一种辐照辅助双酶酶解谷物胚芽制备抗氧化肽的方法与流程

本发明涉及谷物胚芽综合利用开发抗氧化肽技术，尤其涉及一种辐照辅助双酶酶解谷物胚芽制备抗氧化肽的方法。

背景技术：

随着蛋白水解产物抗氧化活性的发现和对小分子肽生理功能的深入认识，抗氧化肽的制备技术已成为当今生物活性肽研究中的热点之一。蛋白酶的商品化为蛋白质在温和条件下通过控制水解的程度获得新型的材料资源提供了有效的工具和手段，所以酶解制备抗氧化肽的技术倍受关注。

谷物胚芽是谷物淀粉加工的副产物，相对于胚乳(主要是淀粉)，其具有更高的营养价值。胚芽是谷物籽粒的生命源泉，除含有淀粉、脂肪、纤维素、多种维生素及矿物质等营养元素外，还蕴含丰富的蛋白质，如麦胚中蛋白质含量高达30％以上。目前绝大部分谷物胚芽被混入皮粕作为饲料或肥料出售，导致宝贵的谷物胚芽资源未能被合理、有效地利用。谷物胚芽蛋白通过特异的蛋白酶水解可生成具有抗氧化活性的氨基酸序列，即抗氧化肽。蛋白水解肽的常规制备技术是先从原料中提取纯化蛋白质，然后再利用酶解技术将其降解成肽，但这样做的弊端是蛋白质在提取纯化过程中用到的试剂及溶剂极易导致蛋白质的性质发生改变(如内部二硫键增加、疏水值升高)，使其溶解性变差、利用率降低，所以在对其进行酶解时不能提高其水解度、肽得率及肽的功能活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有酶解谷物胚芽蛋白制备抗氧化肽方法中存在的问题，提供一种辐照辅助双酶酶解谷物胚芽制备抗氧化肽的方法，以进一步提高酶解效率。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：(1)以麦胚为原料，将其送入⁶⁰Co-γ射线辐照场采用8-10KGy的剂量进行辐照处理；(2)将麦胚粉碎，利用超临界CO₂萃取设备进行脱脂；(3)在经步骤(2)处理的脱脂麦胚粉中加水，使蛋白质含量达到3％-5％(w/w)，将温度调至50℃、pH值调至9.0，加入碱性蛋白酶(Alcalase)，酶解2h；(4)将温度调至50℃、pH值调至7.0，加入中性蛋白酶(Neutrase)，酶解1.5h后灭酶；(5)待自然冷却后，将pH值调至4.0-5.0，按1:1(V:V)的比例加入乙醇后，离心取上清液，将其过分子量为10KDa的超滤膜，取透过液再过分子量为1KDa的超滤膜，取截留液，经浓缩、冷冻干燥得到高活性抗氧化肽。

步骤(1)中所述的辐照场采用的是⁶⁰Co-γ辐照源，源强为9.99×10¹⁵Bq，剂量率为2KGy/h；

步骤(2)中所述将麦胚粉碎是指将麦胚粉碎过40-60目筛，取筛下物；

步骤(2)中所述利用超临界CO₂萃取设备进行脱脂的条件是压力25-35MPa、温度30-35℃、时间120-180min，常温分离，分离压力5MPa，流量13L/min。

碱性蛋白酶的加酶量[E]/[S]为3000U/g～4000U/g，中性蛋白酶的加酶量[E]/[S]为600U/g～1000U/g。

本发明在不进行蛋白提取的情况下，利于⁶⁰Co-γ射线先对谷物胚芽进行辐照处理。⁶⁰Co-γ射线的穿透力极强，对原料经过一定时间和剂量的辐照处理，不仅可以降农残，可有效降低其中大分子物质的聚合度、使结构变得松散、酶反应可及度提高，从而有利于后续酶解过程中蛋白质分子酶切位点的暴露，缩短酶解时间，提高水解度、肽得率及肽的抗氧化活性。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果为：

(1)谷物胚芽资源一直没有得到充分利用和开发，一方面是受传统加工利用方式的影响，对其营养价值认识不够；而最重要的一方面则是因为谷物胚芽的耐储性差导致。因为谷物胚芽中含有丰富的内源酶与脂类，使其很容易酸败变质。本发明采用⁶⁰Co-γ射线对原料进行辐照处理，不仅可以钝化其中的内源酶，而且可以降低其水分活度，极大地提高了原料的耐储性；另外辐照处理可以降农残，提高原料的安全性；

(2)本发明采用⁶⁰Co-γ射线对原料进行辐照处理，可有效降低淀粉、蛋白质等大分子物质的聚合度、使结构变得松散、酶反应可及度提高，提高了水解度、肽得率及肽的抗氧化活性；

(3)本发明采用双酶分步酶解技术，提高了原料中蛋白的水解度和利用率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

(1)以下各实施例中，水解度的测定方法如下：

水解后产生的游离氨基氮用甲醛电位滴定法测定，总氮用凯氏定氮法测定，再按下式计算水解度：

游离氨基氮含量采用甲醛电位滴定法测定步骤为：用移液管吸取10mL水解液于200mL烧杯，加蒸馏水50mL，置于磁力搅拌器上混匀，以精密pH计指示溶液pH值，用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定至pH为8.2，加入10mL预先调至pH8.2的甲醛后，继续用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定至pH 9.2，记录溶液pH值从8.2到9.2间所消耗的NaOH标准溶液体积V₁。以相同条件未酶解的溶液为空白，记录所消耗的0.05mol/L NaOH标准溶液体积V₂，则水解液总游离氨基氮含量为：

游离氨基氮含量(mmol/mL)＝M×(V₁－V₂)/10

式中：M－NaOH标准溶液的摩尔浓度(mol/mL)

V₁－水解液所消耗的NaOH标准溶液体积(mL)

V₂－空白溶液所消耗的NaOH标准溶液体积(mL)

(2)以下各实施例中，肽得率测定的测定方法如下：

采用酸溶性肽含量测定法：

(一)双缩脲测定蛋白质含量标准曲线的绘制

以牛血清白蛋白作标准曲线，利用最小二乘法求牛血清白蛋白浓度X与吸光度Y之间的回归方程。

(二)酸溶性肽含量的测定

量取麦胚蛋白水解液10mL，加入10％三氯乙酸(TCA)10mL与之混合，放置20min，在4000r/min下离心15min，用双缩脲测定上清液中的肽含量。每个样品测定三次，取均值。

(三)肽得率(TCA-PSI)的计算

(3)以下各实施例中，抗氧化活性的测定采用二苯基苦味酰基苯肼自由基(DPPH·)清除率法，具体测定方法如下：

配制浓度为6.5×10^-4mol/L的DPPH·甲醇溶液作为母液，并置入4℃冰箱避光保存。临用前用50％甲醇将母液稀释10倍，然后将稀释后的DPPH·甲醇溶液、50％甲醇及测试样品液按表1进行反应，并于DPPH·甲醇溶液的最大吸收波长517nm测A₀、A_i、A_j所表示样品的吸光度值(注：A_i所表示的样品需在室温下反应30min后方可进行吸光度的测定)。每个试样做三个平行试验，取其平均值。

表1DPPH·试验加样表

样品对DPPH自由基的清除能力(scavenging activity,SA)可表示为：

$SA\left(\%\right)=(1-\frac{A_i-A_j}{A_0})\×100\%$

其中A₀：DPPH·甲醇溶液的吸光度；

A_i：DPPH·甲醇溶液与样品反应后的吸光度；

A_j：样品与甲醇混合液的吸光度。

实施例1：

将麦胚置入源强为9.99×10¹⁵Bq的⁶⁰Co-γ射线辐照场，采用2KGy/h的剂量率、8KGy的剂量进行辐照处理；将麦胚粉碎并过60目筛，取筛下物利用超临界CO₂萃取设备进行脱脂，操作条件为压力25MPa、温度30℃、时间120min，常温分离，分离压力5MPa，流量13L/min；在脱脂麦胚粉中加入去离子水，使蛋白质含量达到3％(w/w)，将温度调至50℃、pH值调至9.0，按酶用量[E]/[S]为4000U/g加入Alcalase反应2h；然后将pH值调至7.0，按酶用量[E]/[S]为1000U/g加入Neutrase反应1.5h后，95℃灭酶10min。待自然冷却后，调pH值为4.0，然后再按1:1(V:V)的比例加入乙醇，在4℃、10000rpm条件下离心10min，并将上清液过分子量为10KDa的超滤膜，取透过液再过分子量为1KDa的超滤膜，取截留液，最后经浓缩、冷冻干燥得到高活性的1-10kDa谷物胚芽蛋白肽冻干粉。酶解液的蛋白水解度、肽得率及抗氧化肽活性结果见表2。

实施例2：

将麦胚置入源强为9.99×10¹⁵Bq的⁶⁰Co-γ射线辐照场，采用2KGy/h的剂量率、10KGy的剂量进行辐照处理；将麦胚粉碎并过40目筛，取筛下物利用超临界CO₂萃取设备进行脱脂，操作条件为压力35MPa、温度35℃、时间180min，常温分离，分离压力5MPa，流量13L/min；在脱脂麦胚粉中加入去离子水，使蛋白质含量达到5％(w/w)，将温度调至50℃、pH值调至9.0，按酶用量[E]/[S]为3000U/g加入Alcalase反应2h；然后将pH值调至7.0，按酶用量[E]/[S]为800U/g加入Neutrase反应1.5h后，95℃灭酶10min。待自然冷却后，调pH值为4.5，然后再按1:1(V:V)的比例加入乙醇，在4℃、10000rpm条件下离心10min，并将上清液过分子量为10KDa的超滤膜，取透过液再过分子量为1KDa的超滤膜，取截留液，最后经浓缩、冷冻干燥得到高活性的1-10kDa谷物胚芽蛋白肽冻干粉。酶解液的蛋白水解度、肽得率及抗氧化肽活性结果见表2。

实施例3：

将麦胚置入源强为9.99×10¹⁵Bq的⁶⁰Co-γ射线辐照场，采用2KGy/h的剂量率、9KGy的剂量进行辐照处理；将麦胚粉碎并过50目筛，取筛下物利用超临界CO₂萃取设备进行脱脂，操作条件为压力30MPa、温度25℃、时间150min，常温分离，分离压力5MPa，流量13L/min；在脱脂麦胚粉中加入去离子水，使蛋白质含量达到4％(w/w)，将温度调至50℃、pH值调至9.0，按酶用量[E]/[S]为3500U/g加入Alcalase反应2h；然后将pH值调至7.0，按酶用量[E]/[S]为600U/g加入Neutrase反应1.5h后，95℃灭酶10min。待自然冷却后，调pH值为5.0，然后再按1:1(V:V)的比例加入乙醇，在4℃、10000rpm条件下离心10min，并将上清液过分子量为10KDa的超滤膜，取透过液再过分子量为1KDa的超滤膜，取截留液，最后经浓缩、冷冻干燥得到高活性的1-10kDa谷物胚芽蛋白肽冻干粉。酶解液的蛋白水解度、肽得率及抗氧化肽活性结果见表2。

实施例4：

将麦胚置入源强为9.99×10¹⁵Bq的⁶⁰Co-γ射线辐照场，采用2KGy/h的剂量率、10KGy的剂量进行辐照处理；将麦胚粉碎并过60目筛，取筛下物利用超临界CO₂萃取设备进行脱脂，操作条件为压力35MPa、温度35℃、时间120min，常温分离，分离压力5MPa，流量13L/min；在脱脂麦胚粉中加入去离子水，使蛋白质含量达到4％(w/w)，将温度调至50℃、pH值调至9.0，按酶用量[E]/[S]为4000U/g加入Alcalase反应2h；然后将pH值调至7.0，按酶用量[E]/[S]为700U/g加入Neutrase反应1.5h后，95℃灭酶10min。待自然冷却后，调pH值为4.0，然后再按1:1(V:V)的比例加入乙醇，在4℃、10000rpm条件下离心10min，并将上清液过分子量为10KDa的超滤膜，取透过液再过分子量为1KDa的超滤膜，取截留液，最后经浓缩、冷冻干燥得到高活性的1-10kDa谷物胚芽蛋白肽冻干粉。酶解液的水解度、肽得率及抗氧化肽活性结果见表2。

表2酶解液的水解度、肽得率及抗氧化肽活性结果