冠状动脉疾病的生物标志物的制作方法

冠状动脉疾病的生物标志物的制作方法
【专利摘要】在多个实施方案中，提供了鉴定哺乳动物具有提高的不利心血管事件风险(例如MI)和/或确定哺乳动物的预后的方法。在某些实施方案中，该方法包括确定与来自哺乳动物的生物样品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平或导致其得到确定，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，抗MAA加合物抗体的提高的水平指示所述哺乳动物患有一种或多种动脉粥样硬化病变和/或存在心肌梗死的提高的风险。
【专利说明】泡状动脉疾病的生物标志物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年3月11日申请的USSN61/451729的优先权和利益，其通过引用被整体并入本文，用于所有目的。
[0003]政府支持申明
[0004][不适用]
[0005]发明背景
[0006]动脉粥样硬化后遗症，诸如外周动脉闭塞性疾病、冠状动脉疾病以及中风性脑发作，仍然是美国、欧洲和大部分亚洲地区的主要死亡原因之一。具体来说，冠状动脉疾病(CAD)是美国的死亡率的首要原因和2.7个美国人中的一个人的死亡的原因。
[0007]动脉粥样硬化的发展被认为是动脉血管壁的慢性进行性炎症，其以生长因子、细胞因子和细胞相互作用的复杂的相互作用为特征。一般来说，LDL和其他的蛋白质成为氧化态、结合并激活内皮细胞，随后移入环绕脉管系统的组织内。巨噬细胞结合到激活的内皮细胞上并渗入该区域内。巨噬细胞和内皮细胞上的清道夫受体(SR)结合并内在化这些材料形成“泡沫细胞”。发生脂质过氧化且更多结合到内皮巨噬细胞上的LDL和蛋白质被氧化。诸如选择蛋白、整合素、ICMA-1、VCAM-1和血小板-内皮-细胞粘附分子_1等的内皮粘附分子的表达，介导内腔中单核细胞和T淋巴细胞的粘附且炎症细胞因子/趋化因子(例如，IL-6、CRP、TNF、IL-1等)得到释放。最后发生大量的细胞凋亡/坏死。斑块变得不稳定且最终帽被破坏。
[0008]重要的是，70%的40岁及更年长的个体患有CAD，然而，其为亚临床的，没有体征。同样，目前还不存在可用的能鉴定这些CAD个体的非侵害性测试。对这些患者进行侵害性测试(例如，心脏导管插入)以确定非阻塞性和亚临床的CAD的存在是禁忌的。包括计算机断层扫描(CT)和磁共振(MR)冠状动脉造影(CTA和MRA)的非侵害性成像在检测这些CAD病灶中是不可靠的。
[0009]发明概述
[0010]在多个实施方案中，提供了鉴定哺乳动物具有不利心血管事件(例如，心肌梗死)的提高的风险和/或确定哺乳动物的预后的方法。在某些实施方案中，方法通常包括确定与来自哺乳动物的生物样品中丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平或使其得到确定，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，抗体的提高的水平指示哺乳动物患有一种或多种动脉粥样硬化病变。在某些实施方案中，方法包括确定与加合物结合的IgG抗体，和/或与加合物结合的IgM抗体，和/或与加合物结合的IgA抗体的存在和/或水平，或使其得到确定。在某些实施方案中，IgG抗体和/或IgM抗体的提高的水平(相比正常健康的哺乳动物中发现的水平)指示哺乳动物具有一个或多个动脉粥样硬化斑块且存在心脏动脉疾病的风险。在多个实施方案中，IgG和/或IgM抗体越高，疾病严重度和/或不利的事件(例如，心肌梗死)的风险越大。在某些实施方案中，相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，IgA抗体提高的水平指示哺乳动物患有稳定型心绞痛。在某些实施方案中，与提高的IgG和/或IgM相关的正常健康的哺乳动物中发现的水平可比拟的IgA抗体的水平指示哺乳动物患有不稳定型心绞痛，且存在明显的心肌梗死风险。在多个实施方案中(例如，高IgG和/或IgM和高IgA)，哺乳动物作为具有提高的不利心血管事件风险的个体和/或作为患有稳定型心绞痛的个体接受治疗。在某些实施方案中(例如，高IgG和/或IgM和低IgA)，哺乳动物作为具有不稳定型心绞痛且存在明显的心肌梗死风险的个体接受处理。在某些实施方案中，哺乳动物被开出补充测试的处方和/或需进行补充测试。在某些实施方案中，补充测试不为与MAA加合物结合的抗体的测量。在某些实施方案中，补充测试包括选自以下的一种或多种测试:心脏组织损伤或高心脏病发作风险的血液检查、心电图、压力测试、冠脉MRI和冠状动脉造影。在某些实施方案中，血液检查包括选自以下的一种或多种测试:肌钙蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌红蛋白。在某些实施方案中，压力测试包括选自以下的一种或多种测试:运动耐量测试、核压力测试和压力超声波心动图。在某些实施方案中，作为对分析数据的响应，哺乳动物被开出治疗的处方和/或需治疗需改变治疗方案。在某些实施方案中，治疗包括改变饮食和/或运动。在某些实施方案中，治疗包括给予一种或多种药物(例如，选自以下的一种或多种药物:他汀类、β_受体阻滞剂、硝酸甘油或其他的硝酸盐、肝素、血管紧张素受体受体阻滞剂(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、钙通道阻滞剂以及雷诺嗪)。在某些实施方案中，治疗为选自以下的治疗:血管成形术、支架植入和冠状动脉搭桥手术。在某些实施方案中，在患者病历中记录了抗MAA加合物IgG抗体或抗MAA-1gM抗体水平和/或基于，至少部分基于水平的诊断。在某些实施方案中，在患者病历中记录了抗MAA加合物IgA抗体水平和/或基于，至少部分基于水平的诊断。在某些实施方案中，患者病历由实验室、医师诊所、医院、健康维护组织、保险公司或私人病历网站维护。在某些实施方案中，在选自以下的医师警示物品上/内记录了至少部分基于抗MAA加合物IgG抗体水平,和/或IgM抗体水平,和/或IgA抗体水平的诊断:卡、穿戴物或射频识别(RFID)标记。在某些实施方案中，在非暂时性的计算机可读媒介上记录了抗体水平和/或基于抗体水平的诊断。在某些实施方案中，方法还包括告知个体抗MAA加合物抗体和/或至少部分基于抗MAA加合物抗体分析的诊断的结果。在某些实施方案中，与MAA加合物结合的抗体作为差别诊断的一部分被检测。在某些实施方案中，哺乳动物为非人的哺乳动物，且生物样品来自非人的哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物为人，且生物样品来自人。在某些实施方案中，生物样品包括选自以下的样品:全血、血液部分、痰/ 口腔液体、尿、组织活检、胸膜液、心包液、脑脊液和腹膜液。在多个实施方案中，在分析中检测抗MAA加合物抗体，在所述分析中，将生物样品分开以从至少一种其他的样品组分中分离包含抗体的部分。在某些实施方案中，哺乳动物为已知患有或怀疑患有动脉粥样硬化和/或已知具有或怀疑具有心血管疾病的一种或多种风险因子的哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物具有选自以下的一种或多种风险因子:心脏病家族风险、高血压、高LDL胆固醇和低HDL胆固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、烟草使用、代谢综合征、结缔组织病症、慢性感染以及炎症性肠病。在某些实施方案中，在分析中检测了与MAA加合物结合的IgG抗体和/或IgM抗体，和/或IgA抗体，在所述分析中，抗体和/或抗体和MAA加合物之间形成的复合物变成标记有可检测标记。在某些实施方案中，在分析中检测了与MAA加合物结合的IgG抗体，和/或IgM抗体，和/或IgA抗体，在所述分析中，抗体通过与另一分析组分形成复合物从未结合状态变成了结合状态。在某些实施方案中，在分析中检测了与MAA加合物结合的IgG抗体，和/或IgM抗体，和/或IgA抗体，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗体变成固定在固相上。在某些实施方案中，使用选自以下的分析测量IgG抗体、IgM抗体，和/或IgA抗体中的一种或多种的水平:SDS/PAGE、等电点聚焦、2维凝胶电泳、血凝分析和免疫分析。在某些实施方案中，使用ELISA分析测量IgG抗体、IgM抗体，和/或IgA抗体中的一种或多种的水平。在某些实施方案中，免疫分析包括:提供固定在固相支持体上的MAA加合物；在这样的条件下将MAA加合物与生物样品接触，其中样品中的抗MAA加合物抗体结合MAA加合物，形成加合物/抗体复合物；及将复合物与特异性结合IgG抗体或IgA抗体，或IgM抗体的检测抗体接触，或将复合物与结合任一抗体的检测试剂接触；及检测和/或定量结合的检测抗体或结合的检测试剂。在某些实施方案中，检测抗体被连接到可检测标记上或被连接到可检测标记上的另一抗体结合；和/或检测试剂被连接到可检测标记上和/或检测试剂被连接到可检测标记上的抗体结合；且检测和/或定量包括检测和/或定量可检测标记。
[0011]在多个实施方案中，提供了监测哺乳动物中动脉粥样硬化和/或冠状动脉疾病的进展的方法。该方法通常包括:确定与来自哺乳动物的生物样品中丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平或使其得到确定；和将抗体的水平与在先前的时间点测得的哺乳动物的水平比较，其中相比先前的测定，与生物样品中的MAA加合物结合的抗体的总水平的增加指示哺乳动物中动脉粥样硬化病变已经恶化；且相比先前的测定，与生物样品中的MAA加合物结合的抗体的总水平的减少指示哺乳动物中动脉粥样硬化病变得到减少。在某些实施方案中，在先前的时间点与确定或导致得到确定的时间之间的时期，哺乳动物接受了动脉粥样硬化，和/或冠状动脉疾病的治疗，且相比先前的测定，与生物样品中的MAA加合物结合的抗体的总水平增加指示治疗具有有限的或没有功效且哺乳动物中斑块已经恶化；且相比先前的测定，与生物样品中的MAA加合物结合的抗体的总水平的减少指示治疗至少具有一些功效且哺乳动物中斑块得到减少。在某些实施方案中，方法包括确定与加合物结合的IgG抗体的存在和/或水平或使其得到确定。在某些实施方案中，方法包括确定与加合物结合的IgM抗体的存在和/或水平或使其得到确定。在某些实施方案中，方法包括确定与加合物结合的IgA抗体的存在和/或水平或使其得到确定。在某些实施方案中，相比先前的测定，与生物样品中的MAA加合物结合的抗体和/或从IgM至IJ IgG抗体的类别转换的总水平的增加指示哺乳动物中动脉粥样硬化病变(斑块)已经恶化；且相比先前的测定，与生物样品中的MAA加合物结合的抗体的总水平和/或从IgG到IgM抗体的类别转换的减少指示哺乳动物中动脉粥样硬化病变(斑块)得到减少。在某些实施方案中，相比先前的测定，IgA抗体的增加指示哺乳动物中动脉粥样硬化病变变得更稳定，和/或治疗至少部分地增加哺乳动物中动脉粥样硬化病变的稳定性。在某些实施方案中，治疗包括选自以下的哺乳动物的一种或多种形式:改变饮食、增加运动、开/给予他汀类处方、开/给予β_受体阻滞剂处方、开/给予钙通道阻滞剂处方。在某些实施方案中，如果测量提供治疗具有有限的或没有功效和/或哺乳动物中病变已经恶化的指示，则对哺乳动物开出补充测试的处方和/或对其进行补充测试。在某些实施方案中，补充测试不为与MAA加合物结合的抗体的测量。在某些实施方案中，补充测试包括选自以下的一种或多种测试:心脏组织损伤或高心脏病发作风险的血液检查、心电图、压力测试、冠脉MRI和冠状动脉造影。在某些实施方案中，血液检查包括选自以下的一种或多种测试:肌钙蛋白1、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌红蛋白。在某些实施方案中，压力测试包括选自以下的一种或多种测试:运动耐量测试、核压力测试和压力超声波心动图。在某些实施方案中，如果测量提供治疗具有有限的或没有功效和/或哺乳动物中病变已经恶化的指示，则给哺乳动物开出需使用新的治疗、不同的治疗或补充治疗的处方和/或使用新的治疗、不同的治疗或补充治疗对其治疗。在某些实施方案中，治疗包括给予药物(例如，选自以下的一种或多种药物:他汀类、β -受体阻滞剂、硝酸甘油或其他的硝酸盐、肝素、ACE抑制剂、血管紧张素受体受体阻滞剂(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、钙通道阻滞剂以及雷诺嗪)。在某些实施方案中，治疗为选自以下的治疗:血管成形术、支架植入和冠状动脉搭桥手术。在某些实施方案中，哺乳动物为非人的哺乳动物，且生物样品来自非人的哺乳动物，或者哺乳动物为人，且生物样品来自人。在某些实施方案中，生物样品包括选自以下的样品:全血、血液部分、血浆、血清、组织液、痰/ 口腔液体、尿、组织活检、胸膜液、心包液、脑脊液和腹膜液。在某些实施方案中，在分析中检测抗MAA加合物抗体，在所述分析中，将生物样品分开以从至少一种其他的样品组分中分离包含抗体的部分。在某些实施方案中，哺乳动物为已知患有或怀疑患有动脉粥样硬化的哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物具有选自以下的一种或多种风险因子:心脏病家族风险、高血压、高LDL胆固醇和低HDL胆固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、烟草使用、代谢综合征、结缔组织病症、慢性感染以及炎症性肠病、
[0012]在多个实施方案中，提供了治疗哺乳动物的方法，其中该方法包括接受与来自哺乳动物的生物样品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平的测量，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，抗体的提高的水平指示哺乳动物患有一种或多种动脉粥样硬化病变；且当抗体显示提高的水平中，需提供或导致与动脉粥样硬化相关的补充测试被提供和/或需提供或导致与动脉粥样硬化相关的补充治疗被提供给哺乳动物。在某些实施方案中，方法包括接受与加合物结合的IgG抗体的存在和/或水平的测量。在某些实施方案中，方法包括接受与加合物结合的IgM抗体的存在和/或水平的测量。在某些实施方案中，方法包括接受与加合物结合的IgA抗体的存在和/或水平的测量。在某些实施方案中，接受测量包括取回和/或查看患者病历中的测量。在某些实施方案中，接受测量包括取回和/或查看来自诊断实验室的报告中的测量。在某些实施方案中，接受测量包括订购分析和接收分析结果。在多个实施方案中，相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，IgA抗体提高的水平(例如至少95%置信水平的统计上显著的提高，优选至少98%的置信水平，更优选至少99%的置信水平，使用任何合适的参数或非参数检验)指示哺乳动物患有稳定型心绞痛，且被进一步测试哺乳动物和/或将其作为患有或存在稳定型心绞痛的风险的个体治疗。在多个实施方案中，相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，IgA抗体的水平指示哺乳动物患有不稳定型心绞痛且存在明显的心肌梗死风险，且被进一步测试哺乳动物和/或将其作为患有或存在不稳定型心绞痛和/或心肌梗死风险的个体治疗。在某些实施方案中，对哺乳动物开出补充测试的处方和/或需进行补充测试。在某些实施方案中，补充测试不为与MAA加合物结合的抗体的测量。在某些实施方案中，补充测试包括选自以下的一种或多种测试:心脏组织损伤或高心脏病发作风险的血液检查、心电图、压力测试、冠脉MRI和冠状动脉造影。在某些实施方案中，血液检查包括选自以下的一种或多种测试:肌钙蛋白1、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌红蛋白。在某些实施方案中，压力测试包括选自以下的一种或多种测试:运动耐量测试、核压力测试和压力超声波心动图。在某些实施方案中，给哺乳动物开出需治疗的处方和/或对其治疗。在某些实施方案中，治疗包括给予药物(例如，选自以下的一种或多种药物:他汀类、β -受体阻滞剂、硝酸甘油或其他的硝酸盐、肝素、ACE抑制剂、钙通道阻滞剂和雷诺嗪)。在某些实施方案中，治疗为选自以下的治疗:血管成形术、支架植入和冠状动脉搭桥手术。在某些实施方案中，哺乳动物为非人的哺乳动物，且生物样品来自非人的哺乳动物，或者哺乳动物为人，且生物样品来自人。在某些实施方案中，生物样品包括选自以下的样品:全血、血液部分、血浆、血清、组织液、痰/ 口腔液体、尿、组织活检、胸膜液、心包液、脑脊液和腹膜液。在某些实施方案中，在分析中检测抗MAA加合物抗体，在所述分析中，将生物样品分开以从至少一种其他的样品组分中分离包含抗体的部分。在某些实施方案中，哺乳动物为已知患有或怀疑患有动脉粥样硬化(和/或已知具有或怀疑具有一种或多种动脉粥样硬化风险因子)的哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物具有选自以下的一种或多种风险因子:心脏病家族风险、高血压、高LDL胆固醇和低HDL胆固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、烟草使用、代谢综合征、结缔组织病症、慢性感染以及炎症性肠病。在某些实施方案中，在分析中确定与MAA加合物结合的IgG抗体和/或IgM抗体，和/或IgA抗体的测量，在所述分析中，抗体和/或抗体和MAA加合物之间形成的复合物变得标记有可检测标记。在某些实施方案中，在分析中确定与MAA加合物结合的IgG抗体，和/或IgM抗体，和/或IgA抗体的测量，在所述分析中，抗体通过与其他的分析组分形成复合物从未结合状态变成了结合状态。在某些实施方案中，在分析中确定与MAA加合物结合的IgG抗体，和/或IgM抗体，和/或IgA抗体的测量，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗体变成被固定在固相上的抗体。在某些实施方案中，使用选自以下的分析测量IgG抗体、IgM抗体，和/或IgA抗体中的一种或多种的水平:SDS/PAGE、等电点聚焦、2维凝胶电泳、血凝分析和免疫分析。在某些实施方案中，使用ELISA分析测量IgG抗体、IgM抗体，和/或IgA抗体。在多个实施方案中，免疫分析包括:提供被固定在固相支持体上的MAA加合物；在这样的条件下将MAA加合物与生物样品接触，其中样品中的抗MAA加合物抗体结合MAA加合物，形成加合物/抗体复合物；和将复合物与特异性结合IgG抗体或IgA抗体，或IgM抗体的检测抗体接触，或将复合物与结合任一抗体的检测试剂接触；和检测和/或定量结合的检测抗体或结合的检测试剂。在某些实施方案中，检测抗体被连接在可检测标记上或被连接在可检测标记上的其他的抗体结合；和/或检测试剂被连接在可检测标记上和/或检测试剂被连接在可检测标记上的抗体结合；且检测和/或定量包括检测和/或定量可检测标记。
[0013]在某些实施方案中，提供了用于评估(和/或冠状动脉疾病)哺乳动物中动脉粥样硬化的存在和/或预后的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含含有MAA蛋白质加合物的包装；和与结合在MAA蛋白质加合物上的IgG抗体特异性结合的第一试剂和/或与结合在MAA蛋白质加合物上的IgM抗体特异性结合的第二试剂。在某些实施方案中，试剂盒还包含与结合在MAA蛋白质加合物上的IgA抗体特异性结合的第三试剂。在某些实施方案中，第一试剂包含与结合在MAA蛋白质加合物上的IgG抗体结合的抗体。在某些实施方案中，第二试剂包含与结合在MAA蛋白质加合物上的IgM抗体结合的抗体。在某些实施方案中，第三试剂包含与结合在MAA蛋白质加合物上的IgA抗体结合的抗体。在某些实施方案中，MAA蛋白质加合物以被固定在固相支持体上的形式提供。在某些实施方案中，固相支持体包括选自以下的材料:塑料、玻璃、石英、凝胶和金属。在某些实施方案中，固相支持体选自以下:颗粒、测试条、微量滴定板、ELISA板和微流通道或室。在某些实施方案中，试剂盒还包含教会使用MAA加合物的抗体的测量来评估不利心脏事件风险，和/或来确定哺乳动物的预后，和/或来评估哺乳动物中动脉粥样硬化的进展，和/或来评估治疗方案的指导材料。在某些实施方案中，将试剂盒用于评估不利心脏事件风险，和/或确定哺乳动物的预后，和/或用来评估哺乳动物中动脉粥样硬化的进展，和/或用来评估治疗方案。
[0014]在多个实施方案中，提供了治疗哺乳动物的方法，其中该方法包括:给予(或导致得到给予)哺乳动物包含特异性结合到连接在可检测标记上或能被可检测标记选择性结合的MAA加合物上的抗体的组合物；和检测位于哺乳动物的脉管系统内的标记的位置，其中该位置指示潜在的不稳定斑块。在某些实施方案中，方法还包括治疗该潜在的不稳定斑块。在某些实施方案中，治疗包括对斑块位于的区域进行血管成形术和/或在斑块位于的区域内插入支架。
[0015]定义
[0016]术语“生物样品”或“测试样品”是指样品为处于健康和/或病理状态的生物组织、细胞或液体的样品，包括待检测的分析物，例如，对MAA蛋白质加合物(例如，抗MAA加合物IgG、IgA、IgM等)起反应的抗体。此类样品包括,但不限于--痰/ 口腔液体、羊水、血液、血液部分或细针活检样品(例如，手术活检、细针活检等)、尿、腹膜液、胸膜液等。尽管样品通常取自受试人(例如，患者)，但可以将该分析用来检测来自任何哺乳动物的样品中的抗MAA加合物抗体，诸如狗、猫、马、山羊、绵羊、牛、猪等。可以在从生物来源获得时直接使用样品或在用来修改样品的特征的预处理后使用。例如，此类预处理可以包括从血液制备血浆、稀释粘性流体等。预处理的方法还可以包括，但不限于:过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、离心、冷冻、冻干、浓缩、失活干扰组分、添加试剂、溶解等。如果关于样品采用此类预处理方法，此类预处理方法通常使得目标分析物(例如，抗MAA加合物抗体)保留在测试样品中，优选以与未处理的测试样品(例如，即，未经过任何此类预处理方法的样品)中的浓度成比例的浓度。此类“处理过的”或“加工过的”样品仍然被认为是关于本文中描述的方法的生物样品。
[0017]术语“血液”包括全血或诸如血清或血浆的血液部分。
[0018]通过“诊断测试”是指进行的有助于疾病和/或病理的诊断或检测的任何种类的
医学检验。
[0019]当关于将在如本文中描述的诊断/预后分析中检测的分析物(例如，抗MAA蛋白质加合物抗体)使用抗体时，指的是内源性的(内在产生的抗体)。抗体通常包含大体上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽。公认的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为K或λ。重链被归类为Y、μ、α、δ或ε ,它们反过来定义免疫球蛋白级别,分别为IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。
[0020]当关于用于检测特定抗原(例如，MAA加合物)的靶向部分使用抗体时，指的是完全的(完整的免疫球蛋白)或许多通过用不同的肽酶消化产生的得到良好表征的片段的任何一个。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区内的二硫键下消化抗体来制造F(ab)’2——Fab的二聚物，其自身为通过二硫键连接到Vh-ChI上的轻链。可以在温和条件下减少？(&13)’2来破坏铰链区内的二硫键连接，从而将(Fab’)2 二聚物转化为Fab’单体。Fab’单体本质上为带有部分绞链区的 Fab (见，Fundamental Immunology, ff.E.Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993)，其为其他的抗体片段的更为详尽的描述)。虽然不同的抗体片段以消化完整抗体的形式定义，但技术人员应当理解可以化学或通过利用重组DNA方法重新合成此类Fab’片段。因此，术语抗体，如本文中所使用，还包括通过修改整个抗体或使用重组DNA方法重新合成制得的抗体片段。抗体还包括单链抗体(作为单个多肽链存在的抗体)，例如，单链Fv抗体(sFv或scFv),在该抗体中可变重链和可变轻链被连接在一起(直接或通过连接肽)来形成连续的多肽。单链Fv抗体通常为共价连接的VH-VL异质二聚体，其可能由包含直接连接或通过肽编码性连接物连接在一起的VH和VL编码序列的核酸表达而来(见，例如，Huston, et al.(1988) Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 85:5879-5883) ?
[0021]“MAA加合物”指的是按先前所述用MAA部分修饰的任何大分子(见，例如，Hill etal.(1998) Atherosclerosis, 141:107-116，美国专利 5939535 等)。“MAA 蛋白质加合物”指的是用MAA部分修饰的蛋白质。
[0022]“抗MAA加合物抗体”或“抗MAA蛋白质加合物抗体”指的是与MAA蛋白质加合物特异性结合(例如，与之反应)的抗体。MAA蛋白质加合物可以为哺乳动物中天然存在的加合物，或经过合成制得的加合物。
[0023]“心血管疾病”为心血管障碍，如本文中所定义，其以临床事件为特征，包括临床症状和临床迹象。临床症状为可指示临床医师病理存在的由患者汇报的那些经历。临床迹象为通过可指示临床医师病理存在的身体或实验室检查发现的那些客观发现。心血管疾病的临床症状包括胸痛、呼吸浅短、虚弱、短时间意识丧失、意识变化、剧痛、阵发性夜间呼吸困难、短暂性脑缺血发作和其他的患者经历的此类现象。心血管疾病的临床迹象包括如EKG异常、改变的外周脉冲、动脉杂音、不正常心声、罗音和喘气声、颈静脉扩张、神经病变的此类发现以及临床医师识别的其他的此类发现。临床症状和临床迹象可以在诸如心肌梗死(MI)或中风(也被称为“脑血管意外”或“CVA”)的心血管疾病中联合在一起，其中患者会汇报某些现象(症状)且临床医 师会识别其他的现象(迹象)，它们都能指示潜在的病理。心血管疾病包括与易碎斑块病症 、闭塞性病症和狭窄的心血管障碍相关的那些疾病。例如，由易碎斑块病症引起的心血管疾病，由于以下定义了那一术语，可以将其称为“易碎斑块疾病”。与易碎斑块疾病相关的临床事件包括那些迹象和症状，其中伴随随后的急性血栓形成或伴随末梢栓塞的易碎斑块的破裂为标志。易碎斑块疾病的实例包括某些中风和心肌梗死。另一个实例，由闭塞性病症引起的心血管疾病可以被称为“闭塞性疾病”。与闭塞性疾病相关的临床事件包括那些迹象和症状，其中动脉的渐进性闭塞可影响到达目标组织的流通的量。渐进性动脉闭塞可以引起渐进性局部缺血，其中如果流通的量不足以维持组织，渐进性局部缺血可能最终发展为组织坏死。闭塞性疾病的迹象和症状包括:跛、静息痛、心绞痛和坏疽，以及指示血管狭窄和减少的末梢灌注的身体和实验室发现。另一个实例，由再狭窄引起的心血管疾病可以被称为支架内狭窄疾病。支架内狭窄疾病包括由作为如同经皮经腔的血管成形术的程序的一部分放置的动脉支架的渐进性堵塞引起的迹象和症状，其中支架的存在试图帮助血管保持其新的扩大的构型。伴随支架内狭窄疾病的临床事件为由经过改造的动脉的再狭窄引起的事件。
[0024]“冠状动脉疾病”(“CAD”)指的是与服务心脏的动脉的堵塞相关的血管病症。堵塞可以通过诸如斑块破裂或栓塞的机制突然发生。堵塞可以渐进式地发生，通过肌内膜增生和斑块形成使动脉变窄。由服务心脏的动脉的堵塞引起的那些临床迹象和症状为冠状动脉疾病或动脉粥样硬化的临床表现。冠状动脉疾病的临床表现包括:心绞痛、局部缺血、心肌梗死、心肌症、充血性心力衰竭、心律失常和动脉瘤形成。应当理解冠脉循环中的易碎斑块疾病与显现为心肌梗死的动脉血栓形成或末梢栓塞相关。应当理解冠脉循环中的闭塞性疾病与心绞痛症状伴随发生的动脉狭窄一通常需用药物干预和用血管成形术治疗的病症相关。
[0025]“风险因子”为鉴定与增加的风险相关的因子。心血管障碍或心血管疾病的风险因子为鉴定与增加的可发展那些病症或恶化那些病症的风险相关的任何因子。风险因子还可能与患有心血管障碍的患者中不利的临床事件或不利的临床结果的增加的风险相关。心血管疾病的风险因子包括，但不限于:吸烟、不利的脂质谱、提升的脂肪或胆固醇、糖尿病、高血压、闻血压状态、提闻的闻半I光氣酸水平以及缺少运动。携带特定的多态等位基因可能为特定心血管障碍的风险因子，且可能与特定病症的增加的风险相关。
[0026]如本文中所使用，术语“治疗”试图包括治愈以及改善疾病的至少一种症状或者与病症相关的至少一种异常情况。治疗心血管障碍可以被给予心血管障碍治疗替换。治疗心血管障碍还可以被修改与心血管障碍相关的风险因子替换。
[0027]如本文中所使用，术语“个体”和“患者”可以可交换地使用，不论个体是否具有或当前正经历任何形式的治疗。如本文中所使用，术语“个体”指的是任何的脊椎动物，包括，但不限于:哺乳动物(例如，奶牛、猪、骆骑、美洲骑、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人的灵长类(例如，猴子，如猕猴、黑猩猩等)以及人)。优选地，个体为人。
[0028]当提及特定标志物(例如，MAA加合物和/或抗MAA加合物抗体)的存在或水平“指示”特定病理或预后时，没有试图暗示该标志物的存在或水平为那一病理或预后的决定性因素。事实上该指示试图在其他的背景下使用(例如，在差别诊断的背景下)，来告知被进一步测试和/或评估，和/或生活方式/行为变化，和/或来告知需进一步治疗或改变治疗方案。
[0029]短语“接受测量”(例如，与丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平的)表明接受此类测量的人获得了由另一来源提供的测量，例如，通过查阅病历，由来自测试实验室的报告提供、由患者/患者史提供等。在某些实施方案中，将测量接收为由接受者(例如，内科医师)订购的测试的结果。在某些实施方案中，测量可以由接受者进行。
[0030]短语“导致被给予”是指通常由医学专业人员(例如，内科医师)或控制个体的医疗护理的人采取的行动，这些行动控制和/或允许将处于争议中的药剂给予到个体。导致被给予可以包括合适的治疗或预防方案的诊断和/或测定，和/或为个体开具体药剂的处方。此类开处方可以包括，例如，起草药方形式、注解病历等。
[0031]当关于参数(例如，抗体水平)使用术语“提高的”是指该参数落入这样的范围内，使得本领域普通技术人员认为关于参考值其为提高的。在某些实施方案中，参考值可以为在先前的时间点测得的个体的值。在某些实施方案中，参考值可以为已知的或确定的具体群体或亚群体(例如，以选自以下的一种或多种因子为特征的亚群体:性别、年龄、种族、体重、健康状况等)的值。在某些实施方案中，如果其落入具体参考群体的值的最高的25个百分位数，或最高的10个百分位数，或最高的5个百分位数，或最高的2个百分位数，或最高的I个百分位数内，参数被认为是提高的。在某些实施方案中，当在> 95%置信水平，优选在> 98%置信水平，更优选在> 99%置信水平使用任何合适的参数检验(例如，ANOVA, t检验等)或非参数检验，测得水平为统计学上显著的提高时，参数被认为是提高的。
[0032]附图的简要说明
[0033]图1阐述了形成丙二醛/乙醛加合物(MAA)的机制。
[0034]图2阐述了形成丙二醛/乙醛加合物(MAA)的第二种机制。
[0035]图3阐述了抗MAA抗体的一种分析形式的示意图。
[0036]图4阐述了相比患有已知的冠状动脉疾病(CAD)的个体，正常对照中MAA的血清浓度。
[0037]图5阐述了由患有急性MI的患者中循环性MAA抗体的MAA白蛋白抑制的百分比。这提供了分析特异性的测量。
[0038]图6阐述了该事件发生时和时间发生后24小时的患有急性心肌梗死的患者中MAA的抗体的血清浓度。
[0039]图7阐述了来自冠状动脉旁路移植(CABG)患者的主动脉钻取活组织检查中的MAA的存在。
[0040]图8显示了易损斑块的示意图。
[0041 ] 图9阐述了 JCR大鼠中抗经MAA修饰的大鼠白蛋白的血清抗体的浓度。数据以6个动物实验的均值土SEM表示。*P ( 0.004，相比Sprague对照血清的显著增加。#P ( 0.001，将主动脉与主动脉MAA包被抗原比较的显著不同。
[0042]图10阐述了来自JCR大鼠的主动脉组织的经MAA修饰的蛋白质的免疫沉淀反应。数据表示染色88带的88-kDa的强度，表示为3个动物实验的均值土SEM，*P=0.005，与Sprague对照大鼠显著不同。
[0043]图11显示了相比患有已知的冠状动脉疾病(CAD)的个体，正常对照中MAA的IgG抗体的血清浓度。
[0044]图12显示了相比患有已知的冠状动脉疾病(CAD)的个体，正常对照中MAA的IgM抗体的血清浓度。
[0045]图13显示了相比患有已知的冠状动脉疾病(CAD)的个体，正常对照中MAA的IgA抗体的血清浓度。
[0046]发明的详细描述
[0047]本文中证明了经修饰的蛋白质(具体来说，丙二醛/乙醛加合物(MAA加合物))与冠状动脉疾病(CAD)相关，且更普遍地相信其与动脉粥样硬化的进展相关。不受具体理论的束缚，据信MAA加合物通过至少两种机制在氧化压力下形成。在图1中以示意图模式阐述的一种机制中，丙二醛(MDA)处于高浓度。一些丙二醛降解形成乙醛(AA)。两个分子结合到可能可接近的蛋白质基质(例如，LDL)上的氨基上，且一个分子的乙醛“粘紧”形成的产物。在图2中以示意图模式阐述的第二种机制中，一个分子的MDA结合到蛋白质基质(在图中阐述为N-乙酰赖氨酸)的氨基上，形成Na-乙酰-N1-(2-丙烯醛)赖氨酸(a)。(a)中的两分子的产物通过分子(b)的经MDA修饰的末端结合，形成Na-乙酰-N1-赖胺酰-3，5- 二甲酰-2，6-二氢吡啶-4-基-吡啶衍生物。缩合反应发生，导致MAA加合物(c)形成，在这种情形下，为Na-乙酰-N1-赖氨酰-4-甲基-2，6- 二氢吡啶_3，5- 二甲醛衍生物。
[0048]被氧化的蛋白质涉及动脉粥样硬化的发展的进展。丙二醛/乙醛(MAA)修饰的LDL为高度氧化的，且在用丙二醛修饰蛋白质后形成了优势表位。[0049]MAA修饰的蛋白质还可与内皮细胞和巨噬细胞上的清道夫受体结合，并提升前炎症细胞因子的释放，从而看起来涉及动脉粥样硬化，且具体来说，斑块形成的进展。
[0050]重要的是，MAA修饰看起来可引起与抗体制造的免疫反应，其中的抗体制造，如本文中所描述，还与疾病(例如，动脉粥样硬化，更具体来说，心脏动脉疾病)的进展和恶化相关。MAA修饰和/或抗体制造通过其使疾病恶化的机制还未完全理解。然而，经MAA修饰的蛋白质的抗体的存在不仅详细说明了 CAD的存在，还详细说明了 CAD进展的性质。
[0051]具体来说，抗MAA加合物抗体滴定提供了心脏动脉疾病的严重性/风险的测量是一个令人吃惊的发现，其中抗MAA加合物抗体的增加的水平指示斑块负荷和/或斑块严重性的增加的水平。
[0052]不受具体理论束缚，据信在动脉粥样硬化和心脏动脉疾病的进展中，建立了炎症位点，其中被氧化的蛋白质和LDL结合、内在化和起始前炎症反应。一些oxLDL和经MAA修饰的蛋白质被从该位点释放，并迁移到免疫系统来以负荷依赖性方法启动免疫反应。起始了与动脉粥样硬化斑块的发展以及其进展相关的抗体。MAA的抗体越多，斑块不稳定的几率越大。随着oxLDL和加合的蛋白质积聚，更多的炎症细胞渗入且斑块增长，引起心绞痛。最终，炎症变得具有压倒性，造成纤维斑块帽变薄(由于细胞因子和免疫反应)，且由于漏膜和对泄露的经修饰的大分子的响应，抗体浓度增加。最终斑块破裂导致大量的oxLDL和与循环性抗体结合的经MAA修饰的蛋白质的释放，引起减少的抗体浓度。
[0053]抗MAA加合物抗体同种型可提供另外的诊断/预后信息为另一令人吃惊的发现。具体来说，抗体的同种型模式可区分动脉粥样硬化病变性质并允许鉴定以下的患者:1)预期具有急性心肌梗死或心脏病发作(高IgG、低IgA)，和2)以稳定型进展而不会心脏病发作(低 IgG、高 IgA) ο
[0054]不受具体理论束缚，据信在被氧化的蛋白质和LDL结合、内在化和起始如上所述的前炎症反应的位点建立炎症。一些oxLDL和经MAA修饰的蛋白质被从该位点释放，并迁移到免疫系统来以负荷依赖性方法启动免疫反应，引起IgM抗体的产生。随着oxLDL和加合的蛋白质积聚，更多的炎症细胞渗入且斑块增长，造成心绞痛。最终，炎症变得具有压倒性，IgM抗体被类别转换为更具治病性的IgG抗体，其有助于纤维斑块帽的变薄(由于细胞因子和免疫反应)，且由于漏膜和对泄露的经修饰的大分子的增加的水平做出的响应，抗体浓度增加。最终斑块破裂造成大量的oxLDL和经MAA修饰的蛋白质的释放和急性心肌梗死。
[0055]作为选择，在患有稳定性CAD的患者体内，oxLDL和加合的蛋白质在帽的外膜边上(不在脉管系统的内腔内)积聚，且炎症反应得到减少。释放的细胞因子引起IgA响应，其具有更少的致病性，且纤维斑块帽保持完整，引起稳定性CAD。
[0056]因此，个体中抗MAA加合物抗体的抗体同种型的分析提供了病理的严重性/预后的指示。
[0057]另外，因为动脉粥样硬化代表了病理的渐进性连续统，据信抗MAA加合物抗体更普遍地可提供动脉粥样硬化过程和心血管疾病的严重性/进展的指示。
[0058]预测CAD的存在和进展的性质(例如，稳定对不稳定)的能力允许在疾病的典型临床表现(例如，心肌梗死)前鉴定患者。这一洞察允许鉴定需要用药物诸如胆固醇降低药物(例如他汀类)、非侵害性心脏压力检查(例如，核研究、压力超声波心动图、CTA、MRA)和/或侵害性心脏检查(例如，心脏导管插入)治疗的患者。使用该工具，在疾病过程的更早的时间点确定存在CAD的发展和/或进展风险的患者是可能的。掌握该知识，可以将患者挑选用于治疗，其中的治疗对阻止进展具有恰当的侵害性，并阻止或延迟心脏病发作和冠心病的相关的发病和死亡。总之，更恰当改善的医学检验和治疗策略有望不仅能允许恰当的更早的治疗，还可减少其他的非侵害性和侵害性测试的利用和过度利用。
[0059]诊断/预后分析
[0060]因此，在某些实施方案中，提供了使用抗MAA加合物抗体的检测/定量的分析，用于鉴定哺乳动物具有提高的不利心血管事件风险和/或确定哺乳动物的预后。该方法通常包括确定与来自所述哺乳动物的生物样品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平或使其得到确定，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，抗MAA加合物的抗体提高的水平指示哺乳动物具有一个或多个动脉粥样硬化斑块。在某些实施方案中，测定了抗MAA加合物抗体的总水平，且较高的抗体水平指示较大的斑块负荷和/或相关的心绞痛和/或较大的不稳定斑块的风险，因此以及不利心血管事件(例如，心肌梗死、心脏局部缺血等)的风险。
[0061]在某些实施方案中，鉴定了不同的抗MAA加合物抗体同种型的水平。在此类情况下，增加的总抗体滴定量指示较大的疾病严重性，如以上所解释。然而，从IgM到IgG的抗体类别转换(例如，如由IgG对IgM抗体的增加所证明)指示不稳定斑块的增加的风险。然而，高IgG和低IgA指示个体预期患有急性心肌梗死或心脏病发作，而低IgG和高IgA指示斑块形成可能以稳定型取得进展，而不会心脏病发作。
[0062]还可以将这些方法用来监测个体中疾病进展和/或用来评估治疗方案。此类方法可以包括:确定与来自哺乳动物的生物样品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平或使其得到确定；和将抗MAA加合物抗体的水平与在先前的时间点测得的所述哺乳动物的水平比较，其中相比先前的测定，与生物样品中的MAA加合物结合的抗体的总水平的增加指示所述哺乳动物中动脉粥样硬化斑块已经恶化；且相比先前的测定，与所述生物样品中的所述MAA加合物结合的抗体的总水平的减少指示哺乳动物中动脉粥样硬化斑块得到减少。如本文中所述，减少的抗体水平可以指示急性心血管事件(例如，斑块破裂)，其可以引起经修饰的蛋白质的释放，从而以及抗体水平的减少。当与指示组织损害的其他的生物标志物(例如，提闻的肌I丐蛋白1、CPK、LDL或AST)有关系时，可以通过考虑差别诊断中的其他的因子区别结果。
[0063]再次地，在某些实施方案中，鉴定了不同抗MAA加合物抗体同种型的水平。在此类情况下，从IgM到IgG的抗体类别转换(例如，如由IgG对IgM抗体的增加所证明)指示增加的风险，而IgG对IgM的减少可以指示个体在改善。类似地，IgG的增加和/或IgA的减少可以指示个体的风险在增加，而IgG的减少和/或IgA的增加可以指示个体以更稳定的方式在取得进展。
[0064]在抗MAA加合物抗体的第一和第二测量之间治疗个体时，如上所述的抗体水平的变化提供了治疗功效的测量。如果治疗显示具有很少功效的效果，则可以实施不同的治疗方案(例如，更为积极的治疗方案)。
[0065]在某些实施方案中，可以将本文中描述的诊断/预后方法整合到治疗方法中。例如，在某些实施方案中，该方法可以包括接受与来自哺乳动物的生物样品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平的测量，其中相比常健康的哺乳动物中发现的水平，抗体的提高的水平指示哺乳动物具有一个或多个动脉粥样硬化斑块；且当抗体显示提高的水平时，需提供或导致与动脉粥样硬化相关的补充测试被提供和/或需提供或导致与动脉粥样硬化相关的补充治疗被提供给哺乳动物。
[0066]再次地，在某些实施方案中，鉴定了不同抗MAA加合物抗体同种型的水平。在此类情况下，从IgM到IgG的抗体类别转换(例如，如由IgG对IgM抗体的增加所证明)指示增加的风险，且可能需要补充测试和/或更积极的治疗方案，而IgG对IgM的减少可以指示个体在改善，且可保证更少积极性的治疗方案或应当维持已存在的治疗方案。类似地，IgG的增加和/或IgA的减少可是指示个体的风险在增加，需保证更多的测试和/或更具积极性的治疗，而IgG的减少和/或IgA的增加可以指示个体在以更稳定的方式取得进展，且可能可以简单地维持已存在的治疗方案或可以减少治疗。
[0067]如上面所指出，本文中描述的不同分析的阳性结果可以提供潜在的病理(例如，动脉粥样硬化/心血管疾病)的存在、严重性或增加的严重性的指示。在某些实施方案中，阳性结果的存在可以指示/保证进一步的测试。补充测试可以包括，但不限于选自以下的一种或多种测试:HDL/LDL比、总胆固醇、甘油三酯水平、脂蛋白相关的磷脂酶A2 (LpPLA2)、同型半胱氨酸、C-反应性蛋白质(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白(HDL)、TNF a、HSP60、肌钙蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌红蛋白、压力测试(例如，运动耐量测试、核压力测试、压力超声波心动图等)、影像学研究(例如，心脏NMR、血管造影等)等。
[0068]如上面所指出，本文中描述的不同分析的阳性结果可以提供潜在的病理(例如，动脉粥样硬化/心血管疾病)的存在、严重性或增加的严重性的指示。在某些实施方案中，阳性结果的存在可以进一步指示/保证治疗方案的改变、实施或增加。在某些实施方案中，治疗方案可以包括:行为矫正(例如，改变饮食和运动)、给予一种或多种药物(例如，选自以下的一种或多种药剂:他汀类、β -受体阻滞剂、硝酸甘油或其他的硝酸盐、肝素、ACE抑制剂、钙通道阻滞剂、雷诺嗪等)，和/或一种或多种程序(例如，血管成形术、支架植入、冠状动脉搭桥手术、血管移植等)。
[0069]所上面所指出，在多个实施方案中，测量对MAA蛋白质加合物起反应的抗体(例如，抗MAA加合物IgG、IgM、IgA等)，来提供个体中斑块形成的存在和/或严重性和/或此类斑块的预后的指示。在某些实施方案中，参照正常健康的个体内发现的可比较的抗体水平评估了抗体水平。在某些实施方案中，参照在先前的时间点测得的个体中抗体水平评估了抗体水平。
[0070]在任何给定的群体中，具有对MAA加合物的反应性的抗体的水平可能存在差异。在某些实施方案中，可以通过参考较广的群体中观察的范围，将测得的任何给定个体的具有对MAA加合物偶联物的反应性的抗体的水平归类为高或低。例如，可以将参照较广种群测得的此类抗体的低于特定百分位值的水平归类为低水平。在某些实施方案中，低水平可能对应于低于第25百分位数，或低于第20、第10或第5百分位数的值。在某些实施方案中，高水平可能对应于，例如超过第5、第10、第20或第25百分位数的值。
[0071]显然，本发明提供的诊断和预后方法需要一定程度的定量来确定诊断性抗MAA加合物抗体的量或病理的预后。在某些实施方案中，可以通过包含恰当的参考样品在本文描述的分析中确定此类定量，其中所述参考样品为合成样品(例如，通过提供溶于缓冲液中的已知量的抗MAA加合物抗体)，和/或来源于健康的或正常的个体。[0072]在一个实施方案中，参考样品包括来源于个体没有经历或显现任何临床症状和/或风险因子时的相同个体的生物样品(例如血浆、血清、全血、痰、唾液等)。在另一实施方案中，参考样品包括来源于正常健康的个体的生物样品。
[0073]因此，对参考样品和测试(例如，患者)样品处理、分析或化验，并比较获得的参考样品和测试样品的数据。在一个实施方案中，在同一时间对参考样品和测试样品加工、分析或化验。在另一实施方案中，在不同时间参考样品和测试样品加工、分析或化验。
[0074]作为选择，或此外，将测试样品的数据与参考样品的来源于先前产生的已确定的数据集的数据比较。因此，在一个实施方案中，参考样品包括先前使用标准分析方案确定的值或范围(例如，确定的群体或特定亚群体(例如，根据种族、性别、年龄等挑选的)的)。随后将来源于加工、分析或化验测试样品的数据与获得的样品群体的数据比较。
[0075]来源于足够多的参考样品以便能代表群体(或亚群体)的数据允许产生可测定特定参数的平均水平的数据集。因此，可以测定个体的任何群体和来源于所述个体的任何样品的斑块存在、稳定斑块的形成、不稳定斑块的形成等的抗MAA抗体诊断或预后的量，用于随后的与测定的被分析样品的表达产物的水平的比较。
[0076]应当认识到本文中描述的分析的阳性或阴性结果不是病理状态(例如，不稳定斑块)的特定存在或不存在的决定因素，而通常被用于其他诊断标准的环境中来帮助缺血性心血管疾病的发展或进展的增加的风险的诊断或预后。此类其他的诊断标准包括，例如，但不限于:个体病史、疾病家族风险、生活方式、体重/肥胖/BM1、其他分析的结果，如血压，HDL/LDL比、总胆固醇、甘油三酯水平、脂蛋白相关的磷脂酶A2(LpPLA2)、同型半胱氨酸、C反应性蛋白质(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白(HDL)、TNFa、HSP60、压力测试、影像学研究等。临床医师还可以考虑其他的因素以达到诊断或预后。在某些实施方案中，本文中描述的分析的阳性结果可以指导处方医师制定其他的测试或程序。
[0077]如果个体被认为具有发展缺血性心血管疾病(例如，心肌梗死)的增加的风险，则可以推荐采取预防性治疗和/或生活方式改变。如果个体被诊断为患有渐进性缺血性心血管疾病，他或她的临床医师可以建议采取适合该个体的治疗和/或生活方式改变。
[0078]生物样品中的抗MAA加合物抗体的检测/定暈。
[0079]如上所述，个体(例如，人或非人的哺乳动物)中抗MAA抗体的水平可提供量/严重性和/或个体中斑块形成和/或此类斑块的预后的指示。不同类型的抗体的水平可提供不利心血管事件(例如，心肌梗死、心肌局部缺血等)的风险的指示。因此，例如，高抗MAA加合物IgG和低抗MAA加合物IgA指示个体预期具有急性心肌梗死或心脏病发作，而高抗MAA加合物IgA、低IgG指示个体其体内的斑块形成更可能以稳定型进展而不会有心脏病发作。
[0080]可以以多种形式中的任何一种进行检测来自个体的样品中抗MAA加合物抗体的分析方法。在某些实施方案中，可以使用免疫分析评估个体的抗体水平，例如，对MAA加合物具有反应性的IgM、IgG或IgA抗体。免疫分析形式优选为,例如,选自以下的:免疫印迹、免疫印迹、斑点杂交、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析。利用荧光共振能量转移(FRET)、生物传感技术、衰减光导纤维技术、蛋白质芯片工艺等的改进的免疫分析也是有用的。优选地，分析为半定量分析或定量分析。
[0081]合适的免疫分析的实例被描述如下，且考虑到本文中提供的教义，其对本领域技术人员显而易见。关于免疫分析的一般性综述，见Cell Biology Volume37:Antibodiesin Cell Biology, Asai, ed.Academic Press, Inc.New York(1993) ；Basic and ClinicalImmunology7th Edition, Stites&Terr, eds.(1991)中的方法，其通过完整引用被并入。
[0082]在多个实施方案中，分析可以包括分析对MAA蛋白质偶联物具有反应性的所有抗体，或仅仅分析特定同种型的抗体，如IgM、IgG或IgA，或分析两种或更多种抗体同种型的组合物。在某些实施方案中，至少测定了 IgG和/或IgM的水平。
[0083]免疫分析可以为竞争性的或非竞争性的。在典型的竞争性免疫分析中，样品中的抗体与有标记的抗体竞争来与MAA蛋白质加合物结合。随后测量结合在MAA蛋白质偶联物上的有标记的抗体的量。样品中的内源性抗MAA加合物抗体的浓度和检测到的有标记的抗体的量之间存在相反关系。
[0084]在非竞争性免疫分析中，将样品中的抗体结合在PAF偶联物上，随后将有标记的检测试剂，通常为抗免疫球蛋白抗体，结合在抗体上。随后测量结合在抗体上的有标记的检测试剂的量。与竞争型方法不同，非竞争性方法的结果直接与抗体的浓度成比例。
[0085]在非竞争性免疫分析或免疫印迹中，将有标记的检测试剂，通常为抗免疫球蛋白抗体，用来检测结合在MAA蛋白质加合物上的抗体(例如，抗MAA加合物抗体)。选择了物种的特异性结合到免疫球蛋白上的合适的抗免疫球蛋白抗体，其中样品从该物种中获得。在某些实施方案中，其可以结合到那一物种的所有的免疫球蛋白同种型上，或仅仅结合到同种型的一个亚集上。例如，其可以仅结合到IgA、IgD、IgE、IgG或IgM上，或这些同种型的两种或更多种的组合上。在某些实施方案中，抗免疫球蛋白抗体可以仅特异性结合到任何给定的同种型的某些亚型上。人IgA的亚型包括IgAl和IgA2。在某些实施方案中，抗免疫球蛋白抗体可以结合到这些亚型的一种或两种上。人IgG的亚型包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方案中，抗免疫球蛋白可以结合到这些人IgG亚型的一种或多种上。应当理解不同的脊椎动物物种存在不同的同种型和亚型。
[0086]在放射免疫分析中，用诸如131I或125I的放射性同位素标记了抗体或检测试剂。在酶免疫分析中，用酶标记了抗体或检测试剂。在某些实施方案中，使用显色底物能检测出合适的酶。显色底物为这样的物质，由于与酶的反应，其可产生有色产物，从而能用分光光度计检测。广泛采用了来自大肠杆菌(E.coli)的诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β_半乳糖苷酶和焦磷酸酶的酶。还可以使用基于诸如荧光素酶的酶的化学发光系统。其他的标记包括荧光标记，如Alexa系列的荧光团、量子点、电子自旋标记物、磁性标记等。在某些实施方案中，经常使用抗体或检测试剂与生物素的结合，因为这可以通过其与酶或荧光团连接的亲和素或链霉亲和素的反应被容易地检测到，其中其可与亲和素或链霉亲和素以很大的特异性和亲和力结合。作为选择，在某些实施方案中，将抗体/检测试剂与结合检测试剂连接的生物素的链霉亲和素或亲和素结合在一起。
[0087]在一个示例性的和典型的非竞争性酶免疫分析中，放置将要分析的样品(例如，血清)，用吸附在(或化学连接到)固体(或大体上为固体)基质上的MAA蛋白质加合物(例如，MAA/白蛋白加合物)与其接触并对其孵育。因此可能存在于样品中的任何抗MAA加合物抗体被贴附在固体基质上的MAA加合物特异性结合，制造出MAA加合物/抗MAA加合物抗体复合物。随后将样品从固体基质上分离，以便清除为结合的物质，例如，通过洗脱。将能结合以MAA加合物/抗MAA加合物抗体复合物形式存在于基质上的抗MAA加合物抗体的指示剂抗体加入到固定基质上，从而制造出MAA加合物/抗MAA加合物抗体/指示剂抗体复合物。指示剂抗体可以，例如，为在非人的动物物种内培养出的抗人IgG免疫球蛋白(或抗人IgM免疫球蛋白，或抗人IgA免疫球蛋白等)。最后，检测和/或定量了固体基质上MAA加合物/抗MAA加合物抗体/指示剂抗体复合物的存在，其中固体基质上所述复合物的存在指示样品中的抗MAA蛋白质加合物抗体的存在，且所述复合物的量指示样品中的抗MAA蛋白质加合物抗体的量。
[0088]在某些实施方案中，优选获得与MAA加合物结合的抗体的定量评估。在典型的非竞争性分析中，假定测得的变量，不论其为光密度或为一些其他的读出，与抗体浓度间存在线性关系。例如，如果分析中样品A使样品B的光密度加倍(已经从两者中减去了背景)，则假定相比B，A中的抗体浓度加倍。然而，优选构建阳性样品(例如，血清样品)的连续稀释的标准曲线。在某些实施方案中，在与测试样品相同的时间分析此类稀释。通过这样做，可以将在测定样品中的抗体的量中产生的来自线性关系的任何变化都考虑在内。
[0089]在某些实施方案中，固体基质为微量滴定盘，例如，通常用于进行ELISA免疫测定的类型。在某些实施方案中，微量滴定盘优选为聚苯乙烯盘。有用的固相支持体还包括，但不限于:天然聚合性糖类和它们的经合成性修改、交叉连接或替换的衍生物，如琼脂、琼脂糖、交联海藻酸、替换的和交联的瓜尔豆胶、纤维素酯，尤其是硝酸和羧酸的纤维素酯、混合性纤维素酯和纤维素醚；含氮的天然聚合物，如蛋白质和衍生物，包括交联的或修饰的明胶；天然碳水化合物聚合物，如乳胶和橡胶；合成聚合物，如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯和其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、以上缩聚物的共聚物和三元共聚物，如多元酯、聚酰胺和其他的聚合物，如聚氨酯或聚环氧化合物；无机材料，如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙、碱土金属、铝和镁的硅酸盐；以及铝或硅氧化物或水合物，如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(可以将这些材料与上述聚合材料一起用作过滤器)；以及以上类型的混合物或共聚物，如通过在先已存在的天然聚合物上引发合成聚合物的聚合获得的接枝共聚物。可以以合适的形状使用所有的这些材料，如薄膜、薄片、管状、微粒或盘状，或者可以将它们镀在、结合到或层压到合适的惰性载体上，如纸、玻璃、塑料膜、纤维等。
[0090]良好适合直流分析装置的示例性的固相材料包括，但不限于滤纸，如多孔玻璃纤维材料或其他的纤维基质材料。此类材料的厚度不是决定性的且是选择的关键，这很大程度上取决于接受分析的样品或分析物的性质，如生物样品的流动性。
[0091]在某些实施方案中，固相可以构成微粒(或纳米粒子)。本领域技术人员可以从任何合适类型的微粒材料中挑选在本文中描述的方法中有用的合适的微粒，且这些微粒包括，但不限于:由聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯、乳胶、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯或类似的材料组成的微粒。此外,微粒可以为有磁性的或顺磁性的微粒，以便促进磁场内的微粒操作。
[0092]可以将微粒悬浮在可溶试剂和生物样品的混合物中，或者可以通过支架材料对其保存和固定。在后者中，支撑材料上或内的微粒通常或优选不能大幅移动位置到支撑材料内的其他地方。作为选择，可以通过沉淀或离心从可溶试剂和生物样品的混合物中的悬浮物中分离微粒。当微粒为有磁性的或顺磁性的时,可以通过磁场从可溶试剂和生物样品的缓和物中的悬浮物中分离微粒。[0093]可以调整本发明的方法用于可利用包括自动化的和半自动化的系统的微粒技术的体统，其中固相包括微粒。此类系统包括第425651号待定美国申请和第5089424号美国专利以及第5006309号美国专利中描述的系统，其中第425651号待定美国申请和第5089424号美国专利分别对应于已公开的第EP0425633号和第EP0424634号EPO申请。
[0094]因此，例如，应当理解还可以在流体相中进行上述的示例性分析。可以以被连接到与悬浮物中的样品接触的微粒或纳米粒子上的形式提供MAA蛋白质加合物。存在于样品中的抗MAA加合物抗体可与微粒上的MAA蛋白质加合物结合，在微粒表面上形成MAA加合物/抗MAA加合物抗体复合物。随后将该复合物与能结合存在于MAA加合物/抗MAA加合物抗体复合物中的抗MAA加合物抗体的指示剂抗体接触，从而产生连接在微粒上的MAA加合物/抗MAA加合物抗体/指示剂抗体复合物。随后可以使用，例如细胞分选仪或磁性分离系统，分离微粒和检测/定量标记。
[0095]在某些实施方案中，固体基质可以包含一个或多个电极。可以将MAA蛋白质加合物(捕获剂)直接或间接地粘附到电极上。在一个实施方案中，例如，可以将MAA蛋白质加合物粘附到有磁性的或顺磁性的微粒上，随后使用磁铁将微粒放置在电极表面附近。其中一种或多种电极充当固相的系统在检测基于电化学相互作用的情况下是有用的。描述了该类型的示例性系统，例如，在第6887714号美国专利中。以下关于电化学检测进一步描述了基本方法。
[0096]如上面所指出，在多个实施方案中，可以通过多种方法中的任何一种将MAA-蛋白质加合物连接到固相支持体上(例如ELSA孔、微粒、测试条等)。连接可以为简单的吸附、离子键或共价交联(直接地或通过连接物)。在一个示例性的实施方案中，通过在缓冲液中使用固体基质孵育MAA加合物将MAA加合物吸附到固体基质上。合适的缓冲液包括,但不限于碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲盐水。通常，在MAA加合物吸附或共价连接到固体基质上后，用阻滞剂孵育固体基质来减少来自样品的物质到固体基质的非特异性结合。合适的阻滞剂包括，但不限于牛血清白蛋白。
[0097]在某些实施方案中，改变了固体基质的固有电荷来促进MAA加合物的连接，和/或来增加抗体结合，和/或来增加可湿性等。在某些实施方案中，为了改变或增加固体基质的固有电荷，可以将带电的物质直接涂层在基质上。例如，可以采用用于使用带负电荷的聚合物固定可固定反应复合物的离子捕获程序(描述于第0326100号EP专利公开和第0406473号EP公开中)来影响快速溶解相免疫化学反应。在这些程序中，通过带负电的聚阴离子/免疫复合物和先前处理过的、带正电的基质之间的离子相互作用从余下的反应混合物中分离了可固定免疫复合物，并通过使用多种信号生成系统的任何一种，包括，例如，如第0273115号EPO公开中所描述的化学发光系统检测该复合物。
[0098]如果固体基质为硅或玻璃，经常在连接捕获剂(例如，MAA蛋白质加合物)前活化表面。可以将诸如三乙氧基氨基丙基娃烧(可从Sigma Chemical C0., St.Louis, M0.获得)、三乙氧基乙烯基娃烧(Aldrich Chemical C0., Milwaukee, ffis.)和(3_疏基-丙基)-三甲氧基娃烧(Sigma Chemical C0.，St.Louis, M0.)的活化的娃烧化合物分别用来引入诸如氨基、乙烯基和巯基的反应基。可以将此类活化的表面用来直接连接捕获物(在氨基或巯基的情形下)，或者可以将活化的表面进一步与诸如戊二醛、二(琥珀酰亚基)辛二酸盐、SPPD9琥珀酰亚基3-[2-吡啶基二硫]丙酸盐)、SMCC (琥珀酰亚基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸盐)、SIAB (琥珀酰亚基[4-碘代乙酰氨基]氨基苯甲酸酯)和SMPB (琥珀酰亚基-4-[1-马来酰亚胺基苯基]丁酸盐)的连接物反应，来从表面分离捕获剂。可以将乙烯基氧化来提供共价结合的方式。还可以将乙烯基用作诸如聚丙烯酸的不同的聚合物的聚合的锚定物，其可以为特定捕获剂提供多个附着点。可以将氨基与不同分子量的被氧化的葡聚糖反应来提供不同大小和能力的亲水连接。可氧化的葡聚糖的实例包括:葡聚糖T-40(分子量40000道尔顿)、葡聚糖Τ-110 (分子量110000道尔顿)、葡聚糖Τ-500(分子量500000道尔顿)、葡聚糖Τ-2Μ(分子量2000000道尔顿)(所有这些都可从Pharmacia, Piscataway, N.J.获得)或聚鹿糖(分子量 70000 道尔顿；可从 Sigma ChemicalC0.，St.Louis, M0.获得)。因此，可以使用第5459080号、第5459078号美国专利等中描述的技术和化学品，将聚合电解质相互作用用来将MAA蛋白质加合物固定在固体基质上。
[0099]影响固相的选择的其他的考虑因素包括将有标记的实体的非特异性结合降到最少的能力以及与采用的标记系统的兼容性。例如，使用的带有荧光标记的固相应当具有足够低的背景荧光来允许信号检测。
[0100]在连接上特定的捕获剂后，可以使用诸如血清、蛋白质或其他的阻滞剂的材料进一步处理固相支持体的表面来将非特异性结合降到最少。
[0101]MAA蛋白质加合物
[0102]在多个实施方案中，MAA蛋白质加合物被用来捕获/结合存在于生物样品中的抗MAA加合物抗体。产生MAA蛋白质加合物的方法为本领域技术人员已知且被描述于，例如，美国专利 5939535 和 Tuma et al.(1996) !fepatology, 23 (4): 872-880。基本上，乙醛和丙二醛(MDA)在蛋白质(带有氨基的基质)存在下一起反应，来形成包含MDA和乙醛的杂种加合物的独特的产物，其被指定为丙二醛、乙醛-加合物(MAA)。
[0103]如美国专利5939535中所描述，通过处理目标蛋白质(例如，白蛋白)可以容易地产生加合物，例如，以lmg/ml的浓度，在37°C下用ImM乙醛加ImM MDA处理3天。在对0.1M磷酸盐缓冲液过夜透析(pH7.4和4°C )后，可以如期望的那样进一步处理溶液(例如，吸附或共价结合到ELISA孔、微粒等上)。
[0104]然而，取决于微粒的类型的类型，可能需要提高或降低AA和MDA的浓度来取得可使得MAA具有反应性的相同量的荧光。
[0105]产生MAA蛋白质加合物的方法是示例性的和非限制性的。使用本文中提供的教义，可以使用其他的方法容易地产生MAA加合物。
[0106]teiP,系统
[0107]适合用于本文中描述的分析中的检测剂的可检测标记(例如，与抗MAA加合物抗体结合并形成抗MAA加合物/抗MAA加合物抗体复合物的抗体)包括可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电的、光的或化学的方式检测的任何组合物。有用的标记包括，但不限于:磁珠(例如，DYNABEADS? )、荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红、若丹明、绿色突光蛋白等，见，例如，Molecular Probes (分子探针),Eugene, Oregon, USA)、诸如口丫啶(例如，吖啶-9-甲酰胺)、菲啶、二氧杂环丁烷、鲁米诺等的化学发光化合物、放射性标记(例如，3H、1251、35S、14C或32P)、诸如酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β_半乳糖苷酶和ELISA中常使用的其他酶)的催化剂，以及测度标记，如胶体金(例如，40-80nm直径大小范围、高效散布绿光的金颗粒)或有色玻璃或有色塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。教会使用此类标记的专利包括第3817837号、第3850752号、第3939350号、第3996345号、第4277437号、第4275149号和第4366241号美国专利。
[0108]可以在与生物样品接触之前、期间或之后，将标记连接到检测剂上。所谓的“直接标记”为在用于分析前被直接连接或并入到检测剂上的可检测标记(例如，抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgA抗体等)。可以通过本领域技术人员熟知的多种方式中的任何一种将直接标记连接到或并入到检测剂上。
[0109]相反，所谓的“间接标记”通常在分析期间的某一时刻结合到检测剂上。通常，间接标记在使用前结合到被连接到或并入到检测剂上的部分上。因此，例如，在用于分析前可以将被用作检测剂的抗体(“检测抗体”)生物素化。在分析期间，亲和素-偶联的荧光团可以结合具有生物素的检测剂，来提供可被容易检测到的标记。
[0110]在间接标记的另一实例中，还可以将能特异性结合免疫球蛋白恒定区的多肽，如多肽A或多肽G用作检测抗体的标记。这些多肽为链球菌的细胞壁的正常成分。它们展现强的与来自多种物种的免疫球蛋白恒定区的非免疫原性反应(见，一般是KronVal，etal.(1973)J.1mmunol., 111:1401-1406 和 Akerstrom(1985)J.1mmunol., 135:2589-2542)。因此,可以将此类多肽标记并加入到分析混合物中，其中它们结合到检测抗体上，以及物种特异性抗体上，标记二者并提供复合信号，这归因于存在于样品中的分析物和自抗体。
[0111]本文中描述的方法中有用的一些标记需要使用指示剂来提供可检测的信号。在ELISA中，例如，酶标记(例如，半乳糖苷酶)可能需要加入基质(例如，X-gal)来提供可检测的信号。
[0112]示例性形式
[0113]化学发光性微粒免疫分析(CMIA)
[0114]在一个示例性的实施方案中，根据本发明在化学发光性微粒分析(CMIA)中采用了化学发光性标记。一般来说，化学发光性微粒分析技术基于这一原理——当通过引发试剂处理时，化学发光标记以特征波长发光(即，化学发光)。
[0115]CMIA所必须的反应物可以包括涂有被测量的分析物的特异性捕获剂、化学发光检测剂和引发剂(例如，化学的或电化学的)的微粒。进行CMIA的反应顺序可以包括:在反应容器内用样品混合涂有分析物特异性捕获剂的微粒来形成免疫复合物；清洗捕获的免疫复合物来去除未结合的物质；用化学发光检测剂混合捕获的免疫复合物；清洗捕获的免疫复合物——化学发光检测剂；和用引发剂混合捕获的免疫复合物——化学发光检测剂来起始光发射。
[0116]CMIA中有用的化学发光体包括吖啶(例如吖啶-9-甲酰胺)、鲁米诺、二氧杂环丁烷、钌络合物和类似的化学发光衍生物。CMIA中有用的微粒包括反磁性的、磁性的和顺磁性的微粒。可商购的可以用来进行化学发光性微粒分析的自动化仪器的实例包括Architect1-Systems 和 Abbott Prism(都可从 Abbott Laboratories, Abbott Park, 111.获得)。
[0117]电化学检测系统
[0118]在其他的实施方案中，使用电化学检测进行了免疫分析。Heineman和合作人已经描述过了电化学检测的基本程序。这需要:第一抗体(Ab，大鼠-抗小鼠IgG)的固定，随后暴露到含有抗原(Ag，大鼠IgG)的一系列的溶液下，将第二抗体偶联到酶标记(AP-Ab，大鼠抗小鼠IgG和碱性磷酸酶)和对氨基苯磷酸盐(PAPP)上。AP转化PAPP为对氨基苯酚(PAPR，“R”试图从氧化型，PAPO，醌亚胺中区别简化型)，ρΗ9.0下(此时AP展现最优活力)，其在不干扰氧和水的还原的电位处为电化学可逆的。PAPR不会造成电极污染，这与苯酚不同，其中苯酚的前体一磷酸单苯酯常常被用作酶底物。尽管PAPR可经历空气和光氧化，可容易地将这些氧化阻止在小规模和短时间框架内。先前已经报导过在微电化学免疫分析中使用20 μ L至360 μ L体积的PAPP获得的PAPR的皮摩尔检测极限和IgG的毫微微克检测极限。在使用电化学检测的毛细管免疫分析中，现今为止报导的最低检测极限为3000分子的小鼠IgG，其中使用了 70 μ L的体积和30分钟或25分钟的分析时间。
[0119]在一种示例性方法中，测试盒(类似于Abbott Point of Care (1-STAT?)电化学免疫分析系统)在装配于硅片内的电化学传感器上提供了 MAA蛋白质加合物。被放置在芯片上的另一位置的为抗体/碱性磷酸酶偶联物(例如，偶联到碱性磷酸酶上的抗IgG)。将生物样品(例如，全血、血浆等)与传感器接触，允许酶偶联物溶入到样品中。样品内的抗MAA加合物抗体变得标记有偶联物，且通过将抗MAA加合物抗体结合到被固定的MAA加合物上，该复合物被捕获到电化学传感器的表面上。将样品，以及过量的酶偶联物从传感器上洗脱掉。洗脱液内为碱性磷酸酶的基质。结合到抗体/抗原/抗体三明治上的酶切割基质，释放出可通过电化学检测产物。电化学(例如，安培的、伏安的等)传感器可测量该酶产物，其与样品中的抗MAA加合物抗体的浓度成比例。
[0120]该电化学检测方案试图为示例性的且不为限制性的。应当注意其他的电化学检测方法为本领域技术人员已知，且不同的电化学检测系统被描述于，例如，第7045364号、第7045310号、第6887714号、第6682648号、第6670115号美国专利等。
[0121]横向流分析
[0122]在某些实施方案中，将分析形式化为横向流分析，也成为横向流免疫层析分析。常常以测试条/量油尺形式产生这些分析。在横向流分析中，测试样品通过毛细管作用沿固体基质流动。在将样品应用到测试后，其遭遇与样品混合并经过基质遭遇线或区域的有色试剂，其中的基质遭遇线或区域已经用(例如，用诸如MAA加合物的抗原)和/或检测试剂(例如，有标记的抗体)预处理过。取决于存在于样品中的分析物，有色试剂可以在测试线或区域处成为结合状态，且可以通过与参考值，或如本文中所述的电化学读取的读数，或使用，例如，读取器光学读取的读数比较得到定量。横向流测试可以运作为竞争性或三明治式分析。
[0123]微流体分析
[0124]在某些实施方案中，使用微流体装置进行了分析。微流体分析为本领域技术人员熟知。在一种不例性方法中，可以使用与表面突光显微镜交界的冷却的电荷稱合器件(CCD)照相机检测全-PDMS[聚(二甲基硅氧烷)]微流体装置中的异质性三明治式酶联免疫分析(ELISA)的荧光反应。已经成功地将PDMS芯片微传感器用来定量模式分析物(绵羊IgM)，其敏感性低至17nM。已经将该混合集成技术扩展至来自PDMS芯片中的生物化学免疫分析的光发射的芯片上成像和定量(见，例如，Eteshola and Balberg(2004)BiomedicalMicrodevices, 6(I):7-9 等)。
[0125]多路传输形式
[0126]在特定的实施方案中，例如，为对同时分析一个生物样品的多种分析物(例如抗MAA IgG、IgM和IgA)有用，分析系统可以包含多种不同的检测剂(例如，抗IgG、抗IgM、抗IgA等)，且在某些实施方案中，可以将这些不同的检测剂至于不同的反应位点(例如，ELISA盘中的不同的孔)。因此，可以将分析多路复用。在单个分析运行期间，固相可以在表面上具有多个不同的区域，其中每个区域都具有粘附的具有特定特异性的抗体。
[0127]这还可以在溶液相中完成，其中用不同的标记标记了每种抗体血清型特异性的检测试剂。反应后可以使用，例如，细胞分选仪分离和/或定量这些试剂。
[0128]多路传输形式可以，但不必，采用多种标记，其中每种标记被用于特定分析物和/或那一分析物特异性的自抗体的检测。例如，可以检测多种分析物而不需使用多个标记，其中在支持物上的不同位置(例如，在ELISA盘的不同孔中)使用了不同的检测剂。因为每个位置处的检测剂的特异性是已知的，特定位置处的信号的检测可能与结合在那一位置处的特定抗MAA加合物抗体的存在相关。该形式的实例包括在沿着通道的不同的位置含有不同的标记剂的微流体装置。在某些实施方案中，不同的标记试剂可能与不同的电极系统相关，其中可以将多个电极系统(例如，IgG检测系统和IgA检测系统和IgM检测系统)组装在单个微芯片/微流体装置中。
[0129]除了上述的不同的免疫分析(例如，直接ELISA、间接ELIAS等)，还可将其他的分析形式用来检测抗MAA加合物抗体。此类分析包括，但不限于:RIP分析、BIAcore分析、瞬逝场分析等。
[0130]RIP分析可测量结合到流体相中的同源抗原上的抗体。因此，可以用放射性标记的MAA蛋白质加合物和诸如蛋白质A-琼脂糖或蛋白质G-琼脂糖的沉淀剂检测和定量抗MAA加合物抗体，其中的沉淀剂与抗体的Fe部分结合并通过离心被用来收集抗原-抗体复合物(Bendtzen et al.(2000)Mol.Biotechnol.14:251-261)。Prabhakar andMuhlfelder (1997)Clin.Nephrol.47:331-335 描述了典型 RIP 测试平台的一个示例性实例，且该实例被用来检测重组体EPO的人抗体。
[0131]BIAcore免疫分析使用表面等离子体共振来光学测量与固定在专门的葡聚糖包被的玻璃表面上的目标抗原(例如，MAA蛋白质加合物)结合的抗体。随着大多数抗体积聚在传感器芯片的表面上，BIAcore分析的信号直接增加。表征/定量抗体的BIAcore免疫分析为本领域技术人员熟知(见，例如，Meager et al.(2003)Clin.Exp.1mmunol.132:128-136 ;VanCott et al.(1992)J.1mmunol.Meth.，146:163-176 ;Takacset al.(1999)J.1nterferon Cytokine Res.19:781-789 ；Swanson(2003)Pp.127-133.1nA.R.Mire-Sluis (ed.)Immunogenicity of therapeutic biological products, vol.112.Karger, Basel, Switzerland ；Swanson (2004)Nephron.Clin Pract.96:c88_c95 等)。
[0132]在某些实施方案中，消逝型生物传感器也是预期的。这些生物传感器不需要检测目标分析物前的生物样品预处理。消逝型生物传感器通常依靠预定波长的光，其与诸如，例如，在探针表面附近连接到MAA加合物上的荧光标记的荧光分子相互作用，来通过结合分析物(例如抗MAA加合物抗体)在不同的波长处发出荧光。
[0133]对技术人员显而易见的是本文中描述的分析形式可接受多种高通量形式中的任何一种。
[0134]牛物样品
[0135]在多个实施方案中，将抗MAA加合物抗体测量对来源于目标个体的生物样品进行。此类个体包括，例如，展现一种或多种临床症状的患者、经历常规检查的无症状患者、展现一种或多种心脏风险因子(例如，肥胖、糖尿病、吸烟者、心脏病家族史等)的患者。
[0136]使用本领域技术人员已知的标准方法获得样品，且在某些实施方案中，为用于特定分析方案最终需将其标准化。通常，如果它们都存在于个体内，生物样品为抗MAA加合物抗体预期可在其中找到的样品。此类样品包括，但不限于:唾液/痰、血液或血液部分(例如，血浆、血清)、某些组织活检等。
[0137]在一个实施方案中，通过选自以下的方法从个体获得生物样品:手术方法或其他的切除方法、诸如高渗盐水或丙二醇的体液吸引术、支气管腺体灌洗、支气管镜检、使用玻璃管、唾液米集管(Sarstedt AG,瑞士塞沃伦)、Ora-sure (Epitope Technologies PtyLtd,澳大利亚维多利亚州墨尔本市)、omni_sal (Saliva Diagnostic Systems,美国纽约布鲁克林)的唾液收集以及使用本领域已知的任何方法的血液采集，如，例如使用注射器。
[0138]在多个实施方案中，可以处理样品来帮助存储和/或分析中的处理，和/或分析的标准化。
[0139]体内斑块成像
[0140]组合物成像及它们的使用
[0141]在某些实施方案中，提供了斑块，尤其是可导致心肌梗死的不稳定斑块成像的方法。在多个实施方案中，方法需要:给予目标个体可特异性或优选结合MAA蛋白质加合物的组合物，其中所述组合物包括可检测标记。因此，靶向组合物通常包含靶向部分(例如，连接到可检测标记上的抗MAA加合物抗体)。当被给予到个体时,祀向部分特异性或优选结合到MAA蛋白质加合物存在的位点。这导致标记定位/优选分布到此类位点。如果将组合物给予到个体的脉管系统，标记将停留或优选分布到斑块形成的位点，使得更多的标记被定位在在得到进一步发展和/或不稳定的斑块处。对个体成像并检测标记位置。这允许评估斑块并提供随后的行动指导(例如，药物治疗、血管成形术、心脏搭桥手术等)。
[0142]可以将标记组合物用于直接靶向方法或用于预靶向策略。在直接靶向中，将可检测标记连接到了可特异性或优选结合到MAA加合物上的靶向部分(例如抗MAA抗体、抗体片段等)上。因此，抗体到斑块形成区域内的抗MAA加合物上的结合可将标记定位在那一区域，随后可以对该区域成像，提供该位置的定位，和/或斑块的严重度。
[0143]在某些实施方案中，可以将标记组合物用于“预靶向”策略。在该方法中，最初没有将标记连接到MAA加合物靶向部分上。而是将MAA加合物靶向部分(例如，抗MAA加合物抗体)连接到了随后可以被具有可检测标记的药剂结合的第二部分上。合适的第二部分包括，例如，表位标签、抗体恒定区或框架区、生物素亲和素等。
[0144]在某些实施方案中，在此类标记组合物中利用的标记为“不透射线过的”标记，例如，可以使用X射线容易地成像的标记。不透射线的材料为本领域技术人员熟知。最常见的不透射线材料包括碘化物、溴化物或钡盐。其他的不透射线材料也是已知的且包括，但不限于:有机铋衍生物(见，例如，美国专利5939045)、不透射线的聚氨酯(见美国专利5346981)、有机铋合成材料(见，例如，美国专利5256334)、不透射线的钡聚合物复合物(见，例如，美国专利4866132)等。
[0145]除了放射标记，其他的可检测标记也适合使用此类标记组合物。这样的标记包括，例如，放射性标记和/或MR1、NMR, PET检测的标记等。
[0146]不同的优选放射性标记包括，但不限于:99TC、2°3Pb、67Ga、68Ga、72As、mIn、113mIn、97Ru、62Cu、641Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121 Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb具体的有用的PET标记包括，但不限于:nC、18F、150、13N等。用于MRI的常见标记包括，但不限于:钆螯合物和具有不同的表面修饰的氧化铁纳米粒子或微粒。诸如钆喷酸葡胺的钆螯合物为最广泛使用的顺磁性对比材料。氧化铁颗粒为一类超顺磁MRI对比剂的部分。将通常由磁矿铁(氧化铁)核组成的这些化合物用葡聚糖或硅氧烷包被、用聚合物密封或进一步修饰。
[0147]可以将靶向部分(例如，抗MAA加合物抗体等)直接连接到可检测标记上或可以将其通过一种或多种连接物的方式连接。例如，可以通过一种多功能(例如，双功能、三功能或四功能)连接剂或成对的互补连接剂偶联靶向部分和可检测标记部分。在另一实施方案中，通过两种、三种或更多种连接剂偶联靶向部分和标记。
[0148]如本文中所使用的“连接物”或“连接剂”为被用来连接两个或更多个分子的分子。在某些实施方案中，连接物通常能对两个分子形成共价键(例如，靶向部分和效应物)。合适的连接物为本领域技术人员熟知且包括，但不限于:直链或支链碳连接物、杂环碳连接物或肽连接物。
[0149]可以将双官能团连接物用来形成期望的偶联物，其中的双官能团连接物的一个官能团可与一个分子上的基团反应(例如，抗MAA抗体)，且另一基团在另一分子上反应(例如，可检测标记)。作为选择，可以进行衍生来提供官能团。因此，例如，在肽上生成游离的巯基基团的程序也是已知的(见，例如，第4659839号美国专利)。
[0150]在某些实施方案中，连接剂为或包含官能团。官能团包括包含反应基以及多功能交联物的单官能团连接物，其中的功能交联物包含两个或更多个能与两个或更多个不同的功能目标(例如，标记、蛋白质、大分子、半导体纳米晶体或基质)形成结合的反应基。在一些实施方案中，多功能交联物为包含两个或更多个不同的反应基的异源双功能交联物。
[0151]合适的反应基包括，但不限于:硫醇(-SH)、羧化物(COOH)、羧基(-C00H)、羰基、胺(NH2)、羟基(-0H)、醛(-CH0)、乙醇(ROH)、酮(R2CO)、活性氢、酯、巯基(SH)、磷酸盐(-PO3)或光敏部分。胺反应基包括，但不限于:例如，异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮、NHS酯、磺酰氯、醛和乙二醛、环氧化合物和环氧乙烷、碳酸盐、芳化剂、亚胺酸酯、碳化二亚胺以及酐。硫醇反应基包括，但不限于:例如，卤代乙酰和卤代烷衍生物、马来酰亚胺、氮杂环丙烷、丙烯酰衍生物、芳化剂以及硫醇-二硫化物转换试剂。羧化物反应基包括，但不限于:例如，重氮烷和重氮基乙酰化合物，如羰基二咪唑和碳化二亚胺。羟基反应基包括，但不限于:例如，环氧化合物和环氧乙烷、羰基二咪唑、氧化性高碘酸盐、N，N’ - 二琥珀酰亚基碳酸盐或N-羟基琥珀酸铵氯甲酸酯、酶氧化物、卤代烷基以及异氰酸酯。醛和酮反应基包括，但不限于:例如，席夫碱形成或氨基化减少的肼衍生物。活性氢反应基包括，但不限于:例如，曼尼希缩合和碘化反应的重氮衍生物。光敏基团包括，但不限于:例如，叠氮化物和卤代的芳基叠氮化物、苯甲酮、重氮化合物和双吖丙啶衍生物。
[0152]在形成嵌合部分中有用的其他合适的反应基和反应类型包括生物共轭化学领域熟知的反应基和反应类型。当前有利的对反应螯合物有效的反应类型为在相对温和的条件下进行的反应。这些反应包括，但不限于:亲核取代(例如，带有卤化酰基、活化酯的胺类和醇类的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)以及加入碳-碳和碳-杂原子重键(例如，迈克尔反应、狄尔斯-阿尔德反应)。这些和其他的有用的反应被讨论于，例如，March (1985)Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John ffiley&Sons, New York、Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego 和 Feeney et al.(1982)Modification of Proteins: Advances in Chemistry Series,Vol.198, AmericanChemical Society, Washington, D.C0
[0153]将不同的分子连接到肽或蛋白质上的许多程序和连接分子为已知的(见，例如，第188256号欧洲专利申请；第4671958号、第4659839号、第4414148号、第4699784号、第 4680338 号、第 4569789 号和第 4589071 号美国专利；以及 Borlinghaus et al.(1987)Cancer Res.47:4071-4075)。
[0154]可以将本文中描述的许多成像试剂提供为螯合物，尤其是当利用了预靶向策略时。螯合分子通常被结合到与连接在本发明的前列腺癌特异性抗体上的表位标签特异性结合的分子(例如，生物素、亲和素、链霉亲和素等)上。
[0155]螯合基团为本领域技术人员熟知。在某些实施方案中，螯合基团来源于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、环己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-0，O’-二(2-氨乙基)-N，N, N’，N’-四乙酸(EGTA) ,N, N-二(羟苄基)_ 乙二胺-N，N’-二乙酸(HBED)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)U, 4，7，10-四氮杂环十二烷-N, N’ -，N"，N〃’ -四乙酸(DOTA)、羟乙基二胺三乙酸(HEDTA)U, 4，8，11-四-氮杂环十四烷-N，N，，N〃，N〃’ -四乙酸(TETA)、取代的DTPA、取代的EDTA等。
[0156]某些优选的螯合剂的实例包括未被取代的或取代的2-亚胺基硫杂烷和2-亚氨基硫杂环己烷，具体来说，为2-亚氨基-4-巯基甲基硫杂烷。
[0157]由于一种螯合剂——I, 4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’ -，N〃，N〃’ -四乙酸(DOTA)可螯合多种诸如放射性核素和放射性标记的在诊断上和治疗上具有重要性的金属的能力，其尤其让人感兴趣。
[0158]已经描述过诸如抗体的DOTA和蛋白质的偶联物。例如，第5428156号美国专利教导了可将DOTA偶联到抗体和抗体片段上的方法。为了产生这些偶联物，将DOTA的一个羧酸基团转化为了活化酯，其可以与抗体或抗体片段上的胺基或巯基反应。Lewis etal.(1994)Bioconjugate Chem.5:565-576描述了类似的方法，其中将DOTA的一个羧基转化为了活化酯，并用抗体混合活化的D0TA，通过抗体的赖氨酸残基的ε -氨基将抗体连接到DOTA上，从而将DOTA的一个羧基转化为氨基化合物部分。
[0159]作为选择，可以直接地或通过连接物将螯合剂结合到表位标签上或结合到结合表位标签的部分上。已经描述过DOTA和生物素的偶联物(见，例如，Su(1995) J.Nucl.Med.，36 (5Suppl): 154P，其公开了通过可利用的诸如DOTA-LC-生物素或DOTA-苄基-4-(6-氨基-己酰胺)_生物素)的氨基侧链生物素衍生物将DOTA连接到生物素上。PCT公开W095/15335公开了产生可以被偶联到生物素上的硝基-苄基-DOTA化合物的方法。该方法包括:通过短暂透射羟基的环化反应；氨基的甲苯磺酰化；短暂保护羟基的去保护；去保护羟基的甲苯磺酰化；以及分子内甲苯磺酸盐环化。Wu et al.(1992) Nucl.Med.Biol.，19⑵:239-244公开了用111In和9°Y合成放射性标记蛋白质的大环螯合剂。Wu etal.制造了带有标记的DOTA-生物素偶联物来研究带有亲和素的偶联物一研究的一种模式蛋白质的稳定性和生物分布。该偶联物使用含有游离氨基的生物素酰肼制得，用来与原位产生的活化DOTA衍生物反应。
[0160]应当注意大环螯合剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’_，N〃，N〃’-四乙酸(DOTA)可以以非凡的稳定性结合9°Y和mIn。可以进行选定缓冲液中用来评估预期的放射性药物标记下的放射性标记反应时间的动力学研究，来确定最优放射性标记条件，以提供符合放射药物的FDA需求的高产物产量。应当注意，Kukis et al.(1998) J.Nucl.Med.，39(12):2105-2110详细描述过制造钇-90-D0TA螯合物的方案。
[0161]制造适合结合到不同的靶向部分(例如，抗MAA加合物抗体)上的螯合物的方法为本领域技术人员熟知(见，例如，第6190923号、第6187285号、第6183721号、第6177562号、第 6159445 号、第 6153775 号、第 6149890 号、第 6143276 号、第 6143274 号、第 6139819号、第 6132764 号、第 6123923 号、第 6123921 号、第 6120768 号、第 6120751 号、第 6117412号、第 6106866 号、第 6096290 号、第 6093382 号、第 6090800 号、第 6090408 号、第 6088613号、第 6077499 号、第 6075010 号、第 6071494 号、第 6071490 号、第 6060040 号、第 6056939号、第 6051207 号、第 6048979 号、第 6045821 号、第 6045775 号、第 6030840 号、第 6028066号、第 6022966 号、第 6022523 号、第 6022522 号、第 6017522 号、第 6015897 号、第 6010682号、第6010681号、第6004533号、第6001329号美国专利等)。
[0162]检测此类标签的方法为本领域技术人员熟知。因此，例如，可以使用感光片、闪烁探测器等检测放射性标记。使用PET成像系统检测/成像PET标记。类似地，使用MRI系统检测/成像MRI标记。
[0163]杭体产牛
[0164]在某些实施方案中，MAA加合物的体内检测的标记试剂包括抗MAA抗体。这样的组合物中有用的抗体包括多克隆和单克隆抗体、抗体片段、单链抗体等。通过将(例如，皮下或肌肉内注射)免疫原(例如，MAA加合物)注射到合适的非人的哺乳动物(例如，小鼠或兔)体内引发多克隆抗体。一般来说，免疫原应当诱导对目标抗原具有相对高的亲和力的高滴度的抗体的产生。`
[0165]如有需要，可以通过本领域熟知的偶联技术将抗原偶联到载体蛋白上。通常使用的载体包括钥孔戚血蓝素(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。随后将偶联物用来免疫动物。
[0166]随后从从动物采集的血液样品获得抗体。用来制造多克隆抗体的技术在文献中得到广泛的描述(见，例如，Methods of Enzymology, “Production of Antisera WithSmall Doses of Immunogen:Multiple Intradermal Injections, ^Langone, et al.eds.(Acad.Press, 1981))。可以将动物制造的多克隆抗体进一步纯化,例如,通过结合到并从目标抗原结合到的基质上洗脱。本领域技术人员可了解免疫学领域内常见的用于纯化和/或浓缩多克隆以及单克隆抗体的不同技术，见，例如，Coligan, et al.(1991)Unit9, CurrentProtocols in Immunology, Wiley Interscience。
[0167]对于很多应用，单克隆抗体(mAb)是优选的。用于制造杂交瘤分泌性mAb的一般方法是熟知的(Kohler 和 Milstein (1975)Nature, 256:495)。简单地说，如 Kohler 和Milstein所描述，该技术需要:从患有黑色素瘤、畸胎癌或者子宫癌、神经胶质癌或肺癌的5个不同的癌症患者的局部引流淋巴结分离淋巴细胞(其中样品从手术样本获得)、合并细胞和用SHFP-1融合细胞。筛选了杂交瘤用于制造与癌细胞系结合的抗体。可以使用常规筛选技术(如酶联免疫吸附测定或“ELISA”)完成在mAb间确认特异性，以确定目标mAb的
基元反应模式。
[0168]如本文中所使用，术语“抗体”包括抗原结合性抗体片段，例如，单链抗体(scFv或其他)，其可以使用噬菌体展示技术进行制造/挑选。在感染细菌的病毒(细菌噬菌体或噬菌体)表面表达抗体片段的能力使得分离单个结合性抗体片段成为可能，例如，从大于1010个非结合性克隆文库中。为了在噬菌体表面上表达抗体片段(噬菌体展示)，将抗体片段基因插入到编码噬菌体表面蛋白(例如，PlII)的基因内，并将抗体片段-PlII融合蛋白质展不在卩遼菌体表面上(McCafferty et al.(1990) Nature, 348:552-554 ；Hoogenboom etal.(1991)Nucleic Acids Res.19:4133-4137)。
[0169]因为噬菌体表面上的抗体片段是有功能的，可以通过抗原亲和层析将噬菌体约束性抗原结合性抗体片段从未约束的噬菌体中分离出来(McCafferty et al.(1990)Nature, 348:552-554)。取决于抗体片段的亲和力，单轮亲和挑选获得了 20倍-1000000倍的富集因子。然而，通过用洗脱的噬菌体感染细菌，更多的噬菌体可以得到生长并经历另一轮的挑选。以这种方式，一轮中的1000倍的富集可以变为挑选的两轮中的1000000倍(McCafferty et al.(1990)Nature, 348:552-554)。因此，即使当富集较低时(Marks etal.(1991) J.Mol.Biol.222:581-597)，多轮的亲和挑选可以引起稀有噬菌体的分离。因为抗原上噬菌体抗体文库的挑选引起富集，在少至3至4轮的挑选后大多数的克隆即结合上抗原。因此，仅需分析相对小数量的克隆(几百个)的抗原结合。[0170]可以通过在噬菌体上展示非常大的和多变的V-基因全库制造人抗体，而不需要前免疫(Marks et al.(1991) J.Mol.Biol.222:581-597)。在一个实验方案中，通过PCR从未免疫的供体中分离出了存在人外周血淋巴细胞中的天然VH和VL全库。可以使用PCR任意地将V-基因全库叠接在一起，来建立scFv基因全库，其可以被克隆到噬菌体载体内来建立3千万个噬菌体抗体的文库(Id.)。从单个“初级”噬菌体抗体文库中，对多于17个不同的抗原分离了结合性抗体片段，其中的抗原包括半抗原、多糖和蛋白质(Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597 ；Marks et al.(1993).Bio/Technology.10:779-783 !Griffithset al.(1993)EMBO J.12:725-734 ；Clackson et al.(1991)Nature.352:624-628)。
[0171]此外，应当注意特异性结合MAA加合物的抗体的产生被描述于第5939535号美国专利。如其中所描述，通过在lmg/ml的浓度和37°C下,用ImM乙醒加ImM MDA处理兔血衆蛋白(由硫酸铵沉淀制备，如 Klassen (1994) Alcohol Clin Exp Res.18:164-171 所描述)3天制得了 MAA-加合物免疫原。对0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4和4°C )过夜透析后，用等体积的弗氏完全佐剂混合溶液并乳化。在沿着它们背上的4个位点处对新西兰白兔进行皮下注射(400yg的修饰蛋白)。两周或四周后，除了使用弗氏完全佐剂外，通过相同的程序增强兔子。最终注射后两周，得到了血清并测试了抗体活性。
[0172]接着亲和纯化了产生的抗血清。通过将其加入到溶于0.1磷酸盐缓冲液的乙醛(ImM)和MDA(ImM) (pH7.4)中，并在37°C恒定震荡下培养3天，对赖氨酸衍生的琼脂糖4B珠(Sigma Chemical C0.，St.Louis, M0.)进行了修饰。用4体积的缓冲液清洗珠子并将其导入 0.7cmX 15cm 的低压 Econo-Column (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)中。将来自免疫的动物的IOml的兔血清载到柱子上。用5体积的缓冲液及随后的IM NaCl清洗柱子，然后用0.5M乙酸(pH2.5)洗脱到Tris缓冲液(pH8.2)中，来中和酸性。通过蛋白质G-琼脂糖B (Pharmacia, Piscataway, N.J.)柱层析进一步纯化洗脱的材料,产生大于95%的纯化的IgG部分。
[0173]如本领域技术人员可以容易地理解的那样，还可以通过多种商业服务(例如，Berkeley Antibody Laboratories, Bethyl Laboratories, Anawa, Eurogenetec 等)的任何一种制备抗体。
[0174]以炎性过程为特征的其他病症的诊断/预后
[0175]还发现丙二醛-乙醛加合物(MAA)可用作许多疾病的炎症的生物标志物。这源于在形成该加合物中涉及到的组分的基本性质。不受具体理论的束缚，据信组织损伤后，细胞膜被不同的吞噬细胞(巨噬细胞和中心粒细胞)识别。在该过程中，吞噬细胞释放可改变细胞膜脂质的超氧化物来制造丙二醛(MDA)。当制造了足够水平的MDA时，随后MAA加合物将会产生。就其本身而言，组织内MAA的存在为发生在炎症反应期间的组织/细胞损伤的量的反应，且其检测为该炎症的良好标志物。
[0176]已经表明MAA加合物具有许多前炎症性和免疫刺激性特性，这些特性可以导致抗体发展为MAA加合物和其结合在上面的大分子(见我们的第二份专利、其他的论文)。因此,抗MAA抗体的存在可反映炎症反应期间组织内形成的MAA的量。此外，MAA的单克隆和多克隆抗体的产生使得评估不同疾病中的炎症反应成为可能。
[0177]因此，在某些实施方案中，预期可以将MAA加合物和/或MAA加合物的抗体用作以炎症反应为特征的多种病理中的炎症的标志物。
[0178]以炎症反应为特征的病症的实例包括，但不限于:风湿性关节炎、动脉粥样硬化(如上面所指出)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、哮喘、感染(例如，细菌性感染、病毒性感染、寄生性感染)、脓毒症/脓毒症综合症、炎症性肠病、狼疮、多发性硬化、结缔组织病、肝炎、湿疹等。
[0179]因此，在某些实施方案中，提供了评估个体的炎症性病变的风险、状态、阶段、进展或严重性的方法。该方法通常包括:测定来自个体的生物样品中的MAA加合物和/或抗MAA加合物的水平，其中MAA加合物和/或抗MAA抗体的提高的水平(相比正常健康的个体，和/或相比与以前相同的个体)指示炎症性病变的增加的风险、状态、阶段、进展和/或严重性。在某些实施方案中，样品包括选自以下的样品:尿液样品、血清样品、血浆样品、血液、血液部分、口腔液体/痰、支气管灌洗、滑液样品、粪便样品、组织活检和脑脊液样品。
[0180]应当理解可以在差别诊断的情形下容易地测定为炎症性状态所特有的特定病变，例如，通过考虑其他的风险因子、病史、生活方式和其他的测试结果。
[0181]可以根据本领域技术人员熟知的标准方法进行MAA加合物和/或抗MAA加合物抗体的分析。
[0182]试剂盒
[0183]诊断/预后分析试剂盒
[0184]在某些实施方案中，用于检测和/或定量生物样品中的抗MAA加合物抗体的试剂盒是预期的。在一个实施方案中，该试剂盒包含含有MAA蛋白质加合物的容器，其中可以将MAA蛋白质加合物提供为冻干粉、溶于溶液中或连接到固相支持体上(例如，微量滴定板、微珠等)。该试剂盒可以任选地还包含一种或多种试剂，用于检测MAA-加合物/抗MAA加合物复合物。此类试剂可以包含抗MAA抗体(例如，抗MAA抗体IgG，和/或IgM，和/或IgM)。该试剂盒可以还包含报道分子，如，例如，酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、基质、辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团、生物素或者诸如胶体金或硒的胶粒。优选将此类报道分子直接连接到检测试剂抗体上。
[0185]在某些实施方案中，试剂盒另外包含参考样品。此类参考样品可以，例如，包括一种或多种抗MAA加合物抗体的标准溶液。
[0186]在另一实施方案中，试剂盒任选包含样品制备方式，如，样品收集装置、样品贮存容器、缓冲液、酶底物等。
[0187]此外，试剂盒任选包含可提供指导(例如，方案)的标记材料和/或指导材料，用于实践本文中描述的诊断/预后方法。优选的指导材料描述了抗MAA加合物抗体(例如，IgG,和/或IgM，和/或IGA)的检测，来诊断斑块的存在和/或来评估斑块形成的预后(例如，形成稳定或不稳定斑块)。
[0188]成像试剂盒
[0189]在某些实施方案中，提供了用于检测和/或定量体内MAA加合物的试剂盒(例如，用于体内成像斑块)。在某些实施方案中，这些试剂盒包含含有抗MAA加合物抗体的容器。在某些实施方案中，该试剂盒可以还包含可检测标记(例如，不透射线的标记、MRI标记、PET标记、NMR标记、ESR标记等)。该试剂盒可以任选地还包含一种或多种试剂和/或装置，用于体内给予和/或检测抗MAA抗体。
[0190]此外，该试剂盒任选包含可提供使用MAA加合物成像试剂来和/或定位，和/或成像斑块的说明(例如，方案)的标记材料和/或指导材料。
[0191]虽然不同试剂盒中的指导材料通常包括书写的或打印的材料，它们并不限于此。任何能储存此类说明并将它们传达给终端用户的媒介都是本发明预期的。此类媒介包括，但不限于:电子储存媒介(例如，磁盘、磁带、暗盒、芯片)、光学媒介(例如，CD ROM)等。此类媒介可以包括可提供此类指导材料的互联网网站的网址。
实施例
[0192]提供以下实施例来例证、但不限制要求保护的发明。
[0193]实施例1
[0194]用醛类修饰的Ox-LDL和蛋白质通过两者共有的丙二醛/乙醛(MAA)加合物诱导前炎症、免疫和动脉粥样硬化效应
[0195]早已知道Ox-LDL和随后由位于主动脉的血管壁上的巨噬细胞摄取可增加动脉粥样硬化病变和斑块形成的风险。丙二醛/乙醛修饰的蛋白质(MAA)存在且似乎与人动脉粥样硬化的发展和进展相关。该研究的目的是确定MAA修饰的蛋白质和Ox-LDL间是否存在关联，这可以解释它们在发展动脉粥样硬化中的潜在作用。
_6] 方法
[0197] 将小鼠主动脉内皮细胞系CRL-2167用来确定MAA修饰的蛋白质或Οχ-LDL是否可能诱导细胞因子表达和/或分泌。简单地说，将这些细胞暴露到不同浓度的LDL、Ox-LDL,人血清白蛋白(HSA)或HSA-MAA下，并分析其细胞因子表达(mRNA)和分泌(蛋白质)。为了评定这些反应是否是因为修饰的配体的相似性，用LDL、Ox-LDL、LDL-MAA、HAS或HSA-MAA免疫Balb/c大鼠，并测试了血清以验证MAA和LDL的抗体的存在。使用先前报导为对该表位具有特异性的抗体分析了这些配体，以验证MAA。从JCR大鼠提取了主动脉组织并通过免疫印迹探测MAA修饰的蛋白质。
[0198]结果和结论
[0199]mRNA表达和蛋白质分泌研究证明了用HSA-MAA、Οχ-LDL和LDL-MAA孵育后MCP-1、IL-6, TNF-α和平滑肌肌动蛋白的增加。来自用不同的配体免疫过的小鼠的血清表明MAA的抗体仅在用Οχ-LDL、LDL-MAA和HSA-MAA免疫过的小鼠体内产生。抗MAA抗体表明仅这3个免疫性配体含有该加合物。用LDL-MAA免疫还导致潜在致病的抗LDL抗体的产生。最后，如通过免疫印迹ting、使用抗MAA抗体所评估，来自JCR大鼠的主动脉含有MAA修饰的蛋白质。总之，MAA修饰的蛋白质和Οχ-LDL引起抗体反应和前炎症效应，它们可以通过两者共有的MAA部分加重动脉粥样硬化疾病。
[0200]实施例2
[0201]用于评估患有动脉粥样硬化疾病和剂型心肌梗死的患者中易损斑块的新的生物标志物
[0202]被氧化的蛋白质涉及动脉粥样硬化的发展和进展。制造了丙二醛(MDA)-乙醛(AA)加合物(MAA)，且其为用氧化性产物MDA孵育蛋白质后形成的优势表位。该研究的目的是作为心脏动脉疾病的标志物评估抗MAA加合物抗体。
[0203]分析了来自正常对照、患有急性心肌梗死(MI)、早期冠状动脉疾病(CAD)和晚期状态冠状动脉疾病的患者的血清样品的MAA蛋白质加合物的抗体(生物标志物)。
[0204]为了测定血清样品中的MAA蛋白质加合物，用人白蛋白或人白蛋白MAA包覆ELISA盘。将来自个体的血清稀释并加入到合适的孔中。使用过氧化物酶标记的抗人IgG第二抗体检测抗体结合(如图3中所阐述)。测定了光密度并从人IgG标准曲线外推出了抗MAA加合物抗体的浓度。将抗MAA加合物抗体浓度测定为抗体MAA-白蛋白减去单一的白蛋白的抗体浓度的浓度。
[0205]如图4中所阐述，相比正常对照、患有早期阶段CAD的个体和患有晚期阶段CAD的个体，患有急性MI的个体具有显著偏高的抗MAA加合物抗体水平。
[0206]存在关于以上分析的特异性的问题，因此进行了研究来表明检测到得抗体即为加合物MAA的抗体。使用牛血清白蛋白(BSA)和用MAA修饰的BSA(BSA-MAA)抑制了血清抗体浓度。将抗体维持在恒定的稀释水平并将不同浓度的BSA或BSA-MAA用作抑制剂。将抗体和抑制剂一起孵育，随后将他们加入到分析孔中并按如上所述使其发展。产生的数据，呈现为百分比抑制，展示在图5中。如其中所示，MAA特异性抗体包含约70%的信号。
[0207]在这些关于MAA的抗体的研究过程中获得了有趣的观察结果。在心肌梗死(MI)时和稳定后24小时收集血清。如图6中所显示，MI后24小时抗体浓度显著减少。不受具体理论所束缚，据信这是由于组织被破坏时产生且在MI期间被释放的修饰蛋白质对抗体的结合和扣留。
[0208]还检测了来自冠状动脉旁路移植术(CABG)患者的主动脉钻取活组织检查中MAA的存在。用MAA的抗体着色来自冠状动脉旁路移植术(CABG)患者的钻取活组织检查。结果显示在图7中。用小鼠(中图)或兔血清(右图)阻塞组织，随后与用红外线颗粒(680nm)直接标记的小鼠或兔抗MAA孵育。通过共聚焦显微镜(63倍)评估片子。组织的自发荧光由左图中的组织表示。如图7中所阐述，MAA存在于这些患者的主动脉中。[0209]图8提供了易损斑块的图解，显示了脂质核心、炎症位点、薄纤维帽和MAA修饰的蛋白质(MAA加合物)的位置。
[0210]在另一研究中，测定了 JCR大鼠体内MAA修饰的大鼠白蛋白的血清抗体浓度。用高胆固醇饮食喂养JCR大鼠6-8个月。分析了血清，以验证大鼠的用MAA修饰的血清白蛋白(RSA-MAA)、正常大鼠血清白蛋白(RSA)或主动脉和用MAA修饰的主动脉的抗体的存在。数据显示在图9中。对未修饰蛋白质减去MAA修饰的蛋白质的活性间的差异表示为ng/ml的从标准曲线推测来的大鼠IgG。
[0211]还进行了来自JCR大鼠的主动脉组织的MAA修饰的蛋白质(MAA蛋白质加合物)的免疫沉淀反应。喂养JCR大鼠高胆固醇饮食6-8个月。收集了来自JCR大鼠或斯普拉-道来氏大鼠的主动脉组织，并使用单克隆抗MAA抗体免疫沉淀。通过SDS-PAGE溶解蛋白质并用兔抗MAA抗体通过免疫印迹探测。结果显示在图10中。数据表示88带的着色性88-kDa的强度，表示为3个动物实验的均值土SEM。JCR大鼠显示显著偏高的MAA加合物水平。
[0212]该模型似乎在模仿人体系统，关于:1)发展动脉粥样硬化斑块；2)发展对MAA修饰的蛋白质抗体滴度；和3)可以在发展出动脉粥样硬化的JCR大鼠的主动脉中检测到MAA修饰的蛋白质的形成。
[0213]不受具体理论所束缚，据信在动脉粥样硬化的进展中和在特定的冠状动脉疾病中，建立了炎症位点，其中被氧化的蛋白质和LDL结合、内在化并起始前炎症反应。一些oxLDL和MAA修饰的蛋白质被从该位点释放，并迁移到免疫系统来以负荷依赖性方法启动免疫反应。起始了与动脉粥样硬化斑块的发展以及其进展相关的抗体。MAA的抗体越多，斑块不稳定的几率越大。随着oxLDL和加合的蛋白质积聚，更多的炎症细胞积聚、渗入，且斑块生长，造成心绞痛。最后，炎症变得具有压倒性，由于细胞因子和免疫反应，造成纤维斑块帽变薄，且由于漏膜和对泄露的修饰的大分子的响应，抗体浓度增加。最终，斑块破裂造成释放大量的oxLDL和与循环性抗体结合的MAA修饰的蛋白质，引起减少的抗体浓度。
[0214]实施例3
[0215]患有动脉粥样硬化疾病和急性心肌梗死的患者体内增加的MAA-蛋白质加合物和抗MAA抗体:用于评估易损斑块的新的生物标志物
[0216]被氧化的蛋白质涉及动脉粥样硬化的发展和进展。丙二醛/乙醛(MAA)修饰的LDL被高度氧化且优势表位在用丙二醛修饰蛋白质后形成。MAA修饰的蛋白质还与内皮细胞和巨噬细胞上的清道夫受体结合，并促进前炎症细胞因子的释放。已经在动脉粥样硬化的JCR大鼠模型中检测到了 MAA修饰的蛋白质。
[0217]目标:
[0218]该研究的目的是评估来自患有动脉粥样硬化的患者的组织以验证MAA加合的蛋白质的存在,并测定这些患者体内循环性抗MAA抗体的水平。
[0219]方法:
[0220]收集了来自正常对照(N=82)、稳定型心绞痛(N=42)、急性心肌梗死(AMI) (N=39)和冠状动脉旁路移植术(CABG) (N=72)的血清样品，并测试了循环性MAA修饰的蛋白质和抗MAA抗体的存在。使用单克隆小鼠抗MAA抗体，使来自CABG患者的主动脉钻取活组织检查经历了免疫组织化学着色，并通过共聚焦显微镜检测。
[0221]结果:[0222]相比正常健康的对照，来自患有稳定型心绞痛、急性MI和CABG的患者的血清中的MAA修饰的蛋白质的循环性抗体被显著性增加(P〈0.001)。相比来自稳定型心绞痛(P<0.04)或CABG(P〈0.004)患者的血清样品，来自患有急性MI的患者的血清样品具有显著增加的循环性抗MAA抗体水平。主动脉钻取活组织检查的共聚焦显微镜检查显示增加的MAA加合物水平。
[0223]益论:
[0224]AMI患者体内抗MAA抗体显著偏低的水平被认为是急性期期间抗体产生的初始增力口，伴随着随后随着在患者的支架或搭桥手术前的医疗稳定后修饰的蛋白质或LDL被清除又减少的结果。这些数据显示了循环性抗MAA抗体水平的显著增加和患有动脉粥样硬化的患者的组织中MAA加合物的存在。抗MAA抗体和MAA修饰的蛋白质可以用作动脉粥样硬化疾病另外的生物标志物和易损斑块的估量。
[0225]实施例4
[0226]CAD中的MAA的抗体同种型
[0227]测定了来自正常对照、急性MI患者、稳定早期CAD患者和稳定晚期CAD患者的血清中的MAA加合物的不同抗体同种型(IgG、IgM和IgA)的血清浓度。如图11中所显示，相比正常对照或患有稳定早期CAD或稳定晚期阶段CAD的患者，患有急性MI的患者具有显著偏高的MAA加合物的IgG水平。
[0228]如图12中所显示，相比正常对照和患有稳定早期CAD或稳定晚期CAD的患者，患有急性MI的患者具有显著偏高的MAA加合物的抗体的IgM水平。这些发现紧密地模仿了观察到的MAA加合物的IgG抗体的发现。
[0229]图13显示相比正常对照或患有稳定早期CAD和稳定晚期CAD的患者，来自患有稳定晚期CAD的患者的血清具有显著偏高的MAA加合物的IgA抗体水平。患有稳定早期CAD和急性MI的患者也具有显著高于正常对照的MAA加合物的IgA抗体水平。
[0230]不受具体理论所束缚，据信在动脉粥样硬化进展期间，且尤其是在冠状动脉疾病期间，建立了炎症位点，其中被氧化的蛋白质和LDL结合、内在化和启动前炎症反应。一些oxLDL和MAA修饰的蛋白质被从该位点释放，并迁移到免疫系统来以负荷依赖性方法启动免疫反应，引起IgM抗体的产生。随着oxLDL和加合的蛋白质积聚，更多的炎症细胞渗入，且斑块生长，造成心绞痛。最后，炎症变得具有压倒性，IgM抗体被类别转换为更具致病性的IgG抗体，其帮助纤维斑块帽变薄(由于细胞因子和免疫反应)，且由于漏膜和对增加的泄露的修饰的大分子水平的响应，抗体浓度增加。最终斑块破裂造成大量的oxLDL和MAA修饰的蛋白质的释放和急性心肌梗死。作为选择，在患有稳定CAD的患者体内，oxLDL和加合的蛋白质在帽的外膜边(不在脉管系统的内腔内)上积累，且炎症反应得到减少。释放的细胞因子造成IgA反应，其为更少致病性的，且纤维斑块帽被保持完整，导致稳定性CAD。
[0231]实施例5
[0232]区别正常冠状动脉、稳定的动脉粥样化病灶和不稳定的动脉粥样化病灶:患有动脉粥样硬化疾病和急性心肌梗死的患者中MAA-蛋白质加合物和抗MAA抗体同种型
[0233]被氧化的蛋白质涉及动脉粥样硬化的发展和进展。制造了丙二醛(MDA)-乙醛(AA)加合物(MAA)，且其为用氧化性产物MDA孵育蛋白质后形成的优势表位。此外，已经在JCR动脉粥样硬化大鼠主动脉组织和动脉粥样硬化的人体模型中检测到了这些MAA修饰的蛋白质。MAA修饰的蛋白质涉及动脉粥样硬化疾病的进展。
[0234]且起:
[0235]本研究的目的是评估MAA加合的蛋白质和循环性IgM、IgG和IgA抗MAA抗体同种型与具有正常冠状动脉的患者和患有稳定和不稳定动脉粥样硬化病变的患者的关联。
[0236]方法:
[0237]在6个月期间，收集了来自正常对照(n=82)、稳定型心绞痛(n=42)、急性心肌梗死(AMI) (n=41)和冠状动脉旁路移植术(CABG) (n=72)患者的血清样品，并测试了抗MAA抗体同种型的存在。所有的样品都在肝素化、干预和/或旁路血液泵起始前收集。使用单克隆小鼠抗MAA抗体使来自CABG患者的大动脉钻取活组织检查经历免疫组织化学(IHC)着色，并通过共聚焦显微镜检测。
[0238]益果:
[0239]相比患有冠状动脉疾病(p〈0.001)的患者，正常对照患者具有显著偏低的循环性抗 MAA IgG(97ng/ml, SE=6.9)和 IgA(82ng/ml)。相比稳定型心绞痛(186ng/ml, SE=20.7)(ρ〈0.04)或CABG患者(163ng/ml, SE=14.6) (ρ〈0.004)，AMI患者具有显著增加的循环性抗 MAA IgG 抗体(242ng/ml, SE=30.5)水平。相比稳定型心绞痛(367ng/ml, SE=64.4)(ρ〈0.001)或AMI患者(361ng/ml, SE=65.0) (ρ〈0.001)，来自患有CABG的患者的血清样品具有显著增加的循环性抗MAA IgA抗体(2495ng/ml，SE=334)水平。抗MAA IgM抗体以与IgG结果类似的形式在组间显著不同。主动脉钻取活组织检查的共聚焦显微镜检查证实主动脉中层间隙中MAA加合物增加的水平。
[0240]益论:
[0241]这些数据表明MAA修饰的蛋白质存在于动脉粥样硬化组织，且患有冠状动脉疾病的患者中循环性抗MAA抗体(IgM、IgG和IgA)水平存在显著增加。相比正常冠状动脉和稳定型CAD患者，展现AMI的患者中抗MAA IgM和IgG表型显著增加，然而，相比所有其他的组，进行过CABG的患者体内抗MAA IgA表型显著增加。免疫球蛋白表型(IgM、IgG和/或IgA)被假定为仅次于患病组织中MAA修饰的蛋白质的抗原致敏作用的差异(Thl对Th2)。
[0242]应思:
[0243]抗MAA IgM、IgG和IgA抗体同种型以及MAA修饰的蛋白质可以用作亚临床的动脉粥样硬化疾病(IgM、IgG和IgA)的生物标志物，以及用作区分具有稳定型(IgA)和不稳定型(IgG)动脉粥样硬化斑块的CAD患者。
[0244]应当理解本文中描述的实例和实施方案仅用于示例性目的，且基于其的不同的修饰或改变被教导给本领域技术人员且被包括在本申请的精神和范围以及附加的权利要求的范围内。本文中引用的所有的出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，用于所有目的。
【权利要求】
1.鉴定哺乳动物具有提高的不利心血管事件风险和/或确定所述哺乳动物的预后的方法，所述方法包括: 确定与来自所述哺乳动物的生物样品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平或使其得到确定，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，所述抗体的提高的水平指示所述哺乳动物患有一种或多种动脉粥样硬化病变。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括确定与所述加合物结合的IgG抗体的存在和/或水平或使其得到确定。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定与所述加合物结合的IgM抗体的存在和/或水平或使其得到确定。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定与所述加合物结合的IgA抗体的存在和/或水平或使其得到确定。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，所述IgG抗体和/或所述IgM抗体的提高的水平指示所述哺乳动物具有一个或多个动脉粥样硬化斑块和存在患心脏动脉疾病风险。
6.如权利要求5所述的方法，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，所述IgA抗体提高的水平指示所述哺乳动物患有稳定型心绞痛。
7.如权利要求5所述的方法，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，所述IgA抗体的水平指示所述哺乳动物患有不稳定型心绞痛且存在明显的心肌梗死风险。
8.如权利要求5-6中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被作为具有提高的不利心血管事件风险的个体和/或被作为患`有稳定型心绞痛的个体接受治疗。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物被作为患有不稳定型心绞痛且存在明显的心肌梗死风险的个体接受治疗。
10.如权利要求8-9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被开出了补充测试的处方和/或进行了所述补充测试。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述补充测试不为测量与MAA加合物结合的抗体。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述补充测试包括选自以下的一种或多种测试:心脏组织损伤或高心脏病发作风险的血液检查、心电图、压力测试、冠脉MRI和冠状动脉造影。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述血液检查包括选自以下的一种或多种测试:肌钙蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌红蛋白。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述压力测试包括选自以下的一种或多种测试:运动耐量测试、核压力测试、心脏MRI压力和压力超声波心动图。
15.如权利要求8-14中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被开出治疗的处方和/或被治疗。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述治疗包括给予药物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述药物包含选自以下的一种或多种药物:他汀类、β -受体阻滞剂、硝酸甘油或其他的硝酸盐、肝素、ACE抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、钙通道阻滞剂以及雷诺嗪。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述治疗为选自以下的治疗:血管成形术、经皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠状动脉搭桥术。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述抗MAA加合物IgG抗体或抗MAA-1gM抗体水平和/或基于，至少部分基于所述水平的诊断被记录在患者病历中。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述抗MAA加合物IgA抗体和/或基于，至少部分基于所述水平的诊断被记录在患者病历中。
21.如权利要求19-20中任一项所述的方法，其中所述患者病历由实验室、医师诊所、医院、健康维护组织、保险公司或私人病历网站维护。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中至少部分基于抗MAA加合物IgG抗体水平，和/或IgM抗体水平，和/或IgA抗体水平的诊断，被记录在选自以下的医师警示物品上/内:卡、穿戴物或射频识别(RFID)标记。
23.如权利要求19-20中任一项所述的方法，其中所述抗体水平和/或基于所述抗体水平的诊断被记录在非暂时性的计算机可读媒介上。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，还包括告知所述个体抗MAA加合物抗体和/或至少部分基于抗MAA加合物抗体分析的诊断的结果。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述与MAA加合物结合的抗体作为差别诊断的一部分被检测。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为非人的哺乳动物，且所述生物样品来自所述非人的哺乳动物。`
27.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为人，且所述生物样品来自所述人。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括选自以下的样品:全血、血液部分、痰/ 口腔液体、尿、组织活检、胸膜液、心包液、脑脊液和腹膜液。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中在分析中检测抗MAA加合物抗体，在所述分析中，所述生物样品被分开以从至少一种其他的样品组分中分离包含所述抗体的部分。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为已知患有或怀疑患有动脉粥样硬化的哺乳动物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物具有选自以下的一种或多种风险因子:心脏病家族风险、高血压、高LDL胆固醇和低HDL胆固醇、高甘油三酯、肥胖、糖尿病、烟草使用、代谢综合征、结缔组织病症、慢性感染和炎症性肠病。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中在分析中检测了与MAA加合物结合的IgG抗体和/或IgM抗体,和/或IgA抗体,在所述分析中，所述抗体和/或在所述抗体和MAA加合物之间形成的复合物变得标记有可检测标记。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中在分析中检测了与MAA加合物结合的IgG抗体,和/或IgM抗体,和/或IgA抗体,在所述分析中，所述抗体通过与其他的分析组分形成复合物由未结合状态变成了结合状态。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中在分析中检测了与MAA加合物结合的IgG抗体，和/或IgM抗体，和/或IgA抗体，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗体变成固定在固相上。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中使用选自以下的分析测量所述IgG抗体、IgM抗体，和/或IgA抗体中的一种或多种的水平:SDS/PAGE、等电点聚焦、2维凝胶电泳、血凝分析和免疫分析。
36.如权利要求35所述的方法，其中使用ELISA分析测量IgG抗体、IgM抗体，和/或IgA抗体中的一种或多种的水平。
37.如权利要求35-36中任一项所述的方法，其中所述免疫分析包括: 提供被固定在固相支持体上的MAA加合物； 在这样的条件下将所述MAA加合物与所述生物样品接触，其中所述样品中的抗MAA加合物抗体与MAA加合物结合，形成加合物/抗体复合物；和 将所述复合物与特异性结合IgG抗体或IgA抗体或IgM抗体的检测抗体接触，或者将所述复合物与结合任一抗体的检测试剂接触；和 检测和/或定量所述结合的检测抗体或所述结合的检测试剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中: 所述检测抗体被连接到可检测标记上或被连接到可检测标记上的另一抗体结合；和/或所述检测试剂被连接到可检测标记上和/或所述检测试剂被连接到可检测标记上的抗体结合；且 所述检测和/或定量包括检测和/或定量所述可检测标记。
39.监测哺乳动物中动脉粥样硬化进展的方法，所述方法包括:` 确定与来自所述哺乳动物的生物样品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平或使其得到确定；和 将所述抗体的水平与在先前的时间点测得的所述哺乳动物的水平比较，其中: 相比先前的测定，与所述生物样品中的所述MA A加合物结合的抗体的总水平的增加，指示所述哺乳动物中动脉粥样硬化病变已经恶化；且 相比先前的测定，与所述生物样品中的所述MAA加合物结合的抗体的总水平的减少，指示所述哺乳动物中动脉粥样硬化病变得到减轻或进展的风险得到减少。
40.如权利要求39所述的方法，其中在所述先前的时间点与所述确定或使其得到确定的时间之间的时期，所述哺乳动物的动脉粥样硬化得到治疗，且: 相比先前的测定，与所述生物样品中的所述MAA加合物结合的抗体的总水平的增加，指示所述治疗具有有限的功效或没有功效且所述哺乳动物中病变已经恶化；和 相比先前的测定，与所述生物样品中的所述MAA加合物结合的抗体的总水平的减少，指示所述治疗至少具有一些功效且所述哺乳动物中动脉粥样硬化病变得到减少，或进展的风险得到减少。
41.如权利要求39-40中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定与所述加合物结合的IgG抗体的存在和/或水平或使其得到确定。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定与所述加合物结合的IgM抗体的存在和/或水平或使其得到确定。
43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定与所述加合物结合的IgA抗体的存在和/或水平或使其得到确定。
44.如权利要求39-43中任一项所述的方法，其中:相比先前的测定，与所述生物样品中的所述MAA加合物结合的抗体的总水平和/或从IgM到IgG和/或IgA抗体的类别转换的增加，指示所述哺乳动物中动脉粥样硬化病变已经恶化；且 相比先前的测定，与所述生物样品中的所述MAA加合物结合的抗体的总水平和/或从IgM到IgG和/或IgA抗体的类别转换的减少，指示所述哺乳动物中动脉粥样硬化病变得到减少。
45.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中相比先前的测定，IgA抗体的增加指示所述哺乳动物中动脉粥样硬化病变变得更稳定，和/或所述治疗至少部分地增加所述哺乳动物中动脉粥样硬化病变的稳定性。
46.如权利要求40-45中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物的所述治疗包括选自以下的一种或多种形式:改变饮食、增加运动、减肥、开他汀类处方/给予他汀类、开受体阻滞剂处方/给予β -受体阻滞剂、开钙通道阻滞剂处方/给予钙通道阻滞剂、开血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂处方/给予血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、心脏导管插入、压力测试和血管支架。
47.如权利要求39-46中任一项所述的方法，其中如果测量提供所述治疗具有有限功效或没有功效和/或所述哺乳动物中病变已经恶化的指示，则给所述哺乳动物开出补充测试的处方和/或进行补充测试。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述补充测试不为与MAA加合物结合的抗体的测量。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述补充测试包括选自以下的一种或多种测试:心脏组织损伤或高心脏病发作风险的血液检查、心电图、压力测试、冠脉MRI和冠状动脉造`影。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述血液检查包括选自以下的一种或多种测试:肌钙蛋白Ι、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌红蛋白。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述压力测试包括选自以下的一种或多种测试:运动耐量测试、核压力测试和压力超声波心动图。
52.如权利要求39-51中任一项所述的方法，其中如果测量提供治疗具有有限的功效或没有功效和/或所述哺乳动物中病变已经恶化的指示，则给所述哺乳动物开出需新的治疗、不同的治疗或补充治疗的处方，和/或使用新的治疗、不同的治疗或补充治疗对其治疗。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述治疗包括给予药物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述药物包括选自以下的一种或多种药物:他汀类、β -受体阻滞剂、硝酸甘油或其他的硝酸盐、肝素、ACE抑制剂、血管紧张素受体受体阻滞剂(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、钙通道阻滞剂以及雷诺嗪。
55.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述治疗为选自以下的治疗:血管成形术、经皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠状动脉搭桥手术。
56.如权利要求39-55中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为非人的哺乳动物，且所述生物样品来自所述非人的哺乳动物。
57.如权利要求39-55中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为人，且所述生物样品来自所述人。
58.如权利要求56-57中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括选自以下的样品:全血、血液部分、血浆、血清、组织液、痰/ 口腔液体、尿、组织活检、胸膜液、心包液、脑脊液和腹膜液。
59.如权利要求62-58中任一项所述的方法，其中在分析中检测抗MAA加合物抗体，在所述分析中，将所述生物样品分开以从至少一种其他的样品组分中分离包含所述抗体的部分。
60.如权利要求39-59中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为已知患有或怀疑患有动脉粥样硬化的哺乳动物。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述哺乳动物具有选自以下的一种或多种风险因子:心脏病家族风险、高血压、高LDL胆固醇和低HDL胆固醇、高甘油三酯、肥胖、糖尿病、烟草使用、代谢综合征、结缔组织病症、慢性感染和炎症性肠病。
62.治疗哺乳动物的方法，所述方法包括: 接受与来自所述哺乳动物的生物样品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)结合的抗体的存在和/或水平的测量，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，所述抗体的提高的水平指示所述哺乳动物患有一种或多种动脉粥样硬化病变；和 当所述抗体显示提高的水平时，提供与动脉粥样硬化相关的对所述哺乳动物的补充测试或使其得到提供，和/或提供与动脉粥样硬化相关的对所述哺乳动物的补充治疗或使其得到提供。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述方法包括接受与所述加合物结合的IgG抗体的存在和/或水平的测量。`
64.如权利要求62-63中任一项所述的方法，其中所述方法包括接受与所述加合物结合的IgM抗体的存在和/或水平的测量。
65.如权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述方法包括接受与所述加合物结合的IgA抗体的存在和/或水平的测量。
66.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，所述IgA抗体提高的水平指示所述哺乳动物患有稳定型心绞痛，且所述哺乳动物被进一步测试和/或被作为患有稳定型心绞痛或存在稳定型心绞痛的风险的个体接受治疗。
67.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其中相比正常健康的哺乳动物中发现的水平，所述IgA抗体的水平指示所述哺乳动物患有不稳定型心绞痛且存在明显的心肌梗死风险，且所述哺乳动物被进一步测试和/或被作为患有不稳定型心绞痛和/或心肌梗死或存在不稳定型心绞痛和/或心肌梗死风险的个体接受治疗。
68.如权利要求62-67中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被开出补充测试的处方和/或进行了所述补充测试。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述补充测试不为与MAA加合物结合的抗体的测量。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述补充测试包括选自以下的一种或多种测试:心脏组织损伤或高心脏病发作风险的血液检查、心电图、压力测试、冠脉MRI和冠状动脉造影。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述血液检查包括选自以下的一种或多种测试:肌钙蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌红蛋白。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述压力测试包括选自以下的一种或多种测试:运动耐量测试、核压力测试和压力超声波心动图。
73.如权利要求62-72中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被开出治疗的处方和/或被治疗。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述治疗包括给予药物。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述药物包括选自以下的一种或多种药物:他汀类、β -受体阻滞剂、硝酸甘油或其他的硝酸盐、肝素、ACE抑制剂、血管紧张素受体受体阻滞剂(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、钙通道阻滞剂以及雷诺嗪。
76.如权利要求73-75中任一项所述的方法，其中所述治疗为选自以下的治疗:血管成形术、经皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠状动脉搭桥手术。
77.如权利要求62-76中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为非人的哺乳动物，且所述生物样品来自所述非人的哺乳动物。
78.如权利要求62-76中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为人，且所述生物样品来自所述人。
79.如权利要求62-78中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括选自以下的样品:全血、血液部分、血浆、血清、组织液、痰/ 口腔液体、尿、组织活检、胸膜液、心包液、脑脊液和腹膜液。`
80.如权利要求62-79中任一项所述的方法，其中在分析中检测抗MAA加合物抗体，在所述分析中，将所述生物样品分开以从至少一种其他的样品组分中分离包含所述抗体的部分。
81.如权利要求62-80中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为已知患有或怀疑患有动脉粥样硬化的哺乳动物。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述哺乳动物具有选自以下的一种或多种风险因子:心脏病家族风险、高血压、高LDL胆固醇和低HDL胆固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、烟草使用、代谢综合征、结缔组织病症、慢性感染以及炎症性肠病。
83.如权利要求62-82中任一项所述的方法，其中在分析中确定与MAA加合物结合的IgG抗体和/或IgM抗体，和/或IgA抗体的测量，在所述分析中，抗体和/或所述抗体和MAA加合物之间形成的复合物变得标记有可检测标记。
84.如权利要求62-83中任一项所述的方法，其中在分析中确定与MAA加合物结合的IgG抗体，和/或IgM抗体，和/或IgA抗体的测量，在所述分析中，所述抗体通过与其他的分析组分形成复合物由未结合状态变成了结合状态。
85.如权利要求62-84中任一项所述的方法，其中在分析中确定与MAA加合物结合的IgG抗体，和/或IgM抗体，和/或IgA抗体的测量，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗体变成了被固定在固相上的抗体。
86.如权利要求62-85中任一项所述的方法，其中使用选自以下的分析测量IgG抗体、IgM抗体，和/或IgA抗体中的一种或多种的水平:SDS/PAGE、等电点聚焦、2维凝胶电泳、血凝分析和免疫分析。
87.如权利要求86所述的方法，其中使用ELISA分析测量IgG抗体、IgM抗体，和/或IgA抗体中的一种或多种的水平。
88.如权利要求86-87中任一项所述的方法，其中所述免疫分析包括: 提供被固定在固相支持体上的MAA加合物； 在这样的条件下将所述MAA加合物与所述生物样品接触，其中所述样品中的抗MAA加合物抗体与MAA加合物结合，形成加合物/抗体复合物；和 将所述复合物与特异性结合IgG抗体或IgA抗体，或IgM抗体的检测抗体接触，或者将所述复合物与结合任一抗体的检测试剂接触；和 检测和/或定量所述结合的抗体或所述结合的检测试剂。
89.如权利要求88所述的方法，其中 所述检测抗体被连接到可检测标记上或被连接到可检测标记上的另一抗体结合；和/或所述检测试剂被连接到可检测标记上和/或所述检测试剂被连接到可检测标记上的抗体结合；和 所述检测和/或定量包括检测和/或定量所述可检测标记。
90.用于评估哺乳动物中动脉粥样硬化的存在和/或预后的试剂盒，所述试剂盒包含含有以下的包装: MAA蛋白质加合物；和 与结合在所述MAA蛋白质加合物`上的IgG抗体特异性结合的第一试剂，和/或与结合在所述MAA蛋白质加合物的IgM抗体特异性结合的第二试剂。
91.如权利要求90所述的试剂盒，还包含与结合在所述MAA蛋白质加合物上的IgA抗体特异性结合的第三试剂。
92.如权利要求90-91中任一项所述的试剂盒，其中所述第一试剂包含与结合在所述MAA蛋白质加合物上的IgG抗体结合的抗体。
93.如权利要求90-92中任一项所述的试剂盒，其中所述第二试剂包含与结合在所述MAA蛋白质加合物上的IgM抗体结合的抗体。
94.如权利要求91-93中任一项所述的试剂盒，其中所述第三试剂包含与结合在所述MAA蛋白质加合物上的IgA抗体结合的抗体。
95.如权利要求90-94中任一项所述的试剂盒，其中所述MAA蛋白质加合物以被固定在固相支持体上的形式提供。
96.如权利要求95所述的试剂盒，其中所述固相支持体包括选自以下的材料:塑料、玻璃、石英、凝胶和金属。
97.如权利要求95所述的试剂盒，其中所述固相支持体选自:颗粒、测试条、微量滴定板、ELISA盘和微流通道或室。
98.如权利要求90-97中任一项所述的试剂盒，还包含指导材料，所述指导材料教导使用MAA加合物抗体的测量以评估不利心脏事件风险，和/或确定哺乳动物的预后，和/或评估哺乳动物中动脉粥样硬化的进展，和/或评估治疗方案。
99.如权利要求90-98中任一项所述的试剂盒，用于评估不利心脏事件风险、和/或确定哺乳动物的预后，和/或用来评估哺乳动物中动脉粥样硬化的进展，和/或用来评估治疗方案。
100.治疗哺乳动物的方法，所述方法包括: 给予所述哺乳动物包含抗体的组合物，所述抗体特异性结合连接到可检测标记上的MAA加合物或能被可检测标记选择性结合； 检测位于所述哺乳动物的脉管系统内的所述标记的位置，其中所述位置指示潜在的不稳定斑块。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述方法还包括治疗所述潜在的不稳定斑块。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述治疗包括对所述斑块位于的区域进行血管成形术。
103.如权利要求101-102中任一项所述的方法，其中所述治疗包括在所述斑块位于的区域内插入支架。`
【文档编号】G01N33/68GK103518135SQ201280022809
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年3月12日 优先权日:2011年3月11日
【发明者】杰弗里·M·蒂勒, 丹尼尔·R·安德森, 迈克尔·J·杜里埃 申请人:内布拉斯加大学董事委员会