本发明涉及原料药磷酸肌酸钠的纯化方法及其无菌粉的制备。
背景技术：
磷酸肌酸（creatine phosphate）是心肌代谢中一种重要的供能物质，1928年从哺乳动物肌肉中分离得到。磷酸肌酸二钠(phosphocreatine disodium)，化学名称为N-[亚氨基(膦氨基)甲基]-N-甲基甘氨酸二钠盐，结构式如下所示是其药用形式，具有心肌保护功能，且无副作用，可作为心内科，外科辅助治疗药。临床上可用于治疗横纹肌活性不足，作为心肌疾病的辅助治疗。1992 年，意大利欧辉制药厂首先将磷酸肌酸二钠盐开发新药上市，由于疗效确切，副作用小，磷酸肌酸二钠盐一上市就在欧美等发达国家的心脏手术，心肌梗塞等心肌疾病治疗中等到了广泛的应用，取得了良好的效果。1995年我国开始进口注射用磷酸肌酸二钠盐。
目前磷酸肌酸的制备方法有化学合成法，生物提取法和生物酶法三种方法。生物提取法以动物肌肉组织为原料，因肌肉组织中磷酸肌酸含量偏低，所以成本高，难以工业化。酶法合成具有反应条件温和，反应速度快和专一性强等优点，但由于生产用酶采用生化提取，难以实现产业化，所以目前外源性磷酸肌酸钠的生产还是以化学合成法为主。对于化学法合成的磷酸肌酸钠，其原料药中主要杂质为肌酸，肌酸酐，无机磷酸钠盐。磷酸肌酸钠的纯化是磷酸肌酸钠项目中较难的部分。磷酸肌酸钠粗品的获得通常是向水性反应液中加入不良溶剂析晶得到磷酸肌酸钠固体。目前针对于磷酸肌酸钠杂质去除方法的报道并不多。我们在产品研究初期，对专利文献报道的纯化方法进行重复。专利CN101723972A报道纯化方法是，向水解液中加入一种或多种醇类的混合溶液，先抽滤一部分（杂质，粘状物），二次析出的固体为产品，反复多次纯化得到药用级磷酸肌酸钠，该方法在析杂质的过程中不易控制，较多产品很容易随杂质一起析出，不易控制收率，且单次纯化达不到理想的纯度。专利CN101033237A，粗品先用阴阳离子树脂除去无机盐，然后加甲醇和乙醇析晶得产品，该方法的缺点是，应用树脂，不宜工业放大，操作不便。专利CN102295658A，磷酸肌酸钠加水溶解后加入小分子有机溶剂形成油状物，分离形成的油状物，再加入有机溶剂打浆得到产品。应用该方法形成的油状物比较粘稠，不易分离，且该方法仅对有机杂质有效，对产品中的无机杂质无效。专利CN101812088A，将磷酸肌酸钠水溶液先加酸游离得到磷酸肌酸，磷酸肌酸加活性炭处理后在过色谱柱纯化并成盐，乙醇析晶得到磷酸肌酸钠。该方法应用普通的硅胶柱或氧化铝柱进行纯化，产品在填料上吸附，分离效果差，收率低，产品在柱色谱洗脱时难监测。基于以上纯化方法的缺点，目前需要找到一个纯化效果好，操作简便，易于实现工业化的纯化方法。
技术实现要素：
为解决纯化方法中纯在的问题，本发明提供一种操作方便纯化效果好的磷酸肌酸钠的方法。
本发明的技术解决方案：
一种磷酸肌酸钠的纯化方法及其在无菌粉中应用，具体步骤如下：
（1）磷酸肌酸钠粗品加入浓氢氧化钠溶液中；
（2）将上述溶液加热至一定温度；
（3）液相检测，磷酸肌酸钠转化为肌酸酐磷酸钠，当磷酸肌酸钠剩余量<5%时，停止反应，降至0~5℃搅拌2h；
（4）抽滤，滤饼加入乙醇搅拌洗涤，抽滤；
（5）向上述滤饼中加入稀氢氧化钠溶液，室温搅拌至反应完全；
（6）加入小分子溶剂，降至0~5℃析晶2h，抽滤，加乙醇搅拌洗涤至洗液pH为7~8，得磷酸肌酸钠精制品。
制备磷酸肌酸钠无菌粉的操作如下：
将上述（5）得到的反应液通过0.22um的滤芯，进入无菌区，加入小分子溶剂（已用0.22um的滤芯提前过滤）降至0~5℃析晶两小时。40℃真空干燥至水分在22.5~24.5%，称重，分装，压盖。
以上所述的浓氢氧化钠溶液的浓度为10M~20M，反应液中浓氢氧化钠溶液倍数为反应原料的5~20倍，反应温度范围为50~80℃，优选65~70℃。稀氢氧化钠溶液的浓度为0.1M~2.0M；稀氢氧化钠与反应原料肌酸酐磷酸钠的摩尔比为1:0.1-0.95；水解开环反应温度为0~30℃，优选20~25℃。以上所述的小分子溶剂为乙腈，丙酮，C1~C4水溶性醇类，优选乙醇。
本发明依据的化学原理：
目前有多篇文献报道肌酸酐磷酸钠在较稀浓度的氢氧化钠溶液中可以开环转化为磷酸肌酸钠，但是我们在实验中发现磷酸肌酸钠在浓氢氧化钠溶液中可以转化为肌酸酐磷酸钠，化学反应式如下所示。肌酸酐磷酸钠在氢氧化钠溶液中的溶解度较磷酸肌酸钠低很多，可以从反应液中析出。这一发现为磷酸肌酸钠的精制提供了新的思路。磷酸肌酸钠可通过转化为肌酸酐磷酸钠除去杂质，再将肌酸酐磷酸钠开环转化为磷酸肌酸钠得到磷酸肌酸钠精制品。
磷酸肌酸钠粗品中的主要杂质为肌酸、肌酸酐和磷酸盐。肌酸、肌酸酐在氢氧化钠溶液中具有一定的溶解性，反应完后溶于反应液中，抽滤得到肌酸酐磷酸钠从而除去杂质。肌酸酐磷酸钠经水解开环，析晶得到精制磷酸肌酸钠.得到的产品精制品, HPLC纯度>99.8%, 肌酸、肌酸酐含量<0.1%，蒸发光检测磷酸盐比例<0.2%。该精制方法操作简便，收率高，产品精制后纯度提高显著，易于工业化，应用该方法可直接制备磷酸肌酸钠无菌粉。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1
向反应瓶中加入磷酸肌酸钠5g，加入10M NaOH 溶液50mL，升温至80℃，搅拌10h，液相检测磷酸肌酸钠HPLC含量<5.0%，停止加热，降温至0~5℃搅拌2h，抽滤，滤饼加乙醇15mL搅拌洗涤，抽滤，湿品固体通过外标计算其中肌酸酐磷酸钠重量。向湿滤饼中加入0.1M氢氧化钠溶液14.5mL 30℃搅拌至反应完全，加入乙腈50mL，降温至0~5℃搅拌析晶2h，抽滤，滤饼加乙腈搅拌洗涤至洗液pH为7~8，抽滤，40℃减压烘干得磷酸肌酸钠精制品4.38g，收率87.6%，HPLC纯度99.81%，肌酸酐0.06%，肌酸0.07%，磷酸盐<0.2%。
实施例2
向反应瓶中加入磷酸肌酸钠5g，加入10M NaOH 溶液50mL，升温至80℃，搅拌10h，液相检测磷酸肌酸钠HPLC含量<5.0%，停止加热，降温至0~5℃搅拌2h，抽滤，滤饼加乙醇15mL搅拌洗涤，抽滤，湿品固体通过外标计算其中肌酸酐磷酸钠重量。向湿滤饼中加入0.5M氢氧化钠溶液11.6mL 25℃搅拌至反应完全，加入丙酮100mL，降温至0~5℃搅拌析晶2h，抽滤，滤饼加丙酮搅拌洗涤至洗液pH为7~8，抽滤，40℃减压烘干得磷酸肌酸钠精制品3.96g，收率79.2%，HPLC纯度99.84%，肌酸酐0.06%，肌酸0.08%，磷酸盐<0.2%。
实施例3
向反应瓶中加入磷酸肌酸钠5g，加入13M NaOH 溶液50mL，升温至70℃，搅拌8h，液相检测磷酸肌酸钠HPLC含量<5.0%，停止加热，降温至0~5℃搅拌2h，抽滤，滤饼加乙醇15mL搅拌洗涤，抽滤，湿品固体通过外标计算其中肌酸酐磷酸钠重量。向湿滤饼中加入1.0M氢氧化钠溶液7.3mL 20℃搅拌至反应完全，加入甲醇50mL，降温至0~5℃搅拌析晶2h，抽滤，滤饼加甲醇搅拌洗涤至洗液pH为7~8，抽滤，40℃减压烘干得磷酸肌酸钠精制品3.12，收率62.4%，HPLC纯度99.87%，肌酸酐0.04%，肌酸0.04%，磷酸盐<0.2%。
实施例4
向反应瓶中加入磷酸肌酸钠5g，加入17M NaOH 溶液50mL，升温至60℃，搅拌7h，液相检测磷酸肌酸钠HPLC含量<5.0%，停止加热，降温至0~5℃搅拌2h，抽滤，滤饼加乙醇15mL搅拌洗涤，抽滤，湿品固体通过外标计算其中肌酸酐磷酸钠重量。向湿滤饼中加入1.5M氢氧化钠溶液9mL 10℃搅拌至反应完全，加入异丙醇45mL，降温至0~5℃搅拌析晶2h，抽滤，滤饼加异丙醇搅拌洗涤至洗液pH为7~8，抽滤，40℃减压烘干得磷酸肌酸钠精制品4.23g，收率84.6%，HPLC纯度99.82%，肌酸酐0.08%，肌酸0.06%，磷酸盐<0.2%。
实施例5
向反应瓶中加入磷酸肌酸钠5g，加入20M NaOH 溶液500mL，升温至50℃，搅拌8h，液相检测磷酸肌酸钠HPLC含量<5.0%，停止加热，降温至0~5℃搅拌2h，抽滤，滤饼加乙醇15mL搅拌洗涤，抽滤，湿品固体通过外标计算其中肌酸酐磷酸钠重量。向湿滤饼中加入2.0M氢氧化钠溶液6.5mL 0℃搅拌至反应完全，加入叔丁醇50mL，降温至0~5℃搅拌析晶2h，抽滤，滤饼加叔丁醇搅拌洗涤至洗液pH为7~8，抽滤，40℃减压烘干得磷酸肌酸钠精制品4.17g，收率83.4%，HPLC纯度99.80%，肌酸酐0.08%，肌酸0.09%，磷酸盐<0.2%。
实施例6
向反应瓶中加入磷酸肌酸钠50g，加入20M NaOH 溶液500mL，升温至70℃，搅拌6h，液相检测磷酸肌酸钠HPLC含量<5.0%，停止加热，降温至0~5℃搅拌2h，抽滤，滤饼加乙醇150mL搅拌洗涤，抽滤，湿品固体通过外标计算其中肌酸酐磷酸钠重量。向湿滤饼中加入0.5M氢氧化钠溶液150mL 20℃搅拌至反应完全，加入乙醇450mL，降温至0~5℃搅拌析晶2h，抽滤，滤饼加乙醇搅拌洗涤至洗液pH为7~8，抽滤40℃减压烘干得得磷酸肌酸钠精制品。采用同一批磷酸肌酸钠作为精制原料，平行批次精制结果如下：
磷酸肌酸钠纯度，肌酸和肌酸酐含量通过液相紫外检测，具体方法如下：
甲醇：10mmol/L正戊胺（10%甲酸调pH至6.5）=5:95为流动相，检测波长210nm，以面积归一法计算HPLC纯度、肌酸和肌酸酐的含量。
磷酸盐含量通过液相蒸发光检测器进行检测，通过对照溶液定性检测，检测方法如下：
取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液，作为供试品溶液；另取磷酸二氢钾对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含4ug的溶液，作为对照品溶液。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：10mmol/L正戊胺（10%甲酸调pH至6.5）=5:95为流动相；柱温为30℃；检测器为蒸发光检测器，检测器温度为45℃，检测器气压为350kPa。分别量取对照品溶液和供试品溶液各100uL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如与对照品溶液主峰保留时间相同的杂质峰，若其峰面积小于对照品溶液的主峰面积（以PO43-计，<0.2%）, 若其峰面积大于对照品溶液的主峰面积（以PO43-计，> 0.2%）。
实施例7
向100L反应釜中加入磷酸肌酸钠2kg，加入15M NaOH 溶液40L，升温至70℃，搅拌8h，液相检测磷酸肌酸钠HPLC含量<5.0%，停止加热，降温至0~5℃搅拌2h，抽滤，滤饼加乙醇6L搅拌洗涤，抽滤，湿品固体通过外标计算其中肌酸酐磷酸钠无水物重量为1.32kg。将湿滤饼转入反应釜中，加入0.2M氢氧化钠溶液30L 20℃搅拌至反应完全，通过0.22um滤芯进入无菌区结晶釜，加入乙醇120L，降温至0~5℃搅拌析晶2h，抽滤，滤饼加乙醇搅拌洗涤至洗液pH为7~8，抽滤，40℃真空干燥12h，水分测试24.1%，收样，称重1.74kg，按每西林瓶装磷酸肌酸钠无水物1.0g（实际称量1.32g）分装，压盖。