似物包含seqidno:701的氨基酸序列，其具有以下的一个或多个：在位置17的gln、在位置18的ala、在位置21的glu、在位置23的ile，和在位置24的ala或cys，或其保守的氨基酸取代。在一些方面，类似物包含代替c-末端α羧酸酯的c-末端酰胺。在某些实施方案中，类似物包含在位置1、位置2，或位置1和2的氨基酸取代，所述取代获得dpp-iv蛋白酶抗性。合适的氨基酸取代是本文描述的。例如，在位置1的dmia和/或在位置2的d-ser或aib。在某些实施方案中，在位置2的氨基酸不是d-丝氨酸。

另外地或可供选择地，类似物可包含以下各项之一或其组合：(a)用ala取代位置2的ser；(b)用glu或谷氨酰胺类似物取代位置3的gln；(c)用ile取代位置7的thr；(d)用trp或包含对于天然存在的氨基酸为非-天然的酰基或烷基的氨基酸取代位置10的tyr；(e)用ile取代位置12的lys；(f)用glu取代位置15的asp；(g)用glu取代位置16的ser；(h)用ser、thr、ala、aib取代位置20的gln；(i)用ser、thr、ala、aib取代位置24的gln；(j)用leu或nle取代位置27的met；(k)用荷电氨基酸，任选地，asp或glu取代位置29的asn；和(l)用gly或荷电氨基酸，任选地,asp或glu取代位置29的thr。在某些方面，类似物包含seqidnos:657-669的任何氨基酸序列。

关于在gip受体显示激动剂活性的类似物，所述类似物包含1-21个氨基酸(例如，5-19、7-15、9-12个氨基酸)的延伸。类似物的延伸可包含任何氨基酸序列，前提是延伸是1-21个氨基酸。在一些方面，延伸是7-15个氨基酸和在其它方面，延伸是9-12个氨基酸。在一些实施方案中，延伸包含(i)seqidno:78或674的氨基酸序列，(ii)具有与seqidno:78或674的氨基酸序列的高的序列同一性(例如，至少80%、85%、90%、95%、98%、99%)的氨基酸序列，或(iii)具有一个或多个保守的氨基酸修饰的(i)或(ii)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述延伸的至少一个氨基酸被酰基化或烷基化。包含酰基或烷基的氨基酸可位于类似物的延伸的任何位置。在某些实施方案中，所述延伸的酰基化或烷基化氨基酸位于类似物的位置37、38、39、40、41或42(依据seqidno:701编号)之一。在某些实施方案中，酰基化或烷基化氨基酸位于类似物的位置40。

在示例性实施方案中，酰基或烷基是对于天然存在的氨基酸是非-天然的酰基或烷基。例如，酰基或烷基可以是c4-c30(例如，c12-c18)脂肪酰基或c4-c30(例如，c12-c18)烷基。酰基或烷基可以是本文讨论的任何那些酰基或烷基。

在一些实施方案中，酰基或烷基，例如，经由氨基酸的侧链直接连接于氨基酸。在其它实施方案中，酰基或烷基经由间隔区(例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水双功能间隔区、疏水性双功能间隔区)连接于氨基酸。在某些方面，间隔区的长度是3-10个原子。在某些实施方案中，氨基酸间隔区不是γ-glu。在某些实施方案中，二肽间隔区不是γ-glu-γ-glu。

同样，在示例性实施方案中，酰基或烷基连接的氨基酸可以是在本文描述的任何那些氨基酸，例如，式i、ii，或iii的氨基酸。被酰基化或烷基化的氨基酸可以是例如lys。包含酰基或烷基的合适的氨基酸，以及合适的酰基和烷基是本文描述的。见例如在题目为酰基化和烷基化的章节中的讲述。

在其它实施方案中，所述延伸的1-6个氨基酸(例如，1-2、1-3、1-4、1-5个氨基酸)是带正电荷的氨基酸，例如，式iv的氨基酸，例如，lys。如本文所用的，术语“带正电荷的氨基酸”指任何氨基酸，天然存在的或非-天然存在的，包含在生理ph下其侧链原子的正电荷。在某些方面，带正电荷的氨基酸位于任何位置37、38、39、40、41、42，和43。在特定实施方案中，带正电荷的氨基酸位于位置40。在其它情况下，所述延伸如本文所述被酰基化或烷基化并包含1-6个如本文描述的带正电荷的氨基酸。

在还有的其它实施方案中，在gip受体显示激动剂活性的类似物包含(i)具有至少一个氨基酸修饰的seqidno:701，(ii)在类似物的位置29的氨基酸的c-末端的1-21个氨基酸(例如，5-18,7-15,9-12个氨基酸)延伸，和(iii)包含对于天然存在的氨基酸为非-天然的酰基或烷基的氨基酸，所述氨基酸位于c-末端延伸的外面(例如，在任何位置1-29)。在某些实施方案中，类似物包含在位置10的酰基化或烷基化氨基酸。在特殊的方面，酰基或烷基是c4-c30脂肪酰基或c4-c30烷基。在某些实施方案中，经由间隔区(例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水双功能间隔区、疏水性双功能间隔区)连接酰基或烷基。在某些方面，类似物包含稳定α螺旋，如在位置16的glu和在位置20的lys之间的盐桥，或位置16、20、21和24的任何1、2、3，或更多个位置的α,α-二取代的氨基酸的氨基酸修饰。在特定的方面，类似物另外地包含赋予dpp-iv蛋白酶抗性的氨基酸修饰，例如，在位置1的dmia、在位置2的aib。本文期望包含其它的氨基酸修饰的类似物。在一个实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含seqidnos:657-669的任何结构。

依据一些实施方案，3型胰高血糖素相关肽包含含有以下修饰的天然胰高血糖素(seqidno:701)的氨基酸序列：在位置2的aib、在位置3的glu、在位置10的lys、在位置16的glu、在位置17的gln、在位置18的ala、在位置20的lys、在位置21的glu、在位置23的ile、在位置24的ala；其中用c14或c16脂肪酸使位置10的lys酰基化，和其中c-末端羧酸酯用酰胺替换。在特定实施方案中，这种3型胰高血糖素相关肽经由其n-末端氨基酸连接于二肽d-lys-肌氨酸。

依据一些实施方案，3型胰高血糖素相关肽包含，基本上由，或由seqidnos:514、517-534，或554的任何氨基酸序列组成，任选地具有保留glp-1激动剂和/或胰高血糖素激动剂活性的最多1、2、3、4，或5个其它的修饰。在某些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含seqidnos:562-684，和1701-1776的任何氨基酸。在一些实施方案中，3型胰高血糖素相关肽包含seqidnos:1801-1908的任何氨基酸序列。

公开的胰高血糖素相关肽-胰岛素肽缀合物被认为是适合于先前已对胰岛素肽描述的任何用途。因此，本文描述的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物可被用来治疗高血糖症，或治疗因高血葡萄糖水平所致的其它代谢性疾病。因此，本发明涵盖包含如本文公开的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物和药学上可接受的载体的药用组合物，其用于治疗患有高血葡萄糖水平的患者。依据一个实施方案，使用本文公开的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物要治疗的患者是驯养动物，和在另一个实施方案中，要治疗的患者是人。

依据本公开的治疗高血糖症的一种方法包括采用给药的任何标准途径，包括胃肠外，如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、经皮、直肠、口服、鼻或通过吸入，给予本公开的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物至患者的步骤。在一个实施方案中，组合物经皮下或肌内给予。在一个实施方案中，组合物经胃肠外给予且胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物被预包装在注射器中。

本文公开的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物可以单独或与其它抗糖尿病剂组合给予。本领域已知的或正在研究的抗糖尿病剂包括天然胰岛素、天然胰高血糖素及其功能类似物、磺脲，如甲苯磺丁脲(orinase)、醋磺环己脲(dymelor)、妥拉磺脲(tolinase)、氯磺丙脲(diabinese)、格列吡嗪(glucotrol)、格列本脲(优降糖,micronase,glynase)、格列美脲(amaryl)，或格列齐特(diamicron)；氯茴苯酸，如瑞格列奈(prandin)或那格列奈(starlix)；双胍类如二甲双胍(glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类如罗格列酮(avandia)、吡格列酮(actos)，或曲格列酮(rezulin)，或其它pparγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制剂，如米格列醇(glyset)、阿卡波糖(precose/拜糖平)；艾塞那肽(exenatide)(byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(dpp-4)抑制剂如维格列汀(vildagliptin)或西他列汀(sitagliptin)；sglt(钠-依赖性葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；或fbpase(果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。

包含本文公开的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物的药用组合物可使用本领域技术人员已知的标准药学上可接受的载体和给药途径配制并给予患者。因此，本公开也涵盖包含一个或多个本文公开的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，与之组合的药学上可接受的载体的药用组合物。在一个实施方案中，药用组合物包含在约4.0-约7.0的ph的磷酸盐缓冲液系统中的1mg/ml浓度的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物。药用组合物可包含作为唯一的药理活性的组分的胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物，或胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物肽可与一个或多个另外的活性剂组合。

构思了本文描述的所有治疗方法、药用组合物、药剂盒和其它类似的实施方案，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物肽包括所有其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，提供具有用于给予胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物至患者的装置的药剂盒。药剂盒还可包括各种容器，例如，小瓶、试管、瓶子等。优选地，药剂盒也应包括使用说明书。依据一个实施方案，药剂盒的装置是气溶胶分配装置，其中组合物被预包装在气溶胶装置中。在另一个实施方案中，药剂盒包含注射器和针头，和在一个实施方案中，胰高血糖素相关肽-胰岛素缀合物组合物被预包装在注射器中。

本发明的化合物可通过标准合成方法、重组dna技术，或制备肽和融合蛋白的任何其它方法制备。虽然某些非-天然氨基酸不能通过标准重组dna技术表达，用于它们的制备的技术是本领域已知的。除了标准肽化学反应(当适用时)外，涵盖非-肽部分的本发明的化合物还可通过标准有机化学反应合成。

依据实施方案1，提供包含胰高血糖素相关肽和胰岛素肽的胰岛素激动剂/肠促胰岛素缀合物，其中胰高血糖素相关肽直接或者通过接头连接于胰岛素肽。在实施方案2中，实施方案1的缀合物具有通过独立地选自在选自a链的a9、a14和a15位置，b链的位置b1、b2、b10、b22、b28或b29的氨基酸侧链的位置，b链的n-末端α胺，b链的羧基末端和在连接单链胰岛素类似物的a链和b链的连接部分的任何位置的氨基酸的侧链，共价连接于胰岛素肽的胰高血糖素相关肽的c-末端区。在实施方案3中，实施方案1或2具有共价连接于胰岛素肽的b链的氨基末端的胰高血糖素相关肽的羧基末端。在实施方案4中，实施方案1-3的任一项的缀合物包含作为单链胰岛素类似物的胰岛素肽。在实施方案5中，实施方案1-4的任一项的缀合物包含单链胰岛素类似物，其中胰高血糖素相关肽连接于连接部分的氨基酸的氨基酸侧链，所述连接部分连接单链胰岛素类似物的a链和b链。在实施方案6中，实施方案1-4的任一项的缀合物包含双链胰岛素类似物且所述缀合物包含第一和第二胰高血糖素相关肽，其中每个胰高血糖素相关肽在选自b链的氨基末端、a链的羧基末端，和b链的羧基末端的位置独立地共价连接于胰岛素肽。

在实施方案7中，提供实施方案1-6的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含

(i)氨基酸序列：

x1-x2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-z(seqidno:839)，另外具有1-3个氨基酸修饰，其中

x1和/或x2是一种非-天然(相对于seqidno:701)氨基酸，其降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，

z选自asn-thr-cooh，和y-cooh，其中y是1-2个氨基酸，和另外其中

(1)内酰胺桥连接位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链，其中i是12、16、20或24或

(2)在胰高血糖素相关肽的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或所有的氨基酸被α,α-二取代的氨基酸取代；

和所述胰高血糖素相关肽具有胰高血糖素激动剂活性；

(ii)seqidno:701的氨基酸序列，其被修饰以包含至少一个选自以下的氨基酸修饰：

用荷电的氨基酸取代位置28的asn；

用选自asp、glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的荷电氨基酸取代位置28的asn；

在位置28用asn、asp或glu取代；

在位置28用glu取代；

用荷电的氨基酸取代位置29的thr；

用选自lys、arg、his、asp、glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的荷电氨基酸取代位置29的thr；

在位置29用asp、glu或lys取代；

在位置29用glu取代；

在位置29后面插入1-3个荷电的氨基酸；

在位置29后面插入glu或lys；

在位置29后面插入gly-lys或lys-lys；或其组合；

和至少一个选自组a或组b的氨基酸修饰，或其组合；

其中组a是选自用thr或aib取代位置16的ser的氨基酸修饰；和

其中组b是选自以下的氨基酸修饰：

用非-天然氨基酸取代位置1的his，所述非-天然氨基酸降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，

用非-天然氨基酸取代位置2的ser，所述非-天然氨基酸降低胰高血糖素相关肽对被二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性，

用phe或val取代位置10的tyr；

用arg取代位置12的lys；

用ala或aib取代位置20的gln；

用glu取代位置21的asp；

用ala或aib取代位置24的gln；

用leu或nle取代位置27的met；

或其组合；

且其中所述胰高血糖素相关肽具有胰高血糖素激动剂活性；

(iii)seqidno:701的胰高血糖素相关肽，其被修饰以包含

(a)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，

(b)(1)在位置i和i+4的氨基酸侧链之间或在位置j和j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i是12、13、16、17、20或24，且其中j是17，或

(2)在类似物的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或所有的氨基酸被α,α-二取代的氨基酸取代，

(c)在位置27、28和29的一个、两个或全部的氨基酸修饰，和

(d)1-6个另外的氨基酸修饰，

其中用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少；

(iv)seqidno:72的序列或seqidno:72的类似物，其中所述类似物与seqidno:72的不同之处在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28和29的1-3个氨基酸修饰，其中所述胰高血糖素相关肽在glp-1受体显示至少20%的天然glp-1的活性；

(v)在不超过10个氨基酸修饰上不同于seqidno:701的氨基酸，所述氨基酸修饰包括在位置16、20、21和/或24使用aib的一个或多个氨基酸取代，和在位置1和/或2提供降低的对由二肽基肽酶iv裂解的敏感性的氨基酸修饰，其中所述胰高血糖素相关肽在glp-1受体显示至少20%的天然glp-1的活性；

在实施方案8中，提供实施方案1-7的任一项的缀合物，其中所述胰岛素肽包含a链和b链，其中所述a链包含序列

givx4x5ccx8x9x10cx12lx14x15lx17x18ycx21-r13(seqidno:19)，且所述b链包含序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45(seqidno:20)，其中

x4是谷氨酸或天冬氨酸；

x5是谷氨酰胺或谷氨酸；

x8是组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；

x9是丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x10是异亮氨酸或丝氨酸；

x12是丝氨酸或天冬氨酸；

x14是酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x15是谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；

x17是谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；

x18是甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；

x21选自选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸，和甲硫氨酸；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x33选自天冬氨酸和谷氨酸；

x34选自丙氨酸和苏氨酸；

x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；

x42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；

x45是酪氨酸或苯丙氨酸；

r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n-末端胺；和

r13是cooh或conh2。

在实施方案9中，提供实施方案1-7的任一项的缀合物，其中所述a链包含序列giveqccx8x9icslyqlenycx21-r13(seqidno:73)，所述b链包含序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45(seqidno:20)

x8是组氨酸或苏氨酸；

x9是丝氨酸、赖氨酸，或丙氨酸；

x21是丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x33选自天冬氨酸和谷氨酸；

x34选自丙氨酸和苏氨酸；

x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；

x42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；

x45是酪氨酸或苯丙氨酸；

r22选自fvnq(seqidno:12)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺和n-末端胺；和

r13是cooh或conh2。

在实施方案10中，提供实施方案1-7的任一项的缀合物，其中所述a链包含序列givdeccx8x9scdlrrlemx19cx21-r13(seqidno:74)和所述b链包含序列r22-x25lcgax30lvdalylvcgdx42gfy(seqidno:75)，其中

x8是苯丙氨酸或组氨酸；

x9是精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；

x19是酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基-苯丙氨酸；

x21是丙氨酸或天冬酰胺；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸；

x42选自丙氨酸、鸟氨酸和精氨酸；和r13是cooh或conh2；

r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12),pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n-末端胺；和

r13是cooh或conh2。

在实施方案11中，提供实施方案1-7的任一项的缀合物，其中所述b链包含序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45yt-z1-b1(seqidno:142)，其中

z1是选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸和脯氨酸-赖氨酸的二肽；和

b1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。

在实施方案12中，提供实施方案1-7的任一项的缀合物，其中所述a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn-r13(seqidno:1)和所述b链包含序列fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)。

在实施方案13中，提供实施方案1-12的任一项的缀合物，其中胰岛素肽是单链胰岛素和连接b和a链的肽接头选自sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpqr(seqidno:52),ssssrapppslpspsrlpgpsdtpilpqk(seqidno:51),gagsssx57x58(seqidno:76),gygsssx57x58(seqidno:21)和gygsssx57x58apqt；(seqidno:77)，其中

x57和x58独立地为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。

在实施方案14中，提供实施方案1-13的任一项的缀合物，其中肽接头选自gygsssrr(seqidno:18)和gagsssrr(seqidno:22)。

在实施方案15中，提供实施方案1-14的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含seqidno:72的序列或seqidno:72的类似物，其中所述类似物与seqidno:72的不同之处在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28和29的1-3个氨基酸修饰，其中胰高血糖素相关肽包含在位置12和16、16和20、20和24，或24和28的氨基酸侧链之间的分子内桥，或其药学上可接受的盐。

在实施方案16中，提供实施方案1-15的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含在位置16和20的氨基酸之间的盐桥或内酰胺桥。

在实施方案17中，提供实施方案1-16的任一项的缀合物，其还包含选自连接于所述胰高血糖素相关肽的羧基末端的seqidnos:78、79和80的肽。在实施方案18中，提供实施方案1-17的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽在位置3的氨基酸是谷氨酸。在实施方案19中，提供实施方案1-18的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽在位置28的氨基酸是asp、asn，或lys，和胰高血糖素相关肽在位置29的氨基酸是gly或thr。在实施方案20中，提供实施方案1-19的任一项的缀合物，其中在胰高血糖素相关肽的位置16的氨基酸是谷氨酸，在胰高血糖素相关肽的位置20的氨基酸是赖氨酸，和胰高血糖素相关肽的c-末端羧酸基团用酰胺，任选地用胰高血糖素相关肽的位置16的谷氨酸和位置20的赖氨酸之间的内酰胺桥替代。在实施方案21中，提供实施方案1-20的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽在位置1或2的氨基酸被修饰，以显示降低的对由二肽基肽酶iv(dpp-iv)裂解的敏感性。在实施方案22中，提供实施方案1-21的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含选自以下的氨基酸序列：

a.seqidno:81；

b.seqidno:83；

c.seqidno:89；

d.seqidnos:84-88的任何一个；

e.seqidnos:100-103的任何一个；

f.seqidno:108，其中在位置20的氨基酸选自精氨酸、鸟氨酸，和瓜氨酸；

g.seqidnos:98、99、109-112、104-106，和seqidno:72的任何一个，其中所述肽在位置28的xaa是天冬酰胺或天冬氨酸；所述肽在位置29的xaa是苏氨酸或甘氨酸；和所述肽的c-末端还包含seqidno:78、seqidno:79、cooh或conh2；和

h.seqidnos:251,319和510的任何一个。

在实施方案23中，提供实施方案1-14的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含具有gip激动剂活性的胰高血糖素(seqidno:701)的类似物，所述类似物包含一个或多个以下的修饰：

(a)在位置1赋予gip激动剂活性的氨基酸修饰，任选地其中在位置1的氨基酸是一种缺少咪唑侧链的氨基酸；

(b)在位置16的ser的氨基酸取代，使用式iv的氨基酸：

[式iv]，

其中n是1-7，其中r1和r2的每一个独立地选自h、c1-c18烷基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)nh2、(c1-c18烷基)sh、(c0-c4烷基)(c3-c6)环烷基、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7，和(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)，其中r7是h或oh，和式iv的氨基酸侧链包含游离氨基，式iv的氨基酸任选地为同型lys、lys、orn或2,4-二氨基丁酸(dab)，

(c)在类似物的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或所有的氨基酸被α,α-二取代的氨基酸取代，

(d)在位置27、28和29的一个、两个或全部的氨基酸修饰，和

(e)相对于胰高血糖素序列(seqidno:701)的1-9个另外的氨基酸修饰，

其中用于gip受体激活的类似物的ec50为约10nm或更少。

在实施方案24中，提供实施方案1-14的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含以下修饰：(a)在位置1的氨基酸是一种大的、芳族氨基酸，任选地为tyr，和(b)其中(i)在位置27的met被一个大的脂族氨基酸(任选的leu)取代，(ii)在位置28的asn被一个小的脂族氨基酸(任选的ala)取代，或(iii)在位置29的thr被一个小的脂族氨基酸(任选的gly)取代，或其中类似物包含(i)、(ii)和(iii)的组合。

在实施方案25中，提供实施方案23或24的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽还包含在位于位置29的氨基酸的c-末端位置连接于所述肽的gpssgappps(seqidno:95)或xgpssgappps(seqidno:96)的氨基酸序列。在实施方案26中，提供实施方案1-14和23-25的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽还包含一个或多个以下的修饰：

(a)在位置2用d-ser、ala、d-ala、gly、n-甲基-ser、aib、val，或α-氨基-n-丁酸取代的ser；

(b)在位置3用glu取代的gln；

(c)在位置10用氨基酸，任选式i的氨基酸取代氨基酸tyr：

其中n=1-4，

包括共价连接于酰基或烷基的侧链；

(d)添加氨基酸，任选式i的氨基酸，包括共价连接于酰基或烷基的侧链，作为类似物的c-末端氨基酸；

(e)在位置12用ile取代的lys；

(f)在位置17用gln取代的arg；

(g)在位置18用ala取代的arg；

(h)在位置21用glu取代的asp；

(i)在位置24用asn取代的gln；和

(j)用荷电的中性基团(任选酰胺)置换c-末端氨基酸的羧酸。

在实施方案27中，提供实施方案1-14和23-25的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含依据seqidnos:227、228、229或230的任何一个的氨基酸序列，其还包含gpssgappps(seqidno:820)或xgpssgappps(seqidno:1096)的氨基酸序列的末端延伸，其中x是位置29的氨基酸的c-末端的任何氨基酸。在实施方案28中，提供实施方案1-14或23的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含选自seqidnos:920-964、146-164、166、192-207、209-221和223的氨基酸序列。在实施方案29中，提供实施方案1-14的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含seqidno:701或修饰的seqidno:701的序列，所述序列包含胰高血糖素相关肽的位置27的氨基酸的c-末端位置的一个、二个、三个或更多个荷电氨基酸和相对于seqidno:701的最多7个额外的氨基酸修饰。在实施方案30中，提供实施方案1-14或29的任一项的缀合物，其中在位置27的氨基酸的c-末端位置的1、2、3或更多个荷电氨基酸被提供，其中荷电氨基酸是glu或asp。在实施方案31中，提供实施方案1-30的任一项的缀合物，其中胰高血糖素相关肽包含haegtftsdvssyleeqaarefiawlvrgrg(seqidno:700)、haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg(seqidno:703)、haegtftsdvssylegqaakeficwlvkgr(seqidno:717)hsqgtftsdyskyldsrraqdfvqwlmnt(seqidno:701)或hsqgtftsdyskylderraqdfvqwlmnt(seqidno:699)的序列。在实施方案29中，提供实施方案1-31的任一项的缀合物，其中胰岛素肽是单链胰岛素类似物，其包含序列gpex25lcgax30lvdalylvcgdx42gfyfnx48x49gagsssrrgivdeccx8rscdlrrlenycn-r13(seqidno:144)、fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpktgagsssrrgiveqcctsicslyqlenycn-r13(seqidno:143)或gpehlcgahlvdalylvcgdrgfyfndrgagsssrrgivdecchrscdlrrlenycn(seqidno:145)，其中

x8是苯丙氨酸或组氨酸；

x25是组氨酸或苏氨酸；

x30是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸；

x42是丙氨酸鸟氨酸或精氨酸；

x48是赖氨酸或天冬氨酸；

x49是脯氨酸、鸟氨酸或精氨酸；和

r13是cooh或conh2。

在实施方案33中，提供实施方案1-32的任一项的缀合物，其中缀合物还被修饰以包含结构u-j，其中

u是氨基酸或羟基酸；

j是通过j的羧基部分和缀合物的胺之间的酰胺键连接于所述缀合物的n-烷基化氨基酸，其中u、j，或u-j连接的缀合物的氨基酸是非-编码氨基酸，另外其中缀合物的u-j在生理条件下，在pbs中的化学裂解半衰期(t1/2)是至少约1小时至约1周。

在实施方案34中，提供实施方案33的任一个的缀合物，其中缀合物还包含共价连接于结构u-j的亲水部分或可供选择地亲水部分共价连接于所述缀合物的氨基酸的侧链，包括在一个或多个对应于a14、a15、b0、b1、b10、b22、b28、b29的位置或天然胰高血糖素(seqidno:701)的位置16、17、20、21、24或29，或在胰高血糖素相关肽的c-末端区共价连接的亲水部分。任选地在任何这些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇。

在实施方案35中，提供实施方案1-32的任一个的缀合物，其中缀合物还被修饰以包含共价连接于氨基酸侧链的酰基或烷基。在进一步的实施方案中，所述酰基或烷基共价连接于胰高血糖素相关肽对应于天然胰高血糖素(seqidno:701)的位置10的位置，或在一个或多个选自胰岛素肽的a14、a15、b0、b1、b10、b22、b28、b29的位置，或在结构u-j的氨基酸侧链。依据本公开还提供一种包含前述实施方案的任何一个的缀合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体的药用组合物。

实施例1

胰岛素a&b链的合成

胰岛素a&b链在4-甲基benzhyryl胺(mbha)树脂或4-羟基甲基-苯基乙酰氨基甲基(pam)树脂上使用boc化学合成。于0℃，使用hf/对-甲酚95:5，从树脂裂解肽1小时。除去hf和沉淀醚后，使肽溶于50%含水乙酸并冻干。可供选择地，使用fmoc化学合成肽。于室温下，使用三氟乙酸(tfa)/三异丙基硅烷(tis)/h2o(95:2.5:2.5)从树脂裂解肽2小时。通过添加过量的乙醚沉淀肽并使沉淀丸粒溶于含水酸性缓冲液中。通过rp-hplc监测肽的质量并经质谱(esi或maldi)证实。

用在氨基酸7的单一游离半胱氨酸和所有作为乙酰氨基甲基a-(sh)⁷(acm)^6,11,20保护的其它半胱氨酸合成胰岛素a链。用在位置7的单一游离半胱氨酸和作为乙酰氨基甲基b-(sh)⁷(acm)¹⁹保护的其它半胱氨酸合成胰岛素b链。通过常规rp-hplc纯化粗肽。

依据在图1概述的通用程序，合成的a和b链通过它们的天然二硫键连键彼此连接。各自的b链通过溶于dmf或dmso被激活至cys⁷-npys类似物并于室温下与2,2’-二硫代双5-硝基吡啶)(npys)按1:1摩尔比反应。通过rp-hplc监测激活和并经esi-ms证实产物。

第一b7-a7二硫键通过各自的a-(sh)⁷(acm)^6,11,20和b-(npys)⁷(acm)¹⁹以1:1摩尔比溶解至10mg/ml的总肽浓度而形成。当链组合反应完成时，将混合物稀释至50%乙酸水溶液的浓度。最后两个二硫键通过添加碘同时形成。将40倍摩尔过量的碘加入到溶液中并于室温下搅拌混合物另外1小时。通过添加抗坏血酸水溶液终止反应。该混合物经rp-hplc纯化和最终化合物经maldi-ms证实。如图2和表1中的数据所示，依据该程序制备的合成胰岛素完全可与用于胰岛素受体结合的纯化胰岛素相比。

包含修饰的氨基酸(例如在位置a19的4-氨基苯丙氨酸)的胰岛素肽也可使用允许将非-编码氨基酸结合到蛋白中的系统，包括例如，在美国专利号7,045,337和7,083,970中讲述的系统经体内合成。

表1：合成的胰岛素相对于天然胰岛素的活性

实施例2

胺基团(n-末端和赖氨酸)经还原性烷基化的聚乙二醇化

a.合成

将胰岛素(或胰岛素类似物)、mpeg20k-醛，和nabh3cn按1:2:30的摩尔比溶于4.1-4.4的ph的乙酸缓冲液。反应溶液包含0.1nnacl、0.2n乙酸和0.1nna2co3。胰岛素肽浓度是约0.5mg/ml。反应于室温下发生6小时。反应程度经rp-hplc监测且反应得率是约50%。

b.纯化

反应混合物用0.1%tfa稀释2-5倍并施用于制备型rp-hplc柱。hplc条件：c4柱；流速10ml/min；a缓冲液10%acn和0.1%tfa在水中；b缓冲液0.1%tfa在acn中；线性梯度b%从0-40%(0-80min)；peg-胰岛素或类似物在约35%缓冲液b中洗脱。在通过sulftolysis或胰蛋白酶降解进行化学修饰之后，所需化合物经maldi-tof证实。

胺基团(n-末端和赖氨酸)通过n-羟基琥珀酰亚胺酰基化的聚乙二醇化

a.合成

使胰岛素(或胰岛素类似物)与mpeg20k-nhs一起按1:1摩尔比溶于0.1n二羟乙基甘氨酸缓冲液(ph8.0)。胰岛素肽浓度是约0.5mg/ml。通过hplc监测反应进行。于室温下2小时后，反应的得率为约90%。

b.纯化

将反应混合物稀释2-5倍并装载到rp-hplc。

hplc条件：c4柱；流速10ml/min；a缓冲液10%acn和0.1%tfa在水中；b缓冲液0.1%tfa在acn中；线性梯度b%从0-40%(0-80min)；在约35%b中收集peg-胰岛素或类似物。在通过sulftolysis或胰蛋白酶降解进行化学修饰之后，所需化合物经maldi-tof证实。

乙酰基在苯丙氨酸的芳环上的还原性氨化聚乙二醇化

a.合成

使1:2:20摩尔比的胰岛素(或胰岛素类似物)、mpeg20k-酰肼，和nabh3cn溶于乙酸缓冲液(ph4.1-4.4)。反应溶液包含0.1nnacl、0.2n乙酸和0.1nna2co3。于室温下24h时，胰岛素或胰岛素类似物浓度为约0.5mg/ml。反应过程经hplc监测。反应的转化是约50%(经hplc计算)

b.纯化

将反应混合物稀释2-5倍并装载到rp-hplc中。

hplc条件：c4柱；流速10ml/min；a缓冲液10%acn和0.1%tfa在水中；b缓冲液0.1%tfa在acn中；线性梯度b%从0-40%(0-80min)；在约35%b中收集peg-胰岛素，或peg-胰岛素类似物。在通过sulftolysis或胰蛋白酶降解进行化学修饰之后，所需化合物经maldi-tof证实。

实施例3

胰岛素受体结合分析：

每个肽对胰岛素或igf-1受体的亲和力以竞争结合分析法，利用闪烁接近技术测定。肽的系列3-倍稀释液在tris-cl缓冲液(0.05mtris-hcl，ph7.5，0.15mnacl，0.1%w/v牛血清白蛋白)中制备并在96孔板(corninginc.,acton,ma)中与0.05nm(3-[125i]-碘代酪氨酰)，一种tyra14胰岛素或(3-[125i]-碘代酪氨酰)igf-1(amershambiosciences,piscataway,nj)混合。将从细胞过度表达人胰岛素或igf-1受体制备的1-6微克的血浆膜片段的等分试样放入每孔中并加入0.25mg/孔的聚乙烯亚胺-处理的麦胚凝集素a型闪烁接近分析株(amershambiosciences,piscataway,nj)。以800rpm震摇5分钟后，将板于室温下温育12h并用microbeta1450液体闪烁计数器(perkin-elmer,wellesley,ma)测定放射性。非-特异性结合(nsb)放射性在孔中用比最高浓度的试验样品4-倍浓度过量的“冷”的天然配体测定。总结合放射性在无竞争剂的孔中检测。百分比特异性结合如下计算：%特异性结合=(结合-nsb/总结合-nsb)x100。ic50值通过使用origin软件(originlab,northampton,ma)测定。

实施例4

胰岛素受体磷酸化分析：

为测量胰岛素或肠促胰岛素-胰岛素缀合物的受体磷酸化，将受体转染的hek293细胞平铺在96孔组织培养板(costar#3596,cambridge,ma)中并于37℃、5%co2和90%湿度下，在补充有100iu/ml青霉素、100g/ml链霉素、10mmhepes和0.25%牛生长血清(hyclonesh30541,logan,ut)的dulbecco’s改良的eagle培养基(dmem)中培养16-20hrs。在补充有0.5%牛血清白蛋白(rocheappliedscience#100350,indianapolis,in)的dmem中制备胰岛素或胰岛素类似物的系列稀释液并加入到含有粘附细胞的孔中。于37℃、在含有5%co2的潮湿气氛中培养15min后，于室温下用5%仲甲醛固定细胞20min，用磷酸缓冲盐水(ph7.4)洗涤两次并用2%牛血清白蛋白在pbs中阻断1hr。然后将板洗涤3次并按照生产商的建议，用在含有2%牛血清白蛋白的pbs中重新构成的辣根过氧化物酶-缀合的抗磷酸酪氨酸抗体填充(upstatebiotechnology#16-105,temecula,ca)。于室温下培养3hrs后，洗涤板4次并将0.1mltmb单一溶液底物(invitrogen,#00-2023,carlbad,ca)加入到每孔中。经加入0.05ml1nhcl5min后停止显色。在titertekmultiscanmcc340(thermofisher,pittsburgh,pa)上测定于450nm处的吸光度。对吸光度对比肽浓度剂量反应曲线作图并通过使用origin软件(originlab,northampton,ma)测定ec50值。

胰高血糖素和glp-1功能分析-camp合成

各个肠促胰岛素或肠促胰岛素-胰岛素类似物诱导camp的能力以萤火虫荧光素酶-基报道基因分析来测定。用受体(胰高血糖素受体、glp-1受体或gip受体)和连接于camp反应元件的荧光素酶基因共同转染的hek293细胞通过在补充有0.25%牛生长血清(hyclone,logan,ut)的dmem(invitrogen,carlsbad,ca)中培养16h剥脱血清，然后于37℃、5%co2中，与系列稀释的或者胰高血糖素、glp-1、gip或者新的胰高血糖素类似物一起在96孔聚-d-赖氨酸-包被的“biocoat”板(bdbiosciences,sanjose,ca)培养5h。在培养结束后，将100微升的luclite荧光底物试剂(perkin-elmer,wellesley,ma)加入到每孔中。短暂震摇板，在暗处培养10min并在microbeta-1450液体闪烁计数器(perkin-elmer,wellesley,ma)测量光输出量。有效的50%浓度通过使用origin软件(originlab,northampton,ma)计算。

实施例5

胰岛素样生长因子(igf)类似物igf1(y^b16l^b17)

申请人已发现，igf类似物作为天然胰岛素在胰岛素受体上显示类似的活性。更特别地，igf类似物(igf1(y^b16l^b17)包含天然igfa链(seqidno:5)和修饰的b链(seqidno:6)，其中天然igfb-链(seqidno:3)在位置15和16的天然谷氨酰胺和苯丙氨酸已分别用酪氨酸和亮氨酸残基替换。如以图4和下表2中所示，igf1(y^b16l^b17)和天然胰岛素的结合活性显示各自是胰岛素受体的高度有效的激动剂。

表2

实施例6

另外的igf胰岛素类似物

igf1(y^b16l^b17)肽序列的进一步的修饰揭示，另外的igf胰岛素类似物在它们在胰岛素和igf-1受体的效力上是变化的。对这些类似物的每一个的结合数据呈现表3中(使用实施例3的分析)，其中修饰的位置基于在天然胰岛素肽(dpi=desb26-30)对应的位置指定。例如，本文提及“位置b28”而缺少任何进一步的详尽描述时，将意指胰岛素类似物b链的对应的位置b27，其中seqidno:2的第一氨基酸已经缺失。因此通常提及"b(y16)"是指天然igf-1序列(seqidno:3)的b链在位置15的酪氨酸残基的取代。关于胰岛素和igf类似物的相对受体结合的数据在表3中提供，而关于igf类似物刺激的磷酸化(使用实施例4的分析)的数据在表4中提供。

实施例7

单链胰岛素类似物的生物合成和纯化

包含经由igf-ic链连接的天然胰岛素b和a链(b⁰-c¹-a⁰)的胰岛素-igf-i小基因被克隆到在用于毕赤(pichiapastoris)酵母中的重组蛋白的组成性表达和纯化的gap启动子(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的启动子)下的表达载体pgapzαa(从invitrogen购得)中。小基因被融合到用于分泌重组蛋白进入介质的n-末端肽编码酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)α-交配因子前导信号中。在小基因和前导α-交配因子序列之间的kex2裂解位点被用来裂解用于分泌小基因的前导序列与天然氨基末端。将单-位点丙氨酸突变在b⁰c¹a⁰小基因的位置1(g1a)、2(y2a)、3(g3a)、4(s4a)、5(s5a)、6(s6a)、7(r7a)、8(r8a)、10(p10a)、11(q11a)，和12(t12a)引入c肽。

包括b⁰c¹a⁰、11个丙氨酸突变，和其它选择的衍生物的小基因经电穿孔转化为毕赤酵母。在最小的甲醇板上选择阳性转化体并进行每个毕赤分离株的基因组制备，整合到酵母基因组中的构件经pcr确认。833碱基对pcr产物在琼脂糖dna凝胶上显示。胰岛素类似物由对应的酵母发酵生产线生产。酵母细胞通过在500mlbeckman离心管中以5k离心20分钟形成沉淀并保留介质用于随后的蛋白纯化。

生长培养基上清液通过0.2μm微孔(millipore)滤器过滤。将乙腈(acn)加入到上清液至最终体积的20%。经一种得自sigma的amberlitexad7hp树脂纯化上清液，用20%的can水溶液预平衡。然后用30ml20%的can水溶液洗涤树脂两次并用30%含有0.1%tfa的can水溶液除去污染物，用54%的含有0.1%tfa的can水溶液从柱洗脱部分纯化的胰岛素类似物并冻干。使冻干的样品再悬浮于0.025mnh3hco3(ph8)中并在lunac18柱(10μm粒径,300a°孔径)上纯化。使用20-60%的can水溶液的线性梯度液从柱洗脱蛋白。合并maldi-ms阳性部分并转移至一次性闪烁瓶用于随后的冻干法。然后将冻干的样品再悬浮于20%含有0.1%tfa的can水溶液中，并在lunac18柱(10μm粒径,300a°孔径)上纯化。使用18-54%的含有0.1%tfa的can水溶液的线性梯度液从柱洗脱蛋白。在吸光度280nm处监测蛋白洗脱液。maldi-tofms阳性部分经由c8分析柱分析，以确保纯度。

b⁰-c^1-a⁰类似物显示在胰岛素受体同工型和igf-1受体二者的相等有效的效力。在位置2的酪氨酸突变为丙氨酸或通过缺失c9-12将c-肽缩短为8个氨基酸，提供由显著减少igf-1受体活性所致的胰岛素作用特异性的选择性增强。也见在表5a和5b中提供的数据：

表5a

表5b

c-肽的位置2和3对在igf-1受体与胰岛素受体的修饰是最敏感的，证明对修饰是相对免疫的。所有类似物与某些特异性类似物维持单一单位毫微摩尔活性，证明效力稍有提高(低单一单位毫微摩尔)。大多数胰岛素选择性类似物是发明人失去c-肽的最后4个残基的那些，具有在c-肽的位置2的丙氨酸突变，或两种变化的组合。

实施例8

用于肠促胰岛素-胰岛素杂化物的表达载体的构建

肠促胰岛素-胰岛素杂化物的每一个的基因经pcr分析，然后连接至自pet30a修饰的表达载体，pet30a包含小的遍在蛋白-样修饰基因(sumo)作为融合前导序列。有一个位于sumo和肠促胰岛素-胰岛素杂化物之间的烟草蚀纹病毒(tobaccoetchvirus)(tev)蛋白酶裂解位点。采用in-fusionhd克隆系统(clontech)用于连接。

肠促胰岛素-胰岛素杂化物的表达和纯化如下进行。表达载体被转化至origamib(de3)(novagen)感受态细胞。于37℃，在含50ug/ml氨比西林、25ug/m卡那霉素和5ug/ml四环素的luria肉汤(luriabroth)(lb)中培养细胞，直至do600nm达到0.8-1.0。在这一点上，温度改为18℃并将iptg加入(0.2mm)到培养物中以诱导基因表达。连续诱导过夜，然后通过以5,000rpm离心15分钟收获细胞。

使发酵细胞沉淀物悬浮于25mmtris(ph8.0)中，所述tris包含300mmnacl、10mm咪唑、6m胍盐酸盐并通过超声处理来溶解。溶胞产物以15,000rpm离心30分钟并将上清液装载到ni-nta亲和力柱上。用25mmtris(ph8.0，包含300mmnacl、20mm咪唑)洗涤柱。用25mm相同的缓冲液tris(ph8.0，具有也含有500mm咪唑的300mmnacl)洗脱蛋白。于4℃，用tev蛋白酶将纯化的蛋白消化过夜并用miliq水稀释4倍v/v。将这种蛋白溶液施加于用含10%甘油的20mmtris(ph8.0)预平衡的q-sepharose柱。用超过15个柱体积的100-600mmnacl的梯度液洗脱q-sepharose柱。色谱法纯化蛋白的纯度经分析hplc和maldi-tof质谱确认。

实施例9

肠促胰岛素-胰岛素融合物的体外活性

构建一系列肠促胰岛素-胰岛素融合多肽，以使用在实施例4公开的体外分析测定所述化合物在胰岛素和各自的肠促胰岛素受体的活性。图6提出一组与单链胰岛素类似物形成的glp1和gip融合肽的序列。形成另外的肠促胰岛素-胰岛素衍生物，其中缀合物的胰岛素组分或肠促胰岛素组分的序列被修饰以消除缀合物的两个组分之一的活性。

更特别地，glp-1母肽(glp1-dp8；seqidno:132)在glp-1受体具有激动剂活性的glp-1肽和在胰岛素受体具有激动剂活性的胰岛素肽(dp8)之间形成。制备glp1-dp8的衍生物，其中胰岛素序列通过用丙氨酸取代位置a19的酪氨酸进行修饰，以有效地消除胰岛素活性(glp1-dp8a19；seqidno:133)，或glp序列通过用丙氨酸取代位置22的苯丙氨酸被修饰，以有效地消除glp-1活性(glp1-a22；seqidno:134)。类似地，胰高血糖素母肽(glu-dp8；seqidno:135)在胰高血糖素受体具有激动剂活性的胰高血糖素肽和在胰岛素受体具有激动剂活性的胰岛素肽之间形成。制备glu-dp8衍生物，其中胰岛素序列通过用丙氨酸取代位置a19的酪氨酸被修饰，以有效地消除胰岛素活性(glu-dp8a19；seqidno:136)，或胰高血糖素序列通过用谷氨酸取代位置3的谷氨酰胺进行修饰，以消除胰高血糖素活性。另外地，设计具有在胰岛素、胰高血糖素和glp-1受体的活性的glu-dp8的其它衍生物，其中glu-dp8序列通过用谷氨酸取代位置16的丝氨酸被修饰(胰高血糖素e16(seqidno:138)。

各缀合物如实施例8公开的合成并经色谱法纯化。图7和8分别提出合成的glp1-dp8和glu-dp8缀合物的经色谱法分离的池部分在胰岛素、glp1和胰高血糖素受体(相对于天然胰岛素、igf-1和天然胰高血糖素)的ec50值。对于分离的glp1-dp8缀合物部分，池1显示与天然胰岛素在胰岛素受体几乎相同的活性(见图7)。所有3个池显示在glp1受体的高活性。因此，池1的缀合物显示与天然胰岛素和天然glp1在它们两个各自受体的同样高的效力。对于分离的glu-dp8缀合物部分，池1显示与天然胰岛素在胰岛素受体类似的活性，而胰高血糖素序列的存在适度减少缀合物在胰岛素受体的活性。池1和3显示在胰高血糖素受体的高活性。所有3个池显示在glp-1受体的差的活性。因此，池1的缀合物在胰岛素和胰高血糖素显示高的效力，但保留关于glp1受体的选择性。因此，纯化缀合物显示在其各自受体的期望的活性，表明缀合物保留两个结合的原始活性肽的活性。

glu-dp8和glp1-dp8缀合物降低血葡萄糖水平的能力通过给予化合物至c57bl/6小鼠和测量血葡萄糖来研究。小鼠以两个剂量(12nmol/kg或60nmol/kg)的天然胰岛素(图9a)，或者以3个不同浓度(12nmol/kg、60nmol/kg和300nmol/kg)给予的缀合物、glp1-dp8(图9b)或glu-dp8(图9c)之一经皮下注射。缀合物显示血葡萄糖的较平缓下降和比天然胰岛素更长的半衰期(更长的作用持续时间)。此外，glp1-dp8(图9b)在葡萄糖降低方面比glu-dp8(图9c)更具活性。这被认为是由胰高血糖素对胰岛素活性的缓冲作用产生的。因此，缀合物显示降低体内血葡萄糖的能力和具有不同于天然胰岛素的特性。

glu-dp8和glp1-dp8缀合物的活性可使用已知的敲除缀合物的两个(肠促胰岛素或胰岛素)活性之一的突变来修饰。在胰岛素、胰高血糖素和glp-1受体测试每个修饰的glu-dp8和glp1-dp8缀合物(glp1-dp8a19、glp1-a22、glu-dp8a19、胰高血糖素e3和胰高血糖素e16)且缀合物的活性达到每个化合物的期望活性。

图10提供glp1-dp8和glp1-dp8a19的体外活性。在a19位置的丙氨酸的取代有效地消除胰岛素在胰岛素受体的活性。ec50值表明胰岛素和glp1-dp8二者均为有效的胰岛素受体激动剂，而glp-1和glp1-dp8a19在胰岛素受体具有差的活性。

图11提出glu-dp8和衍生物缀合物的体外胰岛素受体活性(ec50值)。简言之，每个化合物显示在胰高血糖素和胰岛素受体的活性并且该活性可通过修饰胰岛素或胰高血糖素序列而被破坏。每个缀合物显示活性与其肽序列一致，而各缀合物不交叉反应。特别地，ec50值表明胰岛素和glu-dp8二者均为有效的胰岛素受体激动剂，而胰高血糖素和glu-dp8a19在胰岛素受体具有差的活性。glue3-dp8和glue16-dp8也由于dp8胰岛素序列的存在，在胰岛素受体显示高的效力。

图12提出glu-dp8、glue3-dp8和glue16-dp8、glu-dp8a19，和glp-1-dp8的体外的胰高血糖素受体活性(ec50值)。胰高血糖素在位置3的谷氨酸取代已知有效地消除胰高血糖素活性，和胰岛素在a19位置的丙氨酸的取代已知有效地消除胰岛素在胰岛素受体的活性。胰高血糖素在位置16的谷氨酸取代产生胰高血糖素和glp-1的共激动剂。ec50值指明，胰高血糖素、glu-dp8和glue16-dp8是有效的胰高血糖素受体激动剂，而glp-1和glp1-dp8，和glue3-dp8在胰高血糖素受体具有差的活性。因此，缀合物显示出期望的活性。

图13提出glp-1、glp-1-dp8、glp-1a22-dp8、glp-1-dp8a19、glu-dp8，和glue16-dp8的体外glp-1受体活性(ec50值)。glp-1a22-dp8表示胰岛素和glp-1的缀合物，其中位置22已用丙氨酸取代，一种已知有效地消除glp-1活性的修饰。ec50值表明glp-1、glp1-dp8和glp1-dp8a19是有效的glp-1受体激动剂，而glp-1a22-dp8、glu-dp8，和glue16-dp8具有在glp-1受体的较少的活性。因此，缀合物显示出期望的活性。

glp1-dp8和glu-dp8缀合物及其衍生物对其降低血葡萄糖水平的能力进行了体内测试。体内结果与体外受体数据一致。图14a-14b提出所列缀合物在给予dp8(图14a)或glp1-dp8a19(图14b)的c57bl/6小鼠(相对于天然胰岛素)中对血葡萄糖水平的体内效果。dp8成功地降低血葡萄糖，而glp1-dp8a19未能显著降低血葡萄糖水平。图15a-15c提出所列缀合物在给予glu-dp8a19(图15a)或glp1a22-dp8(图15b)或glue3/dp8(图15c)的c57bl/6小鼠(相对于天然胰岛素)中对血葡萄糖水平的体内效果。glu-dp8a19缀合物缺乏胰岛素活性，但仍诱导由胰高血糖素刺激的胰岛素分泌产生的体内血葡萄糖降低。作为在位置22取代的结果，glp1a22-dp8具有减少的胰高血糖素活性，然而缀合物的胰岛素组分提供血葡萄糖减少活性，以致缀合物具有约五分之一的胰岛素活性。由于在位置e3的取代，glue3/dp8具有减少的胰高血糖素活性，然而缀合物具有相对于天然胰岛素稍微钝化的葡萄糖降低活性。