新型丙三醇激酶、该基因和使用该基因的丙三醇激酶的制造法的制作方法

专利名称：新型丙三醇激酶、该基因和使用该基因的丙三醇激酶的制造法的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码新型丙三醇激酶的基因及利用基因重组技术进行的该酶的制造方法。
背景技术：
丙三醇激酶(EC2.7.1.30)是一种催化通过依赖镁和ATP的磷酸反应，将丙三醇转化为丙三醇-3-磷酸的反应的酶。该丙三醇激酶自1937年由Kalckar在肝脏内发现以来(例如，参照非专利文献1)，有报告从大白鼠肝、鸽子肝、糙醭假丝酵母(Candida mycoderma)、产黄纤维单胞菌(cellulomonas flavigena)、黄栖热菌(Thermus flavus)等中进行提纯得到(例如参照非专利文献2～5及专利文献1)，已知普遍存在于生物中。另外，报告有人、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黄栖热菌(Thermus flavus)等生物中进行了基因克隆(例如参照非专利文献6～9。)。特别是在大肠杆菌(Escherichia coli)中详细研究了该酶，1967年，由Hayashi等进行了提纯(例如参照非专利文献10。)，1988年报告了它的克隆(例如参照非专利文献11)。另外，已经在基因调节研究、变构酶抑制剂对它的抑制作用研究等方面进行了广泛的研究。
另外，丙三醇激酶在工业领域的应用时，被用作临床检验试剂的原料酶。也就是，利用脂肪酶水解试样中的中性脂肪(甘油酯)，利用该酶将生成的甘油转变为丙三醇-3-磷酸。在采用丙三醇-3-磷酸氧化酶进行的比色定量法及采用丙三醇-3-磷酸脱氢酶进行的紫外线吸收定量法中，该丙三醇-3-磷酸被用来测定血中的中性脂类。
最近，生物化学检验用的临床检验试剂已经以溶液状态的试剂为主。为此，不仅对酶要求以前的特性(对基质的高反应性、严格的基质特异性等)，而且还要求酶在检验试剂溶液中具有高度稳定性。使检验试剂溶液保持稳定的特性有多种，一般为了使液状检验试剂能长期保存，可以添加防腐剂。因为防腐剂有时使酶不稳定，故对防腐剂的耐受性高也是检验试剂用酶的期待性质之一。
迄今为止，都认为热稳定性高的酶在液态诊断试剂中具有高的稳定性，通常使用由嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothmophilus)及、黄栖热菌(Thermus flavus)等好热菌而来的丙三醇激酶。但是，这些丙三醇激酶存在对防腐剂的耐受性较低的问题。
专利文献1特开昭56-121484号公报非专利文献1H.Kalckar著，“Enzymologia”，1937年，第2卷，p47非专利文献2C.Bublitz等著，“J.Biol.Chem.”，1954年，第211卷，p951非专利文献3E.P.Kennedy著，“Methods Enzymol.”，1962年，第5卷，p476非专利文献4H.U.Bergmeyer等著，“Biochem.”，1961年，第333号，p471非专利文献5H.S.Huang等著，“J.Ferment.Bioeng.”，1997年，第83号，p328非专利文献6C.A.Sargent等著，“Hum.Mol.Genet.”，1994年，第3卷，p1317非专利文献7C.Holmberg等著，“J.Gen.Microbiol.”，1990年，第136卷，p2367非专利文献8P.Pavlik等著，“Curr.Genet.”，1993年，第24卷，p21
非专利文献9H.S.Huang等著，“Biochim.Biophys.Acta”，1998年，第1382卷，p186非专利文献10S.Hayashi等著，“J.Biol.Chem.”，1967年，第242卷，p1030非专利文献11D.W.Pettigrew等著，“J.Biol.Chem.”，1988年，第263卷，p13

图1表示由本发明实施例得到的丙三醇激酶的反应pH和比活性的关系(也就是最适pH)。50mM的各种缓冲液在37℃下反应5分钟，测定丙三醇激酶活性。横座标为pH，纵座标为比活性。黑圆圈表示50mM MES，黑方块表示50mM HEPES，黑菱形表示TAPS、黑三角表示50mM CHES，白圆圈表示50mM甘氨酸-NaOH。
图2表示由本发明实施例得到的丙三醇激酶的反应温度和比活性的关系(也就是最适温度)。以50mM的HEPES，pH7.9在各种温度反应5分钟，测定丙三醇激酶活性。横座标是温度，纵座标是比活性。
图3表示本发明实施例得到的丙三醇激酶对pH稳定性。50mM的各种缓冲液中溶解丙三醇激酶使其浓度约10U/ml，之后在25℃，保存20小时测定丙三醇激酶活性，求得残存活性。横座标为pH，纵座标为比活性。黑圆圈为乙酸缓冲液、黑方块为磷酸钾缓冲液、黑菱形为CHES缓冲液、黑三角为CAPS缓冲液下。
图4表示本发明实施例得到的丙三醇激酶的热稳定性。50mMpH7.5的磷酸钾缓冲液中溶解丙三醇激酶使其浓度约为10U/ml，之后在各温度保存15分钟测定丙三醇激酶活性，求得残存活性。横座标为温度，纵座标为残存活性。
图5表示比较本发明实施例得到的丙三醇激酶和各种其它的微生物得到的丙三醇激酶在和各种防腐剂4℃共存时的活性残存率(也就是4℃保存时的防腐剂耐受性)的数据。各种来源的丙三醇激酶溶解在50mM pH7.5磷酸钾缓冲液在使其浓度约5U/ml之后，以上述图中的浓度添加各种防腐剂，在4℃保存1星期，测定残存活性。横座标表示活性残存率、纵座标表示丙三醇激酶的来源。各种来源的酶中的活性残存率从上到下表示存在的防腐剂分别为0.3mM的Procline 300、0.8mM的Procline 150、500mg/L的IZU、100mg/L的MIT，未添加防腐剂。
图6表示比较本发明实施例得到的丙三醇激酶和由各种其它微生物得到的丙三醇激酶，在和各种防腐剂共存时的活性残存率(也就是25℃保存时的防腐剂耐受性)的数据。各种来源的丙三醇激酶溶解50mM在pH7.5磷酸钾缓冲液使其浓度为约5U/ml之后，按上述图中的浓度添加各种防腐剂，在25℃，保存1星期，测定残存活性。横座标表示活性残存率、纵座标表示丙三醇激酶的来源。各种来源的酶中的活性残存率从上到下表示存在的防腐剂分别为0.3mM的Procline 300、0.8mM的Procline 150、500mg/L的IZU、100mg/L的MIT，未添加防腐剂。
图7表示比较本发明实施例得到的丙三醇激酶，和来自在黄栖热菌(Thermus flavus)的丙三醇激酶的热稳定性的数据。将丙三醇激酶溶解在pH7.5 50mM磷酸钾缓冲液中，使其浓度约为10U/ml之后，在各种温度下保存15分钟之后，测定丙三醇激酶活性，求得残存活性。横座标表示活性温度，纵座标表示活性残存率。黑圆圈表示本发明，黑方块表示由黄栖热菌得到的丙三醇激酶。
图8表示参照实验中的来自纤维单胞菌JCM2471株(Cellulomonassp.JCM2471)的丙三醇激酶纯化各步骤的结果。
图9表示本发明实施例得到的丙三醇激酶的提纯结果。

发明内容
建立一种通过分离编码对防腐剂具有高耐受性的新型丙三醇激酶的基因、以及利用基因重组技术进行的酶的制造方法，可以应用该酶对中性脂类及丙三醇进行定量。
本发明者为了解决上述问题，进行深入研究，结果，成功分离了对防腐剂具有高耐受性的新型丙三醇激酶。具体地说，发现了生成这样的丙三醇激酶的菌纤维单胞菌JCM2471菌株(Cellulomonassp.JCM2471)。从由该菌体提取的染色体DNA中成功地分离了丙三醇激酶基因，确定了该DNA的全碱基序列。而且，利用基因重组技术成功地使转化子高效率地产生丙三醇激酶，从而可以廉价大量地供给高纯度的丙三醇激酶。另外，上述菌株可以从理化研究所、生物基础研究部微生物系统保存机构购买。
也就是，本发明提供如下的各项的丙三醇激酶等。
1.一种丙三醇激酶，其特征在于，对防腐剂具有高的耐受性。
2.如上述记载的丙三醇激酶，其特征在于，对防腐剂的耐受性，是与100mg/L浓度的防腐剂在25℃共存1周时的活性残存率为70％以上。
3.如上述1或2所述的丙三醇激酶，其中，防腐剂是N-甲基异噻唑啉酮(N-Methylisothiazolone)和/或其衍生物，4.如上述1所述的丙三醇激酶，是以下(a)或(b)所述蛋白质。
(a)由序列表序列序号1记载的氨基酸序列构成的蛋白质，(b)由氨基酸序列(a)中，1个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成，而且具有丙三醇激酶活性的蛋白质。
5.一种基因，编码由上述1所述的氨基酸序列构成的蛋白质的丙三醇激酶。
6.一种基因，由下述(c)或(d)DNA构成，编码丙三醇激酶。
(c)由序列表序列序号2记载的碱基序构成的DNA，(d)在上述(c)的碱基序列中，1或多个碱基被添成、缺失、取代，而且编码有丙三醇激酶活性的蛋白质的DNA。
7.一种基因重组载体，其含有带有上述1、2或3记载的编码丙三醇激酶的基因。
8.一种转化子，用上述重组载体转化寄主细胞而形成。
9.一种丙三醇激酶的制造方法，其特征在于，培养上述8所述的转化子，使其生成丙三醇激酶，并获取该丙三醇激酶。
本发明的丙三醇激酶的特征在于对防腐剂具有高的耐受性。
另外，本发明的丙三醇激酶的特征在于，对防腐剂的耐受性，是与100mg/L浓度的防腐剂在25℃共存1周时的活性残存率为70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上。
本发明中对防腐剂的耐受性，可以利用在pH7.5 50mM磷酸钾缓冲液中使浓度约为5U/mL的丙三醇激酶在25℃下与其共存1周时的活性残存率进行评价。
防腐剂的目的在于抑制保存试剂中微生物的繁殖，是一种添加在试剂中的物质。这时的防腐剂的添加浓度没有特别限定，但要求具有足够效果的浓度。显然防腐剂的添加浓度要根据防腐剂的种类和添加的试剂的组成等而不同，适当的添加浓度可以由操作者适当选择。
对于抗生素的使用，近年来当将产生耐受性菌作为问题考虑时，除真正需要以外，不优选采用。另外，受已有的耐受性菌的影响，可能得不到防腐效果。另外，可以直接作用于蛋白质的防腐剂，据认为微生物难以获得耐受性，因而更宜使用，今后广泛采用的可能性高。这样的防腐剂例如有据称是与蛋白质的SH基及氨基作用的N-甲基异噻唑酮(N-Methylisothiazolone，简称MIT)和/或其衍生物等。但是，这样的直接作用于蛋白质的防腐剂当然也作用于共存的酶蛋白质，故可能导致蛋白质结构不稳定化。这样，对防腐剂的耐受性可以认为是该防腐剂的作用机理和蛋白质的构造两方面引起的。
带有编码本发明的丙三醇激酶的基因可以从产生丙三醇激酶的微生物，例如纤维单胞菌JCM2471株(Cellulomonas sp.JCM2471)等中提取，也可以化学合成。
上述基因，例如编码(a)在序列表·序列序号1记载的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，或者编码(b)在氨基酸序列(a)中，1个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的，而且具有丙三醇激酶活性的蛋白质的DNA。DNA的缺失、取代或添加的程度包括不使基本特性改变，或改善其特性两方面。制备这些变异体的方法采用现有公知的方法。
另外，还有(c)由序列表·序列序号2记载的碱基序列构成的DNA，或者(d)在上述(c)的碱基序列中，1个或多个碱基添加、缺失或取代，而且编码有丙三醇激酶活性的蛋白质的DNA。
得到编码本发明的丙三醇激酶的基因的方法，例如，将纤维单胞菌JCM2471株(Cellulomonas sp.JCM2471)的染色体DNA分离，纯化后，使用超声波破碎，用限制性内切酶处理等，使DNA成为断片，利用连接酶等将得到的物质和线形表达载体在两DNA的平滑末端或粘接末端键合封闭，形成重组载体。这样得到的重组载体移入可复制的微生物寄主后，以丙三醇激酶活性的表达为指标进行筛选，得到保持重组载体的微生物。然后，培养该微生物，从该培养菌体中分离提纯该重组载体，即可以从该重组载体中获取丙三醇激酶基因。
来自作为基因供体的纤维单胞菌JCM2471株(Cellulomonas sp.JCM2471)的DNA具体提取方法如下。也就是，例如将供体微生物搅拌培养1～3天，得到的培养物利用离心分离，收集菌体，然后使其溶菌，制备含有丙三醇激酶基因的溶菌物。溶菌方法例如利用溶菌酶及β-葡聚糖酶等溶菌酶进行处理，根据需要可以结合使用蛋白酶或其它酶、以及十二烷基磺酸钠(SDS)等表面活性剂，而且也可以结合使用冻结融解法或弗氏破碎器法(Flench Press)等物理破碎方法。
从这样得到的溶菌物分离提纯DNA，可以利用常规方法，例如通过苯酚处理及蛋白酶处理进行除蛋白处理，核糖核酸酶处理，醇沉淀处理等方法的适当组合来进行。
另外，也可以利用现在市售的各种的DNA提取用试剂盒高效地得到纯度高的DNA。
切断从微生物分离提纯得到的DNA的方法，可以利用例如超声波处理、限制性内切酶处理等进行。最好使用作用于特定核苷酸序列的II型限制性内切酶。
至于载体，可使用由可以在寄主微生物内自主增殖的噬菌体，或质粒构建用于基因重组的载体。噬菌体有如以由大肠杆菌(Escherichiacoli)为寄主微生物时的λ噬菌体ZAPII(ストラタジ一ン制)λgt·10、λgt·11等。另外，质粒有如以大肠杆菌(Escherichia coli)为寄主微生物时的pUC322、pUC19、pBluescript、pUCBM20、pUCBM21、pSE280、Pse380等。
将这样的载体使用用于切断DNA的限制性内切酶，即上述用于切断丙三醇激酶基因供体的微生物DNA的限制性内切酶切断，可以得到载体断片，但不一定需要使用和切断该微生物DNA所使用的相同的限制性内切酶。微生物DNA断片和载体DNA断片连接的方法可以使用公知的DNA连接酶的方法，例如，把微生物DNA断片的粘接末端退火之后，利用适当的DNA连接酶把微生物DNA断片和，载体DNA断片连接制备成重组载体。如果需要，退火之后，也可以移入寄主微生物体内，利用体内DNA连接酶制备重组载体。
寄主微生物只要是重组载体稳定，而且可以自主增殖，即可表达外源基因，一般可以使用大肠杆菌-W3110株(Escherichia coli W3110)、大肠杆菌-C600株(Escherichia coli C600)、大肠杆菌-HB101株(Escherichia coli HB101)、大肠杆菌-JM109株(Escherichia coli JM109)等。另外，在未添加丙三醇的培养基中，寄生从寄主而来的丙三醇激酶的活性低至可以忽视的程度，但是，最好采用丙三醇激酶缺陷型变异株作为寄主，也可以利用大肠杆菌-KM1株(Escherichia coli KM1)。
将重组载体移入寄主微生物的方法，在寄主微生物为大肠杆菌(E.coli)的情况下，可以使用钙处理感受态细胞的方法或电穿孔法等。也可以使用市售的各种大肠杆菌感受态细胞。这样得到的转化子微生物通过在营养培养基中培养，可以稳定地生产多量的丙三醇激酶。对有无目的重组载体移入寄主微生物的选择，可以检测那些同时表达保持目的DNA的载体的药剂耐受性标记和丙三醇激酶活性的微生物，也可以选择那些根据药剂耐受性标记设计的选择培养基中可以生长，而且生成丙三醇激酶的微生物。
利用上述方法得到的丙三醇激酶基因的碱基序列可以利用市售的试剂及自动分析仪进行测序。这些试剂以在《科学》(science，214，1205-1210，1981)记载的双脱氧核苷酸测序及其改进法为理论依据。另外，丙三醇激酶的氨基酸序列利用确定的碱基序列推定。这样持有经过选择得到的丙三醇激酶基因的重组载体可以从转化子微生物中提取出，并容易地移入其它的微生物。另外，从持有丙三醇激酶基因的重组载体中，利用限制性内切酶或PCR法可以回收丙三醇激酶基因的DNA，使其和其它的载体断片键合，并容易地移入寄主微生物中。
作为转化子的寄主微生物的培养方式可以考虑寄主的营养生理学性质来选择培养条件，通常多数情况下利用液体培养，工业上利用通气搅拌培养是有利的。培养基的碳源可以使用培养微生物通常使用的物质，只要寄主微生物可以利用就可以，例如可以使用葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、丙酮酸等。氮源可以使用寄主微生物可以利用的含氮化合物，例如蛋白胨、肉膏、酪素水解物、大豆粕碱提取物等有机含氮化合物，以及硫酸铵、氯化铵类等无机含氮化合物。除此之外，根据需要可以使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类，以及特定的氨基酸、特定的微生物等。
培养温度可以在寄主微生物生长、生产丙三醇激酶的范围内进行适当地变更。在大肠杆菌(E.coli)的情况下，以20～42℃为好。培养时间根据培养条件稍加变动，但是，最好在丙三醇激酶达到最高收率的适当时间结束，通常在约20～约48小时范围内。培养基pH可以在寄主微生物生长、并产生丙三醇激酶的范围内进行适当地变更，通常优选pH约6.0～约9.0范围。
从培养液回收菌体的方法可以利用通常使用的方法，例如可以利用离心分离、过滤等方法回收。培养液中的丙三醇激酶分泌在菌体外时，可以使用该菌体分离液，根据下述的菌体破碎后的方法，可以分离提纯丙三醇激酶。丙三醇激酶存在在菌体内时，如前所述，可以用前述的酶法或物理破碎方法进行破碎提取。这样得到的粗酶提取液中，利用例如硫酸铵沉淀回收丙三醇激酶部分。将该粗酶液使用通常使用的提纯方法，例如可以使用半透膜的透析或Sephadex G-25(Amershambiosciences公司)凝胶过滤等进行脱盐。
该操作之后，可以利用例如Phenyl-Sepharose Fastflow(Amershambiosciences公司)柱色谱、DEAE-Sepharose(Amershambiosciences公司)柱色谱进行分离提纯，得到提纯酶标准品。该提纯酶标准品纯化至电泳(SDS-PAGE)几乎显示单一条带的程度。
利用本发明的制法得到的具有丙三醇激酶活性的蛋白质具有以下所示的理化性质。
(1)作用丙三醇+ATP 丙三醇-3-磷酸+ADP(2)最适pH约10.0(3)最适温度约50℃(20mM HEPES缓冲液、pH.7.9反应5分钟)
(4)pH稳定性约6.0-10.0(25℃处理20小时后显示90％以上的残存活性的范围)(5)热稳定性约45℃以下(50mM磷酸钾缓冲液、pH7.5处理15分钟后显示90％以上的残存活性的范围)(6)分子量约55,000(SDS-PAGE)、约176,000(凝胶过滤)(7)Km值约6.9×10-6M(丙三醇)、约1.11×10-4M(ATP)(8)比活性约41.2U/mg(9)在50mM磷酸钾缓冲液、pH7.5条件下，与100mg/L MIT共存的活性残存率是，在4℃×保存1周，几乎100％(图5)、在25℃×保存1周约92％(图6)、本发明的丙三醇激酶其存在形式没有特别限制，根据需要可以是冻结干燥品、液态及其它的任何一种形态。冻结干燥时也可以添加适当的赋形剂和稳定剂等。液态条件下也可以添加适当的缓冲液及/或其它的成分等。
具体实施例方式
下面的实施例中，丙三醇激酶的活性按如下方法测定。ATP从东方酶公司(オリエンタル酵素社)购买。牛血清白蛋白从Sigma Aldrich公司购买。丙三醇-3-磷酸氧化酶(代码编号G30-301)过氧化物酶(代码编号PEO-301)使用东洋纺织公司制品。其它试剂从Nacalai Tesque购买的。
测定法1利用速率检测测定丙三醇激酶活性的方法通常使用该方法测定活性。以丙三醇为基质，通过丙三醇-3-磷酸的生成量测定酶活性。向0.5％4-氨基安替比林水溶液0.2ml、1.5％苯酚水溶液0.2ml、丙三醇-3-磷酸氧化酶200U、过氧化物酶80U、ATP48.4mg中添加0.1MHEPES缓冲液(pH7.9)，使总量为21ml，将其作为以下测定的原液。各反应取该测定原液3ml，添加0.3M丙三醇水溶液50μl，酶溶液100μl，混合之后，利用控制在37℃的分光光度计记录3分钟内500nm的吸光度，从其初期直线部分求得每1分钟的吸光度变化(ΔOD测试)。空白用加入100μl的酶稀释液(含有0.2％牛血清白蛋白的20Mm的磷酸钾缓冲溶液，pH7.5)取代酶溶液，利用同样的操作，求得每1分钟的吸光度变化量(ΔOD空白)。根据下述计算式利用得到的吸光度变化量计算丙三醇激酶的酶活性。设定上述条件下1分钟内使1微摩尔的丙三醇磷酸化的酶量为1单位(1U)。
计算式活性值(U/ml)＝{ΔOD/min(ΔOD测试-ΔOD空白)×3.15(ml)×稀释倍率}/{13.3×1/2×1.0(cm)×0.1(ml)}3.15ml＝反应混合液液量13.3＝醌色素在上述测定条件下的毫摩尔吸光系数1/2＝由酶反应中生成的1分子过氧化氢形成的醌色素是1/2分子，由此得到的系数1. 1.0cm＝比色池光程2. 0.1ml＝酶样品液量测定法2测定最适温度的方法为了得到酶的最适温度使用该方法。
将3ml活性反应液(含有4mM ATP、2mM氯化镁的20mM HEPES缓冲液，pH7.9)分别放入试管内，添加稀释至适当浓度(按测定法1的活性大致为1U/ml)的丙三醇激酶溶液0.1ml，充分混合之后，在各反应温度下预加温约3分钟。然后，添加0.05ml0.3M的丙三醇水溶液，混合，开始反应。准确地反应10分钟之后，添加1ml的1N盐酸停止酶反应。在3ml的发色液(含有0.01％4氨基安替比林、0.02％苯酚、5U/ml过氧化物酶、16U/ml丙三醇-3-磷酸氧化酶的0.2M HEPES缓冲液、pH7.9)中添加该反应停止液0.15ml，混合，在37℃下反应约5分钟，测定500nm下的吸光度。这时，同时求得1mM L-丙三醇-3-磷酸溶液的吸光度并求得各次酶反应产生的L-丙三醇-3-磷酸量。测定利用各酶反应生成的L-丙三醇-3-磷酸的量。另外，空白测定用酶的稀释液取代丙三醇激酶溶液，求得各反应温度下不依赖酶反应生成的非特异性的L-丙三醇-3-磷酸的生成量。
测定法3测定最适pH的方法为了得到酶的最适pH使用该方法。
将3ml的活性反应液(含有4mM ATP、2mM氯化镁的50mM浓度的各种pH值的缓冲液)分别放入试管内，添加稀释至适当的浓度(按测定法1的活性大致为1U/ml)的丙三醇激酶溶液0.1ml，充分混合之后，在37℃下预加温约3分钟。然后，添加0.05ml 0.3M的丙三醇水溶液，混合，使反应开始。准确地反应10分钟之后，添加1ml的1N盐酸，停止酶反应。在3ml的发色液(含有0.01％4氨基安替比林、0.02％苯酚、5U/ml过氧化物酶、16U/ml丙三醇-3-磷酸氧化酶的0.2M HEPES缓冲溶液、pH7.9)中添加该反应停止液0.15ml，混合，在37℃下反应约5分钟，测定500nm下的吸光度。这时，同时求得1mM L-丙三醇-3-磷酸溶液的吸光度。并求得定各次酶反应生成的L-丙三醇-3-磷酸量。另外，空白测定用酶的稀释液取代丙三醇激酶溶液，求得各pH缓冲溶液中不依赖酶反应生成的非特异性的L-丙三醇-3-磷酸的生成量。
参考例来自纤维单胞菌JCM2471株(Cellulomonas sp.JCM2471)的丙三醇激酶的纯化将纤维单细胞JCM2471株(Cellulomonas sp.JCM2471)在60ml液体LB培养基(500ml体积的坂口烧瓶)中接种1白金环菌种，在30℃下振荡培养一夜。将本培养液的全部接种在6L的丙三醇激酶生产培养基(10L-发酵罐、2％丙三醇、2％的蛋白胨(日本制药制)、0.2％酵母膏(オリエンタル酵母公司制)、0.2％NaCl、0.02％硫酸镁、0.7％磷酸氢二钾、pH7.3)中，在35℃下通气搅拌培养约20小时。这时的丙三醇激酶在该培养基中的生产量大致为3U/ml。
离心分离该培养液回收菌体，在50mM pH7.5磷酸钾缓冲液中悬浊后，使用戴诺磨(ダイノミル)利用玻璃珠破碎并提取丙三醇激酶，制成粗酶液。添加硫酸铵，从该粗酶液回收35-55％饱和度级分。利用Sephadex G-25(Amershambiosciences公司)凝胶过滤等使该盐析组分脱盐之后。依次进行DEAE-Sepharose CL-6B(Amershambiosciences公司)柱色谱、Phenyl Sephrose CL-6B(Amershambiosciences公司)柱色谱、Sephadex G-25凝胶过滤，DEAE-Sepharose CL-6B柱色谱，得到纯化酶标准品。上述提纯结果示于图8。
利用上述方法纯化的蛋白质在SDS-PAGE显示几乎均一的条带，其活性大致为40.9U/mg蛋白质。另外，蛋白质浓度按酶溶液的280nm下的吸光度为1Abs时为1mg/ml进行估算。
另外，利用SDS-PAGE推测的亚基的分子量为约55,000。而且，利用以爱德曼氏分解法为原理的氨基酸末端序列分析装置分析其氨基末端氨基酸序列，结果推断氨基末端的序列为Ala-Asp-Tyr-Val-Leu-Ara-Ile。
实施例1从纤维单胞菌JCM2471株(Cellulomonas sp.JCM2471)中分离染色体DNA利用下述方法分离纤维单细胞JCM2471株(Cellulomonas sp.JCM2471)的染色体DNA。将该菌株在液体LB培养基(30ml体积试管装5ml含1.0％多聚蛋白胨、0.5％酵母膏、1.0％NaCl、pH7.4)中进行1接种一白金环菌培养物，在30℃下振荡培养一夜。将该培养物分成1ml每份，离心分离(12000rpm、10分钟、4℃)回收菌体，使用MagExtractor-genom-试剂盒(东洋纺织制)按照操作说明书所述的步骤从回收的菌体提取染色体DNA。可以从1ml的菌体得到约20μg的染色体DNA。
实施例2丙三醇激酶基因的PCR扩增多聚酶链反应(PCR)用引物现已发表克隆报告的大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的丙三醇激酶的碱基序列为依据制备。序列表·序列编号3、序列表·序列编号4记载的碱基序列表示PCR用引物。将实施例1得到DNA100ng、各种引物200pmol、dNTP混合物10μl、反应缓冲液10μl、AmpliTaq DNA多聚酶(PE公司制)2.5U混合，总体积为100μl。将其在94℃变性反应1分钟，在45℃进行1分钟的退火反应，在72℃进行3分钟的链延长反应，如此反复进行30个循环PCR，使其扩增到所需大小约800bp的片段。确定该PCR产物的碱基序列，将根据此序列推定的氨基酸序列和铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的丙三醇激酶的氨基序列相比较，结果显示高的相同性，故确认目的的丙三醇激酶基因的一部分得到扩增。
实施例3丙三醇激酶基因全序列的克隆用各种限制性内切酶将实施例1得到的染色体DNA约2μg进行降解之后，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，转移至硝基纤维素过滤膜上。将实施例2得到的PCR产物作为探针使用ECLdirect nucleic acidlabeling and detection system(Amershambiosciences公司制)，按随该系统附带的操作步骤添加试剂，进行定位杂交以筛选出丙三醇激酶基因的断片。结果，含有丙三醇激酶基因全序列的断片被KpnI(东洋纺织制)和NotI(东洋纺织制)切断成大小约为6.5kb的断片检出。
然后，使用MagExtractor-PCR&gel clean up-试剂盒(东洋纺织制)，按照操作说明书所述的步骤利用琼脂糖回收该DNA断片。另外同样地用KpnI(东洋纺织制)和NotI切断0.5μg的puCBM21(Boehringer-mannheim公司)，用细菌碱性磷酸酯酶Boehringer-mannheim(东洋纺织制)进行脱磷酸化处理。之后，用Ligation High试剂盒(东洋纺织制)在16℃使两DNA断片反应1小时而连接后，转化大肠杆菌JM109株的(Escherichia coli JM109)的感受态细胞(东洋纺织制)。转化子涂布在含有100g/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃整夜培养，即可得到转化子。该重组载体命名为pCGK1。
实施例4丙三醇激酶酶基因碱基序列的确定在pCGK1中克隆的丙三醇激酶基因的碱基序列使用pUC系载体常用的测序引物，借助BigDye-Terminator-Cycle Sequencing FS ReadyReaction试剂盒(Applied Biosystems公司制)及ABI PRISM310 GeneticAnalyzer(PE公司制)，由插入DNA的两端确定DNA的序列。再以该确认的序列为基础，再制成引物，利用引物处理确定插入DNA序列的全长。
与已确定的丙三醇激酶基因的开放读码区(オ一プンリ一デイングフレ一ム)相应的DNA序列和由DNA序列推定的氨基酸序列表示在序列表序列编号2中。另外，由DNA序列推定的氨基酸序列内、包含第2个残基Ala在内的7个残基的序列，和利用纯化酶进行的氨基酸序列分析得到的结果完全一致。另外，除去起动密码子蛋氨酸外，由推定的氨基酸序列计算所得的丙三醇激酶的分子量为55142，这和由纤维单胞菌JCM2471株(Cellulomonas sp.JCM2471)提纯的酶经SDS-PAGE分析求得的分子量非常一致。
实施例5丙三醇缺陷型寄主的制备利用GenBank数据库登录的大肠杆菌-(Escherichia coli JM109)的丙三醇激酶基因的碱基序列，制作序列表·序列编号5及序列表·序列编号6所示的引物。另外大肠杆菌-(Escherichia coli JM109)K12株的染色体DNA利用和实施例1相同的方法得到。
将该染色体DNA100ng、各种引物200pmol、2mM dNTP混合物10μl、反应缓冲液10μl、Ampli TaqDNA聚合酶(PE公司制)2.5U混合，总体积为100μl。将其在94℃、变性反应3分钟，在98℃变性反应30秒，在68℃进行退火和延长反应3分钟，反复进行41循环，然后，在98℃、变性反应30秒，在68℃进行退火和延长反应3分钟，在72℃延长反应10分钟，进行1循环，按此要求进行PCR。结果得到和该目的基因相同的约1.5kb的PCR产物。
使用MagExtractor-PCR & gel clean UP试剂盒，按照操作说明书所述的步骤提纯该PCR产物之后，用Ligation High试剂盒(东洋纺织制)在16℃使约0.2μg的PCR产物和用限制性内切酶SmaI切断了的0.5μg的pUC19反应1小时连接后，转化大肠杆菌-JM109株(Escherichia coli JM109)的感受态细胞。转化子涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃整夜培养，即可得到转化子。另外，该重组载体命名为pUCGK。
此重组载体用限制性内切酶BstEII(东洋纺织制)切断，使用Blunting High试剂盒(东洋纺织制)，按照操作说明书所述的步骤，使切断末端平滑化。另外，用HincII切断pUCK4(Amershambiosciences公司制)，通过琼脂糖凝胶电泳分离含有卡那霉素耐受性基因的DNA断片之后，使用MagExtractor PCR & gel clean UP试剂盒提纯(东洋纺织制)回收。用Ligation High试剂盒在16℃使两DNA断片反应1小时连接后，转化大肠杆菌-JM109株的(Escherichia coli JM109)的感受态细胞。转化子涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上，37℃整夜培养，获得转化子。该重组载体命名为pUCGKm。
再用限制性内切酶EcoRI(东洋纺织制)和SalI(东洋纺织制)切断该pUCGKm，通过琼脂糖凝胶电泳分离含有丙三醇激酶基因和卡那霉素耐受性基因的DNA断片之后，使用MagExtractor PCR & gel Clean UP试剂盒，提纯回收。另外，温度敏感性质粒pCH02(pSC101质粒的衍生物；S.Matsuyama等，J.Mol.Biol.，175，331(1984))用EcoRI(东洋纺织制)和SalI(东洋纺织制)切断，用Ligation High试剂盒在16℃使含有丙三醇激酶基因和卡那霉素耐受性基因的断片反应1小时连接后，利用使用基因脉冲仪(Bio-Rad公司制)的电穿孔法使大肠杆菌-K-12株(Escherichia coli K-12)转化。另外，电穿孔的条件按照Gene Pulser的使用说明书中电穿孔大肠杆菌的条件进行。转化子涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基上，37℃整夜培养，获得转化子。
将该转化子接种到含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基(20ml试管中装5ml)中，在37℃下振荡，培养24小时。将此培养液再接种在含有卡那霉素的新鲜LB液体培养基上，反复四次。用灭菌的生理食盐水稀释该培养液之后，涂布在含有50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基上，分离单菌落之后，分离对氨苄青霉素敏感而对卡那霉素有耐受性的菌落，定名为大肠杆菌-KM1菌株(Escherichia coliKm1)。
将该大肠杆菌-KM1株(Escherichia coli Km1)接种在含有50μg/ml卡那霉素的Tryfico(20ml试管装5ml，1.2％多聚蛋白胨、2.4％酵母膏、0.5％丙三醇、0.231％磷酸二氢钾、1.254％磷酸氢二钾)中，在37℃下振荡培养24小时。之后利用离心从1ml的培养液中回收菌体，悬浊在1ml的50mM磷酸钾pH7.5缓冲液中。利用超声波破碎机处理悬浊液，破碎菌体，离心分离该悬浊液，上清液作为粗酶，测定其中丙三醇激酶的活性，未能检出明显的酶活性。
实施例6丙三醇激酶表达载体pCGK112的构建用限制性内切酶NcoI(东洋纺织制)和NotI切断pCGK11，利用琼脂糖(Agarose)凝胶电泳分离含有丙三醇激酶基因的约2kb的DNA断片。然后，使用MagExtractor PCR & &gel Clean UP试剂盒，按照说明书记载的步骤从琼脂糖(Agarose)凝胶回收该DNA断片。另外，相同地用NcoI和NotI切断0.5μg的pSE380(Imitrogen公司制)，用细菌碱性磷酸酯酶(东洋纺织制)进行脱磷酸化处理。之后，用LigationHigh试剂盒(东洋纺织制)在16℃使两DNA断片反应1小时连接后，转化大肠杆菌-JM109株(Escherichia coli JM109)的感受态细胞(东洋纺织制)。转化子涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃整夜培养，获得转化子。该重组载体命名为pCGK12。
然后，将经pCGK12转化的大肠杆菌-JM109株(Escherichia coliJM109)接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基(30ml试管装5ml)中，37℃整夜培养，培养之后，离心分离回收菌体，用MagExtractor-Plasmid-试剂盒(东洋纺织制)，提纯pCGK12。从5ml菌体得到约20μg的纯化质粒。
再将该pCGK12的浓度调整为0.05μg/μl，以实施例5得到的丙三醇激酶缺陷型菌株大肠杆菌-KM1株(Escherichia coli Km1)作为寄主，利用gene pulser电穿孔法导入pCGK12。转化子在含有100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基上选择，30℃整夜培养，挑取同时对2种抗生素具有耐受性的菌落作为转化子。这时的转化效率大致为1×106cfu/μg-DNA。
另外，本转化子大肠杆菌-KM1 pCGK12株(Escherichia coli Km1)在平成14(2002)年9月3日，以微生物保藏编号FERM P-18992保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心。
实施例7重组丙三醇激酶的表达及纯化酶的制备将实施例6得到的转化子在含有100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基(20ml试管装5ml)上接种一白金环，在30℃下振荡培养一夜，作为种子培养液。将该培养液以1％的接种量接种含有100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素的1L的Tryfico肉汤(每12L容量坂口烧瓶加入250ml)中，在37℃下振荡培养20小时。培养结束时1ml培养液的丙三醇激酶活性约为6.8U/ml。
利用离心分离从该培养液回收菌体，在50mM pH7.5磷酸钾缓冲液中悬浊后，使用弗氏破碎器法(Flench Press)破碎菌体。然后，在菌体破碎液中溶解NaCl，使其浓度为0.1M，添加5％聚乙撑亚胺水溶液使其浓度为0.5％，离心分离除去不溶物，制成粗酶液。
然后，使该粗酶液形成60％饱和度进行硫酸铵盐析，离心分离回收沉淀物之后，用50mM pH7.5磷酸钾缓冲液再溶解。再利用SephadexG-25(Amershambioseiences公司)凝胶过滤脱盐之后，上HiTrap Q HP(Amershambioseiences公司)柱，用0.2M NaCl洗涤之后，用0.2M～0.6M的线性梯度NaCl溶液洗脱。
进一步收集该丙三醇激酶活性部分，添加硫酸铵使其为20％饱和度，离心分离除去不溶物。将该酶液通过含有20％饱和度硫酸铵的50mM pH7.5磷酸钾缓冲溶液、缓冲的HiiTrap Q phenyl FF(Amershambioseiences公司)柱，利用相同的缓冲液洗涤之后，用20％～0％饱和度硫酸铵溶液进行线性梯度洗脱。回收有丙三醇激酶活性级分，利用Sephadex G-25凝胶过滤脱盐，即制成纯酶标准样品。上述提纯结果示于图9。
利用上述方法纯化的蛋白质在SDS-PAGE上显示均一的条带，其比活性约为41.2U/mg蛋白质。蛋白质浓度和参考例1同样估算。利用SDS-PAGE推测亚基的分子量约为55,000，TSK-G3000 SW(直径7.6mm、高度30cm、東森(公司)制)凝胶过滤得到的天然酶的分子量为约176,000。
利用上述方法得到的丙三醇激酶具有下述特性。
(1)作用催化下述反应。
(2)作用pH反应pH和比活性的关系如图1所示。
最适pH约为10.0。
(3)作用温度pH反应温度和比活性的关系如图2所示。
最适温度约50℃(20mM pH7.9 HEPES缓冲液，反应5分钟)(4)pH稳定性pH稳定性如图3所示。
在约6.0～10.0(25℃下20小时后显示90％以上的残存活性)稳定。
(5)热稳定性热稳定性如图4所示。
在约45℃以下(50mM pH7.5磷酸钾缓冲溶液，处理15分钟后显示90％以上的残存活性)稳定。
(6)分子量约55,000(SDS-PAGE)、约176,000(凝胶过滤)(7)Km值约6.9×10-6M(丙三醇)、约1.11×10-4M(ATP)对丙三醇及ATP的Km值是根据丙三醇激酶的活性测定方法(测定法1)记载的方法，改变丙三醇或ATP的浓度，测定各种基质浓度下的丙三醇激酶的活性，采用方程式(线性equation)计算Km的值。
(8)比活性约41.2U/mg(9)对防腐剂的耐受性在50mM pH7.5磷酸钾缓冲溶液中和100mg/L MIT共存时的活性残存率如图5和图6所示。活性测定利用测定法1进行。
在4℃保存1周活性残存率几乎为100％，25℃保存1周大约为92％。和其它的防腐剂共存时的活性残存率也一并显示。另外，作为对照的另外来源的丙三醇激酶除黄栖热菌(Thermus flavus；东洋纺织制)以外，均从Sigma-Aldrich日本公司购入。所使用的防腐剂中，N-甲基异噻唑啉酮(N-Methylisothiazolone，简称MIT)和咪唑烷基脲(Imidazolidinylurea、简称IZU)从Roche Diagnostic公司购入，プロクリン150(Procline 150)和プロクリン(Procline 300)从Sigma-AldrichJapan公司购入。
本发明的丙三醇激酶在25℃、保存1周显示90％以上的活性残存率。
另外，作为对照的和黄栖热菌(Thermus flavus)的酶的热稳定性显示在图7中。尽管黄栖热菌(Thermus flavus)而来的丙三醇激酶与本发明相比具有明显高的热稳定性，但是本发明的丙三醇激酶在防腐剂共存条件下的耐受性高，表明本发明的丙三醇激酶对防腐剂具有优良的耐受性。
工业上利用的可能性本发明分离了编码新型的丙三醇激酶的基因，该酶具有比公知的丙三醇激酶对防腐剂更高的耐受性，利用基因重组技术建立了制造该酶的制造方法，可以应用在丙三醇的定量中。
序列表<110>东洋纺织株式会社(Toyo Boseki Kabushiki Kaisya)<120>新型丙三醇激酶、该基因和使用该基因的丙三醇激酶的制造法(新規なグリセロ一ルキナ一ゼ、該遺伝子及び該遺伝子を用いたグリセロ一ルキナ一ゼの製造法)<130>SCT050269-25<160>6<170>PatentIn version 2.1<210>1<211>505<212>PRT<213>Cellulomonas sp.JCM2471<400>1Met Ala Asp Tyr Val Leu Ala Ile Asp Gln Gly Thr Thr Ser Ser Arg1 5 10 15Ala Ile Val Phe Asn His Ser Gly Glu Ile Tyr Ser Thr Gly Gln Leu20 25 30Glu His Asp Gln Ile Phe Pro Arg Ala Gly Trp Val Glu His Asn Pro35 40 45Glu Gln Ile Trp Asn Asn Val Arg Glu Val Val Gly Leu Ala Leu Thr50 55 60Arg Gly Asn Leu Thr His Glu Asp Ile Ala Ala Val Gly Ile Thr Asn65 70 75 80Gln Arg Glu Thr Ala Val Val Trp Asp Lys Thr Thr Gly Lys Pro Val85 90 95Tyr Asn Ala Ile Val Trp Gln Asp Thr Arg Thr Gln Lys Ile Val Asp100 105 110
Glu Leu Gly Gly Asp Glu Gly Ala Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Val Gly115 120 125Leu Pro Leu Ala Thr Tyr Phe Ser Gly Pro Lys Ile Lys Trp Ile Leu130 135 140Asp Asn Val Glu Gly Ala Arg Glu Lys Ala Glu Lys Gly Asp Leu Leu145 150 155 160Phe Gly Asn Thr Asp Thr Trp Val Leu Trp Asn Met Thr Gly Gly Thr165 170 175Glu Gly Gly Val His Val Thr Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Met180 185 190Leu Met Asp Leu Asp Thr Leu Ser Trp Arg Glu Asp Ile Ala Ala Asp195 200 205Met Gly Ile Pro Leu Ser Met Leu Pro Asp Ile Arg Ser Ser Ser Glu210 215 220Val Tyr Gly His Gly Arg Pro Arg Gly Leu Val Pro Gly Val Pro Ile225 230 235 240Ala Gly Ile Leu Gly Asp Gln Gln Ala Ala Thr Phe Gly Gln Ala Cys245 250 255Phe Glu Val Gly Gln Ala Lys Asn Thr Tyr Gly Thr Gly Asn Phe Leu260 265 270Leu Leu Asn Thr Gly Thr Glu Lys Val Met Ser Lys Asn Gly Leu Leu275 280 285Thr Thr Val Cys Tyr Lys Ile Gly Asp Ala Pro Ala Val Tyr Ala Leu290 295 300Glu Gly Ser Ile Ala Val Thr Gly Ser Leu Val Gln Trp Leu Arg Asp305 310 315 320Asn Leu Gly Met Phe Glu Asp Ala Pro Asp Val Glu Trp Leu Ala Gly325 330 335Lys Val Gln Asp Asn Gly Gly Ala Tyr Phe Val Pro Ala Phe Ser Gly
340 345 350Leu Phe Ala Pro Tyr Trp Arg Pro Asp Ala Arg Gly Ala Leu Val Gly355 360 365Leu Thr Arg Tyr Val Asn Arg Asn His Ile Ala Arg Ala Ala Leu Glu370 375 380Ala Thr Ala Phe Gln Ser Arg Glu Val Val Asp Ala Met Asn Ala Asp385 390 395 400Ser Gly Val Asp Leu Thr Glu Leu Arg Val Asp Gly Gly Met Val Ala405 410 415Asn Glu Leu Leu Met Gln Phe Gln Ala Asp Gln Leu Gly Val Asp Val420 425 430Val Arg Pro Lys Val Ala Glu Thr Thr Ala Leu Gly Ala Ala Tyr Ala435 440 445Ala Gly Ile Ala Val Gly Phe Trp Lys Gly Glu Gln Asp Val Ile Asp450 455 460Asn Trp Ala Glu Asp Lys Arg Trp Ser Pro Ser Met Glu Ser Gly Glu465 470 475 480Arg Glu Arg Leu Tyr Arg Asn Trp Lys Lys Ala Val Thr Lys Thr Met485 490 495Glu Trp Val Asp Glu Asp Val Glu Gln500 505<210>2<211>1515<212>DNA<213>Cellulomonas sp.JCM2471<400>2atg gcc gac tac gtt ctc gcc atc gac cag ggg acc acg agc tcc cgg48Met Ala Asp Tyr Val Leu Ala Ile Asp Gln Gly Thr Thr Ser Ser Arg
1 5 10 15gcc atc gtc ttc aac cac tcc ggg gag atc tac tcc acc ggg cag ctc96Ala Ile Val Phe Asn His Ser Gly Glu Ile Tyr Ser Thr Gly Gln Leu20 25 30gag cac gac cag atc ttc ccg cgc gcg ggc tgg gtc gag cac aac ccc 144Glu His Asp Gln Ile Phe Pro Arg Ala Gly Trp Val Glu His Asn Pro35 40 45gag cag atc tgg aac aac gtg cgc gag gtc gtc ggt ctc gcc ctc acc 192Glu Gln Ile Trp Asn Asn Val Arg Glu Val Val Gly Leu Ala Leu Thr50 55 60cga ggc aac ctc acg cac gag gac atc gcg gcc gtc ggc atc acg aac 240Arg Gly Asn Leu Thr His Glu Asp Ile Ala Ala Val Gly Ile Thr Asn65 70 75 80cag cgc gag acg gcc gtc gtc tgg gac aag acc acg ggc aag ccc gtc 288Gln Arg Glu Thr Ala Val Val Trp Asp Lys Thr Thr Gly Lys Pro Val85 90 95tac aac gcc atc gtc tgg cag gac acg cgc acc cag aag atc gtc gac 336Tyr Asn Ala Ile Val Trp Gln Asp Thr Arg Thr Gln Lys Ile Val Asp100 105 110gag ctc ggc ggc gac gag ggc gcc gag aag tac aag tcg atc gtc ggc 384Glu Leu Gly Gly Asp Glu Gly Ala Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Val Gly115 120 125ctg ccg ctc gcc acc tac ttc tcc ggc ccg aag atc aag tgg atc ctc 432Leu Pro Leu Ala Thr Tyr Phe Ser Gly Pro Lys Ile Lys Trp Ile Leu130 135 140gac aac gtc gag ggt gcg cgc gag aag gcc gag aag ggc gac ctg ctg 480Asp Asn Val Glu Gly Ala Arg Glu Lys Ala Glu Lys Gly Asp Leu Leu145 150 155 160ttc ggc aac acc gac acg tgg gtg ctg tgg aac atg acg ggc ggc acc 528
Phe Gly Asn Thr Asp Thr Trp Val Leu Trp Asn Met Thr Gly Gly Thr165 170 175gag ggc ggc gtg cac gtc acc gac gtg acc aac gcg tcg cgc acg atg 576Glu Gly Gly Val His Val Thr Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Met180 185 190ctc atg gac ctc gac acg ctc tcc tgg cgc gag gac atc gcc gcc gac 624Leu Met Asp Leu Asp Thr Leu Ser Trp Arg Glu Asp Ile Ala Ala Asp195 200 205atg ggc atc ccg ctg tcg atg ctc ccc gac atc cgg tcg tcg tcc gag 672Met Gly Ile Pro Leu Ser Met Leu Pro Asp Ile Arg Ser Ser Ser Glu210 215 220gtc tac ggc cac ggg cgc ccg cgc ggc ctc gtc ccc ggc gtc ccg atc 720Val Tyr Gly His Gly Arg Pro Arg Gly Leu Val Pro Gly Val Pro Ile225 230 235 240gcc ggc atc ctc ggc gac cag cag gca gcc acg ttc ggc cag gcg tgc 768Ala Gly Ile Leu Gly Asp Gln Gln Ala Ala Thr Phe Gly Gln Ala Cys245 250 255ttc gag gtc ggc cag gcc aag aac acc tac ggc acc ggc aac ttc ctg 816Phe Glu Val Gly Gln Ala Lys Asn Thr Tyr Gly Thr Gly Asn Phe Leu260 265 270ctg ctc aac acg ggc acg gag aag gtc atg agc aag aac ggc ctg ctc 864Leu Leu Asn Thr Gly Thr Glu Lys Val Met Ser Lys Asn Gly Leu Leu275 280 285acg acg gtc tgc tac aag atc ggc gac gcg ccc gcg gtg tac gcg ctc 912Thr Thr Val Cys Tyr Lys Ile Gly Asp Ala Pro Ala Val Tyr Ala Leu290 295 300gag ggc tcg atc gcc gtg acc ggc tcg ctc gtg cag tgg ctg cgc gac 960Glu Gly Ser Ile Ala Val Thr Gly Ser Leu Val Gln Trp Leu Arg Asp305 310 315 320
aac ctg ggc atg ttc gag gac gcg ccc gac gtc gag tgg ctc gcg ggc 1008Asn Leu Gly Met Phe Glu Asp Ala Pro Asp Val Glu Trp Leu Ala Gly325 330 335aag gtc cag gac aac ggc ggc gcc tac ttc gtg ccg gcg ttc tcc ggc 1056Lys Val Gln Asp Asn Gly Gly Ala Tyr Phe Val Pro Ala Phe Ser Gly340 345 350ctg ttc gcg ccc tac tgg cgg ccc gac gcg cgc ggc gcg ctc gtc ggc 1104Leu Phe Ala Pro Tyr Trp Arg Pro Asp Ala Arg Gly Ala Leu Val Gly355 360 365ctc acg cgg tac gtc aac cgc aac cac atc gcg cgc gcc gcg ctc gag 1152Leu Thr Arg Tyr Val Asn Arg Asn His Ile Ala Arg Ala Ala Leu Glu370 375 380gcg acg gcg ttc cag agc cgc gag gtc gtc gac gcg atg aac gcc gac 1200Ala Thr Ala Phe Gln Ser Arg Glu Val Val Asp Ala Met Asn Ala Asp385 390 395 400tcg ggc gtc gac ctc acc gag ctg cgc gtc gac ggc ggc atg gtc gcc 1248Ser Gly Val Asp Leu Thr Glu Leu Arg Val Asp Gly Gly Met Val Ala405 410 415aac gag ctc ctc atg cag ttc cag gcc gac cag ctc ggc gtc gac gtc 1296Asn Glu Leu Leu Met Gln Phe Gln Ala Asp Gln Leu Gly Val Asp Val420 425 430gtg cgg ccc aag gtc gcc gag acg acg gcg ctc ggt gcc gcg tac gcc 1344Val Arg Pro Lys Val Ala Glu Thr Thr Ala Leu Gly Ala Ala Tyr Ala435 440 445gcg ggc atc gcc gtc ggc ttc tgg aag ggc gag cag gac gtc atc gac 1392Ala Gly Ile Ala Val Gly Phe Trp Lys Gly Glu Gln Asp Val Ile Asp450 455 460aac tgg gcc gag gac aag cgc tgg agc ccg tcg atg gag tcc ggc gag 1440Asn Trp Ala Glu Asp Lys Arg Trp Ser Pro Ser Met Glu Ser Gly Glu
465 470 475 480cgc gag cgg ctg tac cgc aac tgg aag aag gcc gtg acg aag acg atg 1488Arg Glu Arg Leu Tyr Arg Asn Trp Lys Lys Ala Val Thr Lys Thr Met485 490 495gag tgg gtc gac gag gac gtg gag cag 1515Glu Trp Val Asp Glu Asp Val Glu Gln500 505<210>3<211>23<212>DNA<213>synthetic DNA<400>3tacgtsctsg csatcgacca ggg 23<210>4<211>27<212>DNA<213>synthetic DNA<400>4ttcttgtgsa tgccstgscc sacgaag 27<210>5<211>23<212>DNA<213>synthetic DNA<400>5atatcgttgc gctcgaccag ggc 23
<210>6<211>23<212>DNA<213>synthetic DNA<400>6tcgtgttctt cccacgccat cgc 2权利要求
1.一种丙三醇激酶，其特征在于，对防腐剂具有高的耐受性。
2.如权利要求1所述的丙三醇激酶，其特征在于，对防腐剂的耐受性，是在25℃共存1周时的活性残存率为70％以上。
3.如权利要求1或2所述的丙三醇激酶，其中，防腐剂是N-甲基异噻唑啉酮和/或其衍生物。
4.如权利要求1所述的丙三醇激酶，其是以下的(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表·序列序号1记载的氨基酸序列构成的蛋白质，(b)由在氨基酸序列(a)中，1个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成，而且具有丙三醇激酶活性的蛋白质。
5.一种基因，该基因编码具有由序列表·序列序号1记载的氨基酸序列构成的蛋白质的丙三醇激酶。
6.一种基因，由下述(c)或(d)的DNA构成，编码丙三醇激酶；(c)由序列表·序列序号2记载的碱基序列构成的DNA，(d)在上述(c)的碱基序列中，1个或多个碱基被添加、缺失、取代，而且编码具有丙三醇激酶活性的蛋白质的DNA。
7.一种基因重组载体，其含有编码权利要求1、2或3所述的丙三醇激酶的基因。
8.一种转化子，其利用权利要求7所述的重组载体转化寄主细胞而形成。
9.一种丙三醇激酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求8所述的转化子，使其生成丙三醇激酶，并获取该丙三醇激酶。
全文摘要
一种新型的编码丙三醇激酶的基因以及利用基因重组技术制造该酶的方法。提供一种丙三醇激酶，其特征在于对防腐剂具有高的耐受性，提供一种含有编码该丙三醇激酶基因的重组载体；利用该重组载体转化寄主细胞获得的转化子；一种丙三醇激酶的制造方法，其特征在于包括培养该转化子，使其生成丙三醇激酶，然后收集该丙三醇激酶。
文档编号C12N15/54GK1681929SQ0382151
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月8日 优先权日2002年9月10日
发明者曾我部敦, 冈正则, 稻垣贤二, 八田贵, 西濑弘 申请人:东洋纺织株式会社