相关申请的交叉引用本申请要求2013年8月30日提交的美国临时申请号61/872,125和2014年7月30日提交的美国临时申请序列号62/031,036的权益，这两个申请在此出于所有目的以引用的方式整体并入。序列表本申请含有以ASCII格式以电子方式提交并且在此以引用的方式整体并入的序列表。在2014年8月11日创建的所述ASCII副本的名称是A-1856-WO-PCT_SeqList_ST25.txt并且大小是606,208个字节。背景糖皮质激素诱导的TNFR相关基因(GITR:TNFRSF18)，有时也称为活化诱导型TNFR家族成员(AITR)，是属于TNF受体超家族(TNFRSF)的受体。它由其同源配体，GITR配体(GITRL，TNFSF18)活化。GITR是I型跨膜蛋白，其含有富含半胱氨酸的细胞外结构域，这是TNFR家族成员的特征。例如，GITR的细胞质结构域与某些其他TNFR家族成员如4-1BB和CD27共享紧密的同源性(Nocentini等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:6216-6221)。人GITR在应答静息T细胞中以低水平表达，其中CD4+细胞相对于CD8+细胞展现增加的表达。GITR表达在T细胞活化之后的数天显著地上调。GITR在调节性T细胞(Treg)如CD4+CD25+或CD8+CD25+细胞中以高水平组成型表达，并且当这些细胞被活化时进一步上调(Nocentini和Riccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016-1022)。然而，GITR表达不排外地限于T细胞。报道还指出GITR在NK细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞、肥大细胞及单核细胞上表达(Nocentini和Riccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016-1022)。GITRL是II型跨膜蛋白，这对于大多数TNF配体家族成员是典型的。当前研究指出人GITRL通常以三聚体形式存在，不过其也可以单体形式存在或装配成其他多聚体形式(Chattopadhyay等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.104:19452-19457；Zhou等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.105:635-640)。存在一些证据表明也产生可溶性形式的GITRL(Baltz等人(2008)Blood112:3735-3743；Mahesh等人(2006)Eur.J.Immunol.36:2128-2138)。GITRL主要在抗原递呈细胞(APC)上表达，包括巨噬细胞、B细胞、树突状细胞及内皮细胞，其可用作APC(Nocentini和Riccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016-1022；Agostini等人(2005)Infect.Immun.73:7502-7508；以及Nocentini等人(2007)E.J.Immunol.37:1165-1169)。APC上的GITRL与应答T细胞上的GITR的结合触发GITR信号传导，这共刺激了应答T细胞并抑制了Treg细胞的抑制活性。GITR信号传导用作CD4+和CD8+初始T细胞两者的共活化信号，从而诱导或增强增殖和效应子功能，特别是当T细胞受体(TCR)刺激是次优时(Schaer等人(2012)Curr.Opin.Immunol.24:217-224)。更具体地说，GITR可对效应T细胞和调节性T细胞具有若干作用，包括：效应T细胞的共刺激和活化以使得其对抑制更具抗性、抑制调节性T细胞、降低效应T细胞对由调节性T细胞引起的抑制的敏感性以及调节性T细胞在循环部分缺失(Nocentini等人(2007)Eur.J.Immunol.37:1165-1169)。总而言之，上述活性，具体来说应答T细胞的共刺激和调节性T细胞的抑制活性的消除，意味着GITR活化导致免疫应答的增强。这种活化具有恢复对感染和肿瘤的免疫应答的潜力。因此，能够活化GITR的分子在其中需要触发增强的免疫应答的情形中将是有价值的免疫刺激剂。
技术实现要素：
本文描述结合GITR如人GITR的抗原结合蛋白。所述抗原结合蛋白可以是抗体或其片段或者可以是其中包埋或插入一个或多个互补决定区的其他类型的分子骨架，前提条件是所述分子具有结合GITR如人GITR的能力。所述抗原结合蛋白是GITR的激动剂且因此可诱导或增强GITR信号传导。鉴于GITR在刺激免疫应答中发挥的作用，所述抗原结合蛋白在治疗其中需要增强免疫应答的多种GITR相关疾病或病症中具有效用。例如，所述抗原结合蛋白可用于多种免疫疗法应用中，如治疗多种癌症或感染。在第一实施方案中，提供一种包含以下的抗原结合蛋白：a)分别是重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的CDRH3和CDRL3，其中所述VH和VL是选自抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)中任一种的同一抗原结合蛋白的部分；b)包含CDRH1、CDRH2及CDRH3的变体VH，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3中的一个或多个相对于选自Ab1至Ab59(包括端点)的组的任何单个抗原结合蛋白的VH的相应CDRH1、CDRH2及CDRH3在序列上是不同的，然而前提条件是所述变体VH的CDRH1、CDRH2及CDRH3相对于VH序列的相应CDR的序列差异加起来总共不超过1、2、3、4或5个氨基酸；c)包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的变体VL，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3中的一个或多个相对于选自Ab1至Ab59(包括端点)的组的任何单个抗原结合蛋白的VL的相应CDRL1、CDRL2及CDRL3在序列上是不同的，然而前提条件是变体VL的CDRL1、CDRL2及CDRL3相对于VL序列的相应CDR的序列差异加起来总共不超过1、2、3、4或5个氨基酸；d)b)的变体VH和c)的变体VL，前提条件是所述变体VH和所述变体VL分别是同一抗原结合蛋白的VH和VL的变体；e)包含CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH，其中CDRH1包含序列X1YGMX2(SEQIDNO:436)，其中X1是S或N；且X2是H或Y；CDRH2包含序列VIWYX1GSNKYYADSVX2G(SEQIDNO:437)，其中X1是E、V、A、P；且X2是K或R；CDRH3包含序列GGX1LX2X3X4YYX5GMDV(SEQIDNO:438)，其中X1是Q、L、E或R；X2是G、R或S；X3是K、Y、L、F或R；且X4是Y或D；且X5是Y或S；f)包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL，其中CDRL1包含序列RASQX1IRNDLG(SEQIDNO:439)，其中X1是G或V；CDRL2包含序列X1X2SX3LQS(SEQIDNO:440)，其中X1是A或D；X2是A或T；且X3是S或T；CDRL3包含序列X1QX2X3X4YPX5T(SEQIDNO:441)，其中X1是L或Q；X2是H或L；X3是N或H；X4是S、N或T，且X5是W、L或I；g)e)的VH和f)的VL；h)CDRH1、CDRH2及CDRH3，各自来自Ab1至Ab59(包括端点)的抗原结合蛋白的同一VH；i)CDRL1、CDRL2及CDRL3，各自来自Ab1至Ab59(包括端点)的抗原结合蛋白的同一VL；j)h)的CDRH1、CDRH2及CDRH3和i)的CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中所述VH和所述VL来自同一抗原结合蛋白；k)与抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)中任一个的VH序列在氨基酸序列方面具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的VH；l)与抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)中任一个的VL序列在氨基酸序列方面具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的VL；m)k)的VH和l)的VL，其中所述VH和所述VL来自同一抗原结合蛋白；n)包含抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)中任一个的VH的氨基酸序列的VH；o)包含抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)中任一个的VL的氨基酸序列的VL；p)n)的VH和o)的VL，其中所述VH和所述VL来自同一抗原结合蛋白；q)与抗原结合蛋白Ab1至AB59(包括端点)中任一个的全长重链序列在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性的全长重链(HC)；r)与抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)中任一个的全长轻链序列在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性的全长轻链(LC)；s)q)的全长重链和r)的全长轻链，其中所述全长重链和所述全长轻链来自于同一抗原结合蛋白；t)包含抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)中任一个的全长重链的氨基酸序列的全长重链；u)包含抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)中任一个的全长轻链的氨基酸序列的全长轻链；或v)t)的全长重链和u)的全长轻链，其中所述全长重链和所述全长轻链来自于同一抗原结合蛋白。在第二实施方案中，所述抗原结合蛋白包含CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3，且其中CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3中的一个或多个相对于选自Ab1至Ab59(包括端点)的组的任何单个抗体的相应CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3在序列上是不同的，然而前提条件是这些CDR中的序列差异加起来总共不超过1、2、3、4或5个氨基酸。在第三实施方案中，所述抗原结合蛋白包含CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3，且其中：a)CDRL1包含SEQIDNO:5，CDRL2包含SEQIDNO:11，CDRL3包含SEQIDNO:19，CDRH1包含SEQIDNO:31，CDRH2包含SEQIDNO:36且CDRH3包含SEQIDNO:47；b)CDRL1包含SEQIDNO:5CDRL2包含SEQIDNO:12，CDRL3包含SEQIDNO:18，CDRH1包含SEQIDNO:31，CDRH2包含SEQIDNO:40且CDRH3包含SEQIDNO:52；c)CDRL1包含SEQIDNO:10，CDRL2包含SEQIDNO:17，CDRL3包含SEQIDNO:28，CDRH1包含SEQIDNO:35，CDRH2包含SEQIDNO:45且CDRH3包含SEQIDNO:62；d)CDRL1包含SEQIDNO:5，CDRL2包含SEQIDNO:12，CDRL3包含SEQIDNO:29，CDRH1包含SEQIDNO:31，CDRH2包含SEQIDNO:37且CDRH3包含SEQIDNO:58；e)CDRL1包含SEQIDNO:5，CDRL2包含SEQIDNO:14，CDRL3包含SEQIDNO:30，CDRH1包含SEQIDNO:3，CDRH2包含SEQIDNO:36且CDRH3包含SEQIDNO:63；f)CDRL1包含SEQIDNO:10，CDRL2包含SEQIDNO:17，CDRL3包含SEQIDNO:28，CDRH1包含SEQIDNO:35，CDRH2包含SEQIDNO:45且CDRH3包含SEQIDNO:76；g)CDRL1包含SEQIDNO:5，CDRL2包含SEQIDNO:12，CDRL3包含SEQIDNO:29，CDRH1包含SEQIDNO:31，CDRH2包含SEQIDNO:37且CDRH3包含SEQIDNO:58；h)CDRL1包含SEQIDNO:5，CDRL2包含SEQIDNO:14，CDRL3包含SEQIDNO:30，CDRH1包含SEQIDNO:31，CDRH2包含SEQIDNO:71且CDRH3包含SEQIDNO:63；i)CDRL1包含SEQIDNO:5，CDRL2包含SEQIDNO:11，CDRL3包含SEQIDNO:19，CDRH1包含SEQIDNO:31，CDRH2包含SEQIDNO:71且CDRH3包含SEQIDNO:47；或j)CDRL1包含SEQIDNO:5，CDRL2包含SEQIDNO:12，CDRL3包含SEQIDNO:18，CDRH1包含SEQIDNO:31，CDRH2包含SEQIDNO:73且CDRH3包含SEQIDNO:52。在第四实施方案中，所述抗原结合蛋白包含VL和VH，且其中：a)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:119具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:138具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；b)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:124具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:143具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；c)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:134具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:153具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；d)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:135具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:154具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；e)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:136具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:155具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；f)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:242具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:282具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；g)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:255具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:295具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；h)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:262具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:302具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；i)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:267具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:307具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性；或j)所述VL的氨基酸序列与SEQIDNO:272具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性且所述VH的氨基酸序列与SEQIDNO:312具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性。在第五实施方案中，所述抗原结合蛋白包含VL和VH，且其中：a)所述VL包含SEQIDNO:119且所述VH包含SEQIDNO:138；b)所述VL包含SEQIDNO:124且所述VH包含SEQIDNO:143；c)所述VL包含SEQIDNO:134且所述VH包含SEQIDNO:153；d)所述VL包含SEQIDNO:135且所述VH包含SEQIDNO:154；e)所述VL包含SEQIDNO:136且所述VH包含SEQIDNO:155；f)所述VL包含SEQIDNO:242且所述VH包含SEQIDNO:282；g)所述VL包含SEQIDNO:255且所述VH包含SEQIDNO:295；h)所述VL包含SEQIDNO:262且所述VH包含SEQIDNO:302；i)所述VL包含SEQIDNO:267且所述VH包含SEQIDNO:307；j)所述VL包含SEQIDNO:272且所述VH包含SEQIDNO:312。在第六实施方案中，所述抗原结合蛋白包含LC和HC，且其中：a)所述LC与SEQIDNO:317在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:336在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；b)所述LC与SEQIDNO:322在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:341在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；c)所述LC与SEQIDNO:332在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:351在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；d)所述LC与SEQIDNO:333在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:352在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；e)所述LC与SEQIDNO:334在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:353在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；f)所述LC与SEQIDNO:360在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:400在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；g)所述LC与SEQIDNO:373在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:413在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；h)所述LC与SEQIDNO:380在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:420在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；i)所述LC与SEQIDNO:385在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:425在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性；j)所述LC与SEQIDNO:390在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性且所述HC与SEQIDNO:430在氨基酸序列方面具有至少90％、95％、97％或99％同一性。在第七实施方案中，所述抗原结合蛋白包含LC和HC，且其中：a)所述LC包含SEQIDNO:317且所述HC包含SEQIDNO:336；b)所述LC包含SEQIDNO:322且所述HC包含SEQIDNO:341；c)所述LC包含SEQIDNO:332且所述HC包含SEQIDNO:351；d)所述LC包含SEQIDNO:333且所述HC包含SEQIDNO:352；e)所述LC包含SEQIDNO:334且所述HC包含SEQIDNO:353；f)所述LC包含SEQIDNO:360且所述HC包含SEQIDNO:400；g)所述LC包含SEQIDNO:373且所述HC包含SEQIDNO:413；h)所述LC包含SEQIDNO:380且所述HC包含SEQIDNO:420；i)所述LC包含SEQIDNO:385且所述HC包含SEQIDNO:425；j)所述LC包含SEQIDNO:390且所述HC包含SEQIDNO:430。在第八实施方案中，所述抗原结合蛋白与参考抗原结合蛋白竞争结合至人GITR，其中所述参考抗原结合蛋白是如第五实施方案所述的抗原结合蛋白。在第九实施方案中，第八实施方案的抗原结合蛋白与所述参考抗体交叉竞争结合至人GITR。在第十实施方案中，实施方案1-9中任一项的抗原结合蛋白具有以下一种或多种特征：a)是单克隆抗体；b)是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体；c)是多特异性抗体；d)具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型；e)是抗原结合抗体片段；f)是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或Fv片段；g)是双抗体、单链抗体、结构域抗体或纳米抗体；h)是经标记的。在第十一实施方案中，实施方案1-10中任一项的抗原结合蛋白是全人抗体。在第十二实施方案中，实施方案1-11中任一项的抗原结合蛋白激动人GITR的活性。在第十三实施方案中，实施方案1-12中任一项的抗原结合蛋白具有以下一种或多种活性：a)与GITRL交叉竞争结合至GITR；b)可以内化到人CD4细胞中；c)抑制调节性T细胞的抑制作用；d)减少循环调节性T细胞；e)活化效应T细胞；f)在人血清中具有至少6、7、9或12天的半衰期。在第十四实施方案中，实施方案1-13中任一项的抗原结合蛋白是全人IgG1抗体。在第十五实施方案中，实施方案1-14中任一项的抗原结合蛋白能够结合Fcγ受体(FcγR)。在第十六实施方案中，实施方案1-15中任一项的抗原结合蛋白能够结合Fcγ受体(FcγR)以便形成抗原结合蛋白簇。在第十七实施方案中，实施方案1-16中任一项的抗原结合蛋白结合人GITR(例如SEQIDNO:1)。在第十八实施方案中，实施方案1-17中任一项的抗原结合蛋白具有以下一种或多种特征：a)以小于≤10nM的KD结合至SEQIDNO:1的人GITR多肽；b)以小于≤500nM的KD结合至SEQIDNO:2的食蟹猴GITR多肽。在第十九实施方案中，实施方案1-18中任一项的抗原结合蛋白是激动人GITR的IgG1型全人单克隆抗体。在第二十实施方案中，实施方案1-19中任一项的抗原结合蛋白以KD≤10nM结合SEQIDNO:1的人GITR且以KD≤500nM结合SEQIDNO:2的食蟹猴GITR。在第二十一实施方案中，实施方案1-20中任一项的抗原结合蛋白是糖基化的。在第二十二实施方案中，提供编码以下的核酸：a)实施方案1至20中任一项的抗原结合蛋白的VL、VH或两者；或b)实施方案1至20中任一项的抗原结合蛋白的LC或HC或两者。在第二十三实施方案中，所述核酸包含：a)如为选自Ab1至Ab59(包括端点)的组的任何单个抗体所陈述的VL核苷酸序列和/或VH核苷酸序列；b)如为选自Ab1至Ab59(包括端点)的组的任何单个抗体所陈述的LC核苷酸序列和/或HC核苷酸序列。在第二十四实施方案中，提供一种包含实施方案22或23的核酸的载体。在第二十五实施方案中，提供一种包含实施方案22或23的核酸或实施方案24的载体的细胞。在第二十六实施方案中，提供一种用于制备实施方案1至21中任一项的抗原结合蛋白的方法，其中所述方法包括在允许所述抗原结合蛋白表达的条件下培养实施方案25的细胞及任选地从培养物中分离所述抗原结合蛋白。在第二十七实施方案中，提供一种药物组合物，其包含至少一种根据实施方案1至21中任一项的抗原结合蛋白及药学上可接受的载体或稀释剂。在第二十八实施方案中，实施方案27的药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的另一种活性成分：免疫刺激剂、抗血管生成剂及化疗剂。在第二十九实施方案中，实施方案1-21中任一项的抗原结合蛋白或实施方案27或28的药物组合物用于疗法中。在第三十实施方案中，实施方案1-21中任一项的抗原结合蛋白或实施方案27或28的药物组合物用于诱导或增强受试者的免疫应答的方法中，所述方法包括向受试者施用所述抗原结合蛋白。在第三十一实施方案中，提供一种用于诱导或增强受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括以有效诱导或增强免疫应答的量向受试者施用实施方案1至21中任一项的抗原结合蛋白或实施方案27或28的药物组合物。在第三十二实施方案中，实施方案31的方法涉及产生针对肿瘤抗原的免疫应答。在第三十三实施方案中，实施方案31的方法涉及产生针对感染性因子的免疫应答。在第三十四实施方案中，实施方案31-33中任一项的方法涉及以足以在受试者中实现以下一项或多项的量施用抗原结合蛋白：a)减轻效应T细胞活性的调节性T细胞抑制；b)降低循环调节性T细胞的水平；c)活化效应T细胞；d)诱导或增强效应T细胞增殖；e)抑制肿瘤生长；及f)诱导肿瘤消退。在第三十五实施方案中，提供一种用于治疗患有癌症的受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的实施方案1-21中任一项的抗原结合蛋白或实施方案27或28的药物组合物。在第三十六实施方案中，实施方案35的方法是要用于治疗实体癌。在第三十七实施方案中，实施方案35的方法是要用于治疗血液癌。在第三十八实施方案中，实施方案35的方法是要用于治疗黑色素瘤、肺癌、头颈癌、肾细胞癌或结肠直肠癌。在第三十九实施方案中，提供一种用于抑制患有癌症的受试者中的转移的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的实施方案1-21中任一项的抗原结合蛋白或实施方案27或28的药物组合物。在第四十实施方案中，实施方案31-39中任一项的方法进一步包括以下一项或多项a)施用化疗；b)施用放射疗法；c)施用一种或多种另外的治疗剂。在第四十一实施方案中，所述方法是为实施方案40所描述并且所述另一种治疗剂是免疫刺激剂。在第四十二实施方案中，所述方法是为实施方案41所描述且所述免疫刺激剂选自由以下组成的组：T-VEC、PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂及BiTE。在第四十三实施方案中，所述方法是为实施方案40所描述，其中化疗、放射疗法或治疗剂是在所述抗原结合蛋白之前、同时或之后施用。在第四十四实施方案中，提供一种用于治疗患有感染的受试者的方法，所述方法包括以有效治疗所述感染的量施用的实施方案1至21中任一项的抗原结合蛋白或实施方案27或28的药物组合物。附图简述图1A-1D是结合曲线图，其共同证明了如本文所提供的GITR抗体与人GITRL交叉竞争结合至T细胞的两个不同亚群，即CD4+CD25+T细胞和CD8+CD25+T细胞。具体说来，图1A和1B中概述的结果显示如本文所提供的GITR抗体阻断GITRL结合至这两个T细胞亚群。在实验的此部分中，将适当活化的T细胞群与不同摩尔浓度的GITR抗体(9H6、5H7、41G5)孵育10分钟，之后添加4mMHis标记的人GITRL并且在4C下再培养30min。接着洗涤细胞，且随后与荧光标记的抗His抗体孵育以检测结合的GITRL。结合的GITRL的MFI(平均荧光强度)通过流式细胞术来测定。图1A和1B是两个不同细胞群的MFI随GITR抗体:GITRL摩尔浓度比率变化的曲线图。图1C和1D是显示逆转实验的结果的曲线图，并且证明GITRL可阻断抗GITR抗体与两个T细胞亚群的结合。在这些测试里，首先将不同浓度的GITRL而非GITR抗体与适当活化的T细胞群孵育。随后添加GITR抗体(4mM9H6、5H7、41G5)并且在4C下孵育所得混合物30min。结合的GITR抗体通过与荧光标记的抗人Fc孵育来检测。结合通过流式细胞术分析测定。图1C和1D是两个不同细胞群的MFI随GITRL:GITR抗体摩尔浓度比率变化的曲线图。图2是说明了如本文所述的GITR抗体可减轻调节性T细胞(Treg)对效应T细胞的抑制的图。在实验中，将Treg细胞和T应答者与相等数量的T细胞活化珠粒孵育并且与不同浓度的涂覆有代表性GITR抗体的珠粒孵育5天。在培养的最后16个小时期间将细胞用1uCi3H进行脉冲，收获并确定计数。该曲线图是计数的数目随涂覆GITR抗体的珠粒:细胞比率的变化。图3总结了以下实验结果：确定了如本文所公开的若干GITR抗体(9H6v3、5H7v2及41G5v2)引起人源化NSG小鼠模型(不携带肿瘤)中循环调节性T细胞数量的下降。在此实验中，通过将CD34+胎儿肝细胞移植到小鼠中诱导NSG小鼠产生人CD4+和CD8+效应T细胞和调节性T细胞。将单个腹膜内剂量的25mg/kgGITR抗体注射到小鼠中并且通过流式细胞术测定表达调节性T细胞标志物FoxP3的循环人CD4+T细胞的百分比。图4A和4B是显示两种不同形式的Fcγ受体(FcγR)可引起如本文所提供的GITR抗体成簇的图。图4A中的结果证明了在增殖测定中FcγRIIa可使代表性GITR抗体(5H7、9H6、7A10及41G5)成簇以活化原代人T细胞。图4B显示FcγRIIIa具有类似的成簇活性。在每个实验中，将不同浓度的GITR抗体或人IgG1同种型对照添加至被工程改造以表达Fcγ受体中的一种的原代人CD4+T细胞与293T细胞的共培养物中。添加较少数量的CD3涂覆的珠粒以提供次优的TCR刺激。将细胞孵育96小时并且用1uCi3H进行脉冲持续培养的最后18个小时以测定由抗体诱导的细胞增殖的量。这些图是3H计数随抗体浓度变化的曲线图并且表示三个重复孔的平均值±StDev且代表来自5个人供体的5次实验。图5A-5D概括了证明如本文所公开的某些GITR抗体差别地结合至人T细胞的4个不同亚群的实验的结果。具体说来，结果显示本文所述的三种抗体(5H7、9H6及41G5)1)结合CD4+CD25+T细胞而不是CD4+CD25-T细胞(图5A和5B)，及2)结合CD8+CD25+T细胞而不是CD8+CD25-T细胞(图5C和5D)。这些结果与由另一个已知的GITR抗体所获得的那些结果形成对比，所述抗体1)同样结合CD4+CD25+T细胞而不是CD4+CD25-T细胞，但2)不同于5H7、9H6及41G5，其可结合CD8+CD25+T细胞和CD8+CD25-T细胞两者。在每个图中，将平均荧光强度(MFI)相对于抗体浓度(nM)绘图。实验细节提供于实施例12中。图6提供来自类似于关于图5A-D所述的实验的结果的图，例外的是该实验用GITRL而非GITR抗体进行。结果显示GITRL像抗体5H7、9H6及41G5一样，1)结合CD4+CD25+T细胞而不是CD4+CD25-T细胞，及2)结合CD8+CD25+T细胞而不是CD8+CD25-T细胞。因此，用5H7、9H6及41G5观察到的结合选择性类似于用天然配体观察到的选择性。图7是显示如本文所提供的抗体(9H6、5H7及41G5)内化到原代人CD4+细胞中的曲线图。相比之下，另一种已知抗体展示显著较少的内化。在实验中，将CD4+细胞置于孔中，然后与Alexa-488或Alexa-647标记的抗体孵育30分钟。洗涤之后，在37℃5％CO2下将细胞孵育不同的时间段，之后收集细胞并等分到两个孔中。将一个孔与含有0.2M乙酸的溶液孵育，而另一个孔的细胞在完全培养基中孵育。在这些孵育之后，将细胞洗涤，然后用抗人CD25APC或抗人CD25PE在染色缓冲液中染色30min。将细胞洗涤，用2％多聚甲醛固定，然后通过流式细胞术分析。图8A和8B提供如本文所提供的亲代抗体的轻链(VL)可变结构域的氨基酸序列的比对。指明CDR(CDR1、CDR2及CDR3)和构架区(FR1、FR2、FR3及FR4)。全序列跨越两个图，其中FR1、CDR1、FR2及CDR2包括在图8A上且FR3、CDR3及FR4区延伸到图8B上。CDR是由Kabat所定义。当比对编号如根据AHo编号惯例来限定时，破折号仅说明编号的差异(参见，例如Honegger,A.和Pluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657-670)。图9A和9B提供如本文所提供的亲代抗体的重链(VH)可变结构域的氨基酸序列的比对。指明CDR(CDR1、CDR2及CDR3)和构架区(FR1、FR2、FR3及FR4)。全序列跨越两个图，其中FR1、CDR1、FR2及CDR2包括在图9A上且FR3、CDR3及FR4区延伸到图9B上。当比对编号如根据AHo编号惯例来限定时，破折号仅说明编号的差异(参见，例如Honegger,A.和Pluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657-670，其以引用的方式整体并入本文)。图10A和10B提供如本文所提供的工程改造的抗体的轻链(VL)可变结构域的氨基酸序列的比对。指明CDR(CDR1、CDR2及CDR3)和构架区(FR1、FR2、FR3及FR4)。全序列跨越两个图，其中FR1、CDR1、FR2及CDR2包括在图10A上且FR3、CDR3及FR4区延伸到图10B上。当比对编号如根据AHo编号惯例来限定时，破折号仅说明编号的差异(参见，例如Honegger,A.和Pluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657-670)。图11A和11B提供如本文所提供的工程改造的抗体的重链(VH)可变结构域的氨基酸序列的比对。指明CDR(CDR1、CDR2及CDR3)和构架区(FR1、FR2、FR3及FR4)。全序列跨越两个图，其中FR1、CDR1、FR2及CDR2包括在图11A上且FR3、CDR3及FR4区延伸到图11B上。当比对编号如根据AHo编号惯例来限定时，破折号仅说明编号的差异(参见，例如Honegger,A.和Pluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657-670)。图12A和12B证明了GITR抗体的糖基化状态在活化GITR信号传导中的重要性。用糖基化的天然IgG1GITR抗体和被工程改造以在位置297处具有天冬酰胺至谷氨酰胺氨基酸取代的IgG1GITR抗体进行测试，所述取代消除了对于Fc与Fcγ受体的结合关键的N连接的糖基化位点。测试天然的和非糖基化的变体用由Fcγ-RIIa或Fcγ-RIIIa提供的GITR抗体簇介导CD4+T细胞活化的能力。如图12A和12B所示，FcγRIIa(图12A)和RIIIa(图12B)能够使天然的IgG1GITR抗体成簇并驱动效应T细胞增殖。然而，非糖基化的抗体由于其不能结合并由FcγR成簇而不展示任何活性。发明详述文中使用的小节标题只是为了组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。除非本文中另外定义，否则与本申请有关的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语将包括复数术语且复数术语将包括单数术语。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交有关的术语和细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域中熟知和常用的术语和技术。除非另有说明，本申请的方法和技术通常按照本领域中熟知的以及如本说明书通篇所列举和讨论的各种一般性的和比较具体的参考文献中所描述的常规方法进行。参见，例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)，Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992)，以及Harlow和LaneAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990)，其是以引用的方式并入本文。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书如本领域通常完成的或如本文所述的进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学和医学与药物化学有关地使用的术语及分析化学、合成有机化学和医学与药物化学的实验室程序和技术是本领域熟知的和常用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送，和患者的治疗。应当理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案及试剂等，因为这些可以变化。本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不旨在限制本公开的范围，该范围仅由权利要求书来限定。除在操作实施例中或者另外指出时之外，表示本文所用的成分或反应条件的量的所有数值应当被理解成在所有情况下均被术语“约”修饰。术语“约”当有关百分比使用时可意指±1％。以任何方式与本文特定段落所限定的变化相比范围更窄的所有实施方案将被视为包括在本公开中。例如，某些方面被描述为一个属，且应理解，一个属的每个成员可以单独是一个实施方案。同样，被描述为一个属或选择一个属的一个成员的方面应被理解为包括该属的两个或更多个成员的组合。还应理解，尽管在本说明书中的各种实施方案在各种情形下是使用“包含”措辞呈现，但相关实施方案也可使用“由……组成”或“基本上由……组成”措辞来描述。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不受限制。还有，除非另外具体说明，术语如“元素”或“组分”涵盖包括一个单位的元素和组分以及包括一种以上亚单位的元素和组分这两种情况。I.定义如本文所用，术语“GITR”是指“糖皮质激素诱导的TNF相关基因”，在本领域中也称为TNF受体超家族18(TNFRSF18)。人和鼠形式的GITR的氨基酸和核酸序列描述于WO98/06842中，其以引用的方式并入本文。也参见GenBank寄存号Q9Y5U5(人氨基酸序列)和AF109216(鼠核酸和氨基酸序列)。成熟的人GITR多肽的一个特定实例的氨基酸序列陈述于SEQIDNO:1中。来自食蟹猴的示例性成熟GITR蛋白具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。来自小鼠的成熟GITR的氨基酸序列示于SEQIDNO:3中。如本文所用的术语GITR也包括天然存在的等位基因。如本文所用，术语“GITRL”是指GITR的天然存在的配体。GITRL多肽的氨基酸序列提供于GenBank寄存号AAQ89227。人GITRL的示例性氨基酸序列提供于SEQIDNO:4中。如本文所用的“抗原结合蛋白”意指特异性地结合指定的靶抗原如GITR多肽(例如，如SEQIDNO:1中提供的人GITR多肽)的任何蛋白质。该术语包括包含至少一个抗原结合区的多肽。该术语还包括包含至少两条全长重链和两条全长轻链的完整抗体以及其衍生物、变体、片段和突变，其实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段。抗原结合蛋白还包括如下面所进一步描述的结构域抗体如纳米抗体和单链抗体，以及双特异性抗体。该术语不包括GITRL。一般说来，当GITR抗原结合蛋白展现基本上本底结合至非GITR分子时，该抗原结合蛋白被称为“特异性地结合”其靶抗原GITR。然而，特异性地结合GITR的抗原结合蛋白可与来自不同物种的GITR多肽交叉反应。通常，当如经由表面等离子体共振技术(例如BIACore,GE-HealthcareUppsala,Sweden)所测量，离解常数(KD)≤10-7M时，GITR抗原结合蛋白特异性地结合人GITR。再次如使用如BIACore的方法测量，当KD≤5×10-8M时，GITR抗原结合蛋白以“高亲和力”特异性地结合人GITR，并且当KD≤5×10-9M时以“极高亲和力”特异性地结合人GITR。“抗原结合区”意指特异性地结合指定抗原的蛋白质的部分，如抗体或其片段、衍生物或变体。例如，含有与抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白以其针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗原结合蛋白的那个部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区可包含一个或多个“互补决定区”(“CDR”)。某些抗原结合区还包含一个或多个“构架”区。“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“构架”区可直接有助于抗原结合蛋白的特异性结合，但通常帮助维持CDR的适当构型以促进抗原结合区与抗原之间的结合。包括重组GITR抗原结合蛋白的“重组蛋白”是使用重组技术，即通过表达本文所述的重组核酸制得的蛋白。用于产生重组蛋白的方法和技术在本领域中是众所周知的。术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，或其可与完整抗体竞争特异性结合至靶抗原的片段，并且包括例如嵌合、人源化、全人及双特异性抗体。这样的“抗体”是一种抗原结合蛋白。在一些实施方案中，完整抗体包含至少两条全长重链和两条全长轻链。在其他实施方案中，完整抗体包含较少的链，如天然存在于骆驼中的抗体，其可仅包含重链。抗体可仅来源于单一来源，或可以是“嵌合的”，也就是抗体的不同部分可来源于两种不同抗体，如下文所进一步描述。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解在杂交瘤中产生。除非另有指出，术语“抗体”除包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体之外还包括其衍生物、变体、片段及突变，其实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段；结构域抗体如和单链抗体，如下文中更详细地描述。如关于抗原结合蛋白、抗体或其片段使用的术语“轻链”包括全长轻链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域处于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。如关于抗原结合蛋白、抗体或其片段使用的术语“重链”包括全长重链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包含可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2及CH3。VH结构域处于多肽的氨基末端处，且CH结构域处于羧基末端处，其中CH3最靠近多肽的羧基末端。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM及IgE。如本文所用的术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)的“免疫功能性片段”(或简单地称“片段”)是包含抗体的一部分(不管那个部分是如何获得或合成)的抗原结合蛋白，该抗体部分缺少至少一些存在于全长链中的氨基酸但能够特异性地结合至抗原。这种片段具有生物活性是在于，其特异性地结合至靶抗原并且可与其他抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争特异性结合至给定的表位。一方面，这样一种片段将保留至少一个存在于全长轻链或重链中的CDR并且在一些实施方案中，将包含单一重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生或可通过抗原结合蛋白(包括完整抗体)的酶促或化学裂解产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体及单链抗体，并且可来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼或兔。可以进一步预期，本文所公开的抗原结合蛋白的功能性部分(例如一个或多个CDR)可共价地结合至第二蛋白或小分子以便生成针对体内特定靶标的治疗剂，该治疗剂具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期。“Fab片段”由一条轻链及一条重链的CH1和可变区构成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区含有两个重链片段，其包含抗体的CH2和CH3结构域。两个重链片段是通过两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水性相互作用而结合在一起。“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，该重链部分含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1与CH2结构域之间的区域，以使得可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分以使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab')2片段因此由两个Fab'片段构成，Fab'片段通过两条重链之间的二硫键结合在一起。“Fv区”包含来自重链和轻链两者的可变区，但缺少恒定区。“单链抗体”是其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接以形成单个多肽链的Fv分子，该单个多肽链形成抗原结合区。单链抗体详细地论述于国际专利申请公布号WO88/01649及美国专利号4,946,778和5,260,203中。“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。结构域抗体的实例包括在一些情况下，两个或更多个VH区用肽接头共价地结合在一起生成二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。“二价抗原结合蛋白”、“二价抗体”或“双特异性抗体”包含两个抗原结合区。在一些情况下，这两个结合区具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是双特异性的。“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向一个以上抗原或表位的蛋白质或抗体。“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体是分别具有两个不同抗原结合位点的杂合抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白和抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体并且可通过包括但不限于以下的多种方法产生：杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见，例如Songsivilai和Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合至两个不同表位，这些表位可位于相同或不同的蛋白质靶标上。术语“竞争”当在竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如抗体)的上下文中使用时意指在抗原结合蛋白之间的竞争并且通过测定来确定，其中在测试中的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫功能性片段)防止或抑制参考抗原结合蛋白特异性结合至共同抗原(例如，GITR或其片段)。可使用众多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见，例如Stahli等人,1983,MethodsinEnzymology9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见，例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见，例如Morel等人,1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如Cheung等人,1990,Virology176:546-552)；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，这样一种测定涉及使用结合至固体表面的纯化抗原或表达抗原的细胞、未标记的测试抗原结合蛋白以及标记的参考抗原结合蛋白。竞争性抑制通过在测试抗原结合蛋白存在下测定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定(竞争抗原结合蛋白)鉴别的抗原结合蛋白包括与参考抗原结合蛋白结合到相同表位的抗原结合蛋白以及结合到与参考抗原结合蛋白所结合的表位足够靠近以产生位阻的邻近表位的抗原结合蛋白。关于用于测定竞争性结合的方法的更多细节提供于本文的实施例中。例如，在一个实施方案中，竞争是根据BiaCore测定来测定。通常，当竞争抗原结合蛋白过量存在时，其将参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制了至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在有些情况下，结合被抑制了至少80％、85％、90％、95％或97％或更多。术语“抗原”是指能够被选择性结合剂如抗原结合蛋白(包括例如抗体)结合且另外能够用于动物中以产生能够结合至那个抗原的抗体的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多个表位，这些表位能够与不同的抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用。术语“表位”是被抗原结合蛋白(例如抗体)结合的分子的部分。该术语包括能够特异性地结合至抗原结合蛋白如抗体的任何决定簇。表位可以是连续或不连续的(间断的)(例如在多肽中，在多肽序列上彼此不连续但在分子的环境内被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。构象表位是在活性蛋白质的构象内存在但不存在于变性蛋白质中的表位。在某些实施方案中，表位可以是模拟物，因为其包含类似于用于产生抗原结合蛋白的表位的三维结构，而不含或仅含一些用于产生抗原结合蛋白的那个表位中所见的氨基酸残基。最常见的是，表位位于蛋白质上，但在一些情况下可位于另一种分子如核酸上。表位决定簇可包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原有特异性的抗原结合蛋白将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中所述靶抗原上的表位。“氨基酸”包括其在本领域中的通常含义。20种天然存在的氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。参见，Immunology-ASynthesis,第2版,(E.S.Golub和D.R.Green编著),SinauerAssociates:Sunderland,Mass.(1991)，出于任何目的以引用的方式并入本文。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸如[α]-,[α]-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸及其他非常规的氨基酸也可以是多肽的合适组分并且可包括在短语“氨基酸”中。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、[γ]-羧基谷氨酸、[ε]-N,N,N-三甲基赖氨酸、[ε]-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、[σ]-N-甲基精氨酸、及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向且右手方向是羧基末端方向。术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语也可包括已例如通过添加糖残基以形成糖蛋白或被磷酸化而被修饰的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可由天然存在的和非重组的细胞或由遗传工程改造的或重组的细胞产生，并且可包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”特别包括GITR抗原结合蛋白、抗体或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长蛋白质相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与全长蛋白质相比，这类片段也可含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度为约5个至500个氨基酸。例如，片段的长度可以是至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能性片段，包括结合结构域。在GITR抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的一部分或只是其可变区，包括两个CDR，等。术语“分离的蛋白质”意指主题蛋白质(1)不含至少一些其他蛋白质，这些蛋白质通常被发现与主题蛋白质在一起，(2)基本上不含来自相同来源，例如来自相同物种的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％多核苷酸、脂质、碳水化合物或在自然界中与主题相关的其他材料分离，(5)与在自然界中与主题不相关的多肽可操作地连接(通过共价或非共价相互作用)，或(6)不在自然界中存在。通常，“分离的蛋白质”占给定样本的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。合成起点的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA、或其任何组合可以编码这样一个分离的蛋白质。优选地，分离的蛋白质基本上不含蛋白质或多肽或见于其自然环境中的将会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的其他污染物。多肽(例如抗原结合蛋白，如抗体)的“变体”包含其中相对于另一个多肽序列，一个或多个氨基酸残基被插入氨基酸序列、从氨基酸序列中缺失和/或取代至氨基酸序列中的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。多肽的“衍生物”是已以不同于插入、缺失或取代变体的一些方式，例如经由偶联至另一个化学部分而被化学修饰的多肽(例如，抗原结合蛋白，如抗体)。如本说明书通篇关于生物材料如多肽、核酸、宿主细胞等而使用的术语“天然存在的”是指在自然界中所发现的材料。术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物两者。组成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者修饰形式的任一种类型的核苷酸。修饰包括碱基修饰，如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰如2’,3’-二脱氧核糖；以及核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺磷酸硫醇酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)以及氨基磷酸酯。术语“寡核苷酸”意指包含200或更少个核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是10至60个碱基。在其他实施方案中，寡核苷酸的长度是12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如供构建突变基因之用。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包含标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原性标记，以用于检测测定。寡核苷酸可例如用作PCR引物、克隆引物或杂交探针。“分离的核酸分子”意指基因组的DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成来源或其一些组合，其不与分离的多核苷酸天然存在其中的全部或部分多核苷酸缔合或连接至分离的多核苷酸天然与其连接的多核苷酸。对于本公开的目的，应理解“包含”特定核苷酸序列的“核酸分子”不包括完整的染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子除指定序列之外还可包括高达10种或甚至高达20种其他蛋白质或其部分的编码序列，或可包括控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作连接的调控序列，和/或可包括载体序列。除非另外指出，本文论述的任何单链多核苷酸序列的左手末端是5’末端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。新生RNA转录物的5'至3'添加的方向被称为转录方向；与作为RNA转录物的5'至5'末端的RNA转录物具有相同序列的DNA链上的序列区域被称为“上游序列”；与作为RNA转录物的3'至3'末端的RNA转录物具有相同序列的DNA链上的序列区域被称为“下游序列”。术语“控制序列”是指可影响其所连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。这类控制序列的性质可取决于宿主生物体。在具体的实施方案中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点、以及转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可包括包含一个或多个用于转录因子的识别位点的启动子、转录增强子序列、以及转录终止序列。“控制序列”可包括前导序列和/或融合配偶体序列。术语“载体”意指用于转移蛋白质编码信息到宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。术语“表达载体”或“表达构建体”是指适用于宿主细胞的转化并且含有指导和/或控制(结合宿主细胞)一个或多个与其可操作连接的异源编码区域的表达的核酸序列的载体。表达构建体可包括但不限于影响或控制转录、翻译且如果内含子存在的话，影响与其可操作连接的编码区域的RNA剪接的序列。如本文所用，“可操作地连接”意指该术语所应用的组分处于一种关系中，该关系允许这些组分在适宜的条件下发挥它们的内在功能。例如，载体中“可操作地连接”至蛋白质编码序列的控制序列与该蛋白质编码序列连接以便该蛋白质编码序列的表达在与控制序列的转录活性相容的条件下实现。术语“宿主细胞”意指已用核酸序列转化且由此表达目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的子代，不管该子代在形态上或遗传构成上与原始亲本细胞是否相同，只要存在目的基因即可。术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较这些序列所确定。“同一性百分比”意指在所比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比并且基于所比较分子的最小者的大小来计算。对于这些计算，比对中的缺口(如果有的话)必须通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)得到。可用于计算所比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在以下文献中描述的那些：ComputationalMolecularBiology,(Lesk,A.M.编著),1988,NewYork:OxfordUniversityPress；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects,(Smith,D.W.编著),1993,NewYork:AcademicPress；ComputerAnalysisofSequenceData,第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著),1994,NewJersey:HumanaPress；vonHeinje,G.,1987,SequenceAnalysisinMolecularBiology,NewYork:AcademicPress；SequenceAnalysisPrimer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编著),1991,NewYork:M.StocktonPress；以及Carillo等人,1988,SIAMJ.AppliedMath.48:1073。在计算同一性百分比时，以给出序列之间的最大匹配的方式比对所比较的序列。用于测定同一性百分比的计算机程序是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人,1984,Nucl.AcidRes.12:387；GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,WI)。计算机算法GAP用于比对两个多肽或多核苷酸，它们的序列同一性百分比有待被测定。就其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配对序列进行比对(“匹配的跨度”，如通过算法所测定)。缺口开放罚分(计算为3×平均对角线，其中“平均对角线”是所用的比较矩阵的对角线平均值；“对角线”是通过特定比较矩阵对各完美氨基酸匹配分配的分值或数值)和缺口延伸罚分(其通常是缺口开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵如PAM250或BLOSUM62与算法结合使用。在某些实施方案中，该算法也可使用标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等人,1978,AtlasofProteinSequenceandStructure5:345-352；对于BLOSUM62比较矩阵，参见Henikoff等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919)。使用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐参数如下：算法：Needleman等人,1970,J.Mol.Biol.48:443-453；比较矩阵：BLOSUM62来自Henikoff等人,1992，同上；缺口罚分：12(但对于末端缺口没有罚分)缺口长度罚分：4相似性的阈值：0用于比对两个氨基酸序列的某些对比方案只能给出这两个序列的很短的匹配区域，且该对比的小区域甚至在两个全长序列之间没有明显相关性的情况下也可以具有非常高的序列同一性。因此，如果想要产生跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的对比的话，可调整选择的比对方法(GAP程序)。如本文所用，“基本上纯的”是指所述的分子种类是优势种类，其以摩尔基准计在同一混合物中以比任何其他单独的种类更为丰富的量存在。在某些实施方案中，基本上纯的分子是其中目标种类占存在的所有大分子种类的至少50％(以摩尔基准计)的组合物。在其他实施方案中，基本上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子种类的至少80％、85％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，目标种类被纯化至基本同质，其中污染种类不能通过常规的检测方法在组合物中检测到且因此组合物由单一可检测的大分子种类组成。术语“治疗”是指成功治疗或改善损伤、病理或病状的任何迹象，包括任何客观或主观参数，如症状的缓解；缓和；减轻或者使得损伤、病理或病状更为患者所耐受；退化或衰弱速率减慢；使得退化终点衰弱程度较小；改善患者的身体或心理健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括身体检查、神经精神检查和/或精神病学的评价的结果。例如，本文提出的某些方法通过例如减轻癌症的进展或蔓延、抑制肿瘤生长、使肿瘤缓解和/或改善与癌症或肿瘤有关的症状来成功地治疗癌症和肿瘤。同样，本文所提供的其他方法通过减轻感染的进展或蔓延、减轻感染的程度和/或改善与感染有关的症状来治疗感染性疾病。“有效量”通常是足以降低症状的严重性和/或频率、消除症状和/或潜在原因、防止症状和/或其潜在原因出现、和/或改善或修复由癌症引起或与癌症有关的损伤的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以补救疾病状态(例如癌症)或症状，特别是状态或与疾病状态有关的症状，或以其他方式防止、阻止、延迟或逆转疾病状态或以任何方式与疾病有关的任何其他不合需要的症状的进展的量。“预防有效量”是当向受试者施用时将具有想要的预防效果，例如防止或延迟癌症的发病(或复发)，或降低癌症或癌症症状的发病(或复发)的可能性的药物组合物的量。完全的治疗或预防效果不一定通过施用一个剂量而出现，并且可能仅出现在施用一系列剂量之后。因此，治疗或预防有效量可能是以一次或多次施用来施用。短语“GITR相关疾病”及其他类似短语是指与可通过诱导或增强GITR活性，例如经由使用如本文所提供的激动剂GITR抗体治疗的疾病有关的疾病或症状。术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性”、及“恶性”是指或描述哺乳动物中通常特征为失控的细胞生长的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌瘤，包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤以及白血病。这类癌症的更具体实例包括黑色素瘤、肺癌、头颈癌、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)如肝癌(hepaticcarcinoma)和肝细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌如肾细胞癌和韦尔姆斯氏瘤、基底细胞癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌以及食道癌。“肿瘤”是指随着癌性细胞生长和增殖而形成的组织团块，其可侵袭并破坏正常的邻近组织。癌细胞可离开恶性肿瘤并进入血流或淋巴系统,由此癌细胞从原发肿瘤蔓延以在其他器官中形成新的肿瘤。“实体肿瘤”是指通常不含囊肿或液体区域的组织的异常生长或团块。实体肿瘤可以是良性(非癌性)或恶性的(癌性)。不同类型的实体肿瘤是以形成它们的细胞类型来命名。实体肿瘤的实例是肉瘤、癌瘤及淋巴瘤。白血病(血液癌症)通常不形成实体肿瘤。“血液癌”是在形成血液的组织如骨髓中或在免疫系统细胞中开始的癌症。血液癌的实例是白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤。如本文所用的“受试者”或“患者”可以是任何哺乳动物。在一个典型实施方案中，受试者或患者是人。如本文所用的“激动剂”通常是指可结合GITR并触发GITR信号传导的分子，例如如本文所提供的抗原结合蛋白。短语“免疫调节剂”是指诱导、增强或抑制免疫应答的分子。免疫激活剂是诱导或增强免疫应答的分子。免疫抑制剂是减少或抑制免疫应答的分子。因此，激活免疫疗法是涉及施用一种或多种分子以诱导或增强受试者的免疫系统的疗法。抑制免疫疗法是其中受试者用一种或多种分子治疗以减弱或抑制受试者的免疫系统的疗法。II.概述提供适用于调节GITR活性的多种选择性结合剂。这些试剂包括例如含有特异性地结合至GITR多肽，具体说来人GITR(例如SEQIDNO:1)的抗原结合结构域的抗原结合蛋白。所提供的抗原结合蛋白是GITR激动剂且因此可诱导或增强GITR信号传导。考虑到其作为GITR激动剂的活性，所提供的抗原结合蛋白可用于多种免疫疗法应用中。本文所述的抗原结合蛋白是通过广泛的选择过程以鉴别将适用于免疫疗法，具体说来适用作免疫刺激剂的抗体而获得。第一选择是决定产生全人抗体而非人源化或嵌合抗体。全人抗体被选出以降低当向受试者施用时抗体可能针对抗GITR抗体本身而产生的风险，这种风险预期将在其中施用GITR抗体以上调受试者的免疫应答的免疫疗法应用中被放大。用于获得这类全人抗体的过程通过在动物中进行三个单独的免疫接种事件来引发。这些事件采用三种不同的免疫接种策略和三个不同的小鼠品系，以致力于使前导候选物将从其中选出的抗体的数量和序列多样性最大化。然后通过多轮基于序列的生物物理和功能筛选评估从这三个事件中获得的所得的初始抗体以鉴别一组具有所需性质的亲代抗体。随后，以进一步改善所选亲代抗体的一种或多种特征的目标产生这些亲代抗体的工程改造的变体。最终，从亲代和工程改造的抗体中选出一组抗体用于进一步分析。例如，就序列分析而言，基于许多标准如对氧化、脱氨基化、异构化、酸水解和/或聚集的倾向以及免疫原性，从初始抗体中选出亲代抗体。生物物理分析包括基于表达水平、聚集倾向及稳定性评估抗体。功能上，就活性如对GITR的亲和力、活化和刺激效应T细胞的能力以及消除由调节性T细胞产生的抑制的能力来选择亲代抗体。接着，对所选的亲代抗体进行工程改造以试图改良抗体。从亲代抗体的最终选择及其工程改造形式也是基于许多标准，包括细胞系的稳定性、纯化属性、制造评价及所需功能属性。在一些实施方案中，抗原结合蛋白因为其展现与不同T细胞亚类的差异结合而被选出。具体说来，这类抗原结合蛋白比CD4+CD25-T细胞更强地结合至CD4+CD25+T细胞并且比CD8+CD25-T细胞更强地结合至CD8+CD25+T细胞。此结合选择性不同于在一些其他已知的GITR抗体的情况下所观察到的。选择性可为重要的，因为在本文所提供的GITR抗原结合蛋白的情况下观察到的差异结合类似于在天然配体GITRL的情况下所见的。因而，结合选择性可降低与同其他T细胞亚群的非特异性结合有关的不合需要的作用的可能性并且更近似地模拟GITRL的结合。在一个实施方案中，也选择抗原结合蛋白以使得Fc区域被糖基化。因此，例如，抗原结合蛋白可以是其中重链具有IgG1亚型的抗体。Fc结构域的糖基化在抗体结合Fcγ受体并形成抗体簇的能力方面可为重要的。这类成簇在某些抗原结合蛋白最有效地诱导或增强GITR信号传导的能力方面可为重要的。如上所述，鉴于其作为GITR激动剂的活性，所提供的抗原结合蛋白在以下多种免疫疗法中具有价值：其中需要诱导或增强受试者的免疫应答，如治疗多种癌症、免疫病症及感染。本文所公开的抗原结合蛋白具有多种另外的效用。抗原结合蛋白例如适用于GITR的特异性结合测定、亲和力纯化、以及鉴别GITR活性的其他激动剂的筛选测定中。抗原结合蛋白的其他用途包括例如诊断GITR相关疾病或病状以及确定GITR的存在或不存在的筛选测定。III.GITR抗原结合蛋白虽然本文包括的实施例描述作为抗体的抗原结合蛋白，但本文所提供的抗原结合蛋白不仅限于抗体。一般说来，本文所提供的抗原结合蛋白包含骨架，如一种或多种多肽，其中包埋和/或连接有一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)如本文所述的互补决定区(CDR)。在一些抗原结合蛋白中，CDR被包埋到“构架”区中，构架区对一个或多个CDR进行定向以便实现所述CDR的适当抗原结合特性。其中可以包埋CDR的其他类型的骨架在下文中进一步描述。因此，在一些抗原结合蛋白中，CDR序列被包埋入蛋白质骨架或其他生物相容的聚合物中。在其他实施方案中，抗原结合蛋白是抗体或来源于抗体。因此，所提供的某些抗原结合蛋白的例子包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体如合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(有时称为“抗体偶联物”)、及其各自分别的部分或片段。在一些情况下，抗原结合蛋白是完全抗体的免疫功能片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、结构域抗体或微型抗体)。各种结构在本文中进一步描述和定义。考虑到其活化GITR的能力，所提供的抗原结合蛋白可以任何组合展现一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种)以下生物活性：a.在体外或体内诱导或增强GITR信号传导；b.与GITRL交叉竞争结合至GITR；c.可以内化到人CD4细胞中；d.减少效应T细胞活性的调节性T细胞抑制；e.在体外或体内降低循环调节性T细胞的水平；f.在体外或体内活化效应T细胞；g.在体外或体内诱导或增强效应T细胞增殖；h.在人血清中具有至少6、7、9或12天的半衰期i.抑制肿瘤生长；以及j.诱导肿瘤消退。A.具有天然存在的抗体结构的GITR抗原结合蛋白所提供的一些抗原结合蛋白具有通常与天然存在的抗体有关的结构。这些抗体的结构单元通常包含一个或多个四聚体，各自由两个相同的多肽链偶联体组成，但是一些种类的哺乳动物也产生仅具有单一重链的抗体。在一个典型抗体中，每对或偶联体包含一个全长“轻”链(在某些实施方案中约25kDa)和一个全长“重”链(在某些实施方案中约50-70kDa)。每个单独的免疫球蛋白链由若干“免疫球蛋白结构域”构成，所述免疫球蛋白结构域各自由大致90至110个氨基酸组成并且表现出特征性折叠模式。这些结构域是构成抗体多肽的基本单位。每条链的氨基末端部分通常包含负责抗原识别的可变结构域。来自如本文所提及的重链的可变结构域有时简称为VH。类似地，来自轻链的可变结构域被称为VL。羧基末端部分比另一个链末端在进化上更为保守并且被称为“恒定区”或“C区”。人轻链通常被分为κ和λ轻链，且它们各自含有一个可变结构域和一个恒定结构域。重链通常被分为μ、δ、γ、α或ε链，并且这些链将抗体同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA、及IgE。IgG具有若干亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。IgM亚型包括IgM和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。在人中，IgA和IgD同种型含有4条重链和4条轻链；IgG和IgE同种型含有两条重链和两条轻链；并且IgM同种型含有5条重链和5条轻链。重链C区通常包含一个或多个可以负责效应子功能的结构域。重链恒定区结构域的数量将取决于同种型。举例来说，IgG重链各自含有三个被称为CH1、CH2及CH3的C区结构域。所提供的抗体可具有这些同种型和亚型中的任一种。在某些实施方案中，GITR抗体具有IgG1、IgG2或IgG4亚型。在全长轻链和重链中，可变区与恒定区由约十二个或更多个氨基酸的“J”区相连，其中重链还包含约十多个氨基酸的“D”区。参见，例如FundamentalImmunology,第2版,第7章(Paul,W.编著)1989,NewYork:RavenPress(出于所有目的据此以引用的方式整体并入)。轻/重链对各自的可变区通常形成抗原结合位点。示例性GITR单克隆抗体的IgG1重链恒定结构域的一个例子具有以下氨基酸序列：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ.IDNO:442)；星号对应于终止密码子)。示例性GITR单克隆抗体的λ轻链恒定结构域的一个例子具有以下氨基酸序列：QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*(SEQIDNO:443)；星号对应于终止密码子)。示例性GITR单克隆抗体的κ轻链恒定结构域的一个例子具有以下氨基酸序列：TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQIDNO:444)；星号对应于终止密码子)。对于本文所提供的抗体，免疫球蛋白链的可变区通常展现相同的总体结构，包含由三个高变区连接的相对保守的构架区(FR)，高变区更经常被称为“互补决定区”或CDR。来自以上提及的重链/轻链对各自两条链的CDR通常是由构架区进行比对以形成特异性地结合到GITR上的特异性表位的结构。从N端到C端，天然存在的轻链和重链可变区两者通常符合这些元件的以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。来自重链的CDR在本文中通常被称为CDRH1、CDRH2及CDRH3。同样，来自轻链的CDR在本文中通常被称为CDRL1、CDRL2及CDRL3。已设计一种编号系统用于将号码分配给占据这些结构域各自中的位置的氨基酸。此编号系统在以下文献中定义：KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1987和1991,NIH,Bethesda,Md.)，或Chothia&Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,1989,Nature342:878-883。如实施例中所述制备的特异性全人单克隆抗体的序列信息概述于表1中。此表为每种抗体列出六个CDR、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、全长重链(HC)及全长轻链(LC)。表1包括所选的亲代抗体以及通过蛋白质工程获得的亲代抗体的工程改造变体的序列信息。序列的比对提供于图8A、8B、9A、9B、10A、10B、11A及11B中。一般说来，所提供的抗原结合蛋白包含如表1中所列抗体的一个或多个CDR、一个或多个可变结构域、和/或一个或多个全长重链或轻链序列，以及这些序列的变体或衍生物。B.GITR抗原结合蛋白-CDR例如，在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含其中移植、插入和/或连接了一个或多个CDR的骨架。在某些实施方案中，所述骨架是多肽。例如，CDR可以是具有如上所述的天然存在的结构的抗体的一部分。骨架的另外的实例包括但不限于纤连蛋白、新制癌菌素CBM4-2、脂质运载蛋白、蛋白-A结构域(蛋白Z)、Im9、TPR蛋白、锌指结构域、pVIII、GC4、转铁蛋白及C型凝集素样结构域。可用于某些实施方案中的另一些骨架描述于Gebauer和Skerra(2009)Curr.Opin.Chem.Biol.,13:245-255，及Binz等人(2005)Nat.Biotech.23:1257-1268中，所述文献以引用的方式整体并入本文。抗原结合蛋白可具有1、2、3、4、5或6个CDR。抗原结合蛋白因此可具有例如选自表1中所列的CDR序列的一条重链CDR1(“CDRH1”)、和/或一条重链CDR2(“CDRH2”)、和/或一条重链CDR3(“CDRH3”)、和/或一条轻链CDR1(“CDRL1”)、和/或一条轻链CDR2(“CDRL2”)、和/或一条轻链CDR3(“CDRL3”)。一些抗原结合蛋白包括CDRH3和CDRL3两者，其各自来自于表1中所列的同一抗体。一些抗原结合蛋白包含CDRL1、CDRL2及CDRL3，每个来自选自组Ab1至Ab59(包括端点)的任何单个抗体的相同可变轻链。在另一实施方案中，抗原结合蛋白包含CDRL1、CDRL2及CDRL3，每个来自表1中所列的同一抗体，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3各自的氨基酸序列如表1中对于那个抗体所示。在另一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3中的一个或多个相对于选自Ab1至Ab59的组的任何单个抗体的可变结构域的相应CDRL1、CDRL2及CDRL3在序列上是不同的，然而前提条件是序列差异加起来总共不超过1、2、3或4个氨基酸差异。其他抗原结合蛋白包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，每个来自选自Ab1至Ab59的组(包括端点)的任何单一抗体的相同可变重链。在另一实施方案中，抗原结合蛋白包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，每个来自如表1中所列的相同抗体，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3各自的氨基酸序列如表1中对于那个抗体所示。在又一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3中的一个或多个相对于选自Ab1至Ab59(包括端点)的组的任何单个抗体的可变结构域的相应CDRH1、CDRH2及CDRH3在序列上是不同的，然而前提条件是序列差异加起来总共不超过1、2、3或4个氨基酸差异。还有一些抗原结合蛋白包含选自组Ab1至Ab59(包括端点)的任何单个抗体的所有六个CDR。在又一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含选自组Ab1至Ab59(包括端点)的任何单个抗体的所有六个CDR，其中六个CDR各自包含如表1中所列的氨基酸序列。其他抗原结合蛋白包含选自组Ab1至Ab59(包括端点)的任何单个抗体的所有六个CDR，例外的是CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3中的一或多个相对于所选抗体的相应CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3在序列上不同，然而前提条件是序列差异加起来总共不超过1、2、3、4、5或6个氨基酸差异。C.GITR抗原结合蛋白-可变结构域还提供包含选自组Ab1至Ab59(包括端点)的任何抗体的轻链可变结构域(VL)的抗原结合蛋白。在另一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含选自组Ab1至Ab59(包括端点)的任何抗体的VL，其中VL的氨基酸序列如表1所示。在另一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含与如表1所示的抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)的任一个的VL序列在氨基酸序列方面具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的变体VL序列。其他抗原结合蛋白包含变体VL序列，其与来自如表1所示的抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)的任一个的VL的氨基酸序列相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸。另一方面，所述变体VL序列相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸。一些抗原结合蛋白包含选自组Ab1至Ab59(包括端点)的任何抗体的重链可变结构域(VH)。在另一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含选自如表1所示的组Ab1至Ab59(包括端点)的任何抗体的VH，其中VH的氨基酸序列如表1所示。在另一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含与抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)的任一个的VH序列在氨基酸序列方面具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的变体VH序列。其他抗原结合蛋白包含变体VH序列，其与来自如表1所示的抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)的任一个的VH的氨基酸序列相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸。另一方面，所述变体VH序列相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸。又一抗原抗原结合蛋白包含VL和VH，其各自来自选自由Ab1至Ab59(包括端点)组成的组的同一抗体。在另一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含来自选自由Ab1至Ab59(包括端点)组成的组的同一抗体的VL和VH，其中VL和VH的氨基酸序列如表1所示。另一方面，抗原结合蛋白包含VL和VH，每个来自选自组Ab1至Ab59的同一抗体，其中VL和VH的一者或两者分别与抗原结合蛋白Ab1至Ab59(包括端点)的任一个的VL或VH序列在氨基酸序列方面具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性。一些抗原结合蛋白包含变体VL和/或变体VH，其中变体VL和变体VH的一者或两者不同于选自组Ab1至Ab59(包括端点)的任何单个抗体的相应VL或VH序列，前提条件是VH和VL中的序列差异加起来总共不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，差异总共不超过1、2、3、4或5个氨基酸。在又一实施方案中，所述抗原结合蛋白包含来自选自Ab1至Ab59(包括端点)的组的同一抗体的VH和VL，例外的是从VH和/或VL序列的N末端丢失了1、2、3或4个氨基酸。这种变化可能例如由于表达或储存期间的裂解而发生。D.GITR抗原结合蛋白-全长序列还提供包含全长重链的抗原结合蛋白，所述全长重链包含如表1所示的任一抗体的全长重链的氨基酸序列。其他抗原结合蛋白包含全长轻链，所述全长轻链包含如表1所示的任一抗体的全长轻链的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是抗体并且包含全长重链和全长轻链，其各自获自如表1中所列的同一抗体。在另一实施方案中，所述抗体含有两条相同的轻链和两条相同的重链，各自获自如表1中所列的同一抗体。另一些抗原结合蛋白是表1中所示的任何单个抗体的变体，其中变体抗体的全长轻链和/或全长重链具有与表1中所列的相应抗体的轻链和重链的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含具有与表1中所列的抗体的轻链的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的全长轻链。另一方面，所述抗原结合蛋白包含具有与表1中所列的抗体的重链的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的全长重链。提供表1中所示的抗体的其他变体，其包含针对表1中所示的单个抗体所列的全长轻链和全长重链，例外的是一条链或两条链的序列与表1中所示的相应序列相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基。又一方面，含有表1中所列的CDR、可变结构域和/或全长序列的抗原结合蛋白是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性抗体或上述的抗体片段。在另一实施方案中，基于具有表1中所列的序列的抗体，本文所提供的分离的抗原结合蛋白的抗体片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。在又一实施方案中，本文所提供的分离的抗原结合蛋白是具有如表1中陈述的序列的人抗体并且具有IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在某些实施方案中，所述抗体具有IgG1型。某些抗原结合蛋白包含如对于选自表1的Ab1至Ab59(包括端点)的组的任何单个抗体所示的CDR、可变结构域和/或全长序列并且进一步表征为具有以下一种或多种特征：(a)结合人GITR以使得KD≤300nM、≤150nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤2nM或≤1nM；(b)在人血清中具有至少6、7、9或12天的半衰期；(c)结合SEQIDNO:1的人GITR和SEQIDNO:2的食蟹猴GITR；(c)以KD≤10nM结合SEQIDNO:1的人GITR且以KD≤500nM结合SEQIDNO:2的食蟹猴GITR。(d)结合SEQIDNO:1的人GITR和SEQIDNO:2的食蟹猴GITR，而不结合SEQIDNO:3的小鼠GITR。在一些实施方案中，抗原结合蛋白对于GITR具有至少104/M×秒、至少105/M×秒、或至少106/M×秒的结合速率(ka)，如例如以下实施例中所述来测量。所提供的某些抗原结合蛋白具有缓慢解离速率(dissociationrate)或解离速率(off-rate)。一些抗原结合蛋白例如具有1×10-2s-1、或1×10-3s-1、或1×10-4s-1、或1×10-5s-1的kd(解离速率)。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白具有小于25pM、50pM、100pM、500pM、1nM、5nM、10nM、25nM或50nM的KD(平衡结合亲和力)。另一方面，提供(例如,当向人受试者施用时)具有至少一天体外或体内半衰期的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白具有至少三天的半衰期。在各个其他实施方案中，所述抗原结合蛋白具有4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或60天或更长的半衰期。在另一实施方案中，所述抗原结合蛋白被衍生或修饰以使得与未衍生或未修饰的抗体相比具有更长的半衰期。在另一实施方案中，所述抗原结合蛋白含有点突变以延长血清半衰期。以下提供关于这种突变和衍生形式的更多细节。E.GITR抗原结合蛋白-共有序列又一方面，提供包含具有来源于如本文所公开的相关抗体的组的共有氨基酸序列的抗原结合蛋白。如本文所述，“共有序列”是指具有在许多序列中共同的保守氨基酸和在给定的氨基酸序列组内不同的可变氨基酸的氨基酸序列。所提供的CDR共有序列包括对应于CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3中的每一个的CDR。在一个实施方案中，共有序列来源于如表1和图中所概述的Ab1-8、11-14及18-19的CDR。因此，在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含本身包含CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH，其中CDRH1包含序列X1YGMX2(SEQIDNO:436)，其中X1是S或N；且X2是H或Y；CDRH2包含序列VIWYX1GSNKYYADSVX2G(SEQIDNO:437)，其中X1是E、V、A、P；且X2是K或R；CDRH3包含序列GGX1LX2X3X4YYX5GMDV(SEQIDNO:438)，其中X1是Q、L、E或R；X2是G、R或S；X3是K、Y、L、F或R；且X4是Y或D；且X5是Y或S；在另一实施方案中，抗原结合蛋白包含本身包含CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL，其中CDRL1包含序列RASQX1IRNDLG(SEQIDNO:439)，其中X1是G或V；CDRL2包含序列X1X2SX3LQS(SEQIDNO:440)，其中X1是A或D；X2是A或T；且X3是S或T；CDRL3包含序列X1QX2X3X4YPX5T(SEQIDNO:441)，其中X1是L或Q；X2是H或L；X3是N或H；X4是S、N或T；且X5是W、L或I。在又一实施方案中，抗原结合蛋白包含VH和VL，其各自具有如上所述的相应共有CDR序列。F.竞争抗原结合蛋白在另一实施方案中，提供与如上所述示例的抗体或功能片段中的一者竞争特异性结合至GITR(例如，SEQIDNO:1的人GITR)的抗原结合蛋白。这种抗原结合蛋白可结合至与本文所述的抗原结合蛋白中的一种相同的表位或结合至重叠表位。与示例的抗原结合蛋白竞争的抗原结合蛋白和片段预期显示类似的功能性质。示例的抗原结合蛋白和片段包括如上所述的那些，包括具有表1中所包括的重链和轻链、可变区结构域及CDR的那些。因此，作为一个具体实例，所提供的抗原结合蛋白包括与具有以下的抗体竞争的那些蛋白：(a)所有6个针对表1中所列的同一抗体列出的CDR；(b)针对表1中所列的同一抗体列出的VH和VL；或(c)针对表1中所列的同一抗体示出的两条轻链和两条重链。在一个实施方案中，竞争通过BIAcore测定来测定。G.单克隆抗体所提供的抗原结合蛋白包括结合至GITR的单克隆抗体。单克隆抗体可使用本领域中已知的任何技术，例如通过在免疫接种程序完成之后使从转基因动物收集的脾细胞永生化来产生。脾细胞可使用本领域中已知的任何技术永生化，例如通过将它们与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。供在产生杂交瘤的融合程序中使用的骨髓瘤细胞优选是非产抗体的、具有高融合效率并且是酶缺陷的，致使它们不能在仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。供小鼠融合物之用的合适的细胞系的例子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7及S194/5XXOBul；用于大鼠融合物中的细胞系的例子包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F及4B210。适用于细胞融合物的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。在一些情况下，杂交瘤细胞系是通过以下操作产生：用GITR蛋白免疫原使动物(例如，具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)免疫；从免疫过的动物收获脾细胞；将收获的脾细胞融合到骨髓瘤细胞系中，由此生成杂交瘤细胞；由杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，并且鉴别产生结合GITR多肽的抗体的杂交瘤细胞系。这种杂交瘤细胞系及由它们产生的抗GITR单克隆抗体是本申请的方面。由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体可使用本领域中已知的任何技术纯化。杂交瘤或mAb可进一步被筛选与鉴别具有特定性质(如诱导或增强GITR活性的能力)的mAb。这种筛选的例子提供于以下实施例。H.嵌合及人源化抗体还提供基于上述序列的嵌合及人源化抗体。用作治疗剂的单克隆抗体可在使用之前以不同的方式被修饰。一个实例是嵌合抗体，其是由来自不同抗体的蛋白区段组成的抗体，所述蛋白区段共价地连接以产生功能性免疫球蛋白轻链或重链或其免疫功能部分。通常，重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。关于与嵌合抗体有关的方法，参见，例如美国专利号4,816,567；及Morrison等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855，这些文献据此以引用的方式并入。CDR移植描述于例如美国专利号6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089及5,530,101中。通常，制备嵌合抗体的目标是生成其中使来自预期患者种类的氨基酸数量最大化的嵌合体。一个实例是“CDR移植”抗体，其中所述抗体包含一个或多个来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的互补决定区(CDR)，而抗体链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。对于在人中的使用，经常将来自啮齿动物抗体的可变区或所选CDR移植到人抗体中，代替人抗体的天然存在的可变区或CDR。一种有用的嵌合抗体类型是“人源化”抗体。通常，人源化抗体是由最初在非人动物中生成的单克隆抗体产生。在此单克隆抗体中的某些氨基酸残基(通常来自抗体的非抗原识别部分)被修饰以便与在相应同种型的人抗体中的相应残基同源。人源化可例如使用不同方法，通过将啮齿动物可变区的至少一部分取代为人抗体的相应区域来进行(参见，例如美国专利号5,585,089和5,693,762；Jones等人,1986,Nature321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature332:323-27；Verhoeyen等人,1988,Science239:1534-1536)。一方面，本文所提供的抗体(参见表1)的轻链和重链可变区的CDR被移植到来自相同或不同系统发生物种的抗体的构架区(FR)。为了生成共有人FR，可对来自若干人重链或轻链氨基酸序列的FR进行比对以鉴别共有氨基酸序列。在其他实施方案中，用来自不同重链或轻链的FR替代本文所公开的重链或轻链的FR。一方面，在GITR抗体的重链和轻链的FR中的稀有氨基酸不被替代，而FR氨基酸的其余部分被替代。“稀有氨基酸”是一种特殊的氨基酸，其处于其中此特殊氨基酸在FR中通常不可见的位置中。或者，来自一条重链或轻链的移植可变区可与不同于如本文所公开的那个特定重链或轻链的恒定区的恒定区一起使用。在其他实施方案中，移植的可变区是单链Fv抗体的部分。在某些实施方案中，来自除人之外的物种的恒定区可与人可变区一起使用以产生杂合抗体。I.全人抗体还提供全人GITR抗体。可利用在不使人类暴露于给定抗原的情况下制备对所述抗原有特异性的全人抗体的方法(“全人抗体”)。为实现全人抗体产生而提供的一个特殊手段是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中内源性Ig基因已被灭活的小鼠中是一种在小鼠(一种可用任何所需抗原免疫的动物)中产生全人单克隆抗体(mAb)的手段。使用全人抗体可使免疫原性和过敏反应减至最小，这些反应有时可由向人施用小鼠或源自小鼠的mAb作为治疗剂而引起。全人抗体可通过使转基因动物(通常小鼠)免疫而产生，转基因动物能够在内源性免疫球蛋白产生不存在的情况下产生人抗体库。用于此目的的抗原通常具有六个或更多个连续氨基酸，并且任选地偶联至载体如半抗原。参见，例如Jakobovits等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551-2555；Jakobovits等人,1993,Nature362:255-258；及Bruggermann等人,1993,YearinImmunol.7:33。在所述方法的一个实施例中，转基因动物通过使编码其中的小鼠重链和轻链免疫球蛋白的内源性小鼠免疫球蛋白基因座失能并且将含有编码人重链和轻链蛋白的基因座的人基因组DNA插入到小鼠基因组大片段中而产生。然后使具有少于完整的人免疫球蛋白基因座的部分修饰的动物杂交以获得具有所有想要的免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物产生对该免疫原有免疫特异性但具有人而非鼠氨基酸序列(包括可变区)的抗体。关于这种方法的更多细节，参见，例如WO96/33735和WO94/02602。关于用于制备人抗体的转基因小鼠的另一些方法描述于美国专利号5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299及5,545,806中；PCT公布WO91/10741、WO90/04036中；以及EP546073B1和EP546073A1中。如上所述的转基因小鼠(在本文中称为“HuMab”小鼠)含有编码未重排的人重链([μ]和[γ])和[κ]轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座、以及使内源性[μ]和[κ]链基因座失活的靶突变(Lonberg等人,1994,Nature368:856-859)。因此，小鼠展现小鼠IgM或[κ]的减少表达并且在对免疫产生应答时，引入的人重链和轻链转基因经受类别转换和体细胞突变以生成高亲和力人IgG[κ]单克隆抗体(Lonberg等人，同上；Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.YAcad.Sci.764:536-546)。HuMab小鼠的制备详细描述于Taylor等人,1992,NucleicAcidsResearch20:6287-6295；Chen等人,1993,InternationalImmunology5:647-656；Tuaillon等人,1994,J.Immunol.152:2912-2920；Lonberg等人,1994,Nature368:856-859；Lonberg,1994,HandbookofExp.Pharmacology113:49-101；Taylor等人,1994,InternationalImmunology6:579-591；Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.YAcad.Sci.764:536-546；Fishwild等人,1996,NatureBiotechnology14:845-851中，上述参考文献出于所有目的据此以引用的方式整体并入。进一步参见，美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；及5,770,429；以及美国专利号5,545,807；国际公布号WO93/1227；WO92/22646；及WO92/03918，其中所有公开内容出于所有目的据此以引用的方式整体并入。用于在这些转基因小鼠中产生人抗体的技术还公开于WO98/24893及Mendez等人,1997,NatureGenetics15:146-156中，这些文献据此以引用的方式并入。例如，HCo7和HCo12转基因小鼠品系可用于生成抗GITR抗体。关于使用转基因小鼠产生人抗体的更多细节提供于以下实施例中。使用杂交瘤技术，具有所需特异性的抗原特异性人mAb可由转基因小鼠(如如上所述的那些)产生和选出。这种抗体可使用合适的载体和宿主细胞克隆和表达，或抗体可从培养的杂交瘤细胞中收获。全人抗体还可来源于噬菌体展示文库(如Hoogenboom等人,1991,J.Mol.Biol.227:381；及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581中所公开)。噬菌体展示技术通过抗体库在丝状噬菌体表面上的展示模拟免疫选择，并且通过其结合至所选抗原进行噬菌体的后续选择。一项这种技术描述于PCT公布号WO99/10494(据此以引用的方式并入)中。表1包括如本文所提供的许多全人抗原结合蛋白的序列信息。J.双特异性或双功能抗原结合蛋白所提供的抗原结合蛋白还包括双特异性和双功能抗体，其包含一个或多个如上所述的CDR或一个或多个如上所述的可变区。在一些情况下，双特异性或双功能抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过包括但不限于以下的多种方法产生：杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见，例如Songsivilai和Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547-1553。K.变体在一个实施方案中，例如，抗原结合蛋白是以上所公开的抗原结合蛋白(例如，具有表1中所列的序列的那些)的变体形式。例如，一些抗原结合蛋白在表1所列的重链或轻链、可变区或CDR的一个或多个中具有一个或多个保守氨基酸取代。天然存在的氨基酸可基于共同的侧链性质被分成以下类别：1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)碱性：His、Lys、Arg；5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及6)芳族：Trp、Tyr、Phe。保守的氨基酸取代可包括这些类别之一的一个成员与相同类别的另一成员交换。保守的氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过在生物系统中合成而并入。这些包括肽模拟物及氨基酸部分的其他反向或倒置形式。非保守取代可包括以上类别之一的一个成员与另一类别的一个成员交换。这种取代的残基可引入与人抗体同源的抗体区域中或引入分子的非同源区域中。在进行这种变化时，根据某些实施方案，可考虑氨基酸的亲水指数。蛋白的亲水概况通过为每个氨基酸赋予一个数值(“亲水指数”)然后沿着肽链对这些值反复地求平均来计算。已经基于其疏水性和电荷特征为每个氨基酸赋予亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。亲水概况在对蛋白赋予互相作用生物功能方面的重要性在本领域中可以理解(参见，例如Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.157:105-131)。已知某些氨基酸可被取代成具有类似的亲水指数或分数的其他氨基酸并且仍保留类似的生物活性。在基于亲水指数进行变化时，在某些实施方案中，包括亲水指数在±2范围内的氨基酸的取代。在一些方面中，包括在±1范围内的那些，且在其他方面中，包括在±0.5内的那些。在本领域中还应理解，类似氨基酸的取代可有效地基于亲水性来进行，特别是当由此生成的生物功能蛋白或肽是旨在用于免疫学实施方案中时，如在当前情况下。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(受到其邻近氨基酸的亲水性的控制)与其免疫原性和抗原结合或免疫原性有关，即与蛋白质的生物学性质有关。以下亲水性值已经赋予这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。在基于类似的亲水性值进行变化时，在某些实施方案中，包括亲水性值在±2范围内的氨基酸的取代，在其他实施方案中，包括在±1范围内的那些，且在另一些实施方案中，包括在±0.5内的那些。在一些情况下，还可以基于亲水性从一级氨基酸序列来鉴别表位。这些区域也被称为“表位核心区”。示例性保守氨基酸取代陈述于表2中。表2：保守氨基酸取代熟练技术人员使用熟知的技术将能够确定如本文提出的多肽的合适变体。本领域技术人员通过定位确信对于活性不是重要的区来鉴别可以改变但不破坏活性的分子的合适区域。熟练技术人员还将能鉴别在类似多肽中保守的分子的残基和部分。在其他实施方案中，甚至可能对于生物活性或结构来说重要的区域也可经历保守氨基酸取代而不会破坏生物活性或不利地影响多肽结构。此外，本领域技术人员可以制备在每个需要的氨基酸残基上含有单一氨基酸取代的测验变体。然后可使用测定筛选这些变体的GITR抗原结合蛋白(参见以下实施例)，由此得到关于哪些氨基酸可以改变且哪些不可改变的信息。换言之，基于从这类常规实验收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定其中应该单独或以与其他突变组合避免进一步取代的氨基酸位置。大量的科学出版物一直致力于二级结构的预测。参见，Moult,1996,Curr.Op.,Biotech.7:422-427；Chou等人,1974,Biochem.13:222-245；Chou等人,1974,Biochemistry113:211-222；Chou等人,1978,Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.47:45-148；Chou等人,1979,Ann.Rev.Biochem.47:251-276；以及Chou等人,1979,Biophys.J.26:367-384。此外，目前可利用计算机程序来帮助预测二级结构。在一些实施方案中，进行如下氨基酸取代：(1)降低对蛋白质水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)为了形成蛋白质复合物改变结合亲和力，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或(4)为这类多肽赋予或修改其他生理化学或功能性质。例如，可在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，保守的氨基酸取代)。可在位于形成分子间接触的结构域之外的抗体那个部分中进行取代。在这类实施方案中，可使用基本上不改变亲本序列的结构特征的保守氨基酸取代(例如，不破坏表征亲本或天然抗原结合蛋白的二级结构的一个或多个置换氨基酸)。本领域公知的多肽二级和三级结构的例子描述于Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton编著),1984,W.H.NewYork:FreemanandCompany；IntroductiontoProteinStructure(Branden和Tooze编著),1991,NewYork:GarlandPublishing；及Thornton等人,1991,Nature354:105中，这些文献各自以引用的方式并入本文。另外的优选抗体变体包括半胱氨酸变体，其中在亲本或天然氨基酸序列中的一个或多个半胱氨酸残基缺失或被另一个氨基酸(例如，丝氨酸)取代。当抗体必须重折叠成生物活性构型时，半胱氨酸变体尤其适用。半胱氨酸变体可具有比天然抗体更少的半胱氨酸残基，且通常具有使由不成对的半胱氨酸引起的相互作用减至最少的偶数。所公开的重链和轻链、可变区结构域并且CDR可用于制备含有可特异性地结合至GITR的抗原结合区的多肽。例如，表1中所列的一个或多个CDR可共价地或非共价地并入分子(例如，多肽)中以制备免疫粘附物。免疫粘附物可合并有CDR作为较大多肽链的一部分，可将CDR共价地连接到另一多肽链，或可非共价地合并CDR。所述CDR使得免疫粘附物能够特异性结合至特定的目标抗原(例如，GITR多肽或其表位)。L.模拟物还提供基于本文所述的可变区结构域和CDR的模拟物(例如“肽的模拟物”或“肽模拟物”)。这些类似物可以是肽、非肽或肽与非肽区的组合。Fauchere,1986,Adv.DrugRes.15:29；Veber和Freidinger,1985,TINSp.392；及Evans等人,1987,J.Med.Chem.30:1229，这些文献出于任何目的以引用的方式并入本文。在结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可用于产生类似的治疗或预防效果。经常借助于计算机分子建模来开发这类化合物。通常，肽模拟物是在结构上类似于展示所需生物活性(如在此特异性地结合GITR的能力)的抗体但具有一个或多个通过本领域中众所周知的方法任选地被选自以下的键取代的肽键的蛋白质：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸的系统取代(例如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于某些实施方案中以生成更稳定的蛋白质。另外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变化的受约束肽可通过本领域中已知的方法(Rizo和Gierasch,1992,Ann.Rev.Biochem.61:387，以引用的方式并入本文)，例如，通过添加能够形成分子内二硫桥(其使肽环化)的内部半胱氨酸残基而生成。M.衍生物还提供本文所述的抗原结合蛋白的衍生物。衍生的抗原结合蛋白可包含向抗体或片段赋予所需性质(如在特定使用中延长的半衰期)的任何分子或物质。衍生的抗原结合蛋白可包含例如可检测的(或标记)部分(例如，放射性、比色、抗原性或酶促分子，可检测的珠粒(如磁性或电子致密的(例如金珠粒)，或结合至另一个分子(例如生物素或抗生蛋白链菌素)的分子))、治疗性或诊断性部分(例如，放射性、细胞毒性或药学活性部分)、或提高抗原结合蛋白对于特定用途的适用性的分子(例如，向受试者如人受试者施用，或其他体内或体外用途)。可用于衍生化抗原结合蛋白的分子的例子包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。抗原结合蛋白的白蛋白连接的和聚乙二醇化的衍生物可使用本领域中众所周知的技术来制备。某些抗原结合蛋白包含如本文所述的聚乙二醇化单链多肽。在一个实施方案中，抗原结合蛋白被偶联或以其他方式连接到甲状腺素运载蛋白(TTR)或TTR变体上。TTR或TTR变体可在化学上用例如选自由以下组成的组的化学品来修饰：葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇以及聚乙烯醇。其他衍生物包括GITR抗原结合蛋白与其他蛋白或多肽的共价或聚集偶联物，如通过表达包含融合至GITR抗原结合蛋白的N末端或C末端的异源多肽的重组融合蛋白。例如，偶联肽可以是异源信号(或前导)多肽，例如酵母α-因子前导序列或肽如表位标签。含有GITR抗原结合蛋白的融合蛋白可包含被添加以利于纯化或鉴别GITR抗原结合蛋白的肽(例如，聚His)。如Hopp等人,1988,Bio/Technology6:1204；及美国专利号5,011,912中所述，GITR抗原结合蛋白还可与FLAG肽连接。FLAG肽具有高度抗原性并且提供由特异性单克隆抗体(mAb)可逆性结合的表位，从而使所表达的重组蛋白快速测定和易于纯化。适用于制备其中FLAG肽融合至给定多肽的融合蛋白的试剂可商购获得(Sigma,St.Louis,MO)。N.低聚物含有一种或多种GITR抗原结合蛋白的低聚物可被用作GITR激动剂。低聚物可呈共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高级低聚物形式。在一个实施方案中，提供包含两种或更多种GITR抗原结合蛋白的低聚物，其中一个例子是同源二聚体。其他低聚物包括异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体等。一个实施方案涉及包含多个GITR结合多肽的低聚物，这些多肽经由融合至GITR抗原结合蛋白的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接。这类肽可以是肽接头(间隔物)、或具有促进低聚性质的肽。亮氨酸拉链和来源于抗体的某些多肽是在肽中，其可促进与此连接的GITR抗原结合蛋白的低聚，如在下文中更详细地描述。在具体的实施方案中，低聚物包含两个至四个GITR抗原结合蛋白。低聚物的GITR抗原结合蛋白部分可呈如上所述的任何形式，例如变体或片段。优选地，低聚物包含具有激动剂活性的GITR抗原结合蛋白。在一个实施方案中，使用来源于免疫球蛋白的多肽制备低聚物。包含融合至源自抗体的多肽的不同部分(包括Fc结构域)的某些异源多肽的融合蛋白的制备描述于以下文献中，例如Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535；Byrn等人,1990,Nature344:677；及Hollenbaugh等人,1992\ConstructionofImmunoglobulinFusionProteins\,inCurrentProtocolsinImmunology,增刊4,第10.19.1-10.19.11页。一个实施方案涉及一种二聚体，其包含通过将GITR抗原结合蛋白融合至抗体的Fc区而形成的两个融合蛋白。二聚体可通过以下操作生成：例如，将编码融合蛋白的基因融合物插入到适当的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合物，并且允许表达的融合蛋白组装成像抗体分子一样，由此在Fc部分之间形成链间二硫键以产生二聚体。如本文所用的术语“Fc多肽”包括来源于抗体的Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的这类多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(及由此形成的低聚物)提供容易通过在蛋白A或蛋白G柱上的亲和色谱纯化的优点。描述于PCT申请WO93/10151及美国专利号5,426,048和5,262,522中的一种合适的Fc多肽是从N末端铰链区延伸到人IgG1抗体的Fc区的天然C末端的单链多肽。另一种有用的Fc多肽是Fc突变蛋白，其描述于美国专利号5,457,035及Baum等人,1994,EMBOJ.13:3992-4001中。此突变蛋白的氨基酸序列与WO93/10151中提出的天然Fc序列的氨基酸序列相同，例外的是氨基酸19已由Leu改变为Ala，氨基酸20已由Leu改变为Glu，且氨基酸22已由Gly改变为Ala。突变蛋白展现对于Fc受体降低的亲和力。或者，低聚物是包含多个GTR抗原结合蛋白的融合蛋白，有或者没有肽接头(间隔肽)。合适的肽接头描述于美国专利号4,751,180和4,935,233中。用于制备低聚GITR抗原结合蛋白衍生物的另一种方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域是促进其中发现这些结构域的蛋白质低聚的肽。亮氨酸拉链最初在若干DNA结合蛋白中鉴别(Landschulz等人,1988,Science240:1759)，且此后见于多种不同的蛋白质中。已知的亮氨酸拉链是天然存在的肽及其二聚化或三聚化衍生物。适用于产生可溶性低聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的例子描述于PCT申请WO94/10308中，并且来源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链描述于Hoppe等人,1994,FEBSLetters344:191中，这些文献据此以引用的方式并入。允许与此融合的异源蛋白的稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的用途描述于Fanslow等人,1994,Semin.Immunol.6:267-278中。在一种方法中，包含融合至亮氨酸拉链肽的GITR抗原结合蛋白片段或衍生物的重组融合蛋白在合适的宿主细胞中表达，并且将所形成的可溶性低聚GITR抗原结合蛋白片段或衍生物从培养物上清液中回收。O.GITR抗原结合蛋白的物种交叉反应性在一个实施方案中，GITR抗原结合蛋白(例如，具有如表1中所述的序列的那些)结合人GITR蛋白(SEQIDNO:1)但不结合小鼠GITR(SEQIDNO:3)。在另一实施方案中，GITR抗原结合蛋白结合人GITR蛋白(例如SEQIDNO:1)和食蟹猴GITR蛋白(SEQIDNO:2)。在又一实施方案中，GITR抗原结合蛋白结合人GITR(SEQIDNO:1)和食蟹猴GITR(SEQIDNO:2)，但不结合小鼠GITR(SEQIDNO:3)。在各种实施方案中，GITR抗原结合蛋白以KD≤1、2、5、10、20或50nM结合人GITR蛋白(例如，SEQIDNO:1)并且以KD≤50、100、150、200、300、400、500、600或700nM结合至食蟹猴GITR蛋白(例如，SEQIDNO:2)。一方面，结合至人和食蟹猴GITR是通过例如BiaCore来测定。P.GITR抗原结合蛋白的糖基化状态抗原结合蛋白可具有与天然物种中所发现的不同或改变的糖基化模式。如本领域中已知，糖基化模式可取决于蛋白质序列(例如，特定的糖基化氨基酸残基的存在或不存在，在下文中论述)或其中产生蛋白质的宿主细胞或生物体。以下论述具体的表达系统。多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是用于糖部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列在多肽中的存在生成一个潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟氨基酸，最通常丝氨酸或苏氨酸的连接，但是也可使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。糖基化位点向抗原结合蛋白中的添加宜通过更改氨基酸序列以使得其含有上述三肽序列中的一个或多个(对于N-连接的糖基化位点)来完成。所述更改也可通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至起始序列中(对于O-连接的糖基化位点)或通过用一个或多个丝氨酸或苏氨酸的取代来产生。为方便起见，抗原结合蛋白氨基酸序列可通过在DNA水平下的变化而更改，特别是通过使编码靶多肽的DNA在预定的碱基处突变以使得生成将翻译成所需氨基酸的密码子。增加抗原结合蛋白上的碳水化合物部分的数量的另一个手段是通过将糖苷的化学或酶促偶联到蛋白质上。这些方法是有优势的，因为在具有N-或O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中，它们不需要产生蛋白质。取决于所用的偶联模式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO87/05330，及Aplin和Wriston,1981,CRCCrit.Rev,Biochem.,第259-306页中。在初始抗原结合蛋白上存在的碳水化合物部分的除去可以化学或酶促方式完成。化学去糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此处理导致大多数或所有糖的裂解，连接糖除外(N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰半乳糖胺)，同时留下完整的多肽。化学去糖基化描述于Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52及Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131中。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可如Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.138:350所述通过利用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现。在潜在的糖基化位点上的糖基化可如Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.257:3105所述通过利用化合物衣霉素来防止。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。因此，这些方面包括抗原结合蛋白的糖基化变体，其中糖基化位点的数量和/或类型与亲本多肽的氨基酸序列相比已经更改。在某些实施方案中，抗体蛋白变体包含比天然抗体更多或更少数量的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点的特征为以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸外的任何氨基酸残基。取代氨基酸残基生成此序列提供用于添加N-连接的糖链的潜在新位点。或者，消除或更改此序列的取代将防止添加存在于天然多肽中的N-连接的糖链。例如，糖基化可通过Asn的缺失或通过用不同的氨基酸取代Asn来减少。在其他实施方案中，生成一个或多个新的N-连接的位点。抗体通常于Fc区中具有N-连接的糖基化位点。如实施例中所述，发现某些GITR抗原结合蛋白的糖基化状态可以是影响蛋白质的激动剂活性的一个重要因素。具体说来，发现抗原结合蛋白当被糖基化时具有改善的活性。因此，在一些实施方案中，抗原结合蛋白是其中恒定区是IgG1的抗体，因而，免疫球蛋白具有允许结合至Fc受体(FcR)的糖基化状态。在细胞表面上抗体与Fc受体的结合触发多种生物反应，包括伴随内吞抗体涂覆颗粒的后续破坏的内化、免疫复合物的清除、由杀伤细胞所致的抗体涂覆的靶细胞的溶解(一种称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的过程，或简称为ADCC)、免疫球蛋白产生的控制以及炎性介体的释放。如实施例中所证明，通过抗原结合蛋白的FcR结合造成蛋白质的更大程度的成簇，而且又发现产生改善的激动剂活性。此发现与某些报道相悖，报道提出使用具有降低的效应子功能和/或糖基化的GITR抗体维持激动剂活性。Q.具有标记和效应子基团的抗原结合蛋白在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个标记。术语“标记基团”或“标记”意指任何可检测的标记。合适的标记基团的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、或由二级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂偶联到抗原结合蛋白上以减小潜在的位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可在适当时使用。术语“效应子基团”意指偶联到抗原结合蛋白上用作细胞毒性剂的任何基团。合适的效应子基团的例子是放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其他合适的基团包括毒素、治疗剂基团或化疗剂基团。合适的基团的例子包括卡奇霉素、奥瑞斯他汀、格尔德霉素及美登素。在一些实施方案中，效应子基团经由各种长度的间隔臂偶联到抗原结合蛋白上以减小潜在的位阻。一般说来，标记可分成多种类别，这取决于其中它们有待被检测的测定：a)同位素标记，其可以是放射性的或重同位素；b)磁性标记(例如，磁性颗粒)；c)氧化还原作用活性部分；d)光学染料；e)酶促基团(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；f)生物素化基团；以及g)由二级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂偶联到抗原结合蛋白上以减小潜在的位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的。具体的标记包括光学染料，包括但不限于发色团、磷光体及荧光团，后者在许多情况下是特异性的。荧光团可以是“小分子”荧光素(fluores)或蛋白质荧光素(fluores)。“荧光标记”是指可经由其固有的荧光性质被检测的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、若丹明、四甲基若丹明、曙红、藻红、香豆素、甲基-香豆素、芘、Malacitegreen、二苯乙烯、荧光黄、CascadeBlueJ、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LCRed640、Cy5、Cy5.5、LCRed705、俄勒冈绿、Alexa-Fluor染料(AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor660,AlexaFluor680)、CascadeBlue、CascadeYellow及R-藻红蛋白(PE)(MolecularProbes,Eugene,OR)、FITC、若丹明及德克萨斯红(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(AmershamLifeScience,Pittsburgh,PA)。合适的光学染料(包括荧光团)描述于RichardP.Haugland的MolecularProbesHandbook中，该文献据此清楚地以引用的方式并入。合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白，包括Renilla、Ptilosarcus或GFP的多管水母种类(Chalfie等人,1994,Science263:802-805)、EGFP(ClontechLabs.,Inc.，Genbank登记号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，QuantumBiotechnologies,Inc.,Quebec,Canada；Stauber,1998,Biotechniques24:462-471；Heim等人,1996,Curr.Biol.6:178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，ClontechLabs.,Inc.)、荧光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2603-2607)以及Renilla(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利号5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558)。IV.编码GITR抗原结合蛋白的核酸还提供编码本文所述的抗原结合蛋白或其部分的核酸，包括编码抗体的一条链或两条链或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的核酸；编码重链可变区或仅CDR的多核苷酸；足以用作杂交探针的多核苷酸；用于鉴别、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物；用于抑制多核苷酸表达的反义核酸；以及上述核酸的互补序列。所述核酸可具有任何长度。它们可以是例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000个或更多个核苷酸的长度，和/或可包含一个或多个另外的序列，例如调控序列，和/或可以是更大核酸(例如载体)的一部分。核酸可以是单链或双链并且可包含RNA和/或DNA核苷酸，及其人工变体(例如，肽核酸)。表3示出编码IgG1重链恒定区及IgG1κ和λ轻链恒定区的示例性核酸序列。本文所提供的任何可变区都可连接到这些恒定区上以形成完整的重链和轻链序列。然而，应理解这些恒定区序列仅提供作为特定的实例。在一些实施方案中，可变区序列与本领域中已知的其他恒定区序列相连。编码重链和轻链可变区的示例性核酸序列提供于表3和4中。表3：编码重链和轻链恒定区的示例性核酸序列表4提供编码抗原结合蛋白的重链和轻链可变结构域的示例性核酸序列的概要；这些序列还编码可变结构域内所包括的各种CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3序列。因此，在一个实施方案中，提供由以下核酸编码的抗原结合蛋白。表4：编码重链和轻链可变结构域的示例性核酸序列亲代抗体编号参考编号抗体VHVLAb1SS-109421D79980Ab2SS-1241333C910081Ab3SS-1241433F610182Ab4SS-1241534G41028342-->Ab5SS-1241635B1010384Ab6SS-1241741E1110485Ab7SS-1242841G510586Ab8SS-1241842A1110687Ab9SS-1241944C110788Ab10SS-1242045A810889Ab11SS-1242146E1110990Ab12SS-1242248H1211091Ab13SS-1242348H711192Ab14SS-1242449D911293Ab15SS-1242549E211394Ab16SS-1242748A911495Ab17SS-109435H711596Ab18SS-109447A1011697Ab19SS-109459H611798工程改造的编码某些抗原结合蛋白或其部分(例如，全长抗体、重链或轻链、可变结构域、或CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3)的核酸可从已用GITR或其免疫原性片段免疫的小鼠的B细胞中分离。所述核酸可通过常规方法如聚合酶链式反应(PCR)分离。噬菌体展示是由此可制备抗体及其他抗原结合蛋白的衍生物的已知技术的另一个实例。在一种方法中，作为目标抗原结合蛋白的组分的多肽在任何合适的重组表达系统中表达，并且允许所表达的多肽装配形成抗原结合蛋白。表3和4中提供的核酸仅为示例性的。由于遗传密码的简并性，表3和4中所列或另外在本文描绘的每个多肽序列还由除了所提供之外的大量其他核酸序列编码。一个方面进一步提供在特定的杂交条件下与其他核酸(例如，包含表3和表4中所列的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。用于杂交核酸的方法在本领域中是公知的。参见，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定义，中等严格的杂交条件使用含有以下的预洗溶液：5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6xSSC，及55℃的杂交温度(或其他类似的杂交溶液，如含有约50％甲酰胺，杂交温度是42℃)，以及60℃的洗涤条件，在0.5xSSC、0.1％SDS中。严格的杂交条件是在45℃下在6xSSC中杂交，然后在68℃下在0.1xSSC、0.2％SDS中进行一次或多次洗涤。此外，本领域技术人员可操纵杂交和/或洗涤条件以提高或降低杂交的严格性以使得包含彼此具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。影响杂交条件选择的基本参数以及用于设计合适条件的指南阐述于以下文献中，例如Sambrook、Fritsch和Maniatis(2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，同上；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,1995,Ausubel等人编著,JohnWiley&Sons,Inc.,第2.10和6.3-6.4节)，并且可由本领域的普通技术人员基于例如核酸的长度和/或碱基组成容易地确定。变化可通过突变引入核酸中，由此导致在其编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列方面的变化。可使用本领域中已知的任何技术引入突变。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案改变一个或多个特定的氨基酸残基。在另一实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。一旦它被制备，可就所需性质对突变多肽进行表达和筛选。突变可被引入核酸中，而不显著改变其编码的多肽的生物活性。例如，可以进行在非必需氨基酸残基处产生氨基酸取代的核苷酸取代。或者，一个或多个突变可被引入选择性地改变其编码的多肽的生物活性的核酸中。例如，突变可定量地或定性地改变生物活性。定量变化的实例包括提高、降低或消除活性。定性变化的实例包括改变抗体的抗原特异性。在一个实施方案中，可使用本领域中得到确认的分子生物学技术使编码本文所述的任何抗原结合蛋白的核酸突变以更改氨基酸序列。另一方面提供适用作引物或杂交探针以供检测核酸序列的核酸分子。核酸分子可仅包含编码全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码多肽的活性部分(例如，GITR结合部分)的片段。基于核酸序列的探针可用于检测核酸或类似的核酸，例如编码多肽的转录物。所述探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这类探针可用于鉴别表达多肽的细胞。另一方面提供包含编码多肽或其部分(例如，含有一个或多个CDR或一个或多个可变区结构域的片段)的核酸的载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、非附加型哺乳动物载体及表达载体，例如重组表达载体。重组表达载体可包含呈适用于在宿主细胞中表达核酸形式的核酸。重组表达载体包含一个或多个基于待用于表达的宿主细胞来选择的调控序列，所述调控序列与有待表达的核酸序列可操作地连接。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些(例如，SV40早期基因增强子、劳氏肉瘤病毒启动子及巨细胞病毒启动子)、指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些(例如，组织特异性调控序列，参见Voss等人,1986,TrendsBiochem.Sci.11:287，Maniatis等人,1987,Science236:1237)、以及指导核苷酸序列响应于特定的处理或条件诱导型表达的那些(例如，在哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子及在原核和真核系统中的tet反应性和/或链霉素反应性启动子)。表达载体的设计可取决于如下因素：诸如有待转化的宿主细胞的选择以及所需蛋白质的表达水平。表达载体可被引入宿主细胞中，由此产生由如本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。另一方面提供其中已经引入重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞))。载体DNA可经由常规的转化或转染技术引入原核细胞或真核细胞中。对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，取决于所用的表达载体和转染技术，仅一小部分的细胞可将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴别和选择这些整合体，通常将编码可选标记(例如，对抗生素的抗性)的基因连同目标基因一起引入宿主细胞中。优选的可选标记包括赋予对药物(如G418、潮霉素和氨甲蝶呤)抗性的那些。用引入的核酸稳定转染的细胞除其他方法以外可通过药物选择(例如，已经并入了可选标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)来鉴别。V.制备GITR抗原结合蛋白所提供的非人抗体可例如来源于任何产生抗体的动物，如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴、或非人灵长类动物(如猴子(例如，食蟹猴或恒河猴)或猿(例如，黑猩猩))。非人抗体可例如用于在体外细胞培养和基于细胞培养的应用，或其中对抗体的免疫应答不存在或微不足道、可被防止、并不重要，或是所期望的任何其他应用。在某些实施方案中，抗体可通过用全长GITR或其片段免疫而产生。或者，某些非人抗体可通过用氨基酸免疫而产生，所述氨基酸是形成本文所提供的某些抗体所结合至的表位的部分的GITR的区段。所述抗体可以是多克隆的、单克隆的、或可在宿主细胞中通过表达重组DNA合成。全人抗体可如上所述通过使转含有人免疫球蛋白基因座的基因动物免疫或通过选择表达人抗体库的噬菌体展示文库来制备。单克隆抗体(mAb)可通过以下多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,1975,Nature256:495的标准体细胞杂交技术。或者，可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如B-淋巴细胞的病毒或致癌性转化。用于制备杂交瘤的一种合适的动物系统是鼠系统，其是完全确定的程序。用于免疫的脾细胞的分离以便融合的免疫方案和技术在本领域中是已知的。对于所述程序，将来自免疫过的小鼠的B细胞与合适的永生化融合配偶体(如鼠骨髓瘤细胞系)融合。如果需要，作为小鼠的代替，也可免疫大鼠或其他哺乳动物并且可将来自所述动物的B细胞与鼠骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。或者，可使用来自除了小鼠之外的来源的骨髓瘤细胞系。用于制造杂交瘤的融合程序也是公知的。所提供的单链抗体可通过经由氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)片段从而产生单个多肽链而形成。所述单链Fv(scFv)可通过在编码两个可变结构域多肽(VL和VH)的DNA之间融合编码肽接头的DNA来制备。所得的多肽可本身折叠以形成抗原结合单体，或其可形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，这取决于在两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt等人,1997,Prot.Eng.10:423；Kortt等人,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过组合不同的包含VL和VH的多肽，可形成结合至不同表位的多聚体scFv(Kriangkum等人,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。为产生单链抗体而开发的技术包括在以下文献中描述的那些：美国专利号4,946,778；Bird,1988,Science242:423；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879；Ward等人,1989,Nature334:544,deGraaf等人,2002,MethodsMolBiol.178:379-387。来源于本文所提供的抗体的单链抗体包括但不限于包含表1中所描绘的重链和轻链可变区的可变结构域组合或包括表1中所描绘的CDR的轻链和重链可变结构域的组合的scFv。一个亚类的本文所提供的抗体可使用亚类转换方法转变为来自不同亚类的抗体。因此，IgG抗体可来源于IgM抗体，例如，且反之亦然。所述技术允许制备新抗体，所述新抗体具有给定抗体(亲代抗体)的抗原结合性质，而且还展现与不同于亲代抗体的抗体同种型或亚类有关的生物性质。可采用重组DNA技术。编码特定抗体多肽的克隆的DNA可用于所述程序中，例如，编码所需同种型的抗体的恒定结构域的DNA。参见，例如Lantto等人,2002,MethodsMol.Biol.178:303-316。因此，所提供的抗体包括包含例如同上所述的可变结构域组合的那些，其具有所需同种型(例如，IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgD)及其Fab或F(ab’)2片段。此外，如果想要IgG4，那么也可需要如Bloom等人,1997,ProteinScience6:407，以引用的方式并入本文)中所述将点突变(CPSCP(SEQIDNO:448)->CPPCP(SEQIDNO:449))引入铰链区中以降低形成H链内二硫键的倾向，所述二硫键可导致IgG4抗体中的异质性。此外，还已知用于衍生具有不同性质(即，对于其结合的抗原的不同亲和力)的抗体的技术。一种被称为链改组的此类技术，涉及在丝状噬菌体表面上展示免疫球蛋白可变结构域基因库，常称为噬菌体展示。链改组已用于制备针对半抗原2-苯基噁唑-5-酮的高亲和力抗体，如Marks等人,1992,BioTechnology10:779所述。可对表1中所述的重链和轻链可变区或表1中所述的CDR(及对编码核酸的相应修饰)进行保守性修饰以产生具有功能和生物化学特征的GITR抗原结合蛋白。上文描述用于实现这类修饰的方法。GITR抗原结合蛋白可以各种方式进一步被修饰。例如，如果它们将要用于治疗目的，那么其可与聚乙二醇偶联(聚乙二醇化)以延长血清半衰期或增强蛋白质递送。或者，主题抗体或其片段的V区可与不同抗体分子的Fc区融合。用于此目的的Fc区可被修饰以使得其不结合补体，由此降低当融合蛋白被用作治疗剂时在患者中诱导细胞裂解的可能性。另外，主题抗体或其功能片段可与人血清白蛋白偶联以延长抗体或其片段的血清半衰期。抗原结合蛋白或其片段的另一个有用的融合配偶体是甲状腺素运载蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚体的能力，因此，抗体-TTR融合蛋白可形成多价抗体，该多价抗体可提高其结合亲合力。或者，在本文所述的抗原结合蛋白的功能和/或生物化学特征中的实质性修饰可通过在重链和轻链的氨基酸序列中生成取代而实现，这种取代对维持以下的作用是显著不同的：(a)分子主链在取代区域内的结构，例如作为折叠或螺旋构象，(b)在靶位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的庞大。“保守的氨基酸取代”可包括用对在那个位置处的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有作用或没有作用的非天然残基取代天然氨基酸残基。参见，表2，同上。此外，在多肽中的任何天然残基还可被丙氨酸取代，如先前针对丙氨酸扫描诱变所描述的。主题抗体的氨基酸取代(不管是保守的抑或非保守的)可由本领域技术人员通过应用常规技术来实现。氨基酸取代可用于鉴别本文所提供的抗体的重要残基，或提供或降低这些抗体对于GITR的亲和力。VI.表达抗原结合蛋白的方法本文还提供呈质粒、表达载体、转录或表达盒形式的包含至少一种如上所述的多核苷酸的表达系统和构建体；以及包含所述表达系统或构建体的宿主细胞。本文所提供的抗原结合蛋白可通过许多常规技术中的任一种来制备。例如，GITR抗原结合蛋白可使用本领域中已知的任何技术由重组表达系统产生。参见，例如MonoclonalAntibodies,Hybridomas:ANewDimensioninBiologicalAnalyses,Kennet等人(编著)PlenumPress,NewYork(1980)；及Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow和Lane(编著),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1988)。抗原结合蛋白可在杂交瘤细胞系(例如，具体说来抗体可在杂交瘤中表达)中或在除杂交瘤以外的细胞系中表达。编码抗体的表达构建体可用于转化哺乳动物、昆虫或微生物宿主细胞。转化可使用用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的任何已知方法进行，包括例如在病毒或噬菌体中包装多核苷酸及通过本领域中已知的转导程序用构建体转导宿主细胞，如由美国专利号4,399,216；4,912,040；4,740,461；4,959,455所例示。所用的最佳转化程序将取决于何种类型的宿主细胞正在被转化。用于引入异源多核苷酸到哺乳动物细胞中的方法在本领域中是众所周知的并且包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的包裹、核酸与带正电的脂质的混合、以及直接显微注射DNA到核中。重组表达构建体通常包含编码多肽的核酸分子，所述多肽包含以下一种或多种：一个或多个本文所提供的CDR；轻链恒定区；轻链可变区；重链恒定区(例如，CH1、CH2和/或CH3)；和/或GITR抗原结合蛋白的另一个骨架部分。使用标准连接技术将这些核酸序列插入适当的表达载体中。在一个实施方案中，重链或轻链恒定区附加到抗GITR特异性重链或轻链可变区的C末端并且连接到表达载体中。通常选出在所用的特定宿主细胞中具有功能性的载体(即，所述载体与宿主细胞机构相容，可容许基因的扩增和/或表达)。在一些实施方案中，使用这样的载体，其采用使用蛋白报道分子如二氢叶酸还原酶的蛋白片段互补测定(参见，例如美国专利号6,270,964，其据此以引用的方式并入)。可从例如LifeTechnologies或BDBiosciences(原来的“Clontech”)购买合适的表达载体。用于克隆和表达抗体和片段的其他有用的载体包括Bianchi和McGrew,2003,Biotech.Biotechnol.Bioeng.84:439-44中所述的那些，其据此以引用的方式并入。另外合适的表达载体论述于例如MethodsEnzymol.,第185卷(D.V.Goeddel编著),1990,NewYork:AcademicPress中。通常，用于任何宿主细胞中的表达载体将含有用于质粒维持及用于克隆和表达外源性核苷酸序列的序列。这类序列统称为“侧翼序列”，在某些实施方案中，通常将包括以下一个或多个核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码有待表达的多肽的核酸的多接头区域、以及可选择的标记元件。下文论述这些序列中的每一个。任选地，载体可含有“标签(tag)”编码序列，即位于GITR抗原结合蛋白编码序列的5'或3'端处的寡核苷酸分子；所述寡核苷酸序列编码聚His(如六His(SEQIDNO:450))，或另一个“标签”如HA(血球凝集素流感病毒)、或myc，为此存在可商购获得的抗体。在多肽表达时，此标签通常便融合至多肽，并且可充当用于GITR抗原结合蛋白从宿主细胞的亲和纯化或检测的手段。亲和纯化可例如通过柱色谱法，使用针对如亲和基质的标签的抗体来完成。任选地，所述标签随后可通过各种手段如使用用于裂解的某些肽酶从纯化的GITR抗原结合蛋白中除去。侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或品系以外的物种)、杂合的(即，来自一个以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。因而，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎或无脊椎生物、或任何植物，只要侧翼序列在宿主细胞机构中具有功能性并且可由宿主细胞机构激活。适用于载体中的侧翼序列可通过本领域中众所周知的若干方法中的任一种获得。通常，本文中有用的侧翼序列先前已通过绘图和/或通过限制性内切酶消化鉴别且因此可使用适当的限制性内切核酸酶从适当的组织来源中分离。在一些情况下，可已知侧翼序列的全核苷酸序列。在此，侧翼序列可使用本文所述的用于核酸合成或克隆的方法合成。不管是已知所有的或仅一部分的侧翼序列，都可使用聚合酶链式反应(PCR)和/或通过用合适的探针如来自相同或另一物种的寡核苷酸和/或侧翼序列片段筛选基因组文库来获得侧翼序列。当侧翼序列未知时，含有侧翼序列的DNA的片段可从可能含有例如编码序列或甚至另一个或多个基因的更大片段的DNA中分离。分离可通过限制性内切酶消化完成以产生适当的DNA片段，然后使用琼脂糖凝胶纯化、柱色谱法(Chatsworth,CA)或熟练技术人员已知的其他方法进行分离。为实现此目的而进行的合适酶的选择对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。复制的起点通常是商业购买的那些原核细胞表达载体的一部分，并且起点协助载体在宿主细胞中的扩增。如果所选载体不含复制起点位点，那么可基于已知序列通过化学方式进行合成，并且连接到载体中。例如，来自质粒pBR322(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，并且不同的病毒起点(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、疱疹性口腔炎病毒(VSV)或乳头状瘤病毒如HPV或BPV)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。哺乳动物表达载体一般不需要复制起点元件(例如，经常使用SV40起点只是因为它含有病毒早期启动子)。转录终止序列通常位于多肽编码区的3'末端并且用来终止转录。在原核细胞中的转录终止序列通常是富含G-C的片段，接下来是聚胸腺嘧啶核苷酸序列。虽然序列容易从文库中克隆或甚至作为载体的部分在商业上购买，但其也可使用如本文所述的用于核酸合成的方法轻易合成。可选择的标记基因编码为在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。典型的选择标记基因编码具有以下特点的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素的抗性，例如对于原核宿主细胞来说氨苄青霉素、四环素或卡那霉素；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基或限定性培养基中得到的重要营养物。特异性可选择的标记物是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因及四环素抗性基因。新霉素抗性基因还可有利地用于在原核及真核宿主细胞中的选择。其他可选择的基因可用于扩增将要表达的基因。扩增是以下过程：其中产生对于生长或细胞存活至关重要的蛋白质所需的基因在重组细胞连续世代的染色体内串联性重复。哺乳动物细胞的合适的可选择标记物的例子包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于转化体唯有依靠载体中存在的可选择基因才能适于生存的选择压力下。选择压力通过将转化的细胞培养在选择试剂在培养基中的浓度不断增加的调节下来施加，从而导致可选择基因和编码另一基因(如结合GITR多肽的抗原结合蛋白)的DNA都被扩增。因此，增加量的多肽如抗原结合蛋白是由扩增的DNA合成的。核糖体结合位点通常为mRNA的翻译起始所必需且特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。所述元件通常位于启动子的3'与有待表达的多肽编码序列的5'。在一些情况下，如当在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化时，可操纵各种前序列或原序列以改善糖基化或产率。例如，可更改特定信号肽的肽酶裂解位点，或添加也可影响糖基化的原序列。蛋白终产物可在-1位置(相对于成熟蛋白的第一个氨基酸)具有一个或多个易于表达的额外氨基酸，这些氨基酸可以不被完全去除。例如，蛋白终产物可具有在肽酶裂解位点中发现的一个或两个与氨基末端联接的氨基酸残基。或者，一些酶裂解位点的使用可产生稍微截短形式的所需多肽，如果酶切割在成熟多肽内的所述区域的话。表达和克隆载体通常将含有由宿主生物识别并且与编码GITR抗原结合蛋白的分子可操作地连接的启动子。启动子是位于控制结构基因转录的结构基因起始密码子(通常在约100至1000bp内)上游(即5')的非转录序列。启动子通常被分为两类：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子响应于培养条件中的某种变化，如营养物的存在或缺乏，或者温度的改变，而启动处于它们控制下的增加水平的DNA转录。另一方面，组成型启动子均匀地转录与其可操作连接的基因，即，对基因表达几乎没有控制或没有控制。大量由多种潜在的宿主细胞识别的启动子是众所周知的。通过经由限制酶消化从源DNA除去启动子并将所需的启动子序列插入载体，可以将合适的启动子可操作地连接到编码组成GITR抗原结合蛋白的重链或轻链的DNA。供酵母宿主使用的合适的启动子在本领域中也是众所周知的。酵母增强子宜与酵母启动子一起使用。供哺乳动物宿主细胞使用的合适的启动子是众所周知的并且包括但不限于从以下病毒的基因组处获得的那些：如多瘤病毒、传染性上皮瘤病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒以及猿猴病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。增强子序列可插入载体中以增加高等真核生物对编码组成GITR抗原结合蛋白的轻链或重链的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，长度通常约为10-300bp，其作用于启动子以增加转录。增强子是方向和位置相对独立的，已经在转录单位的5'和3'位发现了增强子。已知可从哺乳动物基因获得的若干增强子序列(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域中已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子是用于激活真核启动子的示例性增强元件。虽然增强子可位于载体中编码序列的5'或3'处，但其通常位于启动子的5'位点处。编码适当的天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列可并入表达载体中以促进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于其中有待产生抗体的宿主细胞的类型，并且异源信号序列可替代天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中具有功能性的信号肽的例子包括以下：在美国专利号4,965,195中所述的白介素-7(IL-7)的信号序列；在Cosman等人,1984,Nature312:768中所述的白介素-2受体的信号序列；在欧洲专利号0367566中所述的白介素-4受体信号肽；在美国专利号4,968,607中所述的I型白介素-1受体信号肽；在欧洲专利号0460846中所述的II型白介素-1受体信号肽。所提供的表达载体可由初始载体如可商购获得的载体构建。这类载体可含有或不含有所有想要的侧翼序列。当本文所述的一个或多个侧翼序列早已不存在于载体中时，其可单独获得并联接至载体中。用于获得每一个侧翼序列的方法是本领域技术人员公知的。在已经构建了载体并且编码组成GITR抗原结合序列的轻链、重链、或轻链和重链的核酸分子已经插入载体的适当位点之后，可将完整的载体插入合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。用于抗原结合蛋白的表达载体向选择的宿主细胞中的转化可通过以下众所周知的方法完成，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知的技术。选出的方法将部分地随待使用的宿主细胞类型而变化。这些方法及其他合适的方法是熟练技术人员公知的并且阐述于例如Sambrook等人,2001,同上中。宿主细胞当在适当条件下培养时合成抗原结合蛋白，随后可从培养基中(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或者直接从产生其的宿主细胞(如果不分泌的话)收集所述抗原结合蛋白。适当的宿主细胞的选择将取决于各种因素，如所需的表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)以及折叠为生物活性分子的容易性。可用作宿主用于表达的哺乳动物细胞系在本领域中是众所周知的且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)以及许多其他细胞系。在某些实施方案中，细胞系可通过确定哪个细胞系具有高表达水平并且组成型地产生具有GITR结合性质的抗原结合蛋白而选出。在另一实施方案中，可选出来自B细胞谱系的细胞系，B细胞谱系不产生自身抗体但具有产生和分泌异源抗体的能力。VII.GITR抗原结合蛋白在疗法中的用途GITR在免疫应答中发挥的关键作用使其成为免疫疗法中有吸引力的靶标，所述作用包括诱导或增强针对所需肿瘤抗原或致病抗原(例如，病毒及其他致病生物)的免疫应答。因而，抗原结合蛋白在治疗各种癌症和感染性疾病中具有效用。如上所述，GITR激活将共激活信号送至CD4+和CD8+T细胞并且防止调节性T细胞对免疫应答的抑制。因此，在一个实施方案中，施用GITR抗原结合蛋白以抑制调节性T细胞对效应T细胞活性的抑制。这类抑制可通过本领域中已知的多种方法测定，包括例如通过监测T细胞增殖、激活的已知标记物的表达、或细胞因子分泌。在另一实施方案中，向受试者施用GITR抗原结合蛋白以降低调节性T细胞的水平，例如循环调节性T细胞的水平。在又一实施方案中，通过施用如本文所提供的抗原结合蛋白诱导或增强效应T细胞的活性。在实施例中提供这些方法各自的特异性测定。A.癌症的治疗GITR生物学的几个方面使其成为用于治疗多种癌症的潜在靶标。首先是GITR激活，如上文所详细描述的，激活免疫系统。另外，表达GITR的效应T细胞和调节性T细胞浸润多个肿瘤类型，然而GITR在非造血细胞上几乎不表达或不表达。此分布概况意味着表达GITR的细胞可变得集中在肿瘤处。活性与分布的这种组合一起使得GITR激活成为用于治疗多种癌症的有吸引力的手段。所述抗原结合蛋白可用于治疗实体肿瘤以及血液癌，包括白血病。已经证明多种不同的肿瘤包含GITR阳性免疫细胞。因此，这些肿瘤是特别有吸引力的靶标。这类肿瘤包括例如黑色素瘤(包括III期和IV期恶性黑色素瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌-NSCLC)、头颈癌、肾细胞癌以及结肠直肠癌。可用抗原结合蛋白治疗的其他癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌(例如，头颈部的鳞状细胞癌-SCCHN)、葡萄膜黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、子宫颈癌、脑癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤、霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、胃癌以及星形胶质细胞癌。在治疗上述癌症的任一种时，所提供的治疗方法可在患有肿瘤的个体中用于进一步抑制肿瘤生长、诱导肿瘤消退、提高无进展存活率和/或延长总生存时间。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白还可延迟或预防转移发生。治疗中的进展可使用各种方法监测。例如，抑制可引起肿瘤尺寸减小和/或肿瘤内的代谢活性下降。这些参数都可通过例如MRI或PET扫描来测量。抑制还可通过活组织检查监控以确定坏死水平、肿瘤细胞死亡以及肿瘤内的血管分布水平来监测。转移程度可使用已知方法监控。虽然所提供的GITR抗原结合蛋白可单独施用，但在其他实施方案中，抗原结合蛋白与另一种治疗剂(例如，化疗剂)、放射疗法和/或手术组合施用。如果与另一种治疗剂一起施用，那么抗原结合蛋白可在所述药剂(例如，作为同一组合物的部分)之前、之后或同时施用。可与抗原结合蛋白组合的其他治疗剂包括例如其他免疫治疗剂、各种靶向疗法(例如，在癌症治疗中使用的治疗性抗体)、血管生成抑制剂、化疗剂以及抑制与癌症转移有关的骨质流失的试剂。例如，在一个实施方案中，将抗原结合蛋白与另一种免疫治疗剂(即，诱导或增强免疫应答的免疫刺激剂)组合施用。这种药剂可包括例如：1)树突细胞活化剂，2)疫苗佐剂，3)T细胞刺激物，4)免疫检查点抑制剂，以及5)抑制性细胞、细胞因子和/或酶的抑制剂。因此，在一个实施方案中，将抗原结合蛋白与树突细胞生长因子如Flt3L一起施用。在另一实施方案中，将抗原结合蛋白与刺激抗原呈递细胞的试剂组合。所述药剂的例子包括各种CD40激动剂，如激动剂抗CD40抗体或CD40L。一些方法包括施用抗原结合蛋白与疫苗佐剂。这种佐剂包括例如IL-12及各种Toll样受体(TLR)激动剂，包括CpG(TLR9激动剂)、单磷酰基脂质A(MPL-TLR4激动剂)、聚I:C或聚ICLC(TLR3激动剂)、以及瑞喹莫德和852A(TLR7/8激动剂)。在其他治疗方法中，将抗原结合蛋白与T细胞生长因子如IL-15和/或IL-17、或这些分子的活化剂组合施用。在相关方法中，将T细胞刺激物与抗原结合蛋白组合。这种刺激物包括4-1BB的激动剂，如激动剂抗4-1BB抗体和4-1BBL。在某些实施方案中，将抗原结合蛋白与T细胞检查点抑制剂(例如，将抑制信号送至免疫系统的分子)一起施用。这种药剂的例子包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，如抗PD-1抗体，包括纳武单抗nivolumab(Bristol-MyersSquibb)和lambrolizumab，又名MK-3475(Merck)、pidilizumab(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)及抗PD-L1抗体(包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(BristolMyerSquibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)及MSB-0010718C(Merck))。其他检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂，如抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA4抗体是由Bristol-MyersSquibb销售的(易普利单抗)。其他示例性CTLA-4抗体包括替西木单抗(Pfizer)、Ticilimumab(AstraZeneca)及AMGP-224(GlaxoSmithKline)。在其他方法中，抗原结合蛋白与具有免疫抑制作用的酶抑制剂组合施用。一个例子是1-甲基色氨酸(1MT)，它是吲哚胺2,3-加双氧酶的小分子抑制剂。所述抗原结合蛋白还可与Amgen的T-VEC(talimogenelaherparepvec)组合使用。在某些实施方案中，将抗原结合蛋白与分子组合施用，分子是可用作抗癌药物的一类双特异性抗体。所述分子指导宿主的免疫系统，具体说来T细胞针对癌细胞的细胞毒性。实例包括由Amgen开发的AMG-103(blinatumumab)和AMG-110(solitomab)。抗原结合蛋白还可与多种靶向疗法组合施用。靶向疗法的实例包括但不限于治疗性抗体的使用。示例性抗体包括但不限于结合至肿瘤细胞上存在的细胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白样糖蛋白及表皮生长因子受体(EGFR)，并且任选地诱导针对展示这些蛋白的肿瘤细胞的细胞抑制性和/或细胞毒性作用的那些抗体。示例性抗体还包括(曲妥单抗)，其可用于治疗乳腺癌及其他形式的癌症；及(利妥昔单抗)；ZEVALINTM(替伊莫单抗)；及LYMPHOCIDETM(依帕珠单抗)，其可用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤及其他形式的癌症。某些示例性抗体还包括帕尼单抗(IMC-C225)；ertinolib(易瑞沙)；BEXXARTM(碘131托西莫单抗)；KDR(激酶结构域受体)抑制剂；抗VEGF抗体和拮抗剂(例如，莫特塞尼及VEGAF-TRAP)；抗VEGF受体抗体和抗原结合区；抗Ang-1和Ang-2抗体和抗原结合区；针对Tie-2及其他Ang-1和Ang-2受体的抗体；Tie-2配体；针对Tie-2激酶抑制剂的抗体；Hif-1a的抑制剂及CampathTM(阿伦单抗)。在某些实施方案中，癌症治疗剂是选择性地诱导肿瘤细胞中的细胞凋亡的多肽，包括但不限于TNF相关多肽TRAIL。在某些实施方案中，将如本文所提供的抗原结合蛋白与一种或多种减少血管生成的抗血管生成剂组合使用。某些这类试剂包括但不限于IL-8拮抗剂；Campath、B-FGF；FGF拮抗剂；Tek拮抗剂(Cerretti等人,美国公开号2003/0162712；Cerretti等人,美国专利号6,413,932；及Cerretti等人,美国专利号6,521,424)；抗TWEAK剂(其包括但不限于抗体和抗原结合区)；可溶性TWEAK受体拮抗剂(Wiley,美国专利号6,727,225)；拮抗整联蛋白与其配体的结合的ADAM解整合素结构域(Fanslow等人,美国公布号2002/0042368)；抗eph受体和抗肝配蛋白抗体；抗原结合区、或拮抗剂(美国专利号5,981,245；5,728,813；5,969,110；6,596,852；6,232,447；6,057,124)；抗VEGF剂(例如，特异性地结合VEGF或可溶性VEGF受体或其配体结合区的抗体或抗原结合区)如或VEGF-TRAPTM、及抗VEGF受体试剂(例如，特异性地与此结合的抗体或抗原结合区)、EGFR抑制性试剂(例如，特异性地与此结合的抗体或抗原结合区)如帕尼单抗、IRESSATM(吉非替尼)、TARCEVATM(埃罗替尼)、抗Ang-1和抗Ang-2试剂(例如，特异性地与此或与其受体结合的抗体或抗原结合区，例如Tie-2/TEK)、及抗Tie-2激酶抑制性试剂(例如，特异性地结合并抑制生长因子活性的抗体或抗原结合区，如肝细胞生长因子拮抗剂(HGF，又名ScatterFactor)、及特异性地结合其受体“c-met”的抗体或抗原结合区(例如，rilotumumab和AMG337，Amgen))；抗PDGF-BB拮抗剂；PDGF-BB配体的抗体和抗原结合区；以及PDGFR激酶抑制剂。可与抗原结合蛋白组合使用的其他抗血管生成剂包括试剂如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂以及COX-II(环加氧酶II)抑制剂。有用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREXTM(塞利昔布)、伐地考昔及罗非考昔。如本文所提供的抗原结合蛋白还可与生长因子抑制剂组合使用。这类试剂的实例包括但不限于可抑制EGF-R(表皮生长因子受体)反应的试剂，如EGF-R抗体(例如，帕尼单抗)、EGF抗体、及作为EGF-R抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如可抑制VEGF的VEGF受体和分子；以及erbB2受体抑制剂，如结合至erbB2受体的有机分子或抗体，例如(Genentech,Inc.)。EGF-R抑制剂描述于例如美国专利号5,747,498、WO98/14451、WO95/19970及WO98/02434中。在一些治疗应用中，特别是当癌症已转移到骨骼以致骨骼受到负面影响时，施用抗原结合蛋白和进一步抑制骨质流失或帮助重建流失的骨的治疗剂可能是有用的。因此，抗原结合蛋白可与治疗有效量的骨骼生长促进(合成代谢)剂或骨骼抗再吸收剂一起施用，包括但不限于：命名为BMP-1至BMP-2的骨形态发生因子；转化生长因子-β和TGF-β家族成员；成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF-10；白介素-1抑制剂(包括IL-1ra、针对IL-1的抗体及针对IL-1受体的抗体)；TNFα抑制剂(包括依那西普、阿达木单抗及英夫利昔单抗)；RANK配体抑制剂(包括可溶性RANK、骨保护素及特异性地结合RANK或RANK配体的拮抗性抗体，如地诺单抗)、Dkk-1抑制剂(例如，抗Dkk-1抗体)、甲状旁腺激素、E系列前列腺素、双膦酸盐及骨骼增强矿物质如氟化物和钙。可与抗原结合蛋白及其功能片段组合使用的合成代谢剂包括甲状旁腺激素和胰岛素样生长因子(IGF)，其中后一试剂优选地与IGF结合蛋白复合。适用于这类组合治疗的IL-1受体拮抗剂描述于WO89/11540中并且合适的可溶性TNF受体-1描述于WO98/01555中。示例性RANK配体拮抗剂公开于例如WO03/086289、WO03/002713、美国专利号6,740,511及6,479,635中。在某些实施方案中，治疗方法包括将如本文所提供的抗原结合蛋白与一种或多种化疗剂组合。这类治疗的实例包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂，包括：氮芥如甲二氯二乙胺、环磷酸酰胺、异环磷酰胺、美法仑及氮芥苯丁酸；亚硝基脲如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)及司莫司汀(甲基-CCNU)；TemodalTM(替莫唑胺)、乙烯亚胺/甲基蜜胺如三亚乙基蜜胺(TEM)、三乙烯、噻替派(硫替派)、六甲蜜胺(HMM，altretamine)；烷基磺酸盐如白消安；三嗪如氮烯唑胺(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物如氨甲蝶呤和三甲曲沙、嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶(5FU)、氟脱氧尿苷、吉西他滨、阿糖胞苷(AraC，cytarabine)、5-氮杂胞苷、2,2'-二氟脱氧胞苷、嘌呤类似物如6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、咪唑硫嘌呤、2'-脱氧助间型霉素(喷司他丁)、赤型羟基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉滨、及2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；天然产物，包括抗有丝分裂药物，如紫杉醇、长春花生物碱(包括长春花碱(VLB)、长春新碱及长春瑞滨)、泰素帝(taxotere)、雌氮芥、及磷酸雌氮芥；鬼臼毒素(pipodophylotoxin)，如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，如放线菌素D、道诺霉素(红比霉素)、阿霉素、米托蒽醌、伊达比星、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)、丝裂霉素C、及放线菌素；酶，如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂，如干扰素-α、IL-2、G-CSF及GM-CSF；杂类试剂，包括铂配位复合物如顺铂和卡铂、蒽二酮如米托蒽醌、取代的脲如羟基脲、甲肼衍生物包括N-甲肼(MIH)和甲基苄肼、肾上腺皮质抑制剂如米托坦(o,p-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，如强的松和等效物、地塞米松和氨鲁米特；GemzarTM(吉西他滨)、孕酮如己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮及乙酸甲地孕酮；雌激素，如己烯雌酚和乙炔雌二醇等效物；抗雌激素，如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟烃甲基睾丸酮/等效物；抗雄激素，如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；以及非类固醇抗雄激素，如氟他胺。包括但不限于组蛋白脱乙酰酶抑制剂、去甲基化试剂(例如Vidaza)及转录抑制释放(ATRA)疗法的靶向表观遗传机制的疗法也可与抗原结合蛋白组合。化疗剂的额外具体实例包括紫杉酚、taxene(例如多西他赛和泰素帝)、修饰的紫杉醇(例如，Abraxane和Opaxio)阿霉素、索坦(Sutent)、Nexavar、及其他多激酶抑制剂、顺铂和卡铂、依托泊苷、吉西他滨及长春花碱。其他激酶的特定抑制剂也可与抗原结合蛋白组合使用，包括但不限于MAPK途径抑制剂(例如，ERK、JNK及p38的抑制剂)、PI3激酶/AKT抑制剂及Pim抑制剂。其他抑制剂包括Hsp90抑制剂、蛋白酶体抑制剂(例如Velcade)及多重作用机制抑制剂，如Trisenox。在一些实施方案中，GITR抗原结合蛋白被偶联至药物以形成抗体药物偶联物(ADC)。一般来说，ADC包含偶联至以下化疗剂的抗体，例如细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、毒素或放射性试剂，例如像如上所述的。接头分子可用于将药物偶联至抗体。适用于ADC技术中的广泛多种接头和药物在本领域中是已知的并且可用于形成含有GITR抗原结合蛋白的ADC。(参见，例如US20090028856；US2009/0274713；US2007/0031402；WO2005/084390；WO2009/099728；美国专利号5,208,020；美国专利号5,416,064；美国专利号5,475,092；5,585,499；6,436,931；6,372,738；及6340701，其各自以引用的方式并入本文)。B.感染的治疗除在治疗癌症中的用途之外，在另一实施方案中，所提供的抗原结合蛋白还可用于诱导或增强针对外源抗原的免疫应答，如存在于各种感染性因子上的那些抗原。可针对其生成免疫应答的感染性因子上存在的抗原的实例包括但不限于病毒、寄生虫、细菌及其他微生物上存在的蛋白质、糖蛋白、脂蛋白及糖脂。在某些实施方案中，将所提供的GITR抗原结合蛋白并入针对感染性因子的疫苗中作为预防性治疗的部分。在这种治疗中，将个体用含有需要针对其的免疫力的抗原和如本文所公开的抗原结合蛋白的疫苗进行免疫。或者，可利用编码致病抗原的基因的表达载体及抗原结合蛋白来进行疫苗接种。C.检测和诊断方法本文所述的抗原结合蛋白可用于检测GITR(例如，在生物样本如血清或血浆中)并且用于诊断目的以检测、诊断或监控与GITR或GITR治疗有关的疾病和/或病状。例如，所公开的抗原结合蛋白提供使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测GITR在样本中的存在(例如，Tijssen,1993,PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays,第15卷(编者R.H.Burdon和P.H.vanKnippenberg,Elsevier,Amsterdam)；Zola,1987,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,第147-158页(CRCPress,Inc.)；Jalkanen等人,1985,J.Cell.Biol.101:976-985；Jalkanen等人,1987,J.CellBiol.105:3087-3096)。GITR的检测可在体内或体外进行。本文所提供的诊断应用包括使用抗原结合蛋白来检测GITR的表达及配体与GITR的结合。适用于检测GITR的存在的方法的实例包括免疫测定如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。对于诊断应用，抗原结合蛋白通常将用可检测的标记基团来标记。合适的标记基团包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、或由二级报道分子识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂偶联到抗原结合蛋白上以减小潜在的位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可以使用。另一方面，抗原结合蛋白可用于鉴别表达GITR的一个或多个细胞。在一个特定实施方案中，将抗原结合蛋白用标记基团标记并且检测标记的抗原结合蛋白与GITR的结合。在另一特定实施方案中，在体内检测到抗原结合蛋白与GITR的结合。在另一特定实施方案中，使用本领域中已知的技术分离和测量GITR抗原结合蛋白。参见，例如Harlow和Lane,1988,Antibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarbor(1991编辑和定期增刊)；JohnE.Coligan编著,1993,CurrentProtocolsInImmunologyNewYork:JohnWiley&Sons。在另一实施方案中，提供用于检测与本文所提供的抗原结合蛋白竞争结合至GITR的测试分子的存在的方法。这种测定的一个实例包括在测试分子存在或不存在下检测游离抗原结合蛋白在含有一定量GITR的溶液中的量。游离抗原结合蛋白(即，不结合至GITR的抗原结合蛋白)的量的增加将指示测试分子能够与抗原结合蛋白竞争GITR结合。在一个实施方案中，将抗原结合蛋白用标记基团标记。或者，标记测试分子并且在抗原结合蛋白存在和不存在下监测游离的测试分子的量。用于确定竞争的多种额外方法在本领域中是已知的；方法还提供于下文的实施例中。VIII.药物制剂和施用还提供包含GITR抗原结合蛋白的药物组合物并且可在本文所公开的任何预防和治疗方法中使用。在一个实施方案中，还提供治疗有效量的一种或多种抗原结合蛋白以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。可接受的制剂原料在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。药物组合物可配制成液体、冷冻或冻干组合物。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改变、维持或保持，例如，pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速度、组合物的吸附或渗透的制剂原料。在这类实施方案中，合适的制剂原料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；疏松剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖、二糖及其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂及稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、triton、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES,第18版,(A.R.Genrmo编著),1990,MackPublishingCompany提供关于可并入药物组合物中的合适的试剂的其他细节和选择。在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预定的施用途径、递送形式及所需剂量确定。参见，例如REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES,同上。在某些实施方案中，这类组合物可影响所公开的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率及体内清除速率。在某些实施方案中，在药物组合物中的主要媒介物或载体在性质上可以是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水或生理盐溶液。在某些实施方案中，GITR抗原结合蛋白组合物可通过将具有所需纯度的选出的组合物与任选的制剂(REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES,同上)以冻干饼或水溶液形式混合来制备以便储存。此外，在某些实施方案中，可使用适当的赋形剂如蔗糖将GITR抗原结合蛋白配制成冻干物。如上所论述，某些实施方案提供组合物，特别是药物组合物，其除GITR抗原结合蛋白之外还包含一种或多种赋形剂，如在本节及本文别处示例性地描述的那些。就此而言，赋形剂可鉴于广泛多种目的而用于本发明中，如调节制剂的物理、化学或生物性质，如调节粘度以改善GITR抗原结合蛋白制剂的有效性或使其针对因例如在制造、运输、储存、使用前制备、施用及此后期间出现的应力所致的降解而稳定。在某些实施方案中，例如，游离氨基酸可在GITR抗原结合蛋白制剂中用作疏松剂、稳定剂及抗氧化剂。举例来说，赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸及丙氨酸可用于使制剂中的蛋白质稳定。甘氨酸适用于冷冻干燥中以确保正确的饼结构和性质。精氨酸可适用于在液体和冻干制剂中抑制蛋白质聚集。甲硫氨酸适用作抗氧化剂。一些组合物包含多元醇。多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖、及山梨糖醇和多羟基醇，例如像甘油和丙二醇，并且对于本文论述的目的来说，聚乙二醇(PEG)及相关物质。多元醇是kosmotropic。它们在液体和冻干制剂中是有用的稳定剂以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的破坏。多元醇还适用于调节制剂的张力。某些组合物包含甘露醇作为稳定剂。其通常与冻干保护剂例如蔗糖一起使用。山梨糖醇和蔗糖适用于调节张力并适用作稳定剂以针对在制造工艺期间散装产品的运输或制备期间的冻融应力进行保护。PEG适用于使蛋白质稳定并且适用作低温防护剂且就此而言可用于本发明。表面活性剂也可被纳入某些GITR抗原结合蛋白制剂中。蛋白质分子可易于吸附于表面上并变性且随后聚集在气-液、固-液和液-液界面处。这些作用一般与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用一般与蛋白质浓度成反比并且通常通过物理搅动而加剧，如在产品的运输和处理期间生成的。表面活性剂常规地用于防止、最小化或减少这类表面吸附。表面活性剂还常被用于控制蛋白质构象稳定性。合适的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯、及泊洛沙姆188。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂被纳入GITR抗原结合蛋白制剂中。抗氧化剂赋形剂可用于防止蛋白质的氧化降解。就此而言，还原剂、氧/自由基清除剂及螯合剂是有用的抗氧化剂。抗氧化剂通常是水溶性的并且在产品的整个保质期内保持其活性。EDTA是可纳入制剂中的另一种有用的抗氧化剂。制剂可包括金属离子，其是蛋白辅因子并且为形成蛋白配位复合物所必需。金属离子还可抑制降解蛋白质的一些过程。例如，镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。一种或多种防腐剂可被纳入GITR抗原结合蛋白的某些制剂中。当开发涉及一次以上来自同一容器的提取的多剂量肠胃外制剂时，防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并且确保产品在药物产品的整个保质期或使用期内的无菌性。通常使用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚及间甲酚。制剂组分优选地以施用部位可接受的的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲剂被用于维持组合物在生理pH下或在稍微较低的pH下，通常在约5至约8的pH范围内。药物组合物可被选出用于肠胃外递送。或者，组合物可被选出用于吸入或经由消化道递送，如经口。这类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。当预期肠胃外施用时，治疗性组合物可以无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式提供，该水溶液含有药学上可接受的媒介物中的所需的GITR抗原结合蛋白。用于肠胃外注射的尤其合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中GITR抗原结合蛋白被配制成无菌的适当保存的等渗溶液。在某些实施方案中，所述制剂可包括所需分子与如可注射微球体、可生物溶蚀的颗粒、聚合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体的试剂的制剂，这些试剂可提供可经由积存注射递送的产品的控制或持续释放。在某些实施方案中，也可使用透明质酸，其具有促进循环中持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入药物递送装置可用于引入所需的抗原结合蛋白。某些药物组合物被配制用于吸入。在一些实施方案中，GITR抗原结合蛋白被配制为干燥的可吸入粉剂。在特定的实施方案中，GITR抗原结合蛋白吸入溶液还可与推进剂一起配制用于气溶胶递送。在某些实施方案中，溶液可以是喷雾。肺部施用和配制方法因此进一步描述于国际专利申请号PCT/US94/001875中，其以引用的方式并入并描述化学上修饰的蛋白质的肺部递送。一些制剂可经口施用。以这种方式施用的GITR抗原结合蛋白可在有或没有常规用于固体剂型如片剂和胶囊的复合中的载体下配制。在某些实施方案中，胶囊可被设计以便在胃肠道的某点处释放制剂的活性部分，在该点生物利用度最大并且前系统降解最小。可纳入额外的试剂以便于GITR抗原结合蛋白的吸收。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂以及粘合剂。一些药物组合物包含有效量的一个或多个GITR抗原结合蛋白与适用于制造片剂的无毒赋形剂的混合物。通过将片剂溶解在无菌水或另一种适当的媒介物中，可以单位剂型制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖、或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。本领域技术人员将清楚额外的药物组合物，包括在持续或控制递送的制剂中包含GITR结合蛋白的制剂。用于配制多种其他持续或控制递送装置，如脂质体载体、可生物溶蚀的微粒或多孔珠粒及积存注射剂的技术也是本领域技术人员已知的。参见，例如国际专利申请号PCT/US93/00829，其以引用的方式并入并且描述多孔聚合微粒的控制释放以便递送药物组合物。持续释放制剂可包括以成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公布号EP058481中所公开，其各自以引用的方式并入)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers2:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277及Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,同上)或聚-D(-)-3-羟丁酸(欧洲专利申请公布号EP133,988)。持续释放组合物还可包括脂质体，其可通过本领域中已知的若干方法中的任一种来制备。参见，例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688-3692；欧洲专利申请公布号EP036,676；EP088,046及EP143,949。用于体内施用的药物组合物通常被提供为无菌制剂。灭菌可通过经由无菌过滤膜过滤而完成。当组合物被冻干时，可在冷冻干燥和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或以溶液形式保存。肠胃外组合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如，静脉内溶液包或者具有塞子的小瓶，该塞子可被皮下注射针头穿透。一旦药物组合物已经配制，便可将其以溶液、混悬液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉剂形式保存在无菌小瓶中。这种制剂可以即用形式或在施用之前复水的形式(例如冻干)保存。还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。某些试剂盒含有具有干燥的蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在某些实施方案中，提供含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和lyosyringe)的试剂盒。待采用的含GITR抗原结合蛋白的药物组合物的治疗有效量将例如取决于治疗背景和目标。本领域技术人员将理解用于治疗的适当剂量水平将部分地根据以下因素而变化：递送的分子、GITR抗原结合蛋白所针对使用的适应症、施用途径、以及患者的尺寸(体重、身体表面积或器官大小)和/或情况(年龄和一般健康状态)。在某些实施方案中，临床医师可滴定剂量并且更改施用途径以获得最佳治疗效果。在某些制剂中，抗原结合蛋白具有至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml或150mg/ml的浓度。在一个实施方案中，药物组合物包含抗原结合蛋白、缓冲剂及聚山梨醇酯。在其他实施方案中，药物组合物包含抗原结合蛋白、缓冲剂、蔗糖及聚山梨醇酯。药物组合物的一个实例是含有50-150mg/ml抗原结合蛋白、5-20mM乙酸钠、5-10％w/v蔗糖、以及0.002-0.04％w/v聚山梨醇酯的药物组合物。其他药物组合物含有50-100mg/ml抗原结合蛋白、5-20mM乙酸钠、5-10％w/v蔗糖、以及0.002-0.008％w/v聚山梨醇酯。举例来说，某些组合物含有于9-11mM乙酸钠缓冲液、8-10％w/v蔗糖及0.009-0.011％w/v聚山梨醇酯中的65-75mg/ml抗原结合蛋白。某些这类制剂的pH在4.5-6的范围内。其他制剂具有4.9-5.5的pH(例如，5.0、5.2或5.4的pH)。给药频率将取决于在所用制剂中的具体GITR抗原结合蛋白的药代动力学参数。通常，临床医师施用组合物直到达到获得预期效果的剂量。组合物因此可以单一剂量施用，或者在一定时间内以两次或更多次剂量(其可包含相同或不同量的所需分子)施用，或者通过植入装置或导管连续输注施用。适当的剂量可通过使用适当的剂量反应数据确定。在某些实施方案中，可在延长的时间期限内向患者施用抗原结合蛋白。在某些实施方案中，抗原结合蛋白是每两周、每月、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月或每六个月给药。药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如，经口、通过静脉内注射、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门脉内或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过弹丸注射或通过连续输注或通过植入装置施用。组合物还可经由植入膜、海绵或其上吸收或胶囊包封所需分子的另一种适当的材料被局部施用。在某些实施方案中，当使用植入装置时，所述装置可被植入到任何合适的组织或器官中，并且可经由扩散、定时释放的大丸剂、或连续施用递送所需分子。在某些实施方案中，组合物是每3周通过IV输注来施用，初始周期是12周。在其他实施方案中，组合物是每2-4周一次通过IV输注来施用，初始周期是12周。还可能需要离体使用根据本公开的GITR抗原结合蛋白药物组合物。在这类情况下，将已从患者中移除的细胞、组织或器官暴露于GITR抗原结合蛋白药物组合物，随后将细胞、组织和/或器官植入回患者中。实施例以下实施例，包括所进行的实验及获得的结果，均仅为举例的目的来提供，且不应被视为限制所附权利要求的范围。实施例1测定GITR结合测定GITR结合测定1-未标记抗体：在37C下将原代人外周血液T细胞在平板结合的抗人CD3(克隆OKT3)存在下在生长培养基中培养48-72小时以便上调GITR表达。将细胞收集并洗涤，然后在4C下与抗人GITR抗体或人IgG1同种型对照抗体的滴定物孵育。洗涤之后，在4C下将细胞用偶联荧光染料的抗人CD4和抗人CD25抗体染色以鉴别活化的CD4+效应T细胞并且用偶联荧光染料的抗huIgG染色以检测结合的抗人GITR抗体。结合至CD25+CD4+细胞的抗人GITR抗体的平均荧光强度(MFI)通过流式细胞术来测定。使用GraphPad软件计算结合曲线的EC50。GITR结合测定2-标记抗体：在37C下将原代人外周血液T细胞在平板结合抗人CD3(克隆OKT3)存在下在生长培养基中培养48-72小时以便上调GITR表达。将细胞收集并洗涤，然后在4C下与偶联荧光染料的抗人GITR抗体或偶联荧光染料的人IgG1同种型对照抗体及偶联荧光染料的抗人CD4和抗人CD25抗体的滴定物孵育以鉴别活化的CD4+效应T细胞。结合至CD25+CD4+细胞的抗人GITR抗体的平均荧光强度(MFI)通过流式细胞术来测定。使用GraphPadPrism软件计算结合曲线的EC50。T细胞活化测定平板结合测定：设计此测定以测试抗人GITR单克隆抗体在TCR刺激的存在下活化人或食蟹猴外周血液T细胞的能力。用1ug/mL抗CD3(人：克隆OKT3；食蟹猴：克隆SP34-2)和0.3ug/mL抗人IgG涂布高结合96孔平板。将抗人GITR单克隆抗体或人IgG1同种型对照抗体的滴定物添加至孔中并且在37C下孵育30分钟以允许由平板结合的抗人IgG的捕获。此捕获能够使如下文中更详细描述的抗体交联，这对于抗体活性来说是重要的。将人或食蟹猴T细胞添加至孔中并且在37C下孵育平板总共96小时。收集培养上清液并且通过ELISA测定IFNg作为抗人GITR抗体依赖性T细胞活化的量度。将细胞用1uCi/孔3H进行脉冲持续培养的最后18小时以评估抗人GITR抗体依赖性细胞的增殖。实施例2全人GITR单克隆抗体的制备免疫和效价分析在多个不同品系的动物(Abgenix,Fremont,Calif.)中用不同免疫接种策略产生GITR的抗体(SEQIDNO:1)，所述动物是含有人免疫球蛋白基因的小鼠。将不同动物的三次收获物用于产生人GITR的抗体。第一次收获物包括产生全人IgG2κ抗体的品系XMG2-K的小鼠及产生全人IgG4κ和IgG4λ抗体的品系XMG4-KL的小鼠。第二次收获物包括产生全人IgG2κ抗体的品系XMG2-K的小鼠及产生全人IgG1κ和IgG1λ抗体的品系XMG1-KL的小鼠。第三次收获物仅包括产生全人IgG4κ和IgG4λ抗体的品系XMG4-KL的小鼠。用瞬时过度表达人GITR的CHO细胞免疫收获1的小鼠。用人GITR-Fc融合蛋白免疫收获2的小鼠。用编码人GITR分子的DNA表达载体免疫收获3的小鼠。将收获1小鼠在5周时间内每周两次通过以下方案用抗原注射：交替IP加强，接着在尾巴根部皮下加强；或通过皮下注射递送所有加强剂量。第一次加强是总共4百万个转染细胞且所有后续加强用2百万个转染细胞完成，用Alum或Alum/CpG作为佐剂。最后一次加强不具有任何额外的佐剂且细胞是在PBS中直接免疫。最初将来自收获2的小鼠用10μg抗原免疫，所述抗原是通过皮下注射递送，且所有后续的加强是用5ug剂量进行。将皮下注射与Alum(磷酸铝)和CpG寡聚物混合，每周两次，持续5周。最后一次加强不具有任何额外的佐剂且蛋白质是在PBS中直接免疫。将收获3小鼠用涂布有编码GITR的DNA、鼠GM-CSF及CpG的金颗粒免疫。经由腹部对小鼠进行免疫，每周两次，持续总共5周。最后一次加强用在PBS中的2百万个瞬时表达GITR的CHO细胞完成。用于滴定动物的方案如下：使用293fectin(Invitrogen)，根据制造商建议，用编码人GITR的cDNA构建体或空载体对照(模拟)瞬时转染HEK293细胞。24小时以后，将模拟转染的细胞用CFDA、SE(Invitrogen)标记，然后以1:1比率与GITR转染的细胞混合。将来自免疫动物的血清在FACS缓冲液(含有2％FBS的PBS)中稀释到1:100并且添加到细胞混合物中，在冰上持续1小时。然后用FACS缓冲液洗涤细胞两次以除去未结合的抗体，之后添加5ug/mL与Cy5偶联的山羊抗人IgGFc二级抗体。又一次用FACS缓冲液洗涤细胞以除去未结合的二级抗体，然后通过在BDFACSCalibur仪器上的FACS分析测定细胞上的荧光信号。为收获选择相比于模拟转染子具有GITR转染子的最高几何均数信号的动物。这包括收获1的总共6只动物(3只XMG2-K和3只XMG4-KL)、收获2的6只动物(2只XMG1-KL和4只XMG2-K)以及收获3的20只动物(XMG4-KL)。淋巴细胞的回收、B细胞分离、杂交瘤的融合和产生通过颈椎脱位处死选出的免疫小鼠并且从每个群组收获和汇集引流淋巴结及脾组织。将B细胞从淋巴组织中分离，并且将细胞悬浮在DMEM中。对细胞进行计数，并且轻轻地添加0.9mlDMEM/1亿个淋巴细胞以使细胞沉淀再悬浮。将淋巴细胞与非分泌型骨髓瘤以1:4的比率混合。通过在400×g下离心4min温和地沉淀细胞混合物。在倾析上清液之后，使用1ml移液管温和地混合细胞。在温和的搅拌下经1min缓慢添加来自Sigma(目录号P7306)(1ml/百万个B细胞)的预加热的PEG/DMSO溶液，然后混合1min。然后经2分钟在温和的搅拌下添加预加热的IDMEM(2ml/百万个B细胞)(不含谷氨酰胺的DMEM、L-谷氨酰胺、pen/strep、MEM非必需氨基酸(所有均来自Invitrogen))。最终经3分钟添加预加热的IDMEM(8ml/百万个B细胞)。将融合细胞在400×g下离心沉降6min并且再悬浮于每百万个B细胞20ml选择培养基(DMEM(Invitrogen)、15％FBS(Hyclone)，补充有L-谷氨酰胺、pen/strep、MEM非必需氨基酸、丙酮酸钠、2-巯基乙醇(所有都来自Invitrogen)、HA-重氮丝氨酸次黄嘌呤及OPI(草酰乙酸、丙酮酸、牛胰岛素)(两者是来自Sigma)以及IL-6(BoehringerMannheim))中。在37C下培养细胞20-30min，然后再悬浮于200ml选择培养基中并且在T175烧瓶中培养3-4天，之后进行96孔平板接种以生成产生GITR抗体的杂交瘤。实施例3GITR抗体的初始选择然后对如实施例2中所述获得的GITR抗体进行多种初步筛选以鉴别具有结合与功能活性的所需组合的潜在候选物。最初筛选抗体结合人GITR的能力。通过FMAT或FACS鉴别，收获1、收获2及收获3分别具有260、108及2119个抗原特异性抗体，总共有2567个GITR结合抗体。然后进一步测试这些抗体以鉴别具有所需功能活性的那些，包括活化T细胞的能力以及与食蟹猴GITR的交叉反应性。为了确定其活化T细胞的能力，测试抗GITR抗体向T细胞递送共刺激信号以及经由抗CD3进行TCR信号传导的能力。T细胞活化是通过IFN-γ的分泌和/或增殖来测量。前两次收获物对于抗原特异性杂交瘤是多克隆的，因此功能测定是在有或没有外源性交联剂下在溶液中进行以确定抗体是否可以递送生物信号而不成簇。将第三次收获物克隆平板接种，因此所述测定可以低浓度的抗人IgGFc捕获抗体在每个孔中进行以有效地为生物测定筛选标准化每个孔中的抗原特异性抗体。已确定抗体的交联是所有FcgR依赖性IFNg分泌所需的。同样，此抗体组的克隆性允许对一大组活性抗体进行序列分析以帮助前导选择。还测试抗体结合至原代食蟹猴T细胞(收获1和2)或HSC-F细胞系(收获3)上的食蟹猴GITR的能力，这些细胞已经用抗CD3预刺激。这些结合与功能测定的其他细节如下。初步筛选进行结合至野生型GITR的抗体的初步筛选。通过FMAT对所有收获物进行初始和证实结合筛选。初步筛选的一般方案如下：在筛选日之前24小时，使用293Fection，根据制造商建议的方案用人GITR瞬时转染HEK293细胞。将有待测试抗GITR抗体存在(20ul/孔)的已耗竭的杂交瘤上清液添加至96孔平板的每个孔中。紧接着，将4000个用人GITR转染的细胞和12000个模拟转染的细胞添加至40uL中的每个孔中。然后添加二级抗体(Gt抗HuIgGFcCy5(Jackson目录号：109-175-098))到40uL中的含有细胞和杂交瘤上清液的孔中以使得二级抗体的最终浓度是1ug/mL。在室温下培养样本3小时，然后在FMAT8200仪器上读出。将Mo抗GITR/TNFSF18抗体(R&D目录号：MAB689)从10ug/mL以1:2滴定作为阳性对照用于测定中的结合。用以下二级抗体(Gt抗MoIgGFcCy5(Jackson目录号：115-175-071))进行此抗体的结合。功能测定T细胞活化测定如实施例1中所述进行。食蟹猴交叉反应性为了确定抗GITR抗体是否能够结合至食蟹猴GITR，在体外培养物中刺激以诱导GITR表达之后，测试抗体结合至原代T细胞或食蟹猴T细胞系HSC-F上的GITR的能力。简言之，食蟹猴外周血液单核细胞通过Percoll梯度分离并且与在含有10％FBS的RPMI中的1ug/mL抗CD3(FN-18(Abcam))培养4天。用在含有10％FCS的RPMI中的1ug/mL抗CD3(SP-34(BD))刺激HSC-F细胞1天。T细胞最初用含有抗GITR抗体的已耗竭的杂交瘤上清液在冰上培养2小时。对于原代T细胞，接着洗涤样本以除去未结合的抗体并且用含有山羊抗人IgGFcCy5(5ug/mL)、抗CD4FITC(OKT4(eBioscience))、抗CD25PE(BC96)及5ug/mL7-AAD的混合物在冰上染色1小时。对于HSC-F细胞系，洗涤样本以除去未结合的抗体，然后用含有山羊抗人IgGFcCy5(5ug/mL)、抗CD3FITC(SP-34(BD))、抗CD25PE(BC96)及5ug/mL7-AAD的混合物在冰上染色1小时。接着洗涤样本以除去未结合的抗体。在两种情况下，通过在BDFACSCalibur仪器上的FACS分析评估结合。筛选结果基于所述测定的结果，若干杂交瘤系被鉴定为产生具有与GITR的所需相互作用的抗体。有限稀释用于将可管理数目的克隆从每个系中分离。克隆由杂交瘤系编号(例如9H6)及克隆编号(例如9H6.1)来命名。一般说来，通过本文所述的功能测定检测不到特定系的不同克隆中的差异。将分离的克隆各自在50-100ml的杂交瘤培养基中扩增并且允许生长至耗竭(即，小于约10％细胞活力)。在那些培养物的上清液中的GITR抗体的浓度和效力通过ELISA并且通过如本文所述的体外功能测试来测定。基于结合和功能测定结果，选出大约260个抗体用于进一步分析以鉴别具有活性的最佳组合的前导抗体。实施例4人抗体从杂交瘤中的产生使用50ml耗竭上清液从每个杂交瘤产生抗体，然后通过蛋白A色谱法进行纯化。使杂交瘤系在T75烧瓶中在20ml培养基(IntegraMedia)中生长。当杂交瘤在T75烧瓶中接近汇合时，将其转移到Integra烧瓶(IntegraBiosciences,IntegraCL1000，目录号90005)中。Integra烧瓶是细胞培养烧瓶，其被膜片分隔成两个室，一个小室和一个大室。将20-30ml体积的杂交瘤细胞以1×106个细胞/ml的最小细胞密度置于Integra烧瓶的小室中的Integra培养基中。将Integra培养基单独(1L)置于Integra烧瓶的大室中。分隔两个室的膜片对小分子量营养素是可渗透的，但对杂交瘤细胞和由那些细胞产生的抗体不可渗透。因此，杂交瘤细胞和由那些杂交瘤细胞产生的抗体保留在小室中。一周之后，将培养基从Integra烧瓶的两个室中除去并且用新鲜的Integra培养基替代。从小室收集的培养基被单独保留。生长的第二周之后，再次从小室收集培养基。对于每个杂交瘤系，将第1周收集的培养基与第2周收集的培养基合并。将从杂交瘤系收集得到的培养基样本离心沉降以除去细胞和碎片(在3000rpm下15分钟)并且过滤(0.22um)所得的上清液。将澄清的条件培养基加载到蛋白A-琼脂糖柱上。任选地，首先可浓缩培养基，然后加载到蛋白A琼脂糖柱上。通过充分的PBS洗涤除去非特异性结合。通过从蛋白A柱(如50mM柠檬酸盐，pH3.0)的标准酸性抗体洗脱回收在蛋白A柱上的结合的抗体蛋白。通过尺寸排阻色谱法或在阴离子交换树脂如Q琼脂糖树脂上的结合离子交换色谱法除去在蛋白A琼脂糖合并物中的聚集的抗体蛋白。用在25个柱体积中的10mM-500mM的NaCl梯度洗脱抗体。重组抗GITR人抗体从转染细胞中的产生将HEK293细胞(用于瞬时表达)和CHO细胞(用于稳定表达)用编码重链和轻链的质粒转染。从转染细胞收获条件培养基并且通过除去细胞和细胞碎片进行澄清。将澄清的条件培养基加载到蛋白A-琼脂糖柱上。任选地，首先可浓缩培养基，然后加载到蛋白A琼脂糖柱上。通过充分的PBS洗涤除去非特异性结合物。通过从蛋白A柱(如50mM柠檬酸盐，pH3.0)的标准酸性抗体洗脱回收在蛋白A柱上的结合的抗体蛋白。通过尺寸排阻色谱法或在阴离子交换树脂如Q琼脂糖树脂上的结合离子交换色谱法除去在蛋白A琼脂糖合并物中的聚集的抗体蛋白。实施例5GITR抗体的序列分析接着通过Sanger(双脱氧)核苷酸测序测定上述大约260个抗体的轻链和重链的核酸序列。随后推断核酸序列的氨基酸序列。一旦已对抗体测序，便基于许多不同的序列和功能标准分析抗体以进一步限制可用于进一步研究的抗体的数量。例如，分析序列中可能容易氧化、脱氨基化、异构化、酸水解或具有引起聚集的倾向的氨基酸或氨基酸的组合。排除预期有问题的序列。进一步的选择是基于如实施例3中所述获得的结合、活化及交叉反应性数据。基于所有这些标准的一个分析，选出总共19个亲代抗体用于更进一步的分析和修饰。这些亲代抗体每一个的六个CDR序列、可变结构域(重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL))以及全长重链(HC)和全长轻链(LC)的氨基酸序列通过其相应的序列编号总结于表1中。亲代序列的比对提供于图8A、8B、9A及9B中。实施例6基于功能和生物物理特性的亲代抗体的选择为了报告用于做出适当的前导抗体的额外选择的决策过程，进一步就多种生物物理学性质及额外的功能分析对选出的19个亲代抗体进行分析。生物物理分析包括表达效价、单体形式对比聚集物的纯度、如通过差示扫描量热计(DSC)所测量的稳定性、及搅动后聚集的倾向(聚集稳定性)。额外的功能分析包括测定GITR结合亲和力及活化T细胞的能力。五个亲代抗体(44C1、45A8、49D9、49E2及48A9)的工程改造的变体在分析初期产生，使得经受全分析的抗体总数达到23个。通过在ForteBioOctet上对蛋白A传感物的结合速率测定获得人抗体浓度。允许抗体上清液结合至预润湿的蛋白A传感物持续120秒，在30C下计算初始结合速率。然后将此速率与纯化标准相比并且报道计算浓度。默认“BasicQuantitationwithRegeneration”方案被用于ForteBio上，其中含有0.1％BSA、0.02％Tween20、0.05％叠氮化钠的PBS(pH7.4)作为中和缓冲液且10mM甘氨酸、150mM氯化钠(pH2.0)作为恢复缓冲液。差示扫描量热法(DSC)实验是在MicroCalVP-CapillaryDSC上完成。在每个实验中的蛋白质浓度为在pH5下在10mM乙酸钠、9％蔗糖中约0.5mg/mL。将所有样本以60C/小时的加热速度从20C加热到95C。当50％分子解折叠时，测定热转变中点(Tm)。使用先前确立的程序，基于搅动和热应力对等级次序候选物测定聚集稳定性等级(Chen,S.等人(2010)ProteinSci.19:1191-12042，及Woodward,J.等人(2013)Anal.Chem.85:6429-6436)。如实施例1中所述进行监测IFNg分泌的细胞结合测定和T细胞活化测定。用原始亲代抗体进行的这些不同分析的结果总结于下表5中。表5：亲代GITR抗体的表达和生物物理参数基于所得结果的分析，选出亲代抗体的亚群，抗体5H7、7A10、9H6、33C9及41G5，用于进一步的评价和开发。实施例7亲代GITR抗体亚群的工程改造进一步分析五个选出的亲代抗体的序列以鉴别可能消极地影响活性、稳定性或造成免疫原性风险的残基。关于这后一方面，分析序列结合HLAII类分子的潜能，因为潜在的抗体/HLA复合物的形成可以驱动T淋巴细胞依赖性B细胞抗体反应。随后制备并测试五个选出的亲代抗体的许多工程改造的变体以鉴别具有改善的生物物理和/或功能性质的抗体。用于五个选出的亲代抗体的工程改造的变体的分析结果总结于表6中。来自表6的具有超过某一阈值的活性和表达水平的那些选出的变体的CDR、可变结构域以及全长轻链和重链的序列总结于表1。工程改造的抗体的可变结构域的比对提供于图10A、10B、11A及11B中。从对工程改造的变体收集的数据的分析，选出5个变体(9H6v3、7A10v1、5H7v2、41G5v2、33C9v2)用于进一步的生物物理和功能分析以及按比例放大的产生。生物物理参数分析的概要提供于表7中；在按比例放大产生之后的抗体的选出的变体的功能数据总结于表8中。表7：在按比例放大产生之后的选出的变体的生物物理性质总结抗体9H6v37A10v15H7v241G5v233C9v2IDSS-13806SS-13810SS-13807SS-13809SS-13808计算的pI9.469.18.649.128.98表达效价(mg/L)46mg/L72mg/L39mg/L45mg/L25mg/LSEC％单体(蛋白A)93％97％96％94％99％SEC％单体(终产物)99％99％97％99.399％纯化产率％75％81％96％75％87％Tm(DSC)81.1°74.4°83.2°76.6°72.7°表8：在按比例放大产生之后的选出的变体的生物属性总结实施例8选出的GITR抗体与GITRL的竞争在一组交叉竞争测定中测试一些选出的GITR抗体以确定它们是否与GITRL竞争结合至GITR。在这组实验中，在室温下用5ml的10ug/ml小鼠抗人CD3抗体OKT3(eBioscience#16-0037-85)涂布Falcon100mm平皿(BDFacoln#353003)持续4小时。随后用PBS洗涤平皿两次。使用PanT细胞分离试剂盒II(Miltenyi#130-091-156)将人panT细胞从PBMC中分离。将在完全培养基(PRMI1640，加上10％FBS、L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸钠、β-巯基乙醇)中的五千万个panT细胞接种于用CD3预涂的平皿中并且在37℃下在5％CO2培养箱中培养4天以刺激T细胞增加GITR表达。在第4天，收获panT细胞并且在4℃下用小鼠抗人CD4PerCP5.5(BDBiosciences#560650)、小鼠抗人CD8(BDBiosciences#555634)、及小鼠抗人CD25APC(Miltenyi#130-092-858)在染色缓冲液(PBS中2％FBS，0.05％NaN3)中染色30min以鉴别两个不同的效应细胞群：活化的CD4(CD25+CD4+)和活化的CD8(CD25+CD8+)细胞。然后用染色缓冲液洗涤细胞两次并且将0.5×106个细胞/孔接种于U型底平板中用于竞争性结合。为了评估抗人GITR抗体是否阻断GITR配体(GITR-L,RD#694-GL-CF)结合，在4℃下将2-64nM的非偶联的抗人GITR抗体的滴定物(克隆9H6、5H7、41G5)与panT细胞一起在染色缓冲液中孵育10min。不洗涤，添加4nM的人GITR-L并且在4℃下再孵育30min。然后将细胞用染色缓冲液洗涤两次，并且在4℃下与抗hisPE(Miltenyi#130-092-691)在染色缓冲液中孵育30min。随后将细胞用染色缓冲液洗涤两次并且用在PBS中的2％多聚甲醛固定，以用于流式细胞术分析。这个实验的结果示于图1A和1B中。为了评估GITR-L是否阻断抗人GITR抗体结合，在4℃下将2-64nM的非偶联的人GITR-L滴定物与panT细胞一起在染色缓冲液中孵育10min。不洗涤，添加4nM的抗人GITR抗体(克隆9H6、5H7、41G5)并且在4℃下再孵育30min。将细胞用染色缓冲液洗涤两次，并且在4℃下与抗人FcPE(JacksonImmunoressearch#109-116-170)在染色缓冲液中孵育30min。随后将细胞用染色缓冲液洗涤两次并且用在PBS中的2％多聚甲醛固定，以用于流式细胞术分析。图1C和1D显示此研究的结果。如从图1A和1B可见，所测试的每个抗GITR抗体都能够阻断GITRL结合至CD4+和CD8+细胞。同样，图1C和1D证明GITRL可以阻断测试的每个GITR抗体结合CD4+和CD8+细胞。总之，这些结果说明GITR抗体与GITRL彼此交叉竞争结合至GITR。实施例9调节性T细胞诱导的抑制的防止测试来自选出的前导GITR抗体的抗体以确定所述抗体是否具有防止效应T细胞活性的调节性T细胞抑制的所需活性。在所述实验中，GITR抗体最初偶联至如下的戴诺磁珠(Dynabead)。根据戴诺磁珠抗体偶联试剂盒(Invitrogen目录号413.11D)用户手册中的说明书，将三百微克GITR抗体克隆9H6v3和人IgG1同种型对照偶联至15mg戴诺磁珠M-270环氧化物(Invitrogen#143.01)上。简言之，将0.3mg抗体与15mg珠粒在0.75mlC1缓冲液加0.75mlC2缓冲液中在37℃下在摇动下孵育过夜。次日，根据手册将珠粒用1.2mlHB、LB及SB缓冲液依次洗涤。偶联之后，对珠粒进行计数并且在4℃下以2×108个珠粒/ml保存在具有0.02％NaN3的SB缓冲液中。使用人CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi#130-096)分离人CD4T细胞。根据制造商说明书，使用人CD25微珠II(Miltenyi#130-092-983)进一步富集Treg细胞。CD25耗尽的CD4T细胞被用作抑制测定中的T应答物。Treg抑制检查物(又称T细胞活化珠粒，Miltenyi#130-092-909)是与抗人CD2、CD3及CD28抗体偶联的珠粒，其被用于在测定中活化T细胞。在96孔平板上，将各自50,000个Treg及T应答物接种/孔，并且与相等数量的T细胞活化珠粒及GITR抗体珠粒的滴定物一起孵育5天。在最后16个小时用1uCi3H对细胞进行脉冲，并收获以用于3H计数。图2显示证明GITR激动抗体9H6v3可以减轻效应T细胞活性的Treg抑制的代表性实验的结果。实施例10抗体引起循环调节性T细胞的减少除在证明T细胞抑制的阻止的实施例9中所述的体外研究之外，进行相关体内实验以确定本文所提供的某些抗体是否能够减少人源化NSG小鼠模型中的循环调节性T细胞。在此实验中，将新生NSG小鼠通过眶后注射用CD34+胎肝细胞移植。在16周内，动物发展了各种人免疫细胞库，包括CD4+和CD8+效应T细胞及调节性T细胞。给予单个i.p.剂量的25mg/kg抗人GITR抗体(9H6v3、5H7v2及41G5v2)或人IgG1同种型对照并且在给药之后第4天通过流式细胞术测定表达调节性T细胞标记物FoxP3的循环人CD4+T细胞的％。如图3所示，单独施用抗体9H6v3、5H7v2及41G5v2中每一种到人源化小鼠模型中导致调节性T细胞的循环水平相对于对照下降。所述活性适用于诱导或提高免疫应答。实施例11经由FcγR结合的GITR抗体成簇体外测试若干前导亲代抗体以评估Fcγ受体(FcγR)，具体说来Fcγ-RIIa和Fcγ-RIIIa在TCR刺激存在下介导人外周血液T细胞活化的能力。为了进行这些实验，293T细胞被工程改造以表达人Fcγ-RIIa和人Fcγ-RIIIa。将表达Fcγ-R的293T细胞用多聚甲醛固定并且与人外周血液CD4+T细胞以1:1的比率接种于96孔平板中。抗huCD3涂布的珠粒被添加至培养物中以提供TCR刺激。抗人GITR单克隆抗体或人IgG1同种型对照抗体的滴定物被添加至孔中并且在37C下培养培养物总共96小时。将细胞用1uCi/孔3H进行脉冲持续培养的最后18小时以评估抗人GITR抗体依赖性细胞的增殖。如图4A所示，发现FcγRIIa能够使每个前导抗体成簇以活化原代人T细胞。同样，还发现FcγRIIIa具有成簇活性(图4B)。在每个图中的图形代表三个重复的孔的平均值±标准偏差并且代表来自5位人供体的5次实验。这些结果证明Fcγ受体可以提供为抗人GITR抗体介导的T细胞活化所需的交联。带有FcgR的细胞提供为经由GITR信号传导所需的GITRAb的成簇。Fcg受体结合至GITRAb也是ADCC所需要的。这些结果对于基于抗体活性的生物学具有重要影响。抗体与GITR的结合不足以活化GITR。如在此实施例中所证明不结合至Fc受体，因为抗体除非聚集否则将触发GITR信号传导。实施例12GITR抗体与人T细胞亚群的差异结合测试所获得的一些亲代抗体与如WO06/105021中所述的抗体6C8相比结合不同的人T细胞亚群的能力。为了进行这些实验，在室温下用5ml的10ug/ml小鼠抗人CD3抗体OKT3(eBioscience#16-0037-85)涂布Falcon100mm平皿(BDFacoln#353003)持续4小时。随后用PBS洗涤平皿两次。使用PanT细胞分离试剂盒II(Miltenyi,#130-091-156)将人panT细胞从PBMC中分离。将在完全培养基(PRMI1640，加上10％FBS、L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸钠、β-巯基乙醇)中的五千万个panT细胞接种于预涂的平皿中并且在37℃下在5％CO2培养箱中孵育4天。在第4天，收获panT细胞并且在4℃下用小鼠抗人CD4PerCP5.5(BDBiosciences#560650)、小鼠抗人CD8(BDBiosciences#555634)、及小鼠抗人CD25APC(Miltenyi#130-092-858)在染色缓冲液(2％FBS，0.05％NaN3，在PBS中)中染色。然后用染色缓冲液洗涤细胞两次并且以0.5×106个细胞/孔接种于U型底平板中。在4℃下将抗人GITR抗体(克隆9H6、5H7、41G5)以及2–64nM抗体6C8滴定物与panT细胞一起在染色缓冲液中培养30min。然后将细胞用染色缓冲液洗涤两次，并且在4℃下在染色缓冲液中与抗人FcPE(JacksonImmuneressearch#109-116-170)一起孵育30min。随后将细胞用染色缓冲液洗涤两次并且用在PBS中的2％多聚甲醛固定，以用于流式细胞术分析。用GITRL进行类似的实验。GITRAb结合的结果总结于图5A-5D中。GITRL的相应结果示于图6中。如从这些图中可见，本文所公开的抗体5H7和9H6以及6C8各自结合CD4+CD25+T细胞(图5A)并且还结合CD8+CD25+T细胞(图5C)。然而，6C8可以结合CD8+CD25-T细胞，而5H7和9H6仅以极低水平结合，如果有的话(图5D)。测试抗体中没有一个结合CD4+CD25-T细胞(图5B)。因此，5H7和9H6在T细胞结合方面展示类似的选择性并且差异性结合至不同的人T细胞亚群。如图6中所示，GITRL还显示差异结合至人T细胞亚群。像抗体5H7和9H6一样，其可以结合CD4+CD25+T细胞和CD8+CD25+T细胞，但还类似于5H7和9H6，以显著较低的亲和力结合CD4+CD25-T细胞和CD8+CD25-T细胞。因此，由5H7和9H6展现的结合选择性类似于对于GITRL(天然配体)所观察到的。实施例13GITR抗体向人CD4细胞中的内化进行一组实验以确定若干亲代抗体是否可由人CD4细胞内化。为了比较，还测试了如WO06/105021中所述的抗体6C8。通过在室温下用5ml的10ug/ml小鼠抗人CD3抗体OKT3(eBioscience#16-0037-85)涂布Falcon100mm平皿(BDFacoln#353003)4小时来开始试验。随后用PBS洗涤平皿两次。使用CD4+T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,#130-096-533)将人CD4+T细胞从PBMC中分离。将在完全培养基(PRMI1640，加上10％FBS、L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸钠、β-巯基乙醇)中的五千万个panT细胞接种于预涂的平皿中并且在37℃下在5％CO2培养箱中培养4天。在第4天，收获CD4+T细胞并且将0.5×106个细胞/孔接种于96孔U型底平板中。在4℃下将CD4+细胞与偶联了Alexa-488或Alexa-647的抗人GITR抗体在10ug/ml的完全培养基中孵育30min。然后用完全培养基洗涤细胞两次并且在37℃下在5％CO2培养箱中孵育0、1、2、4及24小时。孵育结束时，收集细胞。将每个孔中的细胞相等地分到两个孔中。在一个孔中的细胞用150ul酸性缓冲液(10％FBS、0.5MNaCl、0.2M乙酸，pH2.5)在4℃下孵育5min，而在其他孔中的细胞用完全培养基孵育。孵育结束之时，将两个孔用完全培养基洗涤三次并且在4℃下用抗人CD25APC(MiltenyiBiotec,#130-092-858)或抗人CD25PE(MiltenyiBiotec,#130-091-024)在染色缓冲液中染色30min。随后将细胞洗涤两次并且用在PBS中的2％多聚甲醛固定，以用于FACScalibur分析。图7的结果显示本文所公开的抗体9H6、5H7及41G5在24小时时间内全部内化到人CD4细胞之中。相比之下，抗体6C8以显著较小的程度内化。实施例14糖基化抗原结合蛋白的增强的活性GITR抗体的糖基化状态的重要性是在测定中评估，在该测定中Fcγ受体提供CD4+T细胞上的GITR信号传导所必需的成簇。用在位置297处的天冬酰胺至谷氨酰胺的氨基酸取代工程改造代表性天然IgG1GITR抗体，这消除了对于Fc与Fcγ受体结合关键的N连接的糖基化位点。测试天然的和非糖基化的变体用由Fcγ-RIIa或Fcγ-RIIIa提供的GITR抗体簇介导CD4+T细胞活化的能力。简言之，293T细胞被工程改造以表达人Fcγ-RIIa或人Fcγ-RIIIa。将表达Fcγ-R的293T细胞用多聚甲醛固定并且与人外周血液CD4+T细胞以1:1的比率接种于96孔平板中。抗huCD3涂布的珠粒被添加至培养物中以提供TCR刺激。天然IgG1变体及非糖基化的IgG1变体抗人GITR抗体或人IgG1同种型对照抗体的滴定物被添加至孔中并且在37C下孵育培养物总共96小时。将细胞用1uCi/孔3H进行脉冲持续培养的最后18小时以评估抗人GITR抗体依赖性细胞的增殖。如图12A和12B所示，FcγRIIa和RIIIa能够使天然的IgG1GITR抗体成簇并驱动效应T细胞的增殖。相比之下，非糖基化的抗体由于其不能结合并由FcγR成簇而不展示任何活性。在体内，Fcγ受体提供抗人GITR抗体介导的T细胞活化所需的成簇活性，因此，GITR抗体的糖基化状态是一个重要因素。实施例15药代动力学和药效学分析抗体9H6和5H7的单剂量药代动力学和药效学(PK/PD)表征在未参加过实验的雄性食蟹猴中评估，其中两个候选者是通过大丸剂静脉内施用在1.0和10mg/kg下测试。抗体9H6在1和10mg/kg的剂量下分别展示181小时(7.55天)和166小时(6.92天)的平均半衰期。抗体5H7在1和10mg/kg的剂量下分别展示1301小时(12.6天)和222小时(9.23天)的平均半衰期。两个候选者展现在剂量成比例暴露情况下的线性PK，如通过浓度与时间的曲线下面积(AUC)所测量。*************************************所鉴别的所有专利及其他出版物出于描述和公开例如在所述出版物中描述的方法而清楚地以引用的方式并入本文，所述出版物可能与所述的发明一起应用。这些出版物只提供在本申请的申请日之前的公开内容。不应该将这一点视为承认由于先前发明或任何其他原因，本发明人无权承认本公开内容先于这些出版物。关于这些文献的内容的日期或表述的所有陈述都是基于本申请人所能获得的信息，并不构成对这些文献的日期或内容正确性的任何承认。