拟杆菌属在预防和治疗冠状动脉疾病中的用途的制作方法

相关申请的交叉引用

无

领域

本发明涉及微生物学。具体地，本发明涉及拟杆菌属细菌菌株在制备用于在受试者中治疗和/或预防冠状动脉疾病或用于降低血糖或血脂水平或用于改善冠状动脉粥样硬化病变的制剂中的用途。本发明还涉及包含拟杆菌属细菌的制剂(诸如药物组合物、营养药物性组合物或食物组合物)。本发明还涉及用于在受试者中治疗和/或预防冠状动脉疾病或降低血糖或血脂水平或改善冠状动脉粥样硬化病变的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的拟杆菌属细菌菌株的步骤。

背景

冠状动脉疾病(cad)是指冠状动脉的任何异常状况，其干扰向心(即心脏)肌或其任何部分递送足够的血液供应。通常，cad是由斑块在动脉壁上的累积(即，动脉粥样硬化)引起的，特别是在服务于心脏的大型和中型动脉中。这些病况具有类似的原因、机制和治疗。cad代表全球死亡和发病的主要原因。

目前的知识表明遗传和环境因素及其相互作用协同诱导复杂的表型和许多疾病。冠状动脉疾病(cad)作为最具影响力的复杂疾病之一，近年来已通过gwas(全基因组关联分析)得到越来越多地研究，并且已揭示10.6％的遗传因素由46个常见变异表示(ehret,g.b.等，geneticvariantsinnovelpathwaysinfluencebloodpressureandcardiovasculardiseaserisk.nature478,103-109,通过引用并入本文)。然而，仍然需要更多的关于环境因素的影响如肠道微生物以及基因和微生物对疾病的贡献的知识。

我们的“被遗忘的器官”，肠道微生物群，在许多方面对我们的健康起着至关重要的作用，诸如从食物摄取能量，产生重要的代谢物，促进免疫系统的发展和成熟，以及保护宿主免受病原体感染等。最近的研究表明，菌群生态失调、慢性炎症和代谢异常存在于某些代谢性疾病如糖尿病和肥胖症的肠道中。冠状动脉疾病的特征是炎症、氧化和脂质代谢，这可能与肠道微生物及其代谢物潜在相关。一项近期的研究表明，肠道微生物可将红肉成分(诸如l-肉碱、磷脂酰胆碱、胆固醇)代谢成tma，其将在肝脏中被进一步氧化成tmao，从而在血管中引起氧化反应，进而导致炎症和脂质沉积，最终造成动脉粥样硬化和冠心病。同时，与健康受试者相比，具有症状性动脉粥样硬化的患者的肠道微生物群表现出明显的异常(koeth，r.a.等intestinalmicrobiotametabolismofl-carnitine,anutrientinredmeat,promotesatherosclerosis.naturemedicine19,576-585，通过引用并入本文)。这些研究表明肠道微生物的生态失调可通过诱导人类代谢异常显著影响冠状动脉疾病的发病机制。然而，肠道菌群失调在由动脉粥样硬化诱发的冠状动脉疾病的发病机制中的作用及其对代谢系统的影响仍然令人困惑。

概要

本公开旨在至少在某种程度上解决现有技术中存在的至少一个问题。

本发明至少部分地基于本发明人的以下发现。

肠道微生物群的评估和表征已成为人类疾病(包括冠状动脉疾病(cad))的主要研究领域。为了对cad患者中的肠道微生物含量进行分析，本发明人基于对来自165位个体的肠道微生物dna样品的深度鸟枪法测序，进行了宏基因组关联分析(mgwas)的方案(qin，j.等ametagenome-wideassociationstudyofgutmicrobiotaintype2diabetes.nature490,55-60(2012)，通过引用并入本文)。

本发明人鉴定了2种拟杆菌属益生菌。然后，本发明人分别验证了上述2种拟杆菌属益生菌在动物实验中对cad的影响。动物实验的结果证明了单形拟杆菌(bacteroidesuniformis)和普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)的有效预防和治疗cad的能力。

因此，在一个方面，本发明提供了单形拟杆菌和/或普通拟杆菌在制备用于治疗和/或预防受试者的冠状动脉疾病，或用于降低受试者的血糖或血脂水平，或用于改善受试者的冠状动脉粥样硬化病变的制剂中的用途。

在第二个方面，本发明提供了在用于治疗和/或预防受试者的冠状动脉疾病，或用于降低受试者的血糖或血脂水平或用于改善受试者的冠状动脉粥样硬化病变的制剂，其包含有效量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。

在第三个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者的冠状动脉疾病，或用于降低受试者的血糖或血脂水平或用于改善受试者的冠状动脉粥样硬化病变的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌的步骤。

在第四个方面，本发明提供了单形拟杆菌和/或普通拟杆菌，其用于治疗和/或预防受试者的冠状动脉疾病，或降低受试者的血糖或血脂水平，或改善受试者的冠状动脉粥样硬化病变的方法中。

附图简述

根据结合附图的以下描述，本发明的这些和其它方面及有利方面将变得清楚和更容易理解，其中：

图1：基于126个mlg标志物的随机森林模型中的65个最具判别性的mlg物种。条长度指示变量(mlg物种)的重要性。

图2：在富含胆固醇的hf饮食条件下，拟杆菌属菌株(单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061，普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510或普通拟杆菌mpk)的施用对ogtt曲线的影响。图2a：施用拟杆菌属菌株之前(在第16周)获得的结果；图2b：施用拟杆菌属菌株后(在第24周)获得的结果。在第16周，在所有hf喂养组中血糖水平未观察到显著差异(图2a)。然而，在管饲法处理8周后(在第24周)，与as组相比，单形拟杆菌组和普通拟杆菌组中的血糖(mmol/l)的auc(曲线下面积)显著减少(图2b)。

图3：施用拟杆菌属菌株(单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061、普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510或普通拟杆菌mpk)后，小鼠冠状动脉粥样硬化病变面积的定量结果(n＝8/组)。值显示为平均值±sem。根据方差分析及随后进行的tukey事后检验(p>0.05)，相同字母标记的组之间的值的差异不具有统计学显著性。如图3所示，动脉粥样硬化病变分析表明用不同拟杆菌属菌株施用8周的小鼠之间没有显著差异。相比之下，与as组相比，施用了拟杆菌属菌株的6组的平均冠状动脉粥样硬化病变面积显著减少。

图4：主动脉根部动脉粥样硬化病变的组织学特性(经油红o染色)。a：nc组，b-d：单形拟杆菌组(分别为单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771和单形拟杆菌0061)；e-g普通拟杆菌组(分别为普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510和普通拟杆菌mpk)；h：as组。结果显示，与健康对照组(图4a，nc组)相比，在第24周，经喂食富含胆固醇的hf饮食和安慰剂后的as组中的小鼠，在主动脉根部发展形成富含脂质的动脉粥样硬化病变(图4h，as组)；然而，与as组相比，施用了拟杆菌属菌株8周的小鼠的内膜下区域中的泡沫细胞和脂质沉积显示大幅减少(图4b～4g)。

图5：通过油红o对中性脂质的染色进行的动脉粥样硬化病变组成成分的表征。值显示为平均值±sem。根据方差分析及随后进行的tukey事后检验(p>0.05)，相同字母标记的组的值之间的差异不具有统计学显著性。结果显示，与as组相比，拟杆菌属处理的小鼠中的脂质累积显著降低，这表明拟杆菌属处理促进了病变巨噬细胞中胆固醇的流出，并抑制了动脉粥样硬化的发展。

详述

本文使用的术语具有如本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，如下提供相关术语的定义和解释。

根据本发明，术语“冠状动脉疾病(cad)”也称为动脉粥样硬化性心脏病、动脉粥样硬化性心血管疾病、冠心病或缺血性心脏病(ihd)，并且为最常见的心脏疾病类型和心脏病发作的原因。该疾病是由沿着心脏动脉内壁积聚的斑块所引起的，所述斑块使动脉变窄并减少流向心脏的血流。

根据本发明，术语“预防”(prevent,preventing或prevention)是指预防、抑制或延缓疾病(诸如cad)的发生。

根据本发明，术语“治疗”(treat,treating或treatment)是指治疗或治愈疾病(诸如cad)，延缓疾病(诸如cad)的症状的发作，和/或延缓疾病(诸如cad)的发展。

根据本发明，术语“有效量”是指可以有效实现预期目的的量。例如，预防有效量可以是有效地或足以预防、抑制或延缓疾病(诸如cad)发生的量；治疗有效量可以是有效地或足以治疗或治愈疾病(诸如cad)，延缓疾病(诸如cad)症状的发作和/或延缓疾病(诸如cad)发展的量。这样的有效量可以由本领域技术人员或医生容易地确定，并且可以与预期目的(预防或治疗)、受试者的一般健康状况、年龄、性别、体重、待治疗的疾病的严重程度、并发症、日常施用等相关。这样的有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

术语诸如“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”不仅旨在指单数实体，而且还包括可以使用具体示例来说明的一个种类。除非在权利要求中指出，否则本文中的术语用于描述本发明的具体实施例，但不旨在限定本发明。

在一个方面，本发明提供了单形拟杆菌(bacteroidesuniformis)和/或普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)在制备用于治疗和/或预防受试者的冠状动脉疾病，或用于降低受试者的血糖或血脂水平或用于改善受试者的冠状动脉粥样硬化病变的制剂中的用途。

在优选实施方案中，所述制剂可包含单形拟杆菌的任何菌株或其任意组合。例如，所述制剂可包含单形拟杆菌的一种或多种菌株，诸如至少2、3、4、5种或更多种菌株。在优选实施方案中，单形拟杆菌选自单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061及其任意组合。

在优选实施方案中，所述制剂可以包含普通拟杆菌的任何菌株或其任意组合。例如，所述制剂可以包含普通拟杆菌的一种或多种菌株，例如至少2、3、4、5种或更多种菌株。在优选实施方案中，普通拟杆菌选自普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510、普通拟杆菌mpk及其任意组合。

在优选实施方案中，可以组合使用如上所述的单形拟杆菌和普通拟杆菌。因此，所述制剂可包含单形拟杆菌的一种或多种菌株以及普通拟杆菌的一种或多种菌株。

在优选实施方案中，所述制剂是药物组合物。这样的药物组合物可包含治疗或预防有效量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。在优选实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以为片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂或颗粒剂的形式。

在优选实施方案中，所述制剂是营养药物性组合物或食物组合物。这样的组合物可以为固体、半固体或液体的形式。在优选实施方案中，所述制剂是乳制品，诸如奶、奶粉或酸奶。

在优选实施方案中，所述制剂还包含用于治疗和/或预防冠状动脉疾病，或降低血糖或血脂水平或改善冠状动脉粥样硬化病变的另外的药剂。这种另外的药剂可选自降胆固醇药物、β-阻滞剂、硝酸甘油、钙拮抗剂、他汀类、硝酸甘油、ace抑制剂、钙通道阻滞剂、阿司匹林及其任意组合。

另外，在所述制剂包含单形拟杆菌的情况下，所述另外的药剂可包含普通拟杆菌的任何菌株，诸如普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510、普通拟杆菌mpk或其任意组合。类似地，在所述制剂包含普通拟杆菌的情况下，所述另外的药剂可包括单形拟杆菌的任何菌株，例如单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061或其任意组合。

在优选实施方案中，所述制剂包含单位剂量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌，例如，浓度为至少1x10⁶cfu/g，诸如至少1x10⁷cfu/g、至少1x10⁸cfu/g、至少1x10⁹cfu/g、至少1x10¹⁰cfu/g、至少1x10¹¹cfu/g或至少1x10¹²cfu/g的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。在所述制剂为液体(例如，溶液、混悬剂、乳剂)形式的情况下，其可以包含浓度至少为1x10⁶cfu/ml，诸如至少1x10⁷cfu/ml、至少1x10⁸cfu/ml、至少1x10⁹cfu/ml、至少1x10¹⁰cfu/ml、至少1x10¹¹cfu/ml或至少1x10¹²cfu/ml的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。

在优选实施方案中，可将所述制剂与额外的疗法一起施用。这种额外的疗法可以是已知用于冠状动脉疾病的任何疗法，例如冠状动脉介入术(如血管成形术)，和冠状动脉旁路移植术。

在优选实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如人。

在第二个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者的冠状动脉疾病，或用于降低受试者的血糖或血脂水平或用于改善受试者的冠状动脉粥样硬化病变的制剂，其包含有效量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。

在优选实施方案中，所述制剂可以包含单形拟杆菌的任何菌株或其任意组合。例如，所述制剂可包含单形拟杆菌的一种或多种菌株，例如至少2、3、4、5种或更多种菌株。在优选的实施方案中，单形拟杆菌选自单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061及其任意组合。

在优选实施方案中，所述制剂可包含普通拟杆菌的任何菌株或其任意组合。例如，所述制剂可包含普通拟杆菌的一种或多种菌株，例如至少2、3、4、5种或更多种菌株。在优选实施方案中，普通拟杆菌选自普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510、普通拟杆菌mpk及其任意组合。

在优选实施方案中，可组合使用如上所述的单形拟杆菌和普通拟杆菌。因此，所述制剂可包含单形拟杆菌的一种或多种菌株以及普通拟杆菌的一种或多种菌株。

在优选实施方案中，所述制剂是药物组合物。这样的药物组合物可包含治疗或预防有效量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。在优选实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以为片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂或颗粒剂的形式。

在优选实施方案中，所述制剂是营养药物性组合物或食物组合物。这样的组合物可以为固体、半固体或液体的形式。在优选实施方案中，所述制剂是乳制品，例如奶、奶粉或酸奶。

在优选实施方案中，所述制剂还包含用于治疗和/或预防冠状动脉疾病，或降低血糖或血脂水平或改善冠状动脉粥样硬化病变的另外的药剂。这种另外的药剂可选自降胆固醇药物、β-阻滞剂、硝酸甘油、钙拮抗剂、他汀类、硝酸甘油、ace抑制剂、钙通道阻滞剂、阿司匹林及其任意组合。

另外，在所述制剂包含单形拟杆菌的情况下，所述另外的药剂可包含普通拟杆菌的任何菌株，诸如普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510、普通拟杆菌mpk或其任意组合。类似地，在所述制剂包含普通拟杆菌的情况下，所述另外的药剂可包括单形拟杆菌的任何菌株，例如单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061或其任意组合。

在优选实施方案中，所述制剂包含单位剂量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌，例如，浓度为至少1x10⁶cfu/g，诸如至少1x10⁷cfu/g、至少1x10⁸cfu/g、至少1x10⁹cfu/g、至少1x10¹⁰cfu/g、至少1x10¹¹cfu/g或至少1x10¹²cfu/g的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。在所述制剂为液体(例如，溶液、混悬剂、乳剂)形式的情况下，其可以包含浓度至少为1x10⁶cfu/ml，诸如至少1x10⁷cfu/ml、至少1x10⁸cfu/ml、至少1x10⁹cfu/ml、至少1x10¹⁰cfu/ml、至少1x10¹¹cfu/ml或至少1x10¹²cfu/ml的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。

在优选实施方案中，可将所述制剂与额外的疗法一起施用。这种额外的疗法可以是已知用于冠状动脉疾病的任何疗法，诸如冠状动脉介入术(如血管成形术)，和冠状动脉旁路移植术。

在优选实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如人。

在第三个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者的冠状动脉疾病，或用于降低受试者的血糖或血脂水平或用于改善受试者的冠状动脉粥样硬化病变的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌的步骤。

在优选实施方案中，可向受试者施用单形拟杆菌的任何菌株或其任意组合。例如，可向受试者施用单形拟杆菌的一种或多种菌株，例如至少2、3、4、5种或更多种菌株。在优选的实施方案中，单形拟杆菌选自单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061及其任意组合。

在优选实施方案中，可向受试者施用普通拟杆菌的任何菌株或其任意组合。例如，可向受试者施用普通拟杆菌的一种或多种菌株，例如至少2、3、4、5种或更多种菌株。在优选实施方案中，普通拟杆菌选自普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510、普通拟杆菌mpk及其任意组合。

在优选实施方案中，可以组合使用如上所述的单形拟杆菌和普通拟杆菌。因此，可向受试者施用单形拟杆菌的一种或多种菌株以及普通拟杆菌的一种或多种菌株。

在优选实施方案中，可将单形拟杆菌和/或普通拟杆菌作为药物组合物进行配制和施用。这样的药物组合物可包含治疗或预防有效量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。在优选实施方案中，所述药物组合物可以是医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂或颗粒剂的形式。

在优选实施方案中，可将单形拟杆菌和/或普通拟杆菌作为营养药物性组合物或食物组合物来进行配制和施用。这样的组合物可以为固体、半固体或液体的形式。在优选实施方案中，这样的组合物是乳制品，诸如奶、奶粉或酸奶。

在优选实施方案中，所述方法还包括施用用于治疗和/或预防冠状动脉疾病，或降低血糖或血脂水平，或改善冠状动脉粥样硬化病变的另外的药剂。这种另外的药剂可以在施用单形拟杆菌和/或普通拟杆菌之前、同时或之后施用。

在优选实施方案中，这种另外的药剂可选自降胆固醇药物、β-阻滞剂、硝酸甘油、钙拮抗剂、他汀类、硝酸甘油、ace抑制剂、钙通道阻滞剂、阿司匹林及其任意组合。

另外，在向受试者施用单形拟杆菌的情况下，所述另外的药剂可包括普通拟杆菌的任何菌株，诸如普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510，普通拟杆菌mpk或其任意组合。类似地，在向受试者施用普通拟杆菌的情况下，所述另外的药剂可包括单形拟杆菌的任何菌株，诸如单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061或其任意组合。

在优选实施方案中，可以以至少1x10⁵cfu/kg，诸如至少1x10⁶cfu/kg、至少1x10⁷cfu/kg、至少1x10⁸cfu/kg、至少1x10⁹cfu/kg、至少1x10¹⁰cfu/kg、至少1x10¹¹cfu/kg或至少1x10¹²cfu/kg受试者体重的量施用单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。在优选实施方案中，可以以每日3次、每日2次、每日1次、每两日1次或每周1次的方式施用单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。

在优选实施方案中，所述方法还包括施用额外的疗法。这种额外的疗法可以是已知用于冠状动脉疾病的任何疗法，诸如冠状动脉介入术(如血管成形术)，和冠状动脉旁路移植术。

在优选实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如人。

在第四个方面，本发明提供了单形拟杆菌和/或普通拟杆菌，其用于治疗和/或预防受试者的冠状动脉疾病，或降低受试者的血糖或血脂水平，或改善受试者的冠状动脉粥样硬化病变的方法中。

在优选实施方案中，单形拟杆菌的任何菌株或其任意组合可用于该方法。例如，单形拟杆菌的一种或多种菌株，例如至少2、3、4、5种或更多种菌株可用于该方法。在优选实施方案中，单形拟杆菌选自单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061及其任意组合。

在优选实施方案中，普通拟杆菌的任何菌株或其任意组合可用于该方法。例如，普通拟杆菌的一种或多种菌株，诸如至少2、3、4、5种或更多种菌株可用于该方法。在优选实施方案中，普通拟杆菌选自普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510、普通拟杆菌mpk及其任意组合。

在优选实施方案中，可组合使用如上所述的单形拟杆菌和普通拟杆菌。因此，单形拟杆菌的一种或多种菌株以及普通拟杆菌的一种或多种菌株可用于该方法。

在优选实施方案中，单形拟杆菌和/或普通拟杆菌可作为药物组合物被配制和施用。这样的药物组合物可包含治疗或预防有效量的单形拟杆菌和/或普通拟杆菌。在优选实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以为片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂或颗粒剂的形式。

在优选实施方案中，单形拟杆菌和/或普通拟杆菌可作为营养药物性组合物或食物组合物被配制和施用。这样的组合物可以为固体、半固体或液体的形式。在优选实施方案中，这样的组合物是乳制品，诸如奶、奶粉或酸奶。

在优选实施方案中，可将单形拟杆菌和/或普通拟杆菌与用于治疗和/或预防冠状动脉疾病，或降低血糖或血脂水平或改善冠状动脉粥样硬化病变的另外的药剂组合施用。这种另外的药剂可在施用单形拟杆菌和/或普通拟杆菌之前、同时或之后施用。

在优选实施方案中，这种另外的药剂可以选自降胆固醇药物、β-阻滞剂、硝酸甘油、钙拮抗剂、他汀类、硝酸甘油、ace抑制剂、钙通道阻滞剂、阿司匹林及其任意组合。

另外，在向受试者施用单形拟杆菌的情况下，所述另外的药剂可包括普通拟杆菌的任何菌株，诸如普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510、普通拟杆菌mpk或其任意组合。类似地，在向受试者施用普通拟杆菌的情况下，所述另外的药剂可以包括单形拟杆菌的任何菌株，诸如单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061或其任意组合。

在优选实施方案中，单形拟杆菌和/或普通拟杆菌可以以至少1x10⁵cfu/kg，诸如至少1x10⁶cfu/kg、至少1x10⁷cfu/kg、至少1x10⁸cfu/kg、至少1x10⁹cfu/kg、至少1x10¹⁰cfu/kg、至少1x10¹¹cfu/kg或至少1x10¹²cfu/kg受试者体重的量施用。在优选实施方案中，单形拟杆菌和/或普通拟杆菌可以以每日3次、每日2次、每日1次、每两日1次或每周1次的方式施用。

在优选实施方案中，可将单形拟杆菌和/或普通拟杆菌与额外的疗法一起施用。这种额外的疗法可以是已知用于冠状动脉疾病的任何疗法，诸如冠状动脉介入术(如血管成形术)，和冠状动脉旁路移植术。

在优选实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如人。

在以下非限制性实施例中进一步举例说明本发明。除非另有说明，否则份和百分比以重量计，度数为摄氏度。所使用的试剂都是商购可得的。对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例虽然指示本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出。

实施例

实施例1：鉴定与冠状动脉疾病风险相关的生物标志物

1.1：样品收集

2011年广东省人民医院收集了来自165名中国南方受试者的粪便样品，所述受试者包括88名动脉粥样硬化性心血管疾病(acvd)患者和77名对照受试者(训练组，表1)。根据病理特征对acvd患者进行诊断和分类。受试者被要求在医院收集新鲜粪便样品。将收集的样品置于无菌管中并立即储存在-80℃直至进一步分析。

本研究已经获得了完整的伦理批准，并且所有患者都给予了书面知情同意书。该研究由广东省总医院机构审查委员会批准。

表1：acvd患者和对照受试者的基线特征。第四列报告了wilcoxon秩和检验的结果。

注释：对于性别的信息，88位患者中的一位是未知的，77位对照受试者中的两位是未知的。

1.2：dna提取

将粪便样品在冰上解冻，并使用qiagenqiaampdnastoolmini试剂盒(qiagen)按照制造商的说明书提取dna。提取物用无dna酶的rna酶处理以消除rna污染。使用nanodrop分光光度计、qubit荧光计(与quant-ittmdsdnabrassay试剂盒)和凝胶电泳测定dna的量。

1.3：dna文库构建和测序

按照制造商的说明书(illumina)构建dna文库。本发明人使用常规工作流程进行dna成簇、模板杂交、等温扩增、单链化、阻断和变性以及测序引物的杂交。本发明人构建了一种双末端(pe)测序文库，所述文库中每个样品中的插入片段大小为350bp，随后进行高通量测序以获得约3000万个长度为2×100bp的pe读数(reads)。通过从illumina原始读数过滤去除具有不确定'n'碱基、接头污染和人源dna污染的低质量读数以及同时通过修剪读数中的低质量末端碱基来获得高质量的读数。

本发明人在illuminahiseq2000平台上对165个样品(88个患者和77个对照受试者)中的每个样品总共输出了约4.77gb的粪便微生物群测序数据(高质量有效数据)(表2)。

表2：宏基因组数据的概述。第四列报告了wilcoxon秩和检验的结果。

1.4：宏基因组数据的处理和分析

1.4.1：基因目录(genecatalogue)构建

基因目录构建。通过使用与用于构建2型糖尿病基因目录相同的参数(qin，j.等ametagenome-wideassociationstudyofgutmicrobiotaintype2diabetes.nature490,55-60(2012)，通过引用并入本文)，本发明人使用soapdenovov1.06(li,r.等denovoassemblyofhumangenomeswithmassivelyparallelshortreadsequencing.genomeresearch20,265-272,doi:10.1101/gr.097261.109(2009)，通过引用并入本文)和genemarkv2.7(zhu,w.,lomsadze,a.&borodovsky,m.abinitiogeneidentificationinmetagenomicsequences.nucleicacidsresearch38,e132,doi:10.1093/nar/gkq275(2010)，通过引用并入本文)分别对165个样品的高质量读数进行了从头(denovo)组装和基因预测。使用blat对所有预测的基因进行成对比对，并且这样的基因将作为冗余被去除，所述基因超过其长度90％的序列与另一个基因进行比对后具有高于95％的同一性(不允许有缺口)，从而得到包含4,537,046个基因的非冗余基因目录(4.5m基因目录)。

基因的分类学分配(taxonomicassignment)。使用已公开的t2d论文(qin等人，2012，同上)中描述的内部流程进行预测基因的分类学分配。

1.4.2：数据集(dataprofile)的构建

基因谱(geneprofile)。使用上述4,537,046个基因及它们在165个样品中的相对丰度的量来构建用于关联性研究的基因谱(本发明人使用与公开的t2d论文(qin等2012，同上)中所述相同的方法来计算相对基因丰度。

img物种和motu物种谱。使用默认参数分别将总粪便有效读数与来自imgv400的4,653个参考基因组(markowitz，v.m.等，img：theintegratedmicrobialgenomesdatabaseandcomparativeanalysissystem.nucleicacidsresearch40，d115-d122(2012)，通过引用并入本文)以及motu参考的79,268个序列(sunagawa,s.等metagenomicspeciesprofilingusinguniversalphylogeneticmarkergenes.naturemethods10,1196-1199(2013)，通过引用并入本文)进行比对。鉴定出1290个img物种(在至少10个受试者中共享的物种)和560个motu物种。

1.4.3：影响肠道微生物群基因谱的因素分析。本发明人使用置换多元方差分析(permutationalmultivariateanalysisofvariance，permanova)来评估25种不同特征(包括cad状态、hdlc、chol、性别、fbg、高血压、apob、年龄、crea、ldlc、hba1c、apoa、tp、糖尿病、alb、trig、bmi、whr、lpa、hbdh、ckmb、ast、ck、probnp_e_和alt)对4.5m参考基因目录的基因谱的影响。本发明人使用在r软件中的软件包“vegan”中实施的方法进行分析，并且通过10,000次置换获得置换的p值。本发明人还使用r软件中的“p.adjust”以及benjamini-hochberg方法来校正多重检验，以获得每个检验的q值。permanoa鉴定了与肠道微生物相关的两个重要因素(基于基因谱)(q<0.05，表3)。分析表明，cad和hdlc状态是最显著相关的标志物，这说明疾病状态是影响肠道微生物群组成的主要决定因素。性别、年龄和一些cad临床指标如chol、fgb、高血压和apob也是重要因素。

表3：基于基因谱的欧氏距离分析的permanova。该分析用于检验临床参数和acvd状态是否对肠道微生物群具有显著影响(即，q值<0.05)。

1.4.4：acvd相关标志物的鉴定

acvd相关基因的鉴定。为了鉴定宏基因组谱与acvd之间的关联，在2.1m高发生基因(在所有165个样品中存在于少于10个样品中的基因被去除)谱中进行双尾wilcoxon秩和检验。共获得438,750个基因标志物(占2.1m基因的20.48％)，其在患者或对照受试者中富集，p值<0.01，fdr＝2.23％。

估计错误发现率(fdr)。发明人应用先前研究中提出的“q值”方法(storey,j.d.adirectapproachtofalsediscoveryrates.journaloftheroyalstatisticalsociety64,479-498(2002)，通过引用并入本文)代替顺序p值拒绝法(sequentialp-valuerejectionmethod)来估计fdr。

受试者工作特征(roc)分析。本发明人应用roc分析来评估基于宏基因组标志物的acvd分类的性能。然后，发明人使用r软件中的“proc”软件包来绘制roc曲线。

1.4.5：mlg物种的构建和acvd相关的mlg物种标志物的鉴定

基于438,750个acvd相关标志物的基因谱的126个mlg物种。本发明人通过与公开的t2d论文(qin等，2012，同上)中所述的相同方法，使用438,750个基因标记物构建了宏基因组连锁群(mlg)。通过将这些基因与imgv400中的4,653个参考基因组比对来注释所有438,750个基因。如果一个mlg中有超过50％的组成型基因被注释到一个基因组，则该mlg被分配至该基因组，否则其被称为未分类的。共有136个具有超过550个基因的mlg基因组被选择出来。将属于相同物种的mlg基因组分为一组以构建mlg物种。最终，本发明人获得了127个mlg物种。本发明人利用benjamini-hochberg调整法对127种mlg物种进行了wilcoxon秩和检验，其中126个mlg被选为acvd相关mlg，q<0.05。为了估计一个mlg物种的相对丰度，本发明人在去除5％最低和5％最高丰度基因后估计该mlg物种的基因的平均丰度(qin等，2012，同上)。

发明人总共构建了基于438,750个基因的分布和发生率(qin等，2012，同上)的136个宏基因组连锁群(具有>550个基因的mlg)。mlg中包括了94.8％的显著基因(p-值<0.01)。在ncbi数据库中注释了136个mlg(每个mlg具有>550个基因，>50％覆盖率并且q<0.05)，并且将来自同一物种的mlg分为一组，得到126个mlg物种。

mlg物种标志物的鉴定。为了鉴定mlg物种标志物，本发明人使用r软件2.10版中的“randomforest4.5-36”软件包分析了126个acvd相关mlg物种。首先，本发明人基于由“randomforest”方法给出的重要性对所有126种mlg物种进行了排序(liaw,andy&wiener,matthew.classificationandregressionbyrandomforest,rnews(2002)，第2/3卷，p.18，通过引用并入本文)。通过创建排名第一的mlg物种的增量子集来构建mlg标志物集，其从5个mlg物种开始并且至所有126个mlg物种结束。对于每个mlg标志物集，本发明人计算165人的组群中的假预测率。最后，选择具有最低假预测率的mlg标志物集(包括65个mlg物种)作为mlg物种标志物(图1)，其中假阴性(fn)率为6.8％，假阳性(fp)率为3.89％。此外，发明人基于所选择的mlg物种标志物使用来自randomforest模型的oob(袋外数据)疾病预测概率来绘制roc曲线，并使用r软件包“proc”计算出roc曲线下面积为98.17％。

在65个mlg物种中，在对照组中富集的mlg物种单形拟杆菌(q＝4.21e-11)和普通拟杆菌(q＝1.80e-09)，被称为是scfa产生细菌。

1.4.6：acvd相关img物种和motu物种的鉴定。基于img物种和motu物种谱来鉴定img物种和motu物种标志物。本发明人鉴定了acvd相关的img物种和motu物种(q<0.05)(利用benjamini-hochberg调整法的wilcoxon秩和检验)。随后，使用randomforest法(如在mlg物种标志物的选择中一样)选择出img物种标志物和motu物种标志物。

根据wilcoxon秩和检验和随机森林选择，roc为98.52％的65个img物种和roc为96.16％的15个motu物种也清楚地将cad患者与健康受试者区分出来(q<0.05；参见表5和6)。类似于65个mlg物种标志物，在65个img物种标志物和15个motu物种标志物中，本发明人发现单形拟杆菌在对照组中显著富集。

实施例2：在与cad相关的动物实验中的验证

为了验证益生菌单形拟杆菌和普通拟杆菌在预防和治疗cad相关疾病中的能力，本发明人进行了动物实验。

2.1：方法

为研究单形拟杆菌和普通拟杆菌对鼠动脉粥样硬化的主动脉斑块面积的抑制作用，给小鼠喂食高脂肪饮食16周，以建立动脉粥样硬化模型，然后从第16周给予单形拟杆菌和普通拟杆菌，并观察对血糖和ogtt(口服葡萄糖耐量试验)、血脂和动脉粥样硬化斑块面积的影响。

2.1.1：动物和治疗

从中国南方医科大学实验动物中心购买64只雄性无特定病原体(spf)的c57bl/6j小鼠(10周龄)，体重22.5～25.9g。使用于饮食诱导的动脉粥样硬化研究的小鼠随意获得饮用水和食物饮食，持续2周的适应。然后将它们随机分成2部分：一部分(8只小鼠)喂食正常食物饮食(nc组，该饮食中10％的卡路里来自脂肪，且每克饮食含有3.85总kcal，其购自researchdiets,inc.,newbrunswick,nj,usa)作为健康对照。另一部分(56只小鼠)喂食用于诱导动脉粥样硬化的具有2％胆固醇的高脂肪饮食(该饮食中60％的卡路里来自脂肪，且每克饮食含有5.24总kcal，其购自researchdiets,inc.)，16周后，将这56只小鼠随机分成7组(每组8只小鼠)。一组作为动脉粥样硬化对照组(as组)，给予与上述相同的富含胆固醇的hf饮食，并接受200μl哥伦比亚血液培养基(dsmzmedium693)作为安慰剂。其它6组(b1～b6组)也接受富含胆固醇的hf饮食，并通过管饲法给各组内小鼠分别施用200μl含有6种候选益生菌株(即单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061、普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510和普通拟杆菌mpk)之一的细菌混悬液，上述菌株混悬于哥伦比亚血液培养基中，浓度为10⁹-10¹⁰cfu/ml(每周新鲜制备的)。将上述小鼠进一步喂养8周。

单形拟杆菌atcc8492和普通拟杆菌atcc8482购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。

单形拟杆菌cect7771购自西班牙普通微生物保藏中心。

单形拟杆菌0061获自弗吉尼亚理工大学厌氧菌实验室培养物保藏中心(shoemaker,n.b.,&salyers,a.a.(1988).tetracycline-dependentappearanceofplasmidlikeformsinbacteroidesuniformis0061mediatedbyconjugalbacteroidestetracyclineresistanceelements.journalofbacteriology,170(4),1651-1657)。

普通拟杆菌pc510获自csiro预防性健康旗舰研究计划和畜牧业产业部门(páraicocuív等draftgenomesequenceofbacteroidesvulgatuspc510,astrainisolatedfromhumanfeces.journalofbacteriology,2011,193(15):4025-6)。

普通拟杆菌mpk获自蒂宾根大学医学微生物与卫生学研究所(waidmannm等bacteroidesvulgatusprotectsagainstescherichiacoli-inducedcolitisingnotobioticinterleukin-2-deficientmice.gastroenterology.2003jul；125(1):162-77)。

使用厌氧培养技术来纯化和培养所述菌株。用于培养的哥伦比亚血液培养基的组成描述于dsmz(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)medium693中。为了实验目的，将菌株在37℃下厌氧繁殖48小时。

2.1.2：口服葡萄糖耐量试验(ogtt)

禁食8小时后，以2.0g/kg体重的剂量向小鼠口服施用葡萄糖。在葡萄糖施用前和施用后15、30、60和120分钟从尾部取血样，并用血糖计(rochediagnostics,mannheim,germany)测量血糖水平。葡萄糖施用前的血糖水平表示空腹血糖水平。

2.1.3：血液和主动脉的收集

在第24周结束时，禁食12小时之后，从眼眶血管丛收集所有血液，通过在4℃下以5000rpm离心15分钟分离获得血清，并将其储存在-80℃以用于随后的生化试验。所有动物通过颈脱位法处死。使用联合酶促反应和反应终末血浆产物的分光光度检测的试剂盒(nanjingjianchengbio-engineeringinstitute,china)来测量血浆甘油三酯(tg)和血浆总胆固醇(tc)。收集并处理主动脉以用于主动脉根中的斑块面积的横截面分析。

2.1.4：动脉粥样硬化斑块的评估

收集血液后，将肝素注入下腔静脉，在显微镜下从主动脉根取出主动脉，并在多聚甲醛中固定，然后在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中包埋，切成6μm厚的切片。进行光学显微镜检查以评价动脉粥样硬化的变化。扫描载玻片上的组织切片以产生用于ivision软件(biovisiontechnologies,exton,pa,usa)进行定量评估的虚拟载玻片。为了检测中性脂质，将组织切片用油红o染色。在捕获切片的图像之后，我们通过计算机辅助的颜色门控测量在总切片面积上测定红色面积(sigmascanpro5；spssinc.,chicago,il,usa)。

2.2：结果

2.2.1：对血糖和ogtt的影响

在第16周，在所有hf喂养组中在血糖水平上未观察到显著差异(图2a)。然而，在管饲法处理8周后(第24周)，与as组相比，在口服葡萄糖耐量试验中观察到单形拟杆菌组和普通拟杆菌组中的血糖(mmol/l)的auc(曲线下面积)显著降低(图2b)，各组auc数据如表7中所示。

表7：每组的ogtt曲线的auc值。每个值显示为平均值±sem。根据方差分析及随后进行的tukey事后检验，相同字母标记的组的值之间的差异不具有统计学显著性。在各个组之间，标记的相同字母表示被标记的组的值通过tukey检验确定为无显著差异(p>0.05)。

2.2.2：对血清脂质的影响

单形拟杆菌atcc8492、cect7771和0061以及普通拟杆菌atcc8482、pc510和mpk的施用对血清脂质的结果示于表8中。与nc组相比，富含胆固醇的hf饮食并管饲安慰剂的处理显著增加了血浆甘油三酯和血浆总胆固醇。然而，与as组相比，单形拟杆菌和普通拟杆菌管饲组的血清脂质水平显著降低。

表8：拟杆菌属菌株的施用对血浆甘油三酯(tg)和血浆总胆固醇(tc)的影响。每个值显示为平均值±sem。根据方差分析及随后进行的tukey事后检验，相同字母标记的组的值之间的差异不具有统计学显著性。在各个组之间，标记的相同字母表示被标记的组的值通过tukey检验确定为无显著差异(p>0.05)。

2.2.3：利用拟杆菌属菌株治疗小鼠冠状动脉粥样硬化病变的效果

图3显示了在施用拟杆菌属菌株(单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061、普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510或普通拟杆菌mpk)之后小鼠冠状动脉粥样硬化病变面积的定量结果(n＝8/组)。值显示为平均值±sem。根据方差分析及随后进行的tukey事后检验(p>0.05)，相同字母标记的组之间的差异不具有统计学显著性。

如图3所示，动脉粥样硬化病变分析表明施用不同拟杆菌属菌株8周后的小鼠之间无显著差异。相比之下，与as组相比，施用了拟杆菌属菌株的6组的平均冠状动脉粥样硬化病变面积显著减少(图3，表9)。

如主动脉根部纵切面的组织学特征所示，与健康对照组(图4a，nc组)相比，as组中的小鼠在喂食富含胆固醇的hf饮食和安慰剂后，在第24周在主动脉根中形成富含脂质的动脉粥样硬化病变(图4h，as组)。相比之下，与as组相比，施用了拟杆菌属菌株8周的小鼠的内膜下区域中的泡沫细胞和脂质沉积显著减少(图4b～4g)。

脂质累积的差异表明单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061、普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510和普通拟杆菌mpk分别对富含胆固醇的hf饮食诱导的小鼠动脉粥样硬化模型中的动脉粥样硬化发展具有缓解作用。与as组相比，通过油红o染色对动脉粥样硬化病变中的脂质积累的定量检测表明拟杆菌属处理的小鼠中的脂质积累显著减少(图5，表9)。这些结果表明拟杆菌属治疗促进了病变巨噬细胞胆固醇的流出，并抑制了动脉粥样硬化的发展。

表9：所有组中的病变面积(％)和油红o(病变面积％)

总之，本研究的结果证明了单形拟杆菌atcc8492、单形拟杆菌cect7771、单形拟杆菌0061、普通拟杆菌atcc8482、普通拟杆菌pc510和普通拟杆菌mpk用于改善冠状动脉疾病及相关疾病、用于降低血糖或血脂的水平或用于改善冠状动脉粥样硬化病变的能力。

尽管已经详细地显示和描述了说明性的实施方案，但是本领域技术人员应当理解，上述实施方案是说明性的，并且不旨在以任何方式限制本公开，并且可在不背离本公开的精神、原理和范围的情况下对所述实施方案进行改变、替换和修改。