具有抗炎症、骨形成及生发促进活性的肽及其的用途的制作方法

本申请对2014年5月13日提出于韩国专利局的韩国专利申请第10-2014-0057191号主张优先权，上述申请的公开内容作为参照插入于本说明书。

本发明涉及具有抗炎症、骨形成及生发促进活性的肽及其的用途。

背景技术：

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α)借助在对于细菌感染及肿瘤疾病的宿主免疫反应过程中被活性化的巨噬细胞及多种细胞生成。上述细胞因子还是炎症反应的重要媒介，上述细胞因子为在如类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎、克罗恩氏病、银屑病、强直性脊柱炎(AS)的炎症性疾病中担当重要因素的炎性细胞因子。例如，在类风湿性关节炎中，肿瘤坏死因子-α使滑膜炎持续并持续破坏骨和软骨。因此，需要抑制肿瘤坏死因子-α的特异性生物活性，因而，防止组织肿瘤坏死因子-α所参与的细胞反应并通过调节炎症前细胞因子的活性和通过肿瘤坏死因子-α调节的过程为目的，正在开发用于抑制肿瘤坏死因子-α的多种生物学制剂。

另一方面，骨不仅为在结构上支撑肌肉或脏器，而且还是储存体内的盖或其他必要无机物，即，如磷或锰的物质的人体的重要部分中的一个。因此，结束生长的成人的骨直至死去为止，去除老化的骨并以新的骨代替的生长和吸收过程动态且持续地反复再生并维持均衡。

在骨形成的过程中，大体有两种细胞参与上述过程。在两种细胞中的一种为生成骨头的成骨细胞(osteoblast)，另一种为用于破坏骨头的破骨细胞(osteoclast)。成骨细胞生成核因子-KB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-KB ligand)和作为上述成分的诱饵受体(decoy receptor)的股保护素(osteoprotegerin)。若核因子-KB受体活化因子配基与作为存在于破骨前驱细胞(osteoclast progenitor cells)表面的作为手提的RANK相结合，则破骨前驱细胞成熟(maturation)成破骨细胞，从而发生骨吸收。但是，若骨保护素与核因子-KB受体活化因子配基相结合，则核因子-KB受体活化因子配基和RANK之间的结合会被断开，从而抑制破骨细胞的形成，且不会引起需求之外的骨吸收(Theill LE.et al.,Annu Rev Immunol.,20:795-823(2002)；；Wagner EF.et al.,Curr Opin Genet Dev.,11:527-532(2001))。老化的骨头的吸收或破坏借助在血液细胞(干细胞)中所产生的破骨细胞来进行，上述破骨细胞用于在骨头形成孔并使少量的盖向血流释放，从而维持人体功能。(William J.et al.,Nature.,423:337342(2003))。另一方面，在骨细胞中生成的成骨细胞用胶原质填孔并覆盖钙和磷的沉淀物(hydroxyapatite)来形成坚固的新骨头，从而去除骨骼(Stains JP.et al.,Birth Defects Res C Embryo Today.,75(1):72-80(2005))。从骨头开始被破坏至形成新的骨头所消耗的时间大约为100天(Schwarz EM.et al.,Curr Opin Orthop.,11:329-335(2000))。虽然幼儿在1年内骨头中的钙会换100％，但是对成人来说，每年骨骼的约10-30％通过上述过程再形成，仅在破骨速度和成骨速度相同的情况下才可维持如上所述的骨密度。如上所述，在重要的骨头失去均衡的情况下，可引起多种疾病，尤其，因骨质疏松症和癌细胞的骨转移(bone metastasis)所引起的骨头的损伤和相关疾病。

骨质疏松症(osteoporosis)为因多种原因而使骨头的质量减少，因骨组织的微细结构的退化而使骨折的危险持续增加的疾病，骨质疏松症处于形成骨头和矿物质(尤其，钙)和基质减少的状态，因骨质形成的均衡被打破，从而发生破骨作用大于成骨作用的状态(Iqbal MM.,South Med J.,93(1):2-18(2000))。正常的骨头内部呈如网状的致密结构，但是在骨质疏松症的情况下，结构之间的间隔变大，且微细结构变薄，因而使骨头变瘦，从而即使受到很小的冲击，骨头也有可能容易被折断(Stepan JJ.et al.,Endocr Regul.,37(4):225-238(2003))。骨质疏松症分为如下种类：与绝经期的开始一同呈现出快速的骨损失(年间2～3％)，并使脊椎的压迫及腕骨容易骨折的危险增加的绝经期后骨质疏松症、在70岁以上的男女老年人当中慢慢发生(年间0.5～1％)，且在坐骨(hip bone)和脊椎骨逐渐发生骨损失的老年性骨质疏松症(Senile osteoporosis)、及与年龄无关，因疾病(内分泌疾病、胃肠管疾病、恶性肿瘤)或药物(肾上腺皮质素、化疗、甲状腺激素、抗惊厥剂，抗凝剂、甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢霉素((cyclosporine)、GnRH等)、乙醇、吸烟、事故所引起的继发性骨质疏松症(Secondary osteoporosis)(Rosen CJ.,N Engl J Med.,353(6):595-603(2005)；Davidson M.,Clinicain Reviews.,12(4):75-82(2002))。

在乳腺癌(breast cancer)、前列腺癌(prostate cancer)或多发性骨髓瘤(multiple myeloma)患者中，几乎一直发生骨转移(Kozlow W.et al.,J Mammary Gland Biol Neoplasia.,10(2):169-180(2005))，这些患者能活多长时间受到是否进行骨转移的影响。乳腺癌患者或前列腺癌患者的死亡率变高的原因为癌细胞选择性地向骨头转移。在乳腺癌中观察得到的骨转移大部分为破坏骨头的溶骨性转移(osteolytic metastasis)，并非乳腺癌细胞直接对骨头产生影响，而是通过刺激破骨细胞来引发(Boyde A.et al.,Scan Electron Microsc.,4:1537-1554(1986))。相反，在前列腺癌中观察得到的骨转移为成骨性转移(osteoblastic metastasis)。成骨性骨转移也与溶骨有密切的关系。向骨头转移的癌细胞在骨头周围的微细环境中增殖并刺激破骨细胞或成骨细胞的活性，由此确定是否进行溶骨性骨转移，还是进行成骨性转移(Choong PF.et al.,Clin Orthop Relat Res.,415S:S19-S31(2003))。乳腺癌患者中的约80％发生癌细胞的骨转移，转移的乳腺癌细胞是破骨细胞活性化(Bendre M.,et al.,Clin Orthop Relat Res.,415(Suppl):S39-S45(2003)；Palmqvist P.et al.,J Immunol.,169(6):3353-3362(2002))。被活性化的破骨细胞破坏骨头周围的微细环境的均衡并引起骨溶解(osteolysis)，因上述现象，不仅频频发生病理性骨折，还会发生白细胞减少症(leukoerythroblastic anaemia)、骨头的畸形、血钙过多症(hypercalcemia)、痛症(pain)、神经压迫综合症(nervecompression syndromes)等的与骨头相关的疾病(Roodman GD.,N Engl J Med.,350:1655-1664(2004))。

根据国民健康保险工团健康保险政策研究院从2001年至2008年对健康保险诊疗费提供资料进行分析的内容，“脱发疾病”的实际治疗患者数从2001年的10万3千名增加至2005年的14万2千名，而且2008年为16万5千名，最近7年内增加了近60％。若按年龄，20～40岁的实际诊疗患者数为11万4千名，占据了总患者数的69.5％，10岁以下患者也为2万2千名以上。以2008年为基准，在实际诊疗患者数中男性为8万4千名，女性为8万名，男性比女性略多，以2008年为基准，“脱发”疾病的按性别国内健康保险实际诊疗患者数如下，即，圆形脱发症(13万)、疤痕性脱发(2万)、产生雄性征脱发(9千)、其他非疤痕毛发损失(8千)。

观察海外的脱发患者患病率，根据2003年6月国际毛发及整形美容研究讨论会资料，在全世界范围内，脱发患者达到2.5亿名，在24-50岁之内，脱发发病率达到30-65％。以2008年为基准，中国的脱发人口约达到3亿，其中30岁男性人口的30％且50岁男性人口的50％呈现脱发症状，且每年脱发患者人数增加10-15％。日本的情况下，脱发发病率为26.5％，推定脱发患者人口数约为1293万名。

目前，用于治疗脱发的制剂大体分为医药品和医药外品及化妆品。需要医生的处方才可购买的专业医药品为美国Merck公司开发并销售的“非那雄胺生发剂”，作为其主要成分的非那司提(Finasteride)在1997年12月从美国FDA获得了脱发治疗机认可。非那司提为用于抑制将睾酮转换为二氢睾酮(二氢睾酮，dihydrotestosterone)的5-α-还原酶的药剂，非那司提起到使软毛生长呈粗长毛发的作用。上述药品虽然在短期内具有脱发改善的效果，但是具有阳痿、性功能衰退、男性的乳房肥大等的副作用。已确保安全性及有效性且即使没有获得医生的处方也可购买的药品为米诺地尔(Minoxidil)，在1997年12月从美国FDA获得了第一个涂抹脱发治疗剂的认可。上述药品改善血液循环并开放钙通道，由此具有促进毛发生长的效果，但是可引起瘙痒、发疹等局部反应，而且还可引起脉频等。

作为从食品和药物管理局得到脱发防止和预发功能认可的以外药品的代表产品具有CJ狮王的“毛发力感受态”、MORACLE的“生发香水”、LG生活健康的“MO&MORE”等，化妆品类为了维持或增进洗发剂类或皮肤、毛发的健康而销售用于头皮或毛发的产品。人的脱发周期大体分为生长期(anagen)、生长中期(catagen)及生长终期(telogen)。生长期为毛发诱导的活动非常活跃且细胞分裂极为旺盛，从而毛发快速生长的时期。根据毛发的种类，生长期的寿命互不相同，但是在头发的情况下，大约为3-6年。生长期毛发占据全部毛发的80-90％，正在脱发的人具有生长期变短且生长终期变长的毛发周期，从而在全部毛发中的生长期毛发的比重降低。生长中期为毛发的生长期结束，且毛发生长逐渐缓慢，结果细胞分裂及生长停止的时期，生长中期的寿命为1-1.5个月左右，全部毛发的1％左右属于生长中期。生长终期为生长的最后步骤，在生长终期，毛囊和皮肤完全分离，毛囊萎缩且毛根更向上方转移，从而毛发脱落。生长终期持续3-4个月，全部毛发的4-14％与生长终期相对应。若生长终期结束且皮肤的活性再次变得活跃，则形成新毛发的皮肤，处于生长终期的毛发被新的毛发所替代，从而完全向头皮外移动。

本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。

技术实现要素：

技术问题

本发明人员努力开发具有在生活学方面有效活性的优秀的肽的结果，查明了由选自由序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽呈现除抗炎症及骨形成活性，由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列的肽具有生发促进活性，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供具有抗炎症活性的肽。

本发明的再一目的在于，提供具有骨分化促进活性的肽。

本发明的另一目的在于提供具有生发促进活性的肽的肽。

本发明的还有一目的在于，提供骨分化促进用组合物。

本发明的又一目的在于，提供脱发防止或生发促进用组合物。

本发明的其他目的及优点通过以下的发明的详细说明、发明要求保护范围及附图变得更加明确。

解决问题的方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供由选自由序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的具有抗炎症活性的肽。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供由选自由序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列的具有生发促进活性的肽。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的具有生发促进活性的肽。

本发明人员努力开发具有在生活学方面有效活性的优秀的肽的结果，查明了由选自由序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽呈现除抗炎症及骨形成活性，由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列的肽具有生发促进活性。

本发明的肽包括序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列。具体地，本发明的肽必须包含序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列。

根据本发明的一实例，本发明的由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列的氨基酸序列形成的肽抑制炎性细胞因子的表达，并抑制炎症细胞的增殖，结果呈现出抗炎症活性。

根据本发明的再一实例，本发明的由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列的氨基酸序列形成的肽使参与磷脂酰肌醇3-激酶、Smad1、Smad5及Smad8的磷酸化增加，并使碱性磷酸酶、骨保护素及骨唾液酸蛋白的表达增加，结果促进骨分化。

根据本发明的另一实例，本发明的由序列表中序列1或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽促进毛囊细胞及脐静脉内皮细胞的增殖，并使细胞外信号调节激酶的磷酸化增加，且增加作为参与毛发生长的蛋白质的磷脂酰肌醇3-激酶、β-链蛋白、胰岛素样生长激素-1、角质细胞生长因子、Wnt3a的表达增加，并减少作为脱发基因的DKK-1的表达，结果呈现出脱发预防及生发促进功效。

在本发明中使用的术语“肽”意味着借助肽结合，氨基酸残基之间相互结合而成的线形的分子。本发明的肽可根据本发明所属技术领域中公知的化学合成方法、尤其，固相合成技术(solid-phase synthesis techniques；Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963)；Stewart,et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd.ed.,Pierce Chem.Co.:Rockford,111(1984))或液相合成技术(US授权专利第5516891号)来制备。

根据本发明的一实例，上述肽的N-或C-末端可以与选自由乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基及聚乙二醇(PEG)组成的组中的保户基相结合。

上述氨基酸的变形起到很大程度上改善本发明的肽的稳定性的作用。在本发明中所使用的术语“稳定性”不仅意味着“体内”稳定性，而且还意味着储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供将由选自由上述序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽作为有效成分包含的抗炎症用组合物。

本发明的组合物将由上述本发明序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列的氨基酸序列形成的肽作为有效成分包含，因此为了避免本说明书的过度复杂，将省略相同的内容记载。

如在以下的实施例中正实，由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列的氨基酸序列形成的肽抑制炎性细胞因子的表达，并通过抑制炎症细胞的增殖来抑制炎症反应，从而对炎症性疾病的预防或治疗极为有效。

可适用本发明的抗炎症用组合物的炎症性疾病包括炎症性皮肤病(例如，哮喘、湿疹、牛皮癣、过敏、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎(psoriatic arthritis)、过敏性皮炎、银屑病、痤疮、特应性鼻炎(花粉症)、变应性皮炎(湿疹)、慢性鼻窦炎或脂溢性皮炎(seborrheic dermatitis))、骨病、胃炎、痛风、关节炎、痛风、溃疡、慢性支气管炎、急性肺损伤、肺部炎症、气道超敏反应、炎性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、败血症、败血性休克、血管炎和急性和慢性炎性疾病、滑囊炎、狼疮、风湿性多肌痛、硬皮病、韦格纳肉芽肿、颞动脉炎、低温球蛋白血症(cryoglobulinemia)及如多发性硬化症的自身免疫性疾病、移植排斥、包括实体瘤(例如，肺、CNS、脏、肾脏及胰腺)的癌症、阿尔茨海默氏病、动脉硬化、病毒感染(例如，HIV或流感)、慢性病毒感染(例如，Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒，疱疹病毒(herpes simplex virus)、或毛细血管扩张性运动失调症，但并不局限于此。

根据本发明的一实例，本发明的抗炎症性组合物可通过药剂学组合物或化妆品组合物制备。

本发明的多个组合物可利用为药剂学组合物，上述药剂学组合物包含：(a)表示上述的本发明的肽的药剂学有效量；以及(b)药剂学上接受的载体。

在本说明书中使用的术语“药剂学有效量”是指达成与上述的肽的功效或活性的充分量。

包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常利用的载体，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。适当的药剂学上接受的载体及制剂详细地记载于Remington’Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)。

本发明的药剂学组合物能够以口服或非口服的方式进行给药，在以非口服的方式给药的情况下，可通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部给药、经皮给药等的方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适当的给药量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度等的因素而多样，一般可容易确定及处方对熟练的医生希望的治疗或预防有效的给药量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物的1天给药量为0.0001-200μg。

并且，本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而可制备成单位容量形态或装入多容量容器内来制备。此时，剂型还可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态或浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或凝胶(例如，水凝胶)形态，还可包含分散剂或稳定剂。

并且，本发明的组合物可利用为化妆品组合物，上述化妆品组合物包含：(a)来源于上述的本发明的肽的化妆品学有效量(cosmetically effective amount)；以及(b)化妆品学上接受的载体。

在本说明书中使用的术语“化妆品学有效量”是指达成上述的本发明的组合物的功效的充分量。

本发明的化妆品组合物可制备成本发明所属领域中通常制备的任何剂型，例如，可剂型化为溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉、肥皂、含有表面活性剂的洁面剂、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡粉底及喷雾剂等，但不局限于此。更详细地，可制备成柔肤化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、洁面霜、洗面奶、卸妆水、面膜、喷雾剂或粉的剂型。

在本发明的剂型为糊剂、乳霜或凝胶的情况下，可利用动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等作为载体成分。

在本发明的剂型为粉或喷雾剂的情况下，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉作为载体成分，尤其，在喷雾剂的情况下，还可包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等的推进剂。

在本发明的剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇的脂肪酸酯。

在本发明的剂型为悬浮液的情况下，可利用水、乙醇或丙二醇等的液态稀释剂、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯脱水山梨醇酯等的悬浮剂、微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂或胺黄树胶等作为载体成分。

在本发明的剂型为含有表面活性剂的洁面剂的情况下，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。

包含于本发明的化妆品组合物的成分除了作为有效成分的肽类和载体成分之外，包含通常利用于化妆品组合物的多种成分，例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等的通常的助剂。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供将由选自由上述序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽作为有效成分包含的骨分化促进用组合物。

本发明的组合物将由上述本发明的序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽作为有效成分包含，因此为了避免本说明书的过度复杂，将省略对相同内的记载。

如在以下的实施例中证实，本发明的将由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽作为有效成分包含的组合物促进成骨细胞株的分化。因此，本发明的组合物可有效促进骨分化。

根据本发明的一实例，本发明的组合物使参与骨分化的磷脂酰肌醇3-激酶、Smad1、Smad5及Smad8的磷酸化增加，并使作为骨分化标记的骨保护素、碱性磷酸酶及骨唾液酸蛋白基因表达增加。

根据本发明的另一实例，本发明的组合物可用于骨病改善或治疗。

根据本发明的一实例，可通过本发明的组合物得到改善或治疗的骨病包括骨质疏松症、青少年骨质疏松症、成骨不全症、骨软化症、骨坏死症、佝偻病、骨髓炎、牙槽骨质丢失、骨头的佩吉特氏病(Paget’s disease)、原发性甲状旁腺功能亢进症、转移性(metastatic)骨病、骨髓瘤、类风湿关节炎中的骨质流失、转移性骨病、基于癌症的骨质流失、纤维异常增殖症、再生障碍性贫血骨病、代谢性骨病或随年龄的骨量损失，但并不局限于此。

本发明的骨分化促进用组合物可通过药剂学组合物制备。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供将由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽作为有效成分包含的脱发防止或生发促进用组合物。

本发明的组合物包含将由上述序列表中序列1或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽作为有效成分包含，因此为了避免本说明书的过度复杂，将省略相同内容的记载。

如以下实施例证实，本发明的将由序列表中序列1或序列表中序列3的氨基酸序列作为有效成分包含的组合物促进毛囊细胞及脐静脉内皮细胞的增殖，并使细胞外信号调节激酶的磷酸化增加，且使作为参与毛发生长的蛋白质的磷脂酰肌醇3-激酶、β-链蛋白、胰岛素样生长激素-1、角质细胞生长因子、Wnt3a的表达增加，并减少作为脱发基因的DKK-1的表达，结果呈现出脱发预防及生发促进功效。

本发明的脱发防止或生发促进用组合物可通过药剂学组合物或化妆品组合物来制备。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供将由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽作为有效成分包含的组合物给药到对象中的步骤的黑色素低色素症的改善或治疗方法。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包括将由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽作为有效成分包含的组合物给药到对象中的步骤的肥胖的预防或治疗方法。

本发明的黑色素低色素症的改善或治疗方法及肥胖的预防或治疗方法利用上述组合物来实施，为了避免本说明书的过度复杂，将省略两者之间的相同内容的记载。

发明的效果

概括本发明的特征及优点如下：

(i)本发明提供由选自由序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列组成的具有抗炎症及骨分化促进活性的肽。

(ii)本发明提供由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列的具有生发促进活性的肽。

(iii)本发明的由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽抑制炎性细胞因子的表达并抑制炎症细胞的增殖，结果呈现出抗炎症活性，且使参与骨形成的磷脂酰肌醇3-激酶、Smad1、Smad5及Smad8的磷酸化增加，并使碱性磷酸酶、骨保护素及骨唾液酸蛋白的表达增加，结果促进骨分化。

(iv)本发明的由序列表中序列1或序列表中序列3的的氨基酸序列形成的肽促进毛囊细胞及脐静脉内皮细胞的增殖，使细胞外信号调节激酶的磷酸化增加，并使作为参与毛发生长的蛋白质的磷脂酰肌醇3-激酶、β-链蛋白、胰岛素样生长激素-1、角质细胞生长因子、Wnt3a的表达增加，并使作为脱发基因的DKK-1的表达减少，结果呈现出脱发预防及生发促进功效。

附图说明

图1a-图1c为测定对于本发明的肽的肿瘤坏死因子受体结合度的结果。

图2a-图2f为测定基于本发明的肽的巨噬细胞的增殖变化的结果。

图3a-图3c为测定作用于借助肿瘤坏死因子-α处理被活性化的NF-KB的核内移动的本发明的肽效果的结果。

图4a-图4c为测定作用于借助肿瘤坏死因子-α处理增加的IL-1β表达的本发明的肽效果的结果。

图5a-图5c为测定作用于借助肿瘤坏死因子-α处理增加的IL-8表达的本发明的肽的效果的结果。

图6为测定对于本发明的肽的HGF受体结合度的结果。

图7为测定作用于借助HGF受体信号刺激增加的磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化的本发明的肽的效果的结果。

图8为测定对于本发明的肽的BMP受体结合度的结果。

图9为测定作用于借助BMP受体信号刺激增加的Smad1/5/8磷酸化的本发明的肽的效果的结果。

图10a-图10c为测定对于本发明的肽的碱性磷酸酶表达变化的结果。

图11a-图11c为测定根据本发明的肽的骨分化促进的矿化(minelaization)结果。

图12a-图12c为测定基于本发明的肽的骨分化标记(骨保护素、碱性磷酸酶及骨唾液酸蛋白)的表达变化的结果。

图13a-图13b为测定基于本发明的肽的毛发真皮乳头细胞的增殖变化的结果。

图14a-图14b为测定基于本发明的肽的毛发角质形成细胞的增殖变化的结果。

图15a-15b为测定基于本发明的肽的脐静脉内皮细胞的增殖变化的图。

图16为测定基于本发明的肽的细胞外信号调节激酶磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶表达及β-链蛋白的表达变化的结果。

图17为测定基于本发明的肽的胰岛素样生长激素-1、角质细胞生长因子及Wnt3a的表达变化的结果。

图18为测定作用于借助二氢睾酮处理增加的DKK-1表达的本发明的肽效果的结果。

图19为测定基于本发明的肽的Ha3-II及角蛋白-14的表达变化的结果。

图20为测定基于本发明的肽的老鼠胡子的生长变化的结果。

具体实施方式

以下，通过实施例更加详细说明本发明。这种实施例只用于更加详细说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

实施例

合成例1：肽的合成

将700mg的氯三苯甲基氯树脂(Chloro trityl chloride resin；CT L resin，Nova biochem Cat No.01-64-0021)放入反应容器中，并加入10ml的二氯甲烷(MC)来搅拌了3分钟。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(DMF)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的二氯甲烷(DCM)溶液放入反应器中，并放入200mmole的Fmoc-C ys-OH(Bachem，Swiss)及400mmole的二异丙基乙胺(DIEA)后，搅拌并均匀溶解，搅拌1小时并进行反应。反应后清洗，将甲醇和二异丙基乙胺(2：1)溶解于二氯甲烷中，反应10分钟，并用过量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1：1)进行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(Piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反应容器中，并在常温条件下搅拌10分钟后，去除了溶液。放入同量的脱保护溶液，并重新维持10分钟反应后，去除溶液，并分别以3分钟的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，来制备了Cys-CTL树脂。在新的反应器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmole的Fmoc-Pro(Bachem，Swiss)、200mmole的羟基苯并三唑(HoBt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(Bop)后，搅拌来均匀溶解。在反应器中，经过2次以分馏的方式放入400mmole的N，N-二异丙基乙胺(DIEA，N，N-Diisopropylethylamine)后，搅拌至所有固体溶解为止至少5分钟。将溶解的氨基酸混合溶液放入具有脱保护的树脂的反应容器中，在常温条件下搅拌1小时并进行反应。去除反应液，并用二甲基甲酰胺溶液每次搅拌5分钟，并搅拌3次后去除。取少量的反应树脂，并利用茚三酮测试(Nihydrin test)检查了反应程度。使用脱保护溶液，以与上述方法相同的方法进行2次脱保护反应，来制备了Pro-Cys-CTL树脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新执行一次茚三酮测试，接着以与上述方法相同的方法执行了以下氨基酸附着实验。根据选定的氨基酸序列，按Fmoc-Arg(pbf),Fmoc-Gly,Fmoc-Ile,Fmoc-Ala,Fm oc-Ser(tBu),Fmoc-Arg(pbf),Fmoc-Cys(Trt)及Fmoc-Ala的顺序进行连锁反应。利用脱保护溶液使Fmoc-保护基以10分钟的方式反应2次后，清洗干净并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分别将放入乙酸酐和N，N-二异丙基乙胺、羟基苯并三唑(HoBt，Hydroxybenzot riazole)乙酰化1小时后制备的肽基树脂清洗3次，使氮气慢慢流入来干燥后，在五氧化二磷(Phosphorus pentoxide，P₂O₅)条件下，减压成真空状态，来完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[95％的三氟乙酸(T FA，Trifluroacetic acid)、2.5％的蒸馏水、2.5％的苯甲硫醚(Thioanis ole)]，接着，在常温条件下微动一下，并维持2小时反应。通过过滤对树脂进行过滤，并利用少量的溶液清洗树脂后，与母液进行混合。利用减压蒸馏至剩有总容积的一半左右的容积，并加入50ml的凉的醚诱导沉淀后，进行离心分离来收集沉淀，并利用更凉的醚清洗2次。去除母液，并在氮条件下充分干燥，来合成了0.79g的纯化前NH₂-Ala-Cys-Arg-Ser-Ala-Ile-Gly-Arg-Pro-Cys-COOH肽1(收率：87.7％),0.77g的纯化前NH₂-Ala-Cys-Phe-Thr-Arg-Thr-Ser-His-Ala-Cys-COOH肽2(收率：85.5％),0.76g的纯化前NH₂-Ala-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Gln-Ala-Leu-Cys-COOH肽3(收率：84.4％)。利用分子量测定器进行测定时，序列1的肽的分子量为1033.3(理论值：1033.2)，序列2的分子量为1096.0(理论值：1096.2)，序列3的分子量为1036.9(理论值：1037.1)。

表1

实施例1：抗炎症活性评价

1-1.受体结合试验(肿瘤坏死因子R)

向酶联免疫吸附测定用板添加50μg/25μl的肽和25μl的包被液(20mM磷酸钠pH9.6)并搅拌，且在4℃的温度下培养的一夜。用PBST(300μl)进行3次稀释之后，在室温条件下，用200μl的粘结缓冲液(3％牛血清白蛋白)实施了2小时的粘结。用PBST(300μl)进行3次洗涤之后，向每个孔添加0.5μg/1ml的TGFR型II(R&D Systems)之后，将抗人IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)按1:1000的比例进行稀释并向每个孔添加100μl的上述稀释产物，在室温条件下培养了2小时。用PBST(300μl)进行3次稀释之后，向每个孔添加100μl的TMB溶液(Sigma Aldrich)之后进行了发色。添加50μl的静止溶液(3NH2SO4)来停止反应之后，在O.D450nm中测定了吸光度。

试验结果，确认了对于肿瘤坏死因子R的序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的肽的高结合亲和度(binding affinity)(阳性对比组：肿瘤坏死因子-α)(图1a-图1c)。

1-2.分化试验(Proliferation assay)

将作为老鼠巨噬细胞株的Raw264.7细胞按1x10⁴细胞/孔密度培养在48孔板。稳定24小时之后，在无血清培养基培养6小时，同时对100ng/ml的肿瘤坏死因子-α和50μg/ml的肽进行处理之后培养了72小时。完成培养之后，去除培养上层液，并利用乙醇使细胞固定化，且完成细胞固定之后，用磷酸盐缓冲盐水(磷酸盐缓冲液，phosphate buffer saline)进行了3次洗涤。在去除洗涤溶液之后，用非色磺酰罗丹明B溶液进行处理，对1％乙酸充分进行洗涤之后，用显微镜观察细胞并观察生存细胞的状态，在紫外线560nm的条件下，对通过20mMtris进行脱色的溶液测定吸光度，并测定细胞的生存状态。

试验结果，可确认借助肿瘤坏死因子-α处理增加的RAW264.7细胞增殖借助序列表中序列1的肽处理减少(图2a-图2f)。

1-3.利用人类角质形成细胞的蛋白质印迹法

将作为人类角质形成细胞(keratinocyte)的HaCaT细胞按5x10⁵细胞/孔密度培养在6孔板之后，按浓度对肽进行处理并培养了1小时。使细胞溶解之后，利用抗-p细胞外信号调节激酶抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)和抗p-c-Jun抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)执行了对于作为核因子-ΚB受体活化因子配基-RANK信号的p-细胞外信号调节激酶、p-c-Jun的蛋白质印迹法。

试验结果，借助肿瘤坏死因子-α处理被活性化的NF-KB的核内移动借助序列表中序列1的肽处理而减少(图3a-图3c)。

1-4.对于L-1β及IL-8的酶联免疫吸附测定

将人类单核细胞(monocyte)THP-1细胞按2x10⁶细胞/孔的密度培养在24孔板。在培养一夜之后，以10μg/ml的浓度对样品进行30分钟的预处理，并对50ng/ml的肿瘤坏死因子-α进行处理之后培养了24小时。获得细胞培养基并在4℃的条件下，以13000rpm的速度进行离心分离10分钟之后分离了上等液。利用IL-1b及IL-8酶联免疫吸附测定试剂盒(R&D system)来执行酶联免疫吸附测定。

试验结果，通过酶联免疫吸附测定确认了借助肿瘤坏死因子-α处理增加的IL-1b及IL-8的表达受到序列表中序列1、序列表中序列2及序列表中序列3的肽处理阻碍(图4a-图4c及图5a-图5c)。

实施例2：骨形成能力评价

2-1.受体结合试验(HGFR)

向酶联免疫吸附测定用板添加50μg/25μl的肽和25μl的包被液(20mM磷酸钠pH9.6)并进行搅拌，且在4℃的条件下培养了一夜。用PBST(300μl)进行3次稀释之后，在室温条件下，用200μl的粘结缓冲液(3％牛血清白蛋白)实施了2小时的粘结。用PBST(300μl)进行3次洗涤之后，向每个孔添加0.5μg/1ml的HGFR(R&D Systems)之后，在室温条件下培养了2小时。用PBST(300μl)进行3次洗涤之后，将抗人IgG-HRP按1:1000的比例进行稀释并向每个孔添加100μl的上述稀释产物，在室温条件下培养了2小时。用PBST(300μl)进行3次稀释之后，向每个孔添加100μl的TMB溶液之后进行了发色。添加50μl的静止溶液(3NH2SO4)来停止反应之后，在O.D450nm中测定了吸光度。

试验结果，确认了具有对于HGFR的序列表中序列1及序列表中序列3的肽的高结合亲和度(图6)。

2-2.利用成骨细胞的蛋白质印迹法(磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化)

将茜素红(老鼠成骨细胞株)按2x10⁵细胞/孔的细胞密度培养在6孔板，在无血清培养基中培养了已培养一夜的细胞24小时。以50μg/ml的浓度对肽进行处理15分钟(阳性对比组：50ng/ml的HGF)。对细胞溶解缓冲液进行处理并确保溶解物之后进行蛋白质定量，且利用抗-p磷脂酰肌醇3-激酶抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)执行了对于Phospho-磷脂酰肌醇3-激酶的蛋白质印迹法。

当对呈现出对于HGFR的高的结合亲和度的序列表中序列1及序列表中序列3的肽进行处理时，可确认基于HGFR信号刺激的磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化增加(图7)。

2-3.受体结合试验(BMPR)

向酶联免疫吸附测定用板添加50μg/25μl的肽和25μl的包被液(20mM磷酸钠pH9.6)并进行搅拌，在4℃的温度下培养了一夜。用PBST(300μl)进行3次稀释之后，在室温条件下，用200μl的粘结缓冲液(3％牛血清白蛋白)实施了2小时的粘结。用PBST(300μl)进行3次洗涤之后，向每个孔添加0.5μg/1ml的BMPR-IB(R&D Systems)之后，在室温条件下培养了2小时。用PBST(300μl)进行3次洗涤之后，将抗人IgG-HRP按1:1000的比例进行稀释并向每个孔添加100μl的上述稀释产物，在室温条件下培养了2小时。用PBST(300μl)进行3次稀释之后，向每个孔添加100μl的TMB溶液之后进行了发色。添加50μl的静止溶液(3NH2SO4)来停止反应之后，在O.D450nm中测定了吸光度。

试验结果，确认了对于BMPR的序列表中序列2的肽的高结合亲和度(阳性对比组：BMP4)(图8)。

2-4.利用成骨细胞的蛋白质印迹法(Smad1/5/8磷酸化)

将茜素红(老鼠成骨细胞株)按2x10⁵细胞/孔的细胞密度培养在6孔板。在无血清培养基中培养了已培养一夜的细胞24小时之后，以50μg/ml的浓度对肽进行处理15分钟、30分钟(阳性对比组：50ng/ml的BMP4)。对细胞溶解缓冲液进行处理并确保溶解物之后进行蛋白质定量，且利用抗-p smad1/5/8抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)执行了对于Phospho-smad1/5/8的蛋白质印迹法。

当对呈现出对于BMPR的高的结合亲和度的序列表中序列2的肽进行处理时，可确认基于BMPR信号刺激的Smad1/5/8磷酸化增加。

2-5.碱性磷酸酶染色

将老鼠成骨细胞株茜素红按4x10⁴细胞/孔的密度培养在24孔板之后培养了一夜。以包含50μg/ml抗坏血酸+10mMb磷酸甘油的培养基交替之后以10μg/ml、50μg/ml的浓度对各个肽进行处理并培养14日，以此诱导分化。此时，每隔三日交换培养基以及反复执行肽处理(阳性对比组：BMP230ng/ml)。用磷酸盐缓冲液对完成培养的孔板进行2次洗涤之后，用混合丙酮、37％甲醛、柠檬酸的固定缓冲液进行细胞固定30秒钟。利用白细胞碱性磷酸酶染色试剂盒(SIGMA)进行了以下的染色。

按1:1的比例混合FBB-碱性溶液、亚硝酸钠溶液并进行处理2分钟之后，对由蒸馏水和AS-BI碱性溶液形成的缓冲液进行处理，从而在37℃的条件下，在培养基中发色1小时。

试验结果，当按浓度对序列表中序列1的肽进行处理时，确认了在前驱成骨细胞茜素红中的根据分化促进的碱性磷酸酶表达增加(图10a-图10c)。

2-6.茜素红染色

将茜素红(老鼠成骨细胞)按4x10⁴细胞/孔的密度培养在24孔板。以包含50μg/ml的抗坏血酸、10mMβ-磷酸甘油的α-MEM培养基交替已培养一夜的细胞的培养基之后，按浓度(10、50μg/ml)进行处理，在37℃的温度下，在培养基中培养了14日。此时，每隔三日交换一次培养基以及反复执行肽处理(阳性对比组：30ng/mlrhBMP2(Cell signaling))。完成培养之后，用磷酸盐缓冲液对孔板进行2次洗涤并进行70％EtOH处理1小时来进行固定。之后，对40mM茜素红S(pH 4.2)(Sigma Aldrich)进行处理并进行染色10分钟。对10％西吡氯铵(在10mM的磷酸钠溶解(pH 7.0))进行处理15分钟之后，利用分光光度计(SpectraMax、Molecular Devices)来在560nm中测定了吸光度。

当按浓度对序列表中序列1的肽进行处理时，在前驱-成骨细胞茜素红中通过茜素红染色确认了根据分化促进的矿化增加(图11a-图11c)。

2-7.RT-PCR

将茜素红(老鼠成骨细胞)按1x10⁵细胞/孔的密度培养在6孔板。在培养一夜之后，按浓度(10、50μg/ml)对肽进行处理，并在37℃的温度下，在培养基中培养了3日(阳性对比组：100ng/mlBMP2(Cell signaling))。在回收完成培养的细胞之后，对RNA提取溶液(Easy Blue，Intron)进行处理来准备RNA之后，使用RT预混合成分(Intron)来合成了cDNA。使用对各个标记因子(OPG、ALP、BSP)的引物序列和PCR预混合成分(Intron)来进行了PCR。

用于骨分化标记PCR的靶特异性引物序列如下，骨保护素正向引物序列，5’-CTGCCTGGGAAGAAGATCAG-3’及骨保护素逆向引物，5’-TTGTGAAGCTGTGCAGGAAC-3’(退火温度，60℃)；碱性磷酸酶正向引物序列，5’-CCAGCAGGTTTCTCTCTTGG-3’及碱性磷酸酶逆向引物，5’-CTGGGAGRCRCATCCTGAGC-3’(退火温度，60℃)；骨唾液酸蛋白正向引物序列，5’-AAAGTGAAGGAAAGCGACGA-3’及骨唾液酸蛋白逆向引物，5’-GTTCCTTCTGCACCTGCTTC-3’(退火温度，60℃)。

向每1％琼脂糖凝胶装载5μlPCR产物并进行电容电泳之后，在Gel-Doc中确认了带。

在老鼠成骨细胞株茜素红中对序列表中序列1的肽进行处理并培养3天的结果，均可在阳性对比组BMP2100ng/ml处理组和序列表中序列1的肽处理组中观察到作为骨分化标记的骨保护素(osteoprotegerin)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein)的表达的增加(图12a-图12c)。

实施例3：生发能力评价

3-1.细胞增殖率观察(proliferation assay)

为了观察对于作为毛发主要细胞的真皮乳头细胞(Human Hair Follicle Dermal Papilla Cell)、角质形成细胞(Human Hair Follicle Germinal Matrix Cell)、脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell)的细胞增殖效果，向96孔板按3x10³细胞/孔的密度培养各个细胞之后，在37℃的温度下，在5％CO²条件下培养了24小时。用完全去除血清的相同培养液来交换培养基之后，按浓度(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml)对肽进行处理，并以上述相同条件培养了72小时。去除培养上层液并利用乙醇固定细胞之后，用磷酸盐缓冲液进行了3次洗涤。去除洗涤溶液之后，对发色SRB溶液进行处理并进行染色。用1％的醋酸充分进行洗涤之后，用显微镜观察细胞并观察生存细胞的状态，在紫外线590nm中测定吸光度来测定细胞的生存状态。

当在毛发真皮乳头细胞(Human HFDPC)、毛发角质形成细胞(Human HFGMC)及脐静脉内皮细胞(HUVEC)中按浓度对序列表中序列1及序列表中序列3的肽进行处理并培养72小时之后，以浓度依赖性细胞发生了增殖(图13a-图13b、图14a-图14b及图15a-图15b)。

3-2.细胞信号传递物质的变化观察

在毛发真皮乳头细胞中，观察对于作为参与细胞增殖的主要信号传递物质的细胞外信号调节激酶磷酸化及磷脂酰肌醇3-激酶的表达变化，并在各个细胞中对本发明的肽进行处理30分钟、60分钟之后，用对于上述细胞的特异性抗体执行了蛋白质印迹法，从而观察p细胞外信号调节激酶、磷脂酰肌醇3-激酶变化。利用抗-p细胞外信号调节激酶抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)及抗-p磷脂酰肌醇3-激酶抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)进行了实验。

将人类毛发真皮乳头细胞按1X10⁵细胞/孔的密度培养在6孔板并培养一夜来使细胞稳定化之后，按浓度(1μg/ml、10μg/ml)、按时间(30分钟、60分钟)对肽进行处理。对细胞溶液缓冲液进行处理并确保溶解物之后，对蛋白质进行定量，并执行Phospho-细胞外信号调节激酶、磷脂酰肌醇3-激酶、β-链蛋白的蛋白质印迹法。

在毛发真皮乳头细胞中对序列表中序列1或序列表中序列3的肽进行处理30分钟、60分钟并观察细胞增殖相关信号传递的变化的结果，参与细胞增殖的细胞外信号调节激酶磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶等级和参与毛发形成的β-链蛋白的表达增加(图16)。

3-3.参与毛发生长的蛋白质的变化观察

在毛发真皮乳头细胞中，观察作为参与毛根生长的蛋白质的IGF1、角质细胞生长因子、Wnt3a的表达的变化，在各个细胞中对本发明的肽进行24小时处理之后，通过对于上述细胞的特异性抗体执行蛋白质印迹法，从而观察了毛发生长相关蛋白质的变化。

将人类毛发真皮乳头细胞按1X10⁵细胞/孔的密度培养在6孔板。培养一夜并使细胞稳定化之后，按浓度(0.1-50μg/ml)对肽进行处理24小时。对细胞溶解缓冲液进行处理并确保溶解物之后，对蛋白质进行定量，并执行了对于胰岛素样生长激素-1、角质细胞生长因子、Wnt3a的蛋白质印迹法。

利用抗-胰岛素样生长激素-1抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)、抗-角质细胞生长因子抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)及抗Wnt3a抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)进行了实验。

在毛发真皮乳头细胞中对序列表中序列1或序列表中序列3的肽按浓度进行处理24小时的结果，作为参与毛发生长的蛋白质的胰岛素样生长激素-1、角质细胞生长因子、Wnt3a的表达增加(图17)。

3-4.基于脱发引发激素的相关蛋白质的变化观察

为了观察对于作为诱导脱发的激素的二氢睾酮(Dihydrotestosterone)的肽功效，在毛发真皮乳头细胞按浓度对二氢睾酮5μg/ml及本发明的肽进行处理之后，观察了作为脱发相关蛋白质的DKK-1的表达变化。48小时间对二氢睾酮和肽进行处理之后，用对于DKK-1的特异性抗体执行了蛋白质印迹法并测定了DKK-1的表达。

将人类毛发真皮乳头细胞按1X10⁵细胞/孔的密度培养在6孔板。培养一夜并使细胞稳定化之后，与5μg/ml二氢睾酮(Sigma Aldrich)一同按浓度(1μg/ml、10μg/ml)对肽进行处理48小时。对细胞溶解缓冲液进行处理来确保溶解物之后，对蛋白质进行定量并利用抗DKK-1抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)来执行了对于DKK-1的蛋白质印迹法。

当在毛发真皮乳头细胞对作为脱发诱导激素的二氢睾酮进行处理时，作为脱发蛋白质的DKK-1的表达增加，序列表中序列1或序列表中序列3的肽确认了借助二氢睾酮增加的DKK-1的表达的减少。

3-5.角蛋白表达变化观察

序列表中序列1或序列表中序列3的肽通过角质细胞的分化促进诱导观察是否呈现出毛发生长促进效果并测定了作为细胞分化标记的角蛋白的表达变化。

将人类角质细胞株HaCaT细胞按1X10⁵细胞/孔的密度培养在6孔板并培养一夜之后按浓度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)对肽进行处理，且在37℃的温度下，在培养基中培养了24小时。回收完成培养的细胞之后，对RNA提取溶液(Easy Blue，Intron)进行处理并准备RNA之后，使用RT预混合(Intron)合成了cDNA。使用对于各个标记(Ha3-II、角蛋白14)的引物和PCR预混合(Intron)来执行RT-PCR来测定了这些的表达变化。

用于角质细胞分化标记PCR的靶-特异性引物序列如下：Ha3-II正向引物序列，5’-CAGAAGTATAGCAGTAAGACAG-3’及Ha3-II逆向引物，5’-CAAGAGGAAAGTTTATTAGGC-3’(退火温度，60℃)；Keratin14正向引物序列，5’-GGACGCCCACCTTTCATCTTC-3’及Keratin14逆向引物，5’-ATCTGGCGGTTGGTGGAGG-3’(退火温度，60℃)。

向每1％琼脂糖凝胶装载5μlPCR产物并进行电容电泳之后，在Gel-Doc中确认了带。

在角质细胞中按浓度对序列表中序列1或序列表中序列3的肽进行处理之后，确认对于作为分化标记的Ha3-II和角蛋白的mRNA表达程度的结果，确认了两个肽均呈现角质细胞分化促进功效(图19)。

3-6.老鼠胡子生长速度观察

分离老鼠部部位的毛根之后，以50μg/ml浓度对肽进行处理，并在37℃，在5％CO2条件下培养了8天。在第五日和第八日观察了毛发的长度并确认了肽的功效。

观察基于肽处理的毛发的生长变化的结果，与对比组相比，在第五日、第八日处理组中查到了毛发的快速生长(图20)。

以上，详细记述了本发明的特定部分，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，上述具体技术仅是一实例，本发明的范围并不局限于上述实例。因此，本发明的实际范围根据发明要求保护范围及其的等同技术方案所定义。

序列表

<110> CAREGEN Co,.LTD.

<120> 具有抗炎症、骨形成及生发促进活性的肽及其的用途

<130> PP140062

<150> KR 2014/0057191

<151> 2014-05-13

<160> 13

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1

<400> 1

Ala Cys Arg Ser Ala Ile Gly Arg Pro Cys

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2

<400> 2

Ala Cys Phe Thr Arg Thr Ser His Ala Cys

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3

<400> 3

Ala Cys Asp Gly Arg Thr Gln Ala Leu Cys

1 5 10

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OPG正向引物

<400> 4

ctgcctggga agaagatcag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OPG反向引物

<400> 5

ttgtgaagct gtgcaggaac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALP正向引物

<400> 6

ccagcaggtt tctctcttgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALP反向引物

<400> 7

ctgggagrcr catcctgagc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BSP正向引物

<400> 8

aaagtgaagg aaagcgacga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BSP反向引物

<400> 9

gttccttctg cacctgcttc 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ha3-II正向引物

<400> 10

cagaagtata gcagtaagac ag 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ha3-II反向引物

<400> 11

caagaggaaa gtttattagg c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 角蛋白14正向引物

<400> 12

ggacgcccac ctttcatctt c 21

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 角蛋白14反向引物

<400> 13

atctggcggt tggtggagg 19