一种纤维单胞菌科作为工业生物催化剂的应用的制作方法

本发明属生物化工领域，具体涉及一种纤维单胞菌科作为工业生物催化剂的应用。

背景技术：

紫杉烷类药物，代表药如紫杉醇、多烯紫杉醇，是目前最主要的抗癌药之一(Nature Reviews Cancer 4,253-265(2004))。但由于结构复杂，化学合成困难，目前主要来自基于红豆杉植株的生产工艺(Current Medicinal Chemistry 20,880-891(2013))。红豆杉植株中紫杉醇本身的含量并不高(0.01％in bark of Taxus brevifolia)，一度出现过严重的资源危机。但一些红豆杉植株中却存在着大量的紫杉烷类前体化合物或衍生物，如10-DAXP在Taxus yunnanensis和Taxus mairei枝叶中的含量同10-DAB处于同一水平(～0.1％)，因而也是紫杉烷药物的一个重要潜在来源。如果能够从10-DAXP到紫杉醇完成高效转化，将会大大提高自然资源的利用度，进一步解决紫杉醇资源危机。另外，10-DAB到紫杉醇需要合成侧链再乙酰化需要11步反应和7步纯化7，而10-DAXP则只需要去掉C-7木糖基后，C-10乙酰化即可得到紫杉醇。将10-DAB只用于多西紫杉醇的合成，将会节约大量的活泼化学试剂和有机溶剂，无论是资源的浪费、经济成本还是对环境的危害，都会大大降低7。因此，10-DAXP资源的转化利用研究一直是一个热点。

前人的筛选结果显示，已商业化的糖苷酶并未表现出10-DAXP水解活性。从自然界中筛选出的代谢水解菌或酶有Moraxella sp.13,Leifsonia shinshuensis14,Enterobacter sp.,Streptomyces matensi,Arthrobacter nicotianae,Achromobacter piechaudii,and Pseudomonas plecoglossicida16,and Lentinala edodes17等，其中来 自Lentinala edodes的木糖苷酶催化效率最高，对10-DAXP的Km为1.79±0.07mM，kcat为1.92s-1，但该效率完全无法到达上述DAXP工业化要求，该酶经重组表达为胞内酶后，难以富集和分离而导致催化效率受到更进一步限制。上述研究结果表明，10-DAXP的C-7木糖苷键的选择性高效水解极具挑战，需要全新的催化和稳定性结构才能完成。

此外，还有很多天然化合物都存在类似情况，如黄芪甲苷，薯蓣皂苷等等。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种纤维单胞菌科作为工业生物催化剂的应用，可将含木糖苷键或葡糖苷键的化合物水解而获得相应的苷元。本发明使用微球菌亚目下的纤维单胞菌科所有已知菌属的至少5个典型菌株或该菌株所产生的酶接触含有至少一种木糖苷键或葡糖苷键的黄芪皂苷类、紫杉烷木糖苷类化合物，并水解相应的糖苷键。该方法可以制备至少一种上述糖苷化合物的苷元，也可以制备在转化上述苷元的过程中所产生的具有药理活性的中间产物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种纤维单胞菌科作为工业生物催化剂的应用，该纤维单胞菌科用于水解糖苷化合物的木糖苷和葡萄糖苷键，从而制备其相应的苷元或半水解产物；应用于生物医药领域、制备医药中间体，也可以用于能源、农业、食品领域，制备单糖或者其相应苷元。

所述的纤维单胞菌科为：Cellulomonadaceae及其所包含的种属，包括Cellulomonas flavigena，Oerskovia enterophila，Oerskovia turbata，Demequina aestuarii，或者Actinotalea fermentans，(包括纤维单孢菌属，厄氏菌属,去甲基醌菌属或光柱菌属)。

所述的糖苷化合物为：带有木糖基和/或葡萄糖基的化合物，如紫杉烷木糖苷类化合物，黄芪皂苷类化合物。

一种纤维单胞菌科作为工业生物催化剂的应用方法，按照以下步骤进行：

(1)粗酶液的制备：将纤维单胞菌通过发酵方法获得粗酶液，培养基的组成包括1～10％％诱导剂，0.2～2％％氮源，0.2％～5％生长因子，0.2％～5％磷酸氢二钾，发酵条件为20-40℃下振荡培养；

(2)苷元或半水解产物的制备：用上述粗酶液水解糖苷化合物的木糖苷和葡萄糖苷键，糖苷化合物溶液与粗酶液以体积比1:10～1混合，孵育温度为20-40℃，反应时间为1-6h；转化后，可用乙酸乙酯萃取合并，减压蒸干后，上硅胶柱并用氯仿:甲醇进行洗脱，可得苷元或半水解产物。

所述的糖苷化合物溶液为紫杉烷木糖苷类化合物或黄芪皂苷类化合物。

所述苷元或半水解产物为7-羟基紫杉烷类化合物或者黄芪皂苷元。

所书糖苷化合物溶液的浓度为：0.01～100毫摩尔每升。

微球菌亚目下纤维单胞菌科的典型菌属的至少5个典型菌株菌株(见图1)，它们分别为Cellulomonas flavigena JCM 18109，Oerskovia enterophila JCM 7350(X83807)，Oerskovia turbata JCM 3160，Demequina aestuarii JCM 12213，Actinotalea fermentans JCM 9966。

所述生物学纯的上述菌株或其发酵产生的水解酶，接触至少一种含有木糖苷键或葡糖苷键的黄芪皂苷类、紫杉烷木糖苷类化合物，并水解相应的糖苷键，制备得到相应的苷元。

本发明提供的水解方法已考虑到具有上述分子结构的化合物的手性中心的所有立体构型，这些立体异构体或单独被水解，或与其它立体异构体混合在一起被水解。

本发明提供的方法的实用价值在于：至今为止，未有关于上述纤维单胞菌科菌株水解上述糖苷化合物活力的报道。本发明提供该科属菌株的新功能，及其在糖苷类化合物苷元及其半水解产物制备中的应用。

由植物材料提取的紫杉烷木糖苷和黄芪甲苷混合物用本发明提供的方法水解，效果很好。

附图说明

图1为：纤维单胞菌科和原小单胞菌科的进化关系及其对紫杉烷木糖苷的水解功能分布图。

图2为：7-木糖紫杉烷的转化结果HPLC-UV图；

其中(a)10-DAXP到10-DAP的生物转化；(b)7-木糖紫杉烷混合物的转化；1 10-DAXP,2 10-DAXC,3 10-DAXPc,1’10-DAP,2’10-DAC,3’10-DAPc,1”7-epi-10-DAP。

具体实施方式

以下实施例只是用于展示本发明的一些具体实施案例，而不是为了限制本发明的适用范围的。

实施例1

粗酶液的制备

使用含1％淀粉，0.2％蛋白胨，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氢二钾的培养基(灭菌前pH 7.0)作为培养基。将纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)的Cellulomonas flavigena菌，接种到上述培养基中，30℃下150rpm振荡培养24h。发酵培养结束后，离心去细胞后，取上清，即为粗酶液。

实施例2

粗酶液的制备

使用含1％淀粉，0.2％蛋白胨，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氢二钾的培养基(灭菌前pH 7.0)作为培养基。将纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)的Oerskovia enterophila或Oerskovia turbata菌，接种到上述培养基中，30℃下150rpm振荡培养24h。发酵培养结束后，离心去细胞后，取上清，即为粗酶液。

实施例3

粗酶液的制备

使用含1％淀粉，0.2％蛋白胨，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氢二钾的培养基(灭菌前pH 7.0)作为培养基。将纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)的Demequina aestuarii菌，接种到上述培养基中，30℃下150rpm振荡培养24h。发酵培养结束后，离心去细胞后，取上清，即为粗酶液。

实施例4

粗酶液的制备

使用含1％淀粉，0.2％蛋白胨，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氢二钾的培养基(灭菌前pH 7.0)作为培养基。将纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)的Actinotalea fermentans菌，接种到上述培养基中，30℃下150rpm振荡培养24h。发酵培养结束后，离心去细胞后，取上清，即为粗酶液。

实施例5

黄芪甲苷IV的水解

在0.9ml实施例一中的粗酶液中加入1ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，再加入0.1ml黄芪甲苷IV的甲醇溶液(浓度为10mg/ml)。100rpm,35℃孵育 12小时后，以环黄芪醇标准品作对照，TLC分析，黄芪甲苷IV几乎全部转化为环黄芪醇。

实施例6

7-木糖-10-去乙酰紫杉醇水解制备10-去乙酰紫杉醇

将10ml 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的甲醇溶液(浓度为5mg/ml)加入到90ml实施例一所述的粗酶液中，100rpm，30℃下反应20小时后，加入20ml乙酸乙酯萃取，合并上层有机相，减压蒸干，获得固体物质，上硅胶柱(20g)并用氯仿:甲醇(98:2)进行洗脱，经HPLC-UV验证(见附图2)，图中1 10-DAXP,2 10-DAXC,3 10-DAXPc,1’10-DAP,2’10-DAC,3’10-DAPc,1”7-epi-10-DAP得到10-去乙酰紫杉醇。

实施例7

黄芪甲苷IV的水解

在0.9ml实施例二或实施例三或实施例四中的粗酶液中加入1ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，再加入0.1ml黄芪甲苷IV的甲醇溶液(浓度为10mg/ml)。100rpm,35℃孵育12小时后，以环黄芪醇标准品作对照，TLC分析，黄芪甲苷IV几乎全部转化为环黄芪醇。

实施例8

7-木糖-10-去乙酰紫杉醇水解制备10-去乙酰紫杉醇

将10ml 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的甲醇溶液(浓度为5mg/ml)加入到90ml实施例二或实施例三或实施例四所述的粗酶液中，100rpm，30℃下分别反映8 小时，12小时和24小时后，加入20ml乙酸乙酯萃取，合并上层有机相，减压蒸干，获得固体物质，上硅胶柱(20g)并用氯仿:甲醇(98:2)进行洗脱，得到10-去乙酰紫杉醇。