本申请是申请号为200980148318.1，申请日为2009年12月2日，发明名称为“单克隆抗体的拮抗活性的调节方法”的中国专利申请的分案申请。技术领域本发明涉及抗体工程化领域，并且更特别地，涉及筛选抗体和/或调节抗体的激动/拮抗活性的方法。更特别地，本发明涉及通过遗传工程化调节单克隆抗体或其二价功能化片段或衍生物的拮抗活性的方法。本发明还涉及用于这种调节方法的多肽和所获得的抗体。
背景技术：
术语“一种抗体”、“多种抗体”或“免疫球蛋白”以最宽意思互换使用，并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们呈现出所需的生物活性)。更特别地，这样的分子由糖蛋白组成，所述糖蛋白包含通过二硫键链间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链由重链可变区(或结构域)(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变性区，称为互补性决定区(CDR)，穿插有具更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以以下顺序从氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一成分(Clq)。免疫球蛋白的重链可以分成三个功能区：Fd区、铰链区、Fc区(可结晶片段)，其通过柔性铰链区来连接。Fd区包含VH和CH1结构域，并且结合轻链，形成Fab—抗原结合片段。Fc片段负责免疫球蛋白效应物功能，其包括，例如，补体固定和结合至效应物细胞的同源Fc受体。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区作为柔性间隔物，使Fab部分在相对于Fc区的空间中自由移动。与恒定区相反，铰链结构域在结构上是多变的，在免疫球蛋白类别和亚类中的序列和长度都有变化。根据结晶研究，免疫球蛋白铰链区可以在结构和功能上进一步细分成三个区：上铰链、核心和下铰链(Shin等，ImmunologicalReviews130:87，1992)。上铰链包括从CH1羧基端至限制运动的铰链中第一个残基的氨基酸，通常为两个重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥键。下铰链区连接CH2结构域的氨基端，并包括CH2结构域中的残基。人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通过二硫键形成二聚化时，形成环八肽，认为这作为枢轴，由此给予柔性。由免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性产生的构象变化可能影响抗体Fc部分的效应物功能。通常，对于鼠来源的单克隆抗体或其功能性片段的制备，可能参考特别在手册“抗体”中描述的技术(Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual(抗体：实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborNY，pp.726，1988)或Kohler和Milstein所述的从杂交瘤的制备技术(Nature，256:495-497，1975)。然后，例如，单克隆抗体可以在亲和性柱上纯化，在柱上之前已经固定了目标受体或其含有所述单克隆抗体特异性识别的表位的片段之一。更特别地，所述单克隆抗体可以通过蛋白A和/或G的色谱来纯化，接着进行或不进行针对消除残余蛋白污染物以及DNA和LPS的离子交换色谱，本质上接着进行或不进行Sepharose凝胶上的排阻色谱，以消除由于二聚体或其他多聚体的存在引起的潜在聚集物。在甚至更优选的方式中，同时或连续使用这些技术的全部。
技术实现要素：
根据本发明的抗体的功能性片段，特别用来表示抗体片段，如Fv、scFv(sc表示单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或二抗，或其半衰期已经通过化学修饰提高的任何片段，化学修饰如添加聚(烷撑)甘醇，如聚(乙烯)甘醇(“PEG化”)(称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的PEG化片段)(“PEG”表示聚(乙烯)甘醇)，或通过将具有原始抗体的至少一个特征性CDR的所述片段掺入脂质体中。优选，这些功能性片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、F(ab’)、scFv-Fc型或二抗的片段，其通常具有与产生其的抗体相同的结合特异性。根据本发明，本发明的抗体片段可以通过如酶消化的方法，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，和/或通过化学还原的二硫桥键的分裂，从如上所述的抗体获得。在另一种方式中，本发明中包含的抗体片段可以通过本领域技术人员同样公知的遗传重组技术来获得，或者通过肽合成获得，例如通过自动化肽合成仪，如Applera等公司供应的那些。如在此所用的术语“拮抗剂”指的是能够抑制目标分子(如胞外或跨膜受体)的一种或多种生物活性的分子。拮抗剂可以通过干扰受体与配体的结合和反之，通过降低受体磷酸化和/或通过使已经由配体激活的细胞丧失能力或杀灭这些细胞来起作用。拮抗剂可以完全阻止受体-配体相互作用或可以本质上通过竞争、构象变化、脱落或下调降低这种相互作用。通过拮抗剂产生的所有这样的干扰点将认为是本发明目的的等价物。如在此所用的术语“激动剂”指的是能够激活目标分子的一种或多种生物活性的任何化合物，包括蛋白、多肽、肽、抗体、抗体片段、偶联物、大分子、小分子。在治疗抗体的研究中，常常期望具有可能作为拮抗剂的抗体。拮抗剂抗体的典型实例是赫塞汀、帕妥珠单抗、爱必妥、抗-VEGFR或抗-IGF-1R抗体。作为特定实例，可以提及由Genentech产生的抗-c-Met5D5抗体[WO96/38557]，其在各种模型中单独加入时，表现为有效的激动剂。为了解决这个技术问题，该抗体必须工程化成Fab片段或单价抗体(一臂5D5)，以具有拮抗活性。因此，这样的抗体不能认为是抗体，而是片段，并且没有呈现出由于“全抗体”形式产生的所有优点(无效应物功能、降低的清除和半衰期[比传统二价抗体快2倍，如20thEORTC-NCI-AACR学术讨论会，Geneva，2008年10月21-24日，Poster411中所述的])。本领域技术人员将认识到效应物功能包括，例如，C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；嗜菌作用；和细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调和通过结合清道夫受体结合配体(FcRn)延长半衰期，如，例如，1988年4月14日授权的U.S.专利No.5,739,277中所述的。本发明的一个创造性方面是解决这样的技术问题，即，提高抗体的拮抗活性，同时保持“全二价”形式。在此必须提及本发明可以用于调节人抗体的激动/拮抗活性，人抗体是通过如下方法获得的：通过免疫“人小鼠”获得(遗传修饰的产生人免疫球蛋白的小鼠)或使用噬菌体展示技术从选定的scFv、Fab或任何其他等价片段构建完整的抗体。在鼠抗体的嵌合和/或人源化的过程中可能会遇到另一个传统的技术问题。本领域技术人员公知，如果鼠抗体的嵌合和/或人源化过程在理论上是非常容易的，但不是这么容易控制这样的鼠抗体的嵌合和/或人源化，以至不失去全部或部分的初始特性。嵌合或人源化抗体可能失去一部分的ADCC、CDC、拮抗/激动、结合、(TBC)…活性。更特别地，本发明涉及嵌合和/或人源化处理后，鼠抗体的激动/拮抗活性的改变。作为特定的实例，在人IgG1形式嵌合时，表现为有效拮抗鼠抗体的一组抗-cMet抗体(下文中描述为224G11、2274H1和11E1)变成部分激动剂。这种从有效拮抗剂至部分激动剂的转变导致在异种移植模型中体内活性的完全丢失。本发明打算解决这些问题，并且更特别地涉及提高针对特定目标分子的单克隆抗体或其二价功能性片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗体能够抑制所述目标分子的一种或多种生物活性，其中所述方法包括铰链区重新构建的阶段，该阶段由通过至少一个氨基酸的删除、添加或置换来修饰所述铰链区的氨基酸序列组成。清楚表述“提高拮抗活性”必须以其最宽的意思来解释，即，按照所需的结果。机械地，可以通过抗体的内在拮抗活性的提高和/或抗体的内在激动活性的降低来获得这样的结果。更特别地，定量药理学中术语的基础定义是基于国际药理学联合会(IUPHAR)对受体命名给出的最新推荐(参见，Neubig等，2003)。术语“激动剂”表示结合受体并改变受体状态而导致刺激或提高的生物应答的配体(任何类型的分子)。激动剂可以作为完全激动剂或部分激动剂：-完全激动剂：当激动剂诱导的受体刺激到达系统的最大应答能力时，那么将产生系统最大应答并是该系统中的完全激动剂。几种激动剂可以引发相同的最大应答，它们全部是该实验系统中的完全激动剂。-部分激动剂：在给定的组织中，在特定的条件下，不能与完全激动剂通过相同系统中的相同受体作用引发相同大的效果的分子(即使在高浓度下应用，使得所有受体应当被占据时)。部分激动剂通常还是部分拮抗剂，因为在完全激动剂的共同存在下，它们使所述完全激动剂的最大应答降至其自身最大应答。这种完全vs.部分激动剂的指定是系统依赖性的，并且对于一种系统或测量的完全激动剂在另一种系统或测量中可能是部分激动剂。术语“拮抗剂”表示降低另一种药物(通常是激动剂)的作用的分子。许多拮抗剂作用于和激动剂相同的受体大分子。-在拮抗剂和激动剂共同存在下的系统的应答对应于系统的基础(没有任何配体)活性的情况中，拮抗效率可以是完全拮抗。-由拮抗剂和激动剂共同存在引发的最大抑制高于系统的基础活性时(即使以高浓度应用，使得所有受体应当被拮抗剂占据时)，拮抗剂可以作为部分拮抗剂。-当激动剂和拮抗剂的结合互相排斥时，拮抗是竞争性的。这可能是因为激动剂和拮抗剂竞争相同的结合位点或结合重叠的邻近位点。第三个可能性是涉及不同的位点，但它们以激动剂和拮抗剂分子不能同时被结合的方式影响受体大分子。-当激动剂和拮抗剂可以同时结合受体时，观察到非竞争性拮抗；拮抗剂结合降低或阻止了激动剂的作用，对激动剂的结合具有或不具有任何作用。传统上可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行删除、添加或置换。本领域技术人员可以使用几种方法来产生给定DNA序列中的添加、删除或插入。可以提及但无限制，用胰腺DNA酶I部分消化DNA，用限制酶部分消化DNA，基于连接物的插入突变体，使用BAL31核酶、DNA酶I或核酸外切酶III的删除突变体的嵌套集合。这些方法在实验室手册中有广泛描述，如MolecularCloning，Alaboratorymanual(分子克隆，实验室手册)(Sambrook，Fritsch和Maniatis)。几种基于PCR的方法也可以用来产生DNA分子中的删除、插入或定点诱变，如重叠延伸PCR(Wurch等，1998)，但不限于这一种。为了进行定点诱变，可以使用几种其他技术，例如，但不限于这几种，可以提及基于单或双引物方法的基于寡核苷酸的诱变，基于尿嘧啶结合的Kunkel方法(Kunkel，1985)。这些方法在实验室手册中有广泛描述，如MolecularCloning，Alaboratorymanual(分子克隆，实验室手册)(Sambrook，Fritsch和Maniatis)。作为添加的非限制性实例，可以提及铰链区中或邻近的脯氨酸添加。在本发明方法的优选实施方案中，所述修饰选自：i)所述铰链区氨基酸序列的至少一个氨基酸的删除；和/或ii)将至少一个二硫桥键添加至所述铰链区中。为了阐明本发明，将首先详述第一个方面(i)，第二个方面(ii)将在之后详述。必须理解这个顺序只是由于本发明的书写，并且如下文中显而易见的，这两个方面是同等重要的。在特定的实施方案中，修饰铰链区氨基酸序列的方式将由所述铰链区氨基酸序列的至多2、3或4个氨基酸删除组成。本发明的特定方面在于所述单克隆抗体是二价抗体。实际上，如以下所看到的，可以通过修饰所述抗体的结构来调节抗体的激动/拮抗活性。第一次，发明人报道了调节这种激动/拮抗活性同时保持抗体二价形式的独创方式，目标在于良好特性(如长的半衰期或效应物功能)的保持。在此还可以提及，如果现有技术中已经报道了为了提高效应物功能的单克隆抗体铰链区的修饰，但相反从未报道过铰链区中这样的修饰的兴趣在于单克隆抗体的激动/拮抗活性调节。这明显是本发明的主题，这对于现有技术是新的和创造性的。作为根据本发明方法的一个方面，单克隆抗体是嵌合抗体。“嵌合”抗体用来表示含有源自给定物种抗体的天然可变(轻链和重链)区并结合与所述给定物种(例如，鼠、马、兔子、狗、牛、鸡等)异源物种的抗体的轻链和重链恒定区的抗体。可以通过使用遗传重组技术来制备根据本发明的嵌合类型的抗体或其片段。例如，可以通过克隆含有启动子和编码非人(尤其是鼠)可变区的序列、根据本发明的单克隆抗体和编码人抗体恒定区的序列的重组DNA来生产嵌合抗体。通过这样的重组基因编码的本发明的嵌合抗体将是，例如，鼠-人嵌合体，通过源自鼠DNA的可变区来决定该抗体的特异性，并且通过源自人DNA的恒定区来决定其同种型。对于嵌合抗体制备的方法，例如，可以参考文献Verhoeyn等(BioEssays，8:74，1988)、Morrison等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6851-6855，1984)或US专利No.4,816,567。作为根据本发明方法的另一个方面，单克隆抗体是人源化抗体。“人源化抗体”用来表示其含有源自非人来源抗体的CDR区的抗体，抗体分子的其他部分源自一个(或几个)人抗体或种系序列。此外，一些骨架(称为FR)片段的残基可以进行修饰，以保持结合亲和性(Jones等，Nature，321:522-525，1986；Verhoeyen等，Science，239:1534-1536，1988；Riechmann等，Nature，332:323-327，1988)。可以通过本领域技术人员已知的技术(如，例如，文献Singer等，J.Immun.150:2844-2857，1992；Mountain等，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10:1-142，1992；或Bebbington等，Bio/Technology，10:169-175，1992中所述的那些)，来制备根据本发明的人源化抗体或其片段。其他人源化方法是本领域技术人员已知的，例如，ProteinDesignLab(PDL)在专利申请EP0451216、EP0682040、EP0939127、EP0566647或US5,530,101，US6,180,370，US5,585,089和US5,693,761中所述的“CDR嫁接”方法。还可以提及以下专利申请：US5,639,641；US6,054,297；US5,886,152和US5,877,293。作为根据本发明方法的另一个方面，单克隆抗体是人抗体。术语“人抗体”包括具有源自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变和恒定区的所有抗体。在优选的实施方案中，所有可变和恒定结构域(或区)源自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。换句话说，包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(如果存在)的任何抗体，即，其具有对应于通过人产生的抗体的氨基酸序列和/或已经使用本发明技术人员已知的用于制备人抗体的任何技术制得的氨基酸序列。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，该杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如，转基因鼠)的B细胞，该转基因非人动物具有包含融合永生细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组。作为这种转基因鼠的实例，可以提及XENOMOUSETM，其是包含人免疫球蛋白基因座大片段并缺乏鼠抗体生成的工程化鼠株系(Green等，1994，NatureGenetics，7:13-21)。XENOMOUSETM产生全人抗体的成人样人库(repertoire)，并且产生抗原特异性人单克隆抗体。第二代XENOMOUSETM含有大约80％的人抗体库(Green&Jakobovits，1998，J.Exp.Med.，188:483-495)。本领域技术人员已知的任何其他技术，如噬菌体展示技术，也可以用于产生根据本发明的人抗体。根据本发明的方法可以用于任何类型的包含铰链区的免疫球蛋白，即，IgA、IgD和IgG。作为实例，对于IgA同种型，IgA1的铰链区包含氨基酸序列PSTPPTPSPSTPPTPSPS(SEQIDNo.8)，而IgA2的铰链区包含氨基酸序列PPPPP(SEQIDNo.9)。在相似的方式中，IgD的铰链区包含氨基酸序列SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(SEQIDNo.10)。作为本发明的特定实施方案，优选使用IgG，包括，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。对应于IgG铰链区的不同同种型的各自的氨基酸序列为：对于IgG1，PKSCDKTHTCPPCP(SEQIDNo.11)，对于IgG2，RKCCVECPPCP(SEQIDNo.7)，对于IgG3，LKTPLFTGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP(SEQIDNo.12)，和对于IgG4，SKYGPPCPSCP(SEQIDNo.13)。再更特别地，优选使用IgG1。实际上，在治疗抗体的领域中，更特别地，在癌症的治疗中，优选产生IgG1，以获得与特异性结合靶向抗原相关的功能以外的效应物功能，如ADCC和CDC。本发明方法的特征在于所述单克隆抗体是IgG1。在本发明的意思内，“目标分子”涉及单克隆抗体能够特异性结合或调节活性的任何分子。通常，将这样的目标分子称为“抗原”。作为单克隆抗体靶向的目标分子的非限制性实例可以提及可溶性配体、受体(如，跨膜受体)、跨膜肿瘤标记等。在优选的实施方案中，所述目标分子是跨膜受体。表述“跨膜受体”指的是跨过细胞的细胞质膜的蛋白，该蛋白的胞外结构域具有结合配体的能力，而胞内结构域具有在配体结合时可以改变(提高或降低)的活性(如，蛋白激酶)。换句话说，跨膜受体是完整的膜蛋白，典型地其存在于细胞的细胞质膜内，并在其中运作，但也在一些亚细胞区室和细胞器的膜中。在膜一侧结合信号分子或有时结合一对这样的分子时，跨膜受体启动另一侧的应答。以这种方式，它们在细胞交流和信号传导中起着独特且重要的作用。许多跨膜受体由两个或多个蛋白亚基组成，这些亚基共同运行，并且在配体结合、脱离或在其“激活”循环的另一个阶段时，可能分离。通常基于它们的分子结构来归类，或因为除了一些受体以外对于所有受体结构的任何详细内容是未知的，基于它们的假设(并且有时候是实验证实的)膜拓扑学来归类。预测最简单的多肽链只穿过脂双层一次，而其他穿过多达七次(称为G-蛋白偶联受体或GPCR)或更多次。与任何完整的膜蛋白相似，跨膜受体可以细分成三个部分或结构域，胞外结构域，跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域是受体伸出细胞或细胞器外侧膜的一部分。如果受体的多肽链穿过双层几次，外部结构域可以包含几个伸出膜外的“环”。根据定义，受体的主要功能是识别并应答特定的配体，例如，神经递质或激素(尽管特定的受体也应答跨膜势能的变化)，并且在许多受体中，这些配体结合胞外结构域。在存在结构证据的大部分受体中，跨膜α螺旋构成大部分的跨膜结构域。在特定的受体中，如尼古丁乙酰胆碱受体中，跨膜结构域形成通过膜的蛋白质线纹的孔，或离子通道。通过结合合适的配体激活胞外结构域时，孔变成离子可接近的，其随后通过。在其他受体中，认为跨膜结构域在结合时经历构象变化，这在胞内发挥出作用。在一些受体中，如7TM超家族的成员，跨膜结构域可以含有配体结合袋。受体的胞内(或细胞质)结构域与细胞或细胞器的内部相互作用，转播信号。对于这种相互作用基本上存在两种不同途径，a)通过与效应物蛋白的特定蛋白-蛋白-相互作用的胞内结构域交流，其随后将信号沿着信号链传送至其终点和b)使用酶相连的受体，胞内结构域具有酶活性。通常，这是酪氨酸激酶活性。酶活性也可以位于与胞内结构域相关的酶上。对于细胞调节跨膜受体的活性，存在几种方式。大部分通过胞内结构域来工作。最重要的方式是磷酸化和内在化(参见遍在蛋白)或第二信使级联如cAMP、IP、Ca2+或cGMP的激活。具有本发明中所述修饰的抗体还可以靶向显示出酶活性的所有膜蛋白。作为实例，可以提及，但不限于，基质金属蛋白酶(MMP)家族，“解整联蛋白和金属蛋白酶结构域蛋白酶”(ADAM)家族、腺苷酸环化酶、……具有本发明中所述修饰的抗体还可以靶向作用于离子通道、孔和转运子的所有膜蛋白。作为实例，可以提及，但不限于，钠通道家族、钾通道家族、尼古丁乙酰胆碱受体家族、sigma受体、一元胺转运子家族。更宽泛地，通过抗体处理还可以靶向对于给定疾病鉴定为特异性标记的所有膜蛋白，该抗体也可以通过本发明中所述的修饰来改进。在本发明的优选实施方案中，所述跨膜受体选自酪氨酸激酶受体、四跨膜蛋白和GPCR。在更优选的实施方案中，所述跨膜受体是酪氨酸激酶受体，其优选选自IGF-1R、c-Met、RON、Axl、VEGF、VEGFR、Her-2neu、ErbB家族的同型二聚体和异型二聚体，等。在本申请中，更特别地，在以下的说明书中，将根据IMGT来限定序列。已经限定了IMGT独特的编号来比较可变结构域，无论哪一种抗原受体、链类型或物种[LefrancM.-P.，ImmunologyToday18,509(1997)；LefrancM.-P.，TheImmunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.-P.，Pommié，C，Ruiz，M.，Giudicelli，V.，Foulquier，E.，Truong，L.，Thouvenin-Contet，V.和Lefranc，Dev.Comp.Immunol，27，55-77(2003)]。在IMGT独特的编号中，保守氨基酸通常具有相同的位置，例如，半胱氨酸23(第一-CYS)、色氨酸41(保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(第二-CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT独特的编号提供了框架区的标准化划界(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互补决定区的标准化划界：CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117。因为缺口表示未占据的位置，CDR-IMGT长度(显示于括号中并由点分开，例如，[8.8.13])成为关键信息。将IMGT独特的编号用于2D绘图表示中，称为IMGTColliersdePerles[Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，Immunogenetics，53，857-883(2002)；Kaas，Q.和Lefranc，M.-P.，CurrentBioinformatics，2，21-30(2007)]，和用于IMGT/3D结构-DB的3D结构中[Kaas,Q.，Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，TcellreceptorandMHCstructuraldata(T细胞受体和MHC结构数据)，Nucl.Acids.Res.，32，D208-D210(2004)]。对于本领域技术人员，将根据IMGT系统所述的本发明变换成任何其他编号系统(例如，Kabat编号系统)是显而易见的。对于所有物种的所有IG和TRV-REGION的IMTG独特编码依赖于可变区结构的高保守性。该编号，在比对超过5000个序列后设定，考虑并结合框架(FR)和互补决定区(CDR)的限定，来自X-射线衍射研究的结构数据和超变环的表征。已经限定了FR-IMGT和CDR-IMGT区的边界。相似地，IMGT独特的编号已经用于C-DOMAIN，并且使得可以精确地界定Ig-样结构域。C-DOMAIN对应于完整的C-REGION、大部分C-REGION或仅仅一部分C-REGION，这取决于免疫球蛋白(IG)类型。对于C-DOMAIN(IG和TR)的IMGT编号衍生为对于V-DOMAIN的IMGT独特编号，从对于V-REGION的最初IMGT独特编号，直至位置104。因此，可以容易地比较C-DOMAIN和V-DOMAIN之间的氨基酸位置。为了精确地定位铰链区，将C-DOMAIN的IMGT编号用于精确地定位CH1和CH2结构域。铰链区包括IMGT-CH1的最后一个残基和IMGT-CH2的第一个残基之间的所有氨基酸残基。涵盖相同铰链区的所有其他免疫球蛋白编号方案，如Kabat或A.Honegger，包括在本发明中。作为本发明的优选实例，基于如上所述的IMGT编号系统，IgG1铰链区的氨基酸序列包含残基H1至H14，片段H1至H9对应于上铰链，片段H10至H14对应于核心铰链。更特别地，人IgG1铰链区包含氨基酸序列PKSCDKTHTCPPCP(SEQIDNo.11)，鼠IgG1铰链区包含氨基酸序列PRDCGCKPCICT(SEQIDNo.14)。表1在本发明的优选实施方案中，考虑了针对缩短编码二价抗体铰链区的蛋白序列长度的修饰。更特别地，根据本发明的方法包括删除铰链区中至少一个氨基酸的步骤。如之前所提及的，优选删除所述铰链区的至多2个氨基酸。如之前所提及的，优选删除所述铰链区的至多3个氨基酸。如之前所提及的，优选删除所述铰链区的至多4个氨基酸。在本发明方法的特定用途中，修饰由选自位置H1、H2、H3、H5、H6、H7、H8、H9、H11、H12或H14氨基酸的至少一个氨基酸删除组成。更特别地，发明人已经证明了特定残基的涉及和本发明的特定创造性方面由特定残基的选择组成。在IgG1的优选情况中，位置H1的氨基酸由脯氨酸组成；位置H2的氨基酸由人种类中的赖氨酸和鼠种类中的精氨酸组成；位置H3的氨基酸由人种类中的丝氨酸和鼠种类中的天冬氨酸组成；位置H5的氨基酸由人种类中的天冬氨酸和鼠种类中的甘氨酸组成；位置H6的氨基酸由赖氨酸组成；位置H8的氨基酸由人种类中的组氨酸和鼠种类中的赖氨酸组成；位置H9的氨基酸由人种类中的苏氨酸和鼠种类中的脯氨酸组成；位置H11的氨基酸由人种类中的脯氨酸和鼠种类中的异亮氨酸组成；位置H12的氨基酸由人种类中的脯氨酸组成。根据优选实施方案，这种删除必须在“上铰链”区中进行。在更优选的实施方案中，例如，对于IgG1，该删除是氨基酸H1至H9构成的“上铰链”的部分，与氨基酸H10至H14构成的“核心铰链”相比较。在本申请中，关于之前所述的IMGT系统进行氨基酸编号。显而易见的是任何其他编号系统，编号改变但铰链区中涉及的残基性质未变，必须认为是等同的。例如，在Kabat系统中将本发明所鉴定的氨基酸部分(根据IMGT系统)重新编号，必须认为是等同的。本发明的另一个方面是基于“上铰链”区中至少一个半胱氨酸的删除，优选位于位置H4。本发明的另一个方面是基于将至少一个二硫桥键添加至铰链区中。更特别地，本发明方法的特征在于修饰由至少一个半胱氨酸引入“上铰链”区组成。根据本发明人，有道理的解释是基于由缩短长度和/或引入另一个二硫桥键可能产生的铰链“硬化”。这样的“硬化”将使得可以维持抗体合适的空间构象，并且因此，获得提高的拮抗活性。清楚针对硬化铰链区的任何方法必须认为是根据本发明方法的等价方法。可以通过添加这样的氨基酸来进行半胱氨酸的引入，通过本领域技术人员已知的任何方法来进行所述添加。另一种将半胱氨酸引入铰链区的优选方式由至少一个氨基酸的置换组成。更特别地，将半胱氨酸引入铰链区的优选方式由选自H1至H9的至少一个氨基酸的置换组成。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行该置换。更特别地，本发明的方法包括“上铰链”区的位置H7的苏氨酸被半胱氨酸置换。在另一个实施方案中，本发明的方法包括“上铰链”区的位置H6的赖氨酸被半胱氨酸置换。再另一个实施方案中，本发明的方法包括“上铰链”区的位置H1的脯氨酸被半胱氨酸置换。再另一个实施方案中，本发明的方法包括“上铰链”区的位置H2的赖氨酸被半胱氨酸置换。再另一个实施方案中，本发明的方法包括“上铰链”区的位置H3的丝氨酸被半胱氨酸置换。再另一个实施方案中，本发明的方法包括“上铰链”区的位置H5的天冬酸被半胱氨酸置换。再另一个实施方案中，本发明的方法包括“上铰链”区的位置H8的组氨酸被半胱氨酸置换。再另一个实施方案中，本发明的方法包括“上铰链”区的位置H9的苏氨酸被半胱氨酸置换。根据另一个实施方案，还可以通过改变编码铰链区的整个氨基酸序列来缩短铰链区的长度和/或增加二硫桥键。作为优选的实例，本发明方法的修饰由IgG1铰链区的氨基酸H1至H14被IgG2铰链区的氨基酸H1至H14替代组成，优选期望提高拮抗活性的所述单克隆抗体是IgG1抗体时。在另一个应用中，本发明涉及筛选针对特定目标分子的拮抗单克隆抗体或其二价功能性片段或衍生物的方法，所述抗体能够抑制所述目标分子的一种或多种生物活性，其中所述方法包括步骤：(a)选择具有所述目标分子的所述一种或多种生物活性的抑制初始水平的初始抗体，(b)通过本发明的方法修饰所述初始抗体铰链区的氨基酸序列，(c)评价步骤(b)的修饰抗体抑制所述目标分子的所述一种或多种生物活性的能力，和(d)选择作为阳性结果的步骤(c)的抗体，其具有高于所述抑制初始水平的所述目标分子的所述一种或多种生物活性的抑制水平。可以在现有抗体中选择初始抗体，如但不限于，IGF-1R、c-Met、RON、Ax1、CD151、VEGF、VEGFR、Her-2neu、ErbB家族的同型二聚体和异型二聚体的抗体拮抗剂。作为非限制性的优选实例，所述初始抗体可以由赫塞汀、帕妥珠单抗、爱必妥、抗-VEGFR或抗-IGF-1R抗体组成。在本发明的意思内，“抑制水平”说明了抗体的拮抗活性。该抑制水平可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测定，如但不限于，如a)直接细胞计数或使用3[H]胸苷嘧啶、四唑盐或任何其他荧光方式来评价增殖，b)蛋白印迹，磷-ELISA或α-筛选试验，以监控信号传导，c)BRET或FRET分析，用于二聚试验，d)显微镜或荧光方法，以监控迁移、入侵、血管生成或形态形成和e)肿瘤的卡规测量，用于体内评价。该筛选方法可用于证实的抗体的改进或作为研究或临床前抗体的选择阶段。根据本发明的另一个方面涉及针对特定目标分子的单克隆抗体或其二价功能性片段或衍生物，可通过本发明的方法来获得，所述抗体的特征在于其包含选自以下的铰链区氨基酸序列：SEQIDNo.1(PRDCGCKPCICT),SEQIDNo.2(PKSCGCKPCICT),SEQIDNo.3(PKSCGCKPCICP),SEQIDNo.4(PRDCGCKPCPPCP),SEQIDNo.5(PRDCGCHTCPPCP),SEQIDNo.6(PKSCDCHCPPCP),SEQIDNo.7(RKCCVECPPCP),SEQIDNo.22(CKSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.23(PCSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.24(PKCCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.25(PKSCCKTHTCPPCP),SEQIDNo.26(PKSCDCTHTCPPCP)SEQIDNo.27(PKSCDKCHTCPPCP),SEQIDNo.28(PKSCDKTCTCPPCP),SEQIDNo.29(PKSCDKTHCCPPCP),SEQIDNo.30(PKSCDKTHTCCPCP),SEQIDNo.31(PKSCDKTHTCPCCP),SEQIDNo.32(PKSCDKTHTCPPCC),SEQIDNo.33(PSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.34(PKSCDTHTCPPCP),SEQIDNo.35(PKSCDKTHCPPCP),SEQIDNo.36(KCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.37(PSCKTHTCPPCP),SEQIDNo.38(PKSCDTHCPPCP),SEQIDNo.39(PKSCTHTCPPCP),SEQIDNo.40(PKSCDKTTCPCP),SEQIDNo.41(PKSCDKTHCPPC),SEQIDNo.42(PKSCDCHTCPPCP),SEQIDNo.43(PKSCDCTHCPPCP),SEQIDNo.44(PCSCKHTCPPCP),SEQIDNo.45(PSCCTHTCPPCP),SEQIDNo.46(PSCDKHCCPPCP),SEQIDNo.47(PKSTHTCPPCP),SEQIDNo.48(PKSCTCPPCP)或SEQIDNo.49(PKSCDKCVECPPCP)。通过本发明方法的实施获得的优选单克隆抗体的特征在于其包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNo.1(PRDCGCKPCICT),SEQIDNo.2(PKSCGCKPCICT),SEQIDNo.3(PKSCGCKPCICP),SEQIDNo.4(PRDCGCKPCPPCP),SEQIDNo.5(PRDCGCHTCPPCP),SEQIDNo.6(PKSCDCHCPPCP),SEQIDNo.7(RKCCVECPPCP),SEQIDNo.22(CKSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.23(PCSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.24(PKCCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.25(PKSCCKTHTCPPCP),SEQIDNo.26(PKSCDCTHTCPPCP)SEQIDNo.27(PKSCDKCHTCPPCP),SEQIDNo.28(PKSCDKTCTCPPCP),SEQIDNo.29(PKSCDKTHCCPPCP),SEQIDNo.30(PKSCDKTHTCCPCP),SEQIDNo.31(PKSCDKTHTCPCCP),SEQIDNo.32(PKSCDKTHTCPPCC),SEQIDNo.33(PSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.34(PKSCDTHTCPPCP),SEQIDNo.35(PKSCDKTHCPPCP),SEQIDNo.36(KCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.37(PSCKTHTCPPCP),SEQIDNo.38(PKSCDTHCPPCP),SEQIDNo.39(PKSCTHTCPPCP),SEQIDNo.40(PKSCDKTTCPCP),SEQIDNo.41(PKSCDKTHCPPC),SEQIDNo.42(PKSCDCHTCPPCP),SEQIDNo.43(PKSCDCTHCPPCP),SEQIDNo.44(PCSCKHTCPPCP),SEQIDNo.45(PSCCTHTCPPCP),SEQIDNo.46(PSCDKHCCPPCP),SEQIDNo.47(PKSTHTCPPCP),SEQIDNo.48(PKSCTCPPCP)或SEQIDNo.49(PKSCDKCVECPPCP)。在优选的实施方案中，所述单克隆抗体是人抗体，更优选是IgG1抗体。本发明还涉及编码之前所述的单克隆抗体的分离核酸，即，包含选自以下的铰链区氨基酸序列：SEQIDNo.1(PRDCGCKPCICT),SEQIDNo.2(PKSCGCKPCICT),SEQIDNo.3(PKSCGCKPCICP),SEQIDNo.4(PRDCGCKPCPPCP),SEQIDNo.5(PRDCGCHTCPPCP),SEQIDNo.6(PKSCDCHCPPCP),SEQIDNo.7(RKCCVECPPCP),SEQIDNo.22(CKSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.23(PCSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.24(PKCCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.25(PKSCCKTHTCPPCP),SEQIDNo.26(PKSCDCTHTCPPCP)SEQIDNo.27(PKSCDKCHTCPPCP),SEQIDNo.28(PKSCDKTCTCPPCP),SEQIDNo.29(PKSCDKTHCCPPCP),SEQIDNo.30(PKSCDKTHTCCPCP),SEQIDNo.31(PKSCDKTHTCPCCP),SEQIDNo.32(PKSCDKTHTCPPCC),SEQIDNo.33(PSCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.34(PKSCDTHTCPPCP),SEQIDNo.35(PKSCDKTHCPPCP),SEQIDNo.36(KCDKTHTCPPCP),SEQIDNo.37(PSCKTHTCPPCP),SEQIDNo.38(PKSCDTHCPPCP),SEQIDNo.39(PKSCTHTCPPCP),SEQIDNo.40(PKSCDKTTCPCP),SEQIDNo.41(PKSCDKTHCPPC),SEQIDNo.42(PKSCDCHTCPPCP),SEQIDNo.43(PKSCDCTHCPPCP),SEQIDNo.44(PCSCKHTCPPCP),SEQIDNo.45(PSCCTHTCPPCP),SEQIDNo.46(PSCDKHCCPPCP),SEQIDNo.47(PKSTHTCPPCP),SEQIDNo.48(PKSCTCPPCP)或SEQIDNo.49(PKSCDKCVECPPCP)。根据再另一个方面，本发明涉及分离的核酸，其特征在于其选自以下的核酸：a)编码根据本发明的人工铰链区的核酸、DNA或RNA，其相应的RNA核酸或其互补序列；b)包含选自SEQIDNo.15至SEQIDNo.21、SEQIDNo.50至SEQIDNo.77的核酸序列的分离核酸序列，其相应的RNA核酸或其互补序列；和c)能够在高严谨条件下与SEQIDNo.15至21和50至77的至少一个序列杂交的至少18个核苷酸的核酸。优选，本发明包括分离的核酸，其包含选自SEQIDNo.15至21和SEQIDNo.50至77的核酸序列。本发明的另一部分是包含之前所述的分离核酸的表达载体或转化宿主细胞，更特别地，包含选自SEQIDNo.15至21和SEQIDNo.50至77的核酸序列的分离核酸，其相应的RNA核酸及其互补序列。将在本发明中同等使用的术语核酸、核或核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列，用来表示核苷酸的精确连接，其是修饰或未修饰的，允许是待限定核酸的片段或区域，含有或不含非天然核苷酸，并且关于所述DNA的转录产物，能够正好对应于双链DNA、单链DNA。在此还必须理解本发明不涉及在其天然染色体环境中的核苷酸序列，也就是说天然状态的。涉及已经分离和/或纯化的序列，也就是说它们已经得到直接或间接选择，例如，通过拷贝，它们的环境至少已经部分改变。因此，同样旨在在此表明通过遗传重组获得的分离核酸，例如，通过宿主细胞的遗传重组，或通过化学合成获得。在高严谨条件下杂交表示以允许维持两个互补DNA片段之间杂交的方式来选择温度条件和离子强度条件。作为说明，对于限定上述多核苷酸片段的目的，高严谨杂交步骤的条件有利地为以下的条件。以两个步骤来进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交：(1)在含有5×SSC(1×SSC对应于0.15MNaCl+0.015M柠檬酸钠溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、10×Denhardt’s、5％葡聚糖硫酸酯和1％鲑鱼精子DNA的磷酸缓冲液(20mM，pH7.5)中，在42℃下，预杂交3小时；(2)在根据探针大小的温度下实际杂交20小时(即：对于探针大小>100个核苷酸，42℃)，接着在2×SSC+2％SDS中20℃洗涤2次20分钟，在0.1×SSC+0.1％SDS中20℃下洗涤1次20分钟。对于探针大小>100个核苷酸，最后一次洗涤在0.1×SSC+0.1％SDS中60℃下洗涤30分钟。根据Sambrook等的教导(1989，Molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：实验室手册)，第2版，ColdSpringHarbor)，本领域技术人员可以将上述对于限定大小的多核苷酸的高严谨杂交条件用于更大或更小尺寸的寡核苷酸。本发明同样涉及包含根据本发明的核酸的载体。本发明尤其针对含有根据本发明的核苷酸序列的克隆和/或表达载体。根据本发明的载体优选含有使翻译的核苷酸序列在确定的宿主细胞中表达和/或分泌的要素。因此，载体必须含有启动子、翻译启动和终止信号以及合适的转录调控区。必须能够以稳定的方式在宿主细胞中维持并可以任选具有特定的信号，其指定所翻译蛋白的分泌。本领域技术人员按照所用宿主细胞的功能来选择和优化这些不同的要素。为了这种效果，可以将根据本发明的核苷酸序列插入选定宿主中的自主复制载体中，或是选定宿主的整合载体。通过本领域技术人员常用的方法来制备这些载体，并且将所得到的克隆通过标准方法引入合适的宿主中，标准方法如脂转染、电穿孔、热冲击或化学方法。例如，根据本发明的载体是质粒或病毒来源的载体。它们可用于转化宿主细胞，以克隆或表达根据本发明的核苷酸序列。本发明同样包含通过根据本发明的载体转化的宿主细胞或包含根据本发明的载体的宿主细胞。宿主细胞可以选自原核或真核系统，例如，细菌细胞，以及酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。同样可以使用昆虫细胞或植物细胞。附图说明本发明的其他特征和优点将在实施例和附图的继续描述中显现出来，其中：图1A和图1B：作为人IgG1/κ同种型产生的一系列鼠和相应的嵌合抗-c-MetMab对A549细胞上的c-Met受体磷酸化的作用。图1A：用百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算的激动剂作用。图1B：用由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算的拮抗剂作用。图2A和图2B：含有各种工程化铰链区的鼠224G11Mab和嵌合224G11Mab之间对A549细胞上的c-Met受体磷酸化的比较。图2A：用百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算的激动剂作用。图2B：用由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算的拮抗剂作用。图3A和图3B、图4和图5：c-Met二聚化和激活BRET模型。图6A和图6B：通过嵌合和人源化224G11形式的c-Met识别。图7A、图7B和图7C：鼠和嵌合抗体对HGF诱导的NCI-H441细胞增殖的体外作用。将NCI-H441细胞涂布于无血清培养基中。涂布二十四小时后，在HGF不存在或存在下加入(图7A)m11E1和[11E1]chim、(图7B)m227H1和[227H1]chim或(图7C)m224G11和[224G11]chim。黑色箭头表示在HGF不存在或存在下仅用细胞涂布的孔。引入鼠IgG1(mIgG1)，作为同种型对照。图8：鼠和嵌合224G11Mab对NCI-H441异种移植模型的体内比较。图9A和图9B：鼠224G11Mab以及该抗体的各种嵌合和人源化形式对HGF诱导的NCI-H441细胞增殖的体外作用。将NCI-H441细胞涂布于无血清培养基中。涂布二十四小时后，在HGF不存在或存在下，加入待测试的抗体。在图中(图9A)，显示了鼠m224G11、嵌合IgG1[224G11]chim、人源化IgG1[224G11][Hz1]、[224G11][Hz2]、[224G11][Hz3]形式。在图中(图9B)，呈现了鼠m224G11和各种嵌合IgG1形式([224G11]chim、[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]、[224G11][TH7chim])。黑色箭头表示在HGF不存在或存在下仅用细胞涂布的孔。引入了鼠IgG1，作为激动剂活性的阴性对照。将m5D5用作剂量依赖性完全激动剂对照。图10：鼠224G11Mab以及该抗体的各种嵌合和人源化形式对HGF诱导的NCI-H441细胞增殖的体外作用。将NCI-H441细胞涂布于无血清培养基中。涂布二十四小时后，在HGF不存在或存在下，加入待测试的抗体。呈现了鼠m224G11、[224G11]chim、[224G11][TH7chim]IgG1嵌合形式和[224G11][TH7Hz1]、[224G11][TH7Hz3]。黑色箭头表示在HGF不存在或存在下仅用细胞涂布的孔。引入了鼠IgG1，作为用于激动剂活性的阴性对照。将m5D5用作剂量依赖性完全激动剂对照。图11A-图11B和图12A-图12B：本发明的一系列具有工程化铰链的抗-c-MetMab对A549细胞上的c-Met受体磷酸化的作用。图11A和图11B：用百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算的激动剂作用。图12A和图12B：用由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算的拮抗剂作用。图13A和图13B：c-Met二聚化和激活BRET模型。图14A：用百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算的激动剂作用。图14B：用由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算的拮抗剂作用。图15：c-Met二聚化和激活BRET模型。图16：不同形式的Mab214B2对PC3细胞粘附的作用的显微镜分析。图17：使用ATP分析的不同形式的Mab214B2对PC3细胞粘附的作用的分析。在每个孔中，使用PC3标准曲线测定了粘附细胞的数量，从0至200000细胞/孔。按照以下来呈现结果：将未处理的细胞取作参照(100％)，并将处理的细胞呈现为参照的％。具体实施方式实施例1：嵌合Mab的构建和c-Met受体磷酸化状态的功能评价将靶向原型酪氨酸激酶受体(c-Met受体)的几种鼠Mab重新格式化为携带鼠可变结构域和人恒定结构域的嵌合Mab。基于监控配体(HGF)依赖性c-Met受体磷酸化抑制的功能试验分析了它们的内在活性。通过鼠可变结构域序列(VH、VL)的PCR-克隆，将携带鼠VH或VL序列的{NheI-Bcl1