一种提高恩拉霉素B组分产量的发酵培养基及发酵方法与流程

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种提高恩拉霉素B组分产量的发酵培养基及发酵方法。

背景技术：

恩拉霉素为多肽类抗生素，它可以阻止黏肽的合成，使细胞壁缺损，导致细胞内渗透压升高，细胞外液渗入菌体，使细菌变形、肿大、破裂而死亡。恩拉霉素对革兰氏阳性菌有很强的活性，特别是对肠道内的有害梭菌有很强的抑杀作用，还可通过抑制肠道中有害细菌的生长繁殖来改变肠道内的菌群平衡。长期使用恩拉霉素，细菌对其不易产生耐药性，与其他抗生素之间也不产生明显交叉耐药。恩拉霉素在饲料中稳定性很高，在室温条件下长期储藏也很少降解，制成颗粒料稳定性更高，与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。最为重要的是，恩拉霉素在消化道内不被各种酶类降解，能保持原有的抗菌活性。恩拉霉素由不同种类的氨基酸和不饱和脂肪酸分子组成，其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。根据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素A(C₁₀₇H₁₃₈C₁₂N₂₆O₃₁)和恩拉霉素B(C₁₀₈H₁₄₀C₁₂N₂₆O₃₁)，恩拉霉素则是由这两种成分组成的混合物。

然而，现有技术中恩拉霉素的产量较低，因此，需要一种能够提高恩拉霉素产量的发酵培养基。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高恩拉霉素B组分产量的发酵培养基及发酵方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种提高恩拉霉素B组分产量的发酵方法，利用杀真菌素链霉菌在发酵培养基中发酵生产恩拉 霉素，所述发酵培养基中添加有复合维生素。

所述复合维生素为市售可得的产品，在本发明的具体实施方式中，所述复合维生素使用颐康金维牌多维元素片(昆明制药集团股份有限公司生产)。

进一步地，所述复合维生素的含量为0.5-1g/L。

更进一步地，所述发酵培养基包括以下含量的成分：8-10g/L的玉米淀粉，10-13g/L的葡萄糖，0.2-0.3g/L的磷酸氢二钾，1-1.5g/L的七水硫酸镁，12-15g/L的氯化钠，2-2.2g/L的碳酸钙。

所述发酵培养基的pH为7.2。

本发明还提供了一种提高恩拉霉素B组分产量的发酵培养基，所述发酵培养基包括以下含量的成分：8-10g/L的玉米淀粉，10-13g/L的葡萄糖，0.2-0.3g/L的磷酸氢二钾，1-1.5g/L的七水硫酸镁，12-15g/L的氯化钠，2-2.2g/L的碳酸钙，0.5-1g/L的复合维生素。

进一步地，所述发酵培养基的制备方法为：

将玉米淀粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠碳酸钙和复合维生素溶解于蒸馏水中，得到含量分别为10g/L玉米淀粉，13g/L葡萄糖，0.2g/L磷酸氢二钾，1g/L七水硫酸镁，15g/L氯化钠，2.2g/L碳酸钙，0.5-1g/L复合维生素的培养基；pH值为7.2，棉塞封口后再用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min。

本发明的有益效果在于：

本发明通过在培养基中添加适量的复合维生素，显著提高了杀真菌素链霉菌发酵产生的恩拉霉素B组分的产量。

附图说明

图1为本发明实施例3所述的高效液相色谱图；

图2为本发明对比例1所述的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1培养基的制备

1、原料

10g玉米淀粉，13g葡萄糖，0.3g磷酸氢二钾，1.5g七水硫酸镁，15g氯化钠，2.2g碳酸钙，1g复合维生素(颐康金维牌多维元素片，昆明制药集团股份有限公司生产)，蒸馏水。

2、制备方法

将玉米淀粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠碳酸钙和复合维生素溶解于蒸馏水中，得到各成分含量如下的培养基：10g/L玉米淀粉，13g/L葡萄糖，0.2g/L磷酸氢二钾，1g/L七水硫酸镁，15g/L氯化钠，2.2g/L碳酸钙，0.5-1g/L复合维生素。调节pH值为7.2，棉塞封口后再用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min。

实施例2培养基的制备

1、原料

8g玉米淀粉，10g葡萄糖，0.2g磷酸氢二钾，1g七水硫酸镁，12g氯化钠，2g碳酸钙，0.5g复合维生素。

2、制备方法

将玉米淀粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠碳酸钙和复合维生素溶解于蒸馏水中，得到各成分含量如下的培养基：8g/L玉米淀粉，10g/L葡萄糖，0.2g/L磷酸氢二钾，1g/L七水硫酸镁，12g/L氯化钠，2g/L碳酸钙，0.5g/L复合维生素。调节pH值为7.2，棉塞封口后再用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min。

实施例3发酵生产恩拉霉素

1、杀真菌素链霉菌的培养

杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidius)BJX002，其保藏号为CGMCC No.6026，以10％的接种量接种于装有实施例1所述培养基的发酵瓶中，在28℃、200r/min条件下培养200h，然后获得发酵浸提液，进行下一步提取。

2、发酵生产恩拉霉素B

2.1提取方法如下：

(1)发酵结束后取2ml发酵液，加入盛有9ml甲醇的10ml磨口比色管中，超声波超声20min，以4000rpm的速度离心10min，取上清溶液，共得到9.2-9.4ml上清。

(2)取1ml上清，以0.45μm的有机相微孔滤膜过滤，获得发酵浸提液，待测。

2.2HPLC分析：

采用岛津LC-10A型高效液相色谱仪，250mm×4.6mm(i d)不锈钢柱，内填Reliasil Cl8型号为Wondasil的C18反相柱，柱温35℃，取步骤(2)的发酵浸提液，进样量20μl；以磷酸缓冲盐(pH8.2)：乙腈(体积比为7:3)为流动相进行分离，流速为1ml/min，利用UV检测器在波长267nm处检测并自动形成分离图谱。

色谱结果如图1所示。

对比例1

本对比例实验方法同实施例3，区别在于，本对比例所使用的发酵培养基未添加复合维生素。

色谱结果如图2所示。

通过比较图1和图2可以看出，色谱结果显示在19.5min左右出现的峰值为恩拉霉素A组分，且添加复合维生素对其合成几乎没有影响，含量均约为4650mg/mL。但在34.4min左右出现的峰值有所增加，发酵滤液中恩拉霉素B组分保留时间为34.311min左右，根据洗脱峰面积，计算未加复合维生素时恩拉霉素B组分的含量为4986mg/mL。加有复合维生素时恩拉霉素B组分的含量为5630mg/mL。

可见，与实施例3相比，添加了复合维生素的培养基发酵生产的恩拉霉素B组分的产量提高了13％，虽对A组分的产量未产生明显影响，但恩拉霉素的总量由于B组分的提高，明显得到了显著的提高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。