一种检测染色体异常以及重组位点DNA序列的方法与流程

本发明涉及一种检测染色体异常的方法，尤其涉及一种能够低成本、快速测定染色体异常、以及染色体异常重组区域DNA序列并找到重组位点的方法。

背景技术：

出生缺陷严重地影响了人口素质，给国家、社会和家庭都带来了巨大的损失。染色体结构和数量异常是造成出生缺陷的最主要原因，染色体结构异常包括染色体易位和染色体倒位等。

染色体易位是指染色体片段位置的改变。当易位发生在一条染色体内时，称为移位或染色体内易位；而当易位发生在两条同源或非同源染色体之间时，称为染色体间易位。

染色体倒位是由于同一条染色体上发生了两次断裂，其产生的DNA片断经过180度颠倒、重新连接后造成了染色体倒位。如果倒位发生在染色体的一条臂上，称为臂内倒位；如果倒位包含了着丝粒区，则称为臂间倒位(Anthony J.F.Griffiths等人，An Introduction to Genetic Analysis，第八版)。

多年来，核型分析和荧光原位杂交技术(FISH)是主要的染色体异常分析技术，在鉴定染色体重组大致区域方面具有一定的成本优势，但产前诊断染色体异常的灵敏度仅有71.9％(杨凌云等人，中国优生与遗传杂志，2009，17(9)：1-4)。近年来，随着下一代高通量测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术的迅速发展，NGS目前也已经被广泛应用于染色体异常的分析，但是由于高等真核染色体中存在大量的重复序列，而且NGS的序列读长较短，在处理染色体易位和倒位等复杂情形时，NGS的作用有限。BioNano和OpGen公司的技术能够帮助给出全基因组的框架图，对于鉴定染色体异常的位置有帮助。但是目前的方案仍然很难快速、廉价地找出染色体异常位置的DNA序列。

技术实现要素：

针对现有技术方案无法快速、廉价地测序染色体重组(易位、倒位等)位点DNA序列的问题，本发明提供了一种新的检测重组位点DNA序列的方法。

本发明第一个方面所提供的检测染色体变异的方法，包括：

根据CRISPR技术，利用单酶切活性的Cas9酶对染色体DNA进行切割，

将双链DNA解开为单链DNA，

NGS平台进行单链DNA定向测序，与正常染色体DNA序列对比，判断是否存在染色体变异。

本发明第二个方面是提供一种检测检测染色体变异的方法，包括：

根据CRISPR技术，利用单酶切活性的Cas9酶对染色体DNA进行切割，

将双链DNA解开为单链DNA，

NGS平台进行单链DNA定向测序，与正常染色体DNA序列对比，判断是否存在染色体变异；

如果判定存在变异，确定重组位点的精确区域，测定精确区域的重组位点的DNA序列。

本发明第三个方面是提供一种检测染色体重组位点DNA序列的方法，包括：

初步定位染色体异位大致区域，

根据第一条染色体该区域的参照序列设计并制备排序的sgRNA序列，

根据CRISPR技术，利用单酶切活性的Cas9酶对染色体DNA进行切割，

将双链DNA解开为单链DNA，

NGS平台进行单链DNA定向测序，确定重组位点的精确区域，并测定精确区域的重组位点的DNA序列。

本发明第四个方面所提供的检测染色体间易位重组位点DNA序列的方法，包括：

初步定位染色体重组大致区域，

根据第一条染色体重组大致区域的参照序列设计并制备排序的第一组sgRNA序列，

根据CRISPR技术，利用单酶切活性的Cas9酶对染色体DNA进行切割，

将双链DNA解开为单链DNA，

NGS平台进行单链DNA定向测序，确定第一条染色体重组位点的精确区域，并测定精确区域的重组位点的DNA序列；

根据第二条染色体重组大致区域的参照序列设计并制备排序的第二组sgRNA序列，

根据CRISPR技术，利用单酶切活性的Cas9酶对染色体DNA进行切割，

将双链DNA解开为单链DNA，

NGS平台进行单链DNA定向测序，确定第二条染色体重组位点的精确区域，并测定精确区域的重组位点的DNA序列。

本发明上述内容中，所述“大致区域”的含义对于本领域技术人员而言是明确的，一般为含有染色体重组位点的较大的区域，如1-10M区域，更优选为1-8M区域，更优选为1-5M区域。

本发明上述内容中，所述“精确区域”的含义对于本领域技术人员而言是明确的，一般为含有染色体重组位点的较小区域，如≤20kb，更优选为≤15kb，更优选为≤10kb，更优选为≤5kb，更优选为≤1kb。

其中，本发明上述内容中，初步定位染色体重组大致区域的方法，可以是选自核型分析、FISH、BioNano等技术。

所述初步定位染色体重组大致区域步骤中，还可以包括染色体异常类型的判断。

其中，本发明所述方法的一种优选实施例中，在染色体DNA切割后还可以包括利用DNA缺口平移技术在缺口处掺入碱基类似物的步骤，并在双链DNA解开后利用碱基类似物的特征纯化单链DNA。

其中，本发明上述内容中，所述“碱基类似物”的含义对于本领域技术人员而言是明确的，指的是化学结构与碱基成分类似、能够替代正常碱基插入DNA分子中的化合物，如8-吖鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴去氧尿核苷、马来酰肼、丙烯酰胺基修饰的dNTP、叠氮化修饰的dNTP、地高辛修饰的dNTP、Biotin修饰的dNTP、5-羟甲基胞嘧啶中的任意一种或几种，更优选为Biotin修饰的dGTP。

其中，本发明所述方法的一种优选实施例中，在NGS平台进行单链DNA定向测序后，还可以包括利用现有的分子生物学技术来精确测定目标序列的步 骤。其中，所述现有的分子生物学技术可以是PCR技术、以及已知的其他测序技术。

本发明可通过比较成熟的现有技术，低成本条件下分析染色体重组的大致区域，并利用Cas9体外多点单链切割技术，有效地克服NGS读长较短等缺点，从而能够直接利用NGS平台测序，极大地降低了测序成本。

本发明方法不仅能够确定染色体倒位、易位等信息，还能够对目的区域的DNA序列进行精确测定。相比于传统的染色体异常检测手段，该方法能够获得更多的DNA序列信息。

附图说明

图1为本发明实施例1中染色体倒位区域DNA序列测定方法的流程示意图；

图2为本发明实施例2中染色体易位区域DNA序列测定方法的流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明所述检测重组位点DNA序列的方法进行详细的介绍和描述，。

实施例1：

(1)用经典的核型分析、FISH、BioNano等技术确定染色体异常的状况(包括在那条染色体上、何种异常、大概位置)，如图1所示，染色体异常为染色体倒位。

定位到染色体倒位位点的大致的区域(如1-5M的区域)。

(2)针对该区域设计排序的sgRNA序列，并进行体外制备sgRNA。

(3)抽提染色体DNA；根据CRISPR技术，利用单酶切活性(如D10A或H840A)的Cas9，在体外对染色体进行切割。

(4)灭活Cas9酶，利用DNA缺口平移技术在缺口处掺入碱基类似物(如Biotin修饰的dGTP)。

(5)将DNA随机打断；将双链解开变为单链DNA，并利用碱基类似物的特征纯化单链DNA。

(6)利用NGS平台进行单链DNA定向测序。

(7)序列分析，锁定重组位点的精确区域(如<10kb)。

(8)若(7)仍未找到精确的重组位点的序列，则可以在(7)基础上，利用现有成熟的分子生物学技术(PCR、测序等)来精确测定目标序列。

实施例2：

(1)用经典的核型分析、FISH、BioNano等技术确定染色体异常的状况(包括在那条染色体上，何种异常，大概位置)，如图2所示，染色体异常为染色体间易位。

定位到染色体倒位位点的大致的区域(如1-5M的区域)。

(2)针对第一条染色体c1区域设计排序的sgRNA序列，并进行体外制备sgRNA。

(3)抽提染色体DNA；根据CRISPR技术，利用单酶切活性(如D10A或H840A)的Cas9，在体外对染色体进行切割。

(4)灭活Cas9酶，利用DNA缺口平移技术在缺口处掺入碱基类似物(如Biotin修饰的dGTP)。

(5)将DNA随机打断；将双链解开变为单链DNA，并利用碱基类似物的特征纯化单链DNA。

(6)利用NGS平台进行单链DNA定向测序。

(7)序列分析，锁定重组位点的精确区域(如<10kb)；

(8)然后针对第二条染色体c2区域设计排序的sgRNA序列，并进行体外制备sgRNA，重复上述(2)-(7)的步骤。

(9)若(7)或(8)中仍未找到精确的重组位点的序列，则可以在(7)或(8)基础上，利用现有成熟的分子生物学技术(PCR、测序等)来精确测定目标序列。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA(Horvath,P.,and Barrangou,R.(2010).CRISPR/Cas,the immune system of bacteria and archaea.Science 327,167–170)。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性，此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合 物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割(Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,and Charpentier,E.(2012).A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337,816–821)。

Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH两个独特的活性结构，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。对其中的一个结构域进行突变(如RuvC1的D10A和HNH结构域的H840A)后，突变后的Cas9便丧失对应的活力(Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,and Charpentier,E.(2012).A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337,816–821)。目前，随着大量工作的突破，Cas9的体外切割体系已经非常成熟(例如，sgRNA的体外制备技术非常方便且NEB公司已经开始出售Cas9酶)。

根据上述实施例可以看出，本发明具有如下优点：

1、由于目前的染色体核型分析、FISH等技术比较成熟，若只需要鉴定染色体重组的大致区域，成本较低。NGS的测序技术也比较成熟，若能直接利用NGS平台，则检测过程不仅快速，而且便宜。本发明中，利用了Cas9体外多点单链切割技术、切口平移技术等进行单链DNA标记，然后引入NGS测序技术，极大地降低了测序成本，并能够有效地克服NGS读长较短等缺点。

2、结合NGS测序技术，该方法不仅能够确定染色体倒位、易位等信息，还能够对目的区域的DNA序列进行精确测定。相比于传统的染色体异常检测手段，该方法能够获得更多的DNA序列信息。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。