利用铁添加剂作为培养基补充剂来检测硫酸盐还原细菌的方法与流程

本发明涉及结构监测的检测领域。更具体地说，本发明涉及硫酸盐还原细菌(srb)的监测，所述硫酸盐还原细菌(srb)引起油工业中使用的基础金属结构发生降解和腐蚀破坏。

背景技术：

在石油工业中，微生物菌落可以在基础设备上生长。特别地，由于srb将硫酸盐还原为硫化物的能力，因此硫酸盐还原细菌(srb)的生长对于石油工业是有问题的。发现硫化物会造成腐蚀、注入井的堵塞、气体和/或油的变酸以及有毒硫化氢的增加。这些问题由于设备故障、去除硫化物所需的额外设备、控制微生物生长的杀生物剂的补救性使用以及去除或防止硫化铁沉积物使用的额外化学物质而大大提高了生产成本。

传统上，石油工业使用最大或然数(mpn)法来检测现场样品中srb的生长。mpn法很慢，并且可能需要高达28天才能报告最终读数。这个方法的另一个缺点是其不能检测到低密度的活srb细胞。因此，srb可以存在于样品中而没有被检测到，因为其浓度低于mpn法的检测极限。

直接镜检法是一种快速的替代方法，但不能区分活细菌和死细菌。也可以使用其它srb测试试剂盒；然而，这些试剂盒在测试长度时间过长和缺乏灵敏度方面都有其自身的相关缺点。因此，需要一种srb检测方法，所述方法易于适应油田的严苛条件并且具有增强的灵敏度，将改善硫酸盐还原细菌和其生长的检测。

关于这些和其它考虑因素，提出了本文所公开的内容。

技术实现要素：

根据本发明，提供了一种测定包含的硫酸盐还原细菌(srb)的浓度的方法。所述方法包含：在一组测试瓶中制备标准生长培养基；将四水合氯化亚铁(fcth)添加到每个所述测试瓶中；将样品部分添加到所述组测试瓶中的第一个中；通过向所述测试组中的后续小瓶中注入依序排列的前一个小瓶的液体来依序稀释样品部分；以及培育所述组测试瓶，其中所培育的测试瓶中的液体变黑指示存在阈值数目个srb。

在一些实施例中，测定根据本发明的srb的浓度的方法包括在添加fcth之前向所述组测试瓶中的标准生长培养基中添加铁源。在一些实施例中，以每9毫升标准生长培养基0.01克的剂量添加fcth。在某一实施方式中，将fcth以0.5到1毫升溶液添加到8毫升标准生长培养基和1毫升测试样品中。

在其它实施例中，测定根据本发明的srb的浓度的方法包括调节标准生长培养基的ph以补偿大约7.6的fcth的添加。在其它实施例中，通过从已经含有混合的测试样品的小瓶中抽出一毫升并且将抽出的毫升注入下一顺序的小瓶中来执行依序稀释的步骤。在一些实施方式中，将那组测试瓶培育5到7天。在一些实施方式中，测试瓶可以在37摄氏度下培育。

本发明还提供一种用于测定测试样品中的硫酸盐还原细菌(srb)的浓度的测试试剂盒。测试试剂盒的实施例包含一组含有标准生长培养基的测试瓶和包含四水合氯化亚铁(fcth)的铁添加剂，以添加到测试瓶中。在测定期间，将测试样品添加到所述组测试瓶中的第一个中，并且在所述组的其余小瓶中依序稀释测试样品。将测试瓶与稀释的样品和铁添加剂一起培育后，所述组中任何测试瓶中的液体变黑指示srb浓度高于阈值水平。

在一些实施例中，小瓶填充有8毫升标准生长培养基和0.5到1毫升fcth。在一些实施方式中，向第一个测试瓶中注入1毫升测试样品。另外，可以调节标准生长培养基的ph，以将fcth铁添加剂补偿到大约7.6。

这些和其它方面、特征和优点可从本发明的某些实施例和附图以及权利要求的以下描述中理解。

附图说明

图1是根据本发明的一实施例使用fcth添加剂来确定现场样品中硫酸盐还原细菌的存在和量的测试组和对照组的制备方法的流程图；

图2是根据本发明的一实施例将fcth铁添加剂施加到测试组以准备srb浓度测试的方法的流程图；

图3是根据本发明的一实施例利用添加fcth依序稀释测试样品的过程的示意图；和

图4是使用本发明的方法对srb进行三次例示性测试的结果的示意图。

图5是根据现有技术用于将稀释测试结果校准为srb浓度估计值的表。

具体实施方式

为了更快速和准确地测试样品中存在的srb数目，公开了一种测试方案，其中将铁化合物四水合氯化亚铁(feso4·7h2o)(“fcth”)用作标准细菌生长培养基的添加剂。如本文所述，这种添加剂充当标准培养基的补充培养基，并且不仅增加了srb检测灵敏度，而且还提供了对srb生长的快速检测。特别地，如本文所述，srb的本发明检测方法依赖于目测提示以提醒测试者存在srb，并且更特别地，生长培养基由于硫化铁的悬浮已变成黑色而将清楚地揭示srb的存在。

所述方案以采用标准培养基(例如apirp386)开始，以支持srb的生长，并且然后以连续稀释的方式添加fcth。培育后，fcth通过srb促进硫化铁的生产，这使培养基变黑并且为srb的存在提供标记。使用具有不同稀释度的小瓶，可以根据在样品中目测检测到硫化铁变黑(即生长培养基变成黑色)的稀释度来估计存在的srb数目。fcth的添加将检测下限提高到每毫升大约10⁴到10⁵个细胞。

图1是根据本发明确定现场样品中硫酸盐还原细菌的存在和量的测试组和对照组的制备方法的一实施例的流程图。在步骤101中，所述方法开始。在步骤102中，从现场设备(例如，石油管道、井孔、储存容器)收集样品，以确定样品是否含有srb，并且如果是，那么确定其所含srb的量。在第二步骤104中，制备铁添加剂。在一些实施方式中，这一步骤涉及将1克fcth溶解于100毫升蒸馏水中，用氩气吹扫溶液，并且然后将溶液密封并且高压灭菌大约15分钟(这产生浓度为10mg/ml的铁添加剂溶液)。

在步骤106中，制备标准srb生长培养基(“标准培养基”)。在一些实施方式中，标准培养基使用水和下表1中所示的组分制备。

表1

在标准培养基的制备过程中，可以调节用于形成培养基的水的盐度，以匹配样品的盐度(例如，可以使用具有类似盐度的水(合成水或过滤后的原水))。另外，可以针对铁的存在来调节标准培养基的ph。举例来说，可以将不含铁补充剂的所制备的培养基的ph与包括1ml铁补充剂的标准培养基的ph进行比较。如果两种培养基的ph明显不同，那么可以调节包括铁补充剂的标准培养基的ph，使其与不含铁补充剂的标准培养基的ph匹配。一般来说，可以单独制备表1中列出的组分，以避免沉淀并且维持厌氧条件。

在制备标准培养基并且调节盐度之后，在步骤108中，通过将一定数量的标准培养基分布到一组小瓶中来形成测试对照组，还向每个小瓶中添加铁源，例如铁钉子。然后将小瓶密封。在一特定实施方式中，将9ml标准培养基分布到八个或更多个小瓶中。在步骤110中，通过将较少量标准培养基分布到第二组小瓶(“测试组”)中类似地制备测试组，还向每个小瓶中添加铁源(例如钉子)以及fcth。然后也将测试组小瓶密封。在一特定实施方式中，将8ml标准培养基分布到测试组的小瓶中。然后，将包括fcth的0.5ml堆叠溶液(1g/ml溶液)添加到测试组中。

图2是将fcth铁添加剂施加到测试组以准备srb浓度测试的方法的流程图。在步骤201中，所述方法开始。在步骤202中，将测试瓶在高压釜或类似灭菌装置中灭菌一小时。在灭菌之后，在步骤204中，向测试组的第一小瓶中注入1.0ml待测试样品，并且然后将溶液充分混合。在步骤206中，从第一小瓶中提取1ml混合物，然后将其添加到测试组的下一个小瓶中。以这种方式，连续的小瓶接收样品的稀释部分(即十分之一浓度)。重复依序添加和提取的过程，直到在步骤208中确定测试组中的所有八个或更多个小瓶已接种有一部分样品。这个过程在图3中示意性地示出。如图所示，测试组包括六个小瓶302、304、306、308、310和312。尽管展示六个小瓶，但这仅是为了便于说明，并且可以使用较小或优选较大数目个小瓶。展示注射器315，其能够将液体注入小瓶302-312中并且从小瓶302-312中抽出液体。第一小瓶302包括9ml液体，并且注入1ml样品，产生1:10的样品/液体比，或原始样品浓度的十分之一。当从小瓶302中抽出1ml液体并且注入小瓶304中时，小瓶304然后有效地含有原始样品浓度的十分之一的十分之一，或1:100的样品/液体比。在从小瓶中依序抽出1ml液体并且将所抽出的液体注入下一个顺序小瓶的过程中，样品/液体比呈几何下降：小瓶306的比例为1:1000，小瓶308的比例为1:10,000，小瓶310的比例为1:100,000，并且小瓶312的比例为1:1,000,000。

接种测试组后，在步骤210中，将一定量的fcth(例如0.5ml)添加(例如，通过注射)到所有小瓶(其含有稀释样品)中，并且将所得溶液充分混合。在步骤212中，将依序稀释的测试组小瓶在37摄氏度下培育一段时间。优选的培育时间为五(5)到七(7)天，比需要28天的普遍方法减少至少75％。培育后，在步骤214中，当测试组小瓶中的培养基由于硫化铁的悬浮而变成黑色时，揭示srb的存在并且测定其量值。

图4是展示不同原始样品的三次例示性样品测试：测试1、测试2和测试3的示意图。如图所示，在测试1中，四个小瓶402、404、406和408中的液体展示为已变黑，指示srb的阈值浓度，(而两个小瓶410、412中的液体展示为未变黑，指示srb浓度低于小瓶410、412中的阈值。小瓶402、404、406和408分别表示10^-1、10^-2、10^-3和10^-4样品/液体比，而小瓶410和412分别表示10^-5和10^-6样品/液体比。这表明，超出原始样品的1:10,000稀释水平后，srb浓度不足，无法通过产生硫化铁而使液体变黑。类似地，在测试2中，四个小瓶422、424、426和428中的液体展示为已变黑，再次指示srb的阈值浓度，而两个小瓶430、432中的液体展示为未变黑，指示srb浓度低于小瓶430、432中的阈值。小瓶422、424、426和428分别表示10^-1、10^-2、10^-3和10^-4样品/液体比，而小瓶430和432分别表示10^-5和10^-6样品/液体比。测试2类似地表明，在超出原始样品的1:10,000稀释水平后，srb浓度不足，无法通过产生硫化铁而使液体变黑。因此，在测试1和2中，在10^-4稀释水平下的液体变黑指示测试中使用的原始样品中srb的量值，所述量值可以转换为测试1和测试2中使用的原始样品中存在的srb的浓度的量度。

可以使用最大或然数(mpn)校准方法将发生变黑的稀释水平以足够准确的程度转换为样品中每毫升的srb数的估计值。mpn校准方法利用一张表格，在表格中标准稀释测试的结果用生物体浓度的估计值进行校准。作为一实例，以下实例说明如何使用这个方法。对于样品进行取样并且用于srb浓度的三次连续稀释测试。小瓶结果直接展示于下表2中，其中“+”指示变黑，而“-”指示未变黑。从测试结果中，选择第五、第六和第七次稀释以提供样品中srb浓度的估计值。如表2所指示，所有三次测试在10^-5水平下呈阳性(图5的mpn表中为10^-n)，2次测试在10^-6水平下呈阳性(mpn表中为10^-n+1)，并且1次测试在10^-7水平下呈阳性(mpn表中为10^-n+2)。将mpn表中的这种3-2-1模式与mpn估计值相匹配，得出1.5的值。乘以稀释因数得出原始样品的值为1.5×10⁵个srb。

表2：用mpn表进行实例校准

相反，在测试3中，只有三个小瓶442、444、446中的液体变黑，指示srb的阈值浓度，而两个小瓶448、450和452中的液体展示未变黑，指示srb浓度低于小瓶448、450和452中的阈值。小瓶442、444和446分别表示10^-1、10^-2和10^-3样品/液体比，而小瓶448、450和452分别表示10^-4、10^-5和10^-6样品/液体比。因此，测试3与测试1和2的不同之处在于，超出原始样品的1:1,000稀释水平(与1:10,000的水平相反)后，srb浓度不足，无法通过产生硫化铁而使液体变黑。

进行了许多测试，其中使用了具有不同盐度和srb培养物的各种类型的水样品。制备srb培养物并且与不同地点分离，即阿布阿里(abuali)供水、阿布阿里处理水、硬水和乌斯曼尼亚(uthmaniyah)供水。将不同体积(即0.1ml和0.2ml)的srb培养物注入100ml蒸馏水中。之后，将来自总体积的1ml作为接种物来进行mpn测试。这种接种物以不同的水盐度进行。表1-6阐述不同的测试实例，并且更具体地说：实例1：srb培养物(35％的qsw)-a)0.1mlsrb/100蒸馏水；和b)0.2mlsrb/100蒸馏水；实例2：srb培养物(100％的qsw)-a)0.1mlsrb/100蒸馏水；和b)0.2mlsrb/100蒸馏水；实例3：阿布阿里供水井(35％的qsw)；实例4：阿布阿里处理水(100％的qsw)；实例5：硬水样品(100％的qsw)；和实例6：乌斯曼尼亚水样品(100％的qsw)。

实验在以下条件下进行：对于每个测试样品，测试了两个一式三份的mpn的16个稀释系列。一个mpn组使用标准srb培养基(每个小瓶中有9ml培养基)，而另一mpn组通过向标准培养基中添加1ml铁添加剂来制备，在添加铁添加剂后在每个小瓶中产生9ml培养基。将1ml的水样品一式三份地接种以用于16个稀释系列。将样品在35℃下培育28天。每天检查生长，并且记录样品(培养物)变成黑色的日期，以确认铁添加剂(ic)是否能促进srb生长。28天后，进行最终的mpn读取和数据转换，并且这指示铁添加剂是否提高了srb检测灵敏度。

以下所阐述的表2展示srb生长，所述结果在含0.1mlsrb培养物的35％qurayyah海水(qsw)下添加和不添加0.1ml和0.5ml铁化合物的情况下使用(本文所述的)标准mpn法。以下数据指示，在不存在由原始样品栏表示的铁化合物(ic)的情况下，培育一天(即第1天)后检测到2.3个srb/ml的低生长。两天后，srb生长增加到230个srb/ml，但随后直到28天的培育期结束时保持这一水平。但是，在添加0.1ml铁化合物(ic)的情况下，结果展示在培育的一天(第1天)后检测到2.3个srb/ml。两天后，srb生长增加到2.3×10⁴个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持这一水平。在添加0.5ml铁化合物(ic)的情况下检测到类似的结果。因此，结果展示，培育一天后检测到2.3个srb/ml。两天后，srb生长增加到2.3×10⁵个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持。因此，测试结果指示，铁化合物(ic)不仅促进了srb生长，而且还提高了srb检测灵敏度。

表3：0.1mlsrb培养物(35％的qsw)/100蒸馏水的结果

表3展示在将0.1ml和0.5ml铁化合物添加和不添加到含0.2mlsrb培养物的35％qurayyah海水(qsw)的情况下的srb生长结果。数据指示，在不存在铁化合物的情况下，培育一天后检测到2.3个srb/ml的低生长。两天后，srb生长速度增加到230个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持这一水平。但是，在添加0.1ml铁化合物的情况下，结果展示，培育一天后检测到2.3个srb/ml。两天后，srb生长增加到2.3×10³个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持。在添加0.5ml铁化合物的情况下检测到可比较的结果。结果展示，培育一天后检测到230个srb/ml。后来，srb生长增加到2.3×10⁴个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持。因此，测试结果指示，铁化合物(ic)不仅促进了srb生长，而且提高了srb检测灵敏度。

表4：0.2mlsrb培养物(35％的qsw)/100蒸馏水的结果

表4展示在将0.5ml铁化合物添加到含0.1mlsrb培养物的100％qurayyah海水(qsw)中的情况下的srb生长结果。结果展示，在不存在铁化合物的情况下，培育一天后检测到2.3个srb/ml的低生长。两天后，srb生长增加到2.3×10²个srb/ml。后来，第三天srb生长增加到2.3×10⁴个srb/ml。随后，srb生长在第五天继续显著增加到2.3×10¹²个srb/ml，并且直到培育期结束时保持这一水平。在添加0.5ml铁化合物的情况下检测到类似结果。培育一天后，检测到2.3个srb/ml的srb生长。两天后，srb生长分别在两天后增加到2.3×10²个srb/ml，并且然后增加到2.3×10⁴个srb/ml。在第五天，srb生长增加到2.3×10¹⁷个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持这一水平。因此，测试结果指示，铁化合物(ic)不仅促进了srb生长，而且提高了srb检测灵敏度。

表5：0.1mlsrb培养物(100％的qsw)/100蒸馏水的结果

表5中的结果展示在将0.5ml铁化合物添加和不添加到含0.2mlsrb培养物的100％qurayyah海水(qsw)的srb生长结果。结果指示，在培育的前两天，在未添加铁化合物的原始样品中，srb生长低于检测极限。在第四天检测到极略微增加到23个srb/ml，并且直到培育期结束时继续这一水平。在添加0.1ml铁化合物的情况下检测到相同结果。在培育的前两天，srb生长低于检测极限。但是，在第四天检测到极少增加到23个srb/ml，并且直到培育期结束时继续这一水平。然而，在添加0.5ml铁化合物的情况下，培育一天后srb生长低于检测极限。但是两天后，结果展示srb生长略微增加到2.3个srb/ml。之后，srb生长在第三天增加到2.3×10²个srb/ml，并且在四天后再次增加到2.3×10⁴个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持这一水平。因此，测试结果指示，铁化合物(ic)不仅促进了srb生长，而且还提高了srb检测灵敏度。

表6：0.1mlsrb培养物(100％的qsw)/100蒸馏水的结果

表6中展示阿布阿里供水井840(35％的qsw)的srb结果。测试被设计成在以0.5ml不添加和添加0.5ml铁化合物的情况下检测srb生长。结果指示，在28天的培育期中，在未添加铁化合物的原始样品中，srb生长低于检测极限。在添加0.5ml铁化合物的情况下检测到相同结果。直到第五天，srb生长都低于检测极限。然而，srb生长逐渐增加到2.3个srb/ml，然后分别在五天和十天后增加到2.3×10²个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持这一水平。因此，测试结果指示，铁化合物(ic)不仅促进了srb生长，而且提高了srb检测灵敏度。

表7：阿布阿里给水井840的srb结果(35％的qsw)

表7中呈现硬水样品的srb结果。结果展示，在不添加铁化合物(原始样品)的情况下，srb生长在28天内低于检测极限。另外，在添加0.2ml铁化合物的情况下检测到相同结果。srb生长在28天内低于检测极限。然而，在添加0.5ml铁化合物的情况下，srb生长在前五天内低于检测极限。但是六天后，srb生长略微增加到2.3个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持这一水平。

表8：硬水样品的srb结果

表8展示在添加和不添加0.2ml和0.5ml铁化合物的情况下硬水样品的srb结果。结果展示，在不添加铁化合物的情况下，在整个培育期间，srb生长都低于检测极限。在添加0.2ml铁化合物的情况下检测到相同结果。srb生长在28天内低于检测极限。然而，在添加0.5ml铁化合物的情况下，前两天srb生长度低于检测极限。但是四天后，srb生长略微增加到2.3个srb/ml，并且直到28天的培育期结束时保持这一水平。

表9：uthm水样品的srb结果

根据本发明的测定srb浓度的方法提供优于现有技术的若干优点。所述方法能够检测极低浓度的活srb细胞，通常低于任何已知细菌生长培养物的检测极限。此外，所述方法提供休眠srb的快速重新活化，特别是不能使用标准程序重新生长并且通常被错误地认为不再存活的srb。重要的是，所述方法使得srb检测快速生长，通常在5-7天之内，这比使用标准培养基(至多28天)从油田样品中生长srb所需的时间少至少75％。

申请人已经发现，如本公开和本文所含的实例所支持的那样，额外的fcth增强和促进srb的活性并且活化休眠的srb。

如本文所讨论，本发明是针对呈铁化合物(ic)形式的培养基补充剂，其为添加到用于最大或然数mpn法的srb标准培养基的四水合氯化亚铁(fecl2.4h2o)。进行以下观察：

1.铁化合物充当补充培养基，以增加srb检测灵敏度并且促进srb生长的检测。

2.添加铁化合物后，srb快速生长并且检测到srb(通常在5-7天内)。

3.在没有铁化合物的情况下，mpn法无法检测到非常低密度的活srb细胞。

4.在不存在铁化合物的情况下，mpn法非常缓慢地重新活化休眠的srb。

5.添加不同体积的铁化合物是有效的。然而，来自ic储备铁溶液(含1gfecl2.4h2o的100ml蒸馏水)的0.5ml是一种优选的有效体积。

6.ic的量可以在50到55mg/l的范围内。

由本发明的方法提供的srb的快速检测可以应用于微生物控制试剂盒、工具和处理程序(例如，杀生物剂处理)的设计中。所述方法能够快速评估和调节处理，从而使srb控制最大化并且显著降低操作成本。而且，本发明的方法有助于最小化来自在程序中使用的化学物质的应用对环境的影响，并且有助于优化这类应用。

应理解，本文所公开的任何结构和功能细节不应被解释为限制所述系统和方法，而是作为用于教导本领域技术人员实现所述方法的一种或多种方式的代表性实施例和/或布置方式来提供。

应进一步理解，贯穿若干附图，图中类似的附图标记表示类似的元件，并且不是所有的参考附图描述和图示的组件和/或步骤都是所有实施例或布置方式所需要的。

本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且并不意图限制本发明。如本文所用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一”和“所述”意图还包括复数形式。将进一步理解，术语“包含”在用于本说明书中时指定所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其群组的存在或添加。

上面讨论的方法步骤可以在不脱离本发明的范围的情况下以不同的次序进行。举例来说，可以在制备标准生长培养基之后制备铁添加剂。

此外，本文使用的措词和术语是出于描述的目的并且不应被视为限制。本文“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”和其变化形式的使用意指涵盖在其后所列出的项目和其等效物以及额外项目。

虽然已参考例示性实施例描述本发明，但是所属领域的技术人员应理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可作出各种改变并且可用等效物取代本发明的元件。另外，在不脱离本发明的基本范围的情况下，所属领域的技术人员将理解许多修改以使特定仪器、情形或材料适于本发明的教示。因此，希望本发明不限于作为进行本发明所涵盖的最佳模式公开的特定实施例，但是本发明将包括属于所附权利要求书范围内的所有实施例。