基于PGM快速检测牛乳或鸡组织中抗生素残留的方法与流程

本发明属于食品中抗生素残留快速检测技术领域，具体涉及一种基于电流型便携式葡萄糖传感器(PGM)及其配套电极结合S.thermophilus对葡萄糖发酵抑制率的测定和计算，实现以客观判定为依据对牛乳或鸡组织中抗生素残留的快速检测。

背景技术：

抗生素具有良好的抗感染效果，价格便宜，容易获得等优点，在畜牧业和水产业得到了广泛应用，但也因此造成了严重的抗生素残留问题。长期使用抗生素或者食用抗生素残留的食品都会造成人及其动物体内抗生素累积，危害人体健康，如发生过敏反应、微生态平衡破坏致免疫系统受损以及体内产生一定的耐药性致病菌株；如长期食用的食品中含有氨基糖苷类抗生素残留则会引起中耳炎和肾毒性疾病；而如果人体内的抗生素残留量达到一定程度时还可能会导致人体癌症和基因突变。

近年来，由于经济利益的驱使，现在抗生素在畜、禽和水产养殖业生产中的滥用越来越多，已经成为我国和全世界都面临的严重问题。长期食用含有抗生素残留的食品，可能会导致人体产生过敏反应和耐药性等，如氯霉素，会导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症，从而危害人类的健康。目前抗生素残留的检测方法主要有微生物抑制法、理化分析法和免疫检测法，其中微生物抑制法的TTC法，我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409-85)。该法简单、快速，检测成本低，3～4h可以出结果，适用于基层检测单位采用，但是需要通过肉眼主观来判断显色状态，没有客观判定标准，易产生一定的误差，并且对微红色难以做出准确的判断；理化分析方法虽然具有较高的准确性和灵敏性，但是样品前处理和检测过程都较复杂，仪器设备昂贵。因此，研制简便、快速、经济和准确的抗生素残留的检测方法具有重要的现实意义。

电流型便携式葡萄糖传感器(简称便携式血糖仪，Personal glucose meters，PGM)具有体积微小、便携、经济、操作简便、快速准确等突出优点，己被广泛应用于糖尿病患者血糖的医院随时检测和自我监测。将具有如此突出优点和成熟的检测技术引入到繁琐的食品致病菌和抗生素残留的快速检测领域，具有很好的创新性、研究价值和应用前景。目前仅有的基于PGM构建的对非糖类物质检测的方法所必须用到的蔗糖转化酶标记抗体或核酸类物质等生物制剂的制备较繁琐，活性等易受贮存时间和贮存环境等条件作用而降低，不但影响检测结果的准确性，同时，在简便、快捷和经济方面的优势也受到了很大影响。

本发明将微生物检测法易于普及的特点与PGM简便灵敏的优势相结合，采用S.thermophilus作为指示菌，利用PGM测定S.thermophilus发酵体系中的葡萄糖浓度，若样品中有抗生素残留，S.thermophilus生长繁殖受到抑制，消耗葡萄糖的能力也就受到抑制。基于此原理，以牛乳中青霉素、氯霉素、庆大霉素和卡那霉素残留以及鸡组织中青霉素和庆大霉素残留为检测对象，对一系列试验结果进行综合分析和对比，以提高此方法的灵敏度与稳定性，为抗生素残留的检测提供了一种简便、快速、经济、准确的新方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种基于PGM快速检测牛乳或鸡组织中抗生素残留的方法。

基于PGM快速检测牛乳或鸡组织中抗生素残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种的培养和收集：将嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株划斜面置于37℃培养12h后，挑取一环S.thermophilus菌种，接种到灭菌脱脂乳中，置于37±1℃下培养15h进行活化；取活化后的菌液置于MRS培养基中进行扩大培养15h，用生理盐水洗下菌体，最后用生理盐水悬浮菌体计数1×10⁸cfu/mL后备用，得菌液；

(2)取牛乳或匀浆后的鸡组织样本5.0g，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为10～15.0mmol/L，再加入步骤(1)的菌液1mL；对照组为无抗牛乳或匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加入葡萄糖使其浓度与样本相同，再加入步骤(1)的菌液1mL；空白组为无抗牛乳或匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加入葡萄糖使其浓度与样本相同，不加菌液；80℃灭菌20min，在对应时间0min、180min取出，用电流型便携式葡萄糖传感器(PGM)测定样本、对照组和空白组中葡萄糖含量，计算葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2，C1为0h时的葡萄糖浓度，C2为180min时的葡萄糖浓度；

(3)计算葡萄糖发酵抑制率：葡萄糖发酵抑制率＝[(对照ΔC-样品ΔC-空白ΔC)/对照ΔC]×100％；

(4)葡萄糖发酵抑制率等于或大于50％的，即可判定被测牛乳或鸡组织中抗生素残留为阳性。

进一步地，步骤(2)中，当样本为牛乳时，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为10mmol/L。当样本为鸡组织时，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为15mmol/L。

抗生素残留是食品中重要危害因素，特别是在我国，为构建更敏感准确的残留抗生素快速检测新方法，本发明根据抗生素能抑制嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，S.thermophilus)发酵且PGM能快速检测一定基质中葡萄糖发酵抑制率的原理，创建了一种牛乳和鸡组织中抗生素残留的快速检测方法。在无抗乳中添加适量葡萄糖，利用S.thermophilus在发酵过程中能分解葡萄糖和在抗生素存在的情况下生长受到抑制的原理，用PGM测定发酵过程中的葡萄糖浓度。对牛乳中葡萄糖初始浓度、S.thermophilus添加量、检测时间等因素的选择和优化，结果确定乳中抗生素检测的最佳条件为葡萄糖初始浓度为15.0mmol/L，S.thermophilus的添加量为1×10⁸cfu/mL，检测时间为3h，牛乳中青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素的检测限分别为4μg/L、50μg/L、100μg/L、50μg/L，鸡组织中青霉素和庆大霉素的检测限分别为12.5μg/kg、50μg/kg。此方法具有简便快速、检测成本低廉、容易实施等优点，适用于基层检测机构的抗生素残留检测。

附图说明

图1是PGM的校正曲线图。

图2是不同培养液中葡萄糖浓度随时间的变化曲线图。

图3a、图3b是牛乳中葡萄糖消耗量随菌浓度的变化曲线图。

具体实施方式

实施例1：牛乳中4种抗生素残留的检测

菌种的培养和收集：将嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株划斜面置于37℃培养12h后置于4℃冰箱中保藏以用于抗生素的检测。挑取一环S.thermophilus菌种，接种到灭菌脱脂乳中，置于37±1℃下培养15h进行活化。取活化后的菌液置于MRS培养基中进行扩大培养15h，用生理盐水洗下菌体，最后用生理盐水悬浮菌体计数后备用。

血糖仪校正及适用性确定：含有细菌的牛奶与测定血糖时用的血液在整体组成成分方面差别很大，为确定PGM可否适用于牛奶体系，精确配制含不同浓度葡萄糖的牛奶作为标准液进行对照，分别用PGM测定牛奶中葡萄糖浓度来确定血糖仪的准确性和精确度，以保证试验结果的准确性。

PGM是专门设计制作用来测定人体血液中葡萄糖含量的，测试用电极反应区域内发生反应往往是有严格条件限制的，在其工作范围1.1mmol·L^-1～33.3mmol·L^-1内，为保证该研究中测试结果的准确性，以葡萄糖标准液作为对照，检测结果如图1所示，其中C1是葡萄糖-牛乳中的葡萄糖浓度，C2是PGM所测得的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度在1.1mmol·L^-1～33.3mmol·L^-1之间变化时，PGM检测到的葡萄糖浓度与标准液中葡萄糖浓度呈良好的线性关系，线性方程为C1(mmol/L)＝1.59C2(mmol/L)+1.57，相关系数为0.996。试验结果表明，PGM能够准确检测出葡萄糖-牛乳中葡萄糖浓度，可适用于该体系中。

检测用菌种的选择及菌液工作浓度的优化确定：基于对葡萄糖发酵受抑制性及对多种抗生素敏感的特性，选择嗜热链球菌(S.thermophilus)为检测用菌；菌株经活化、扩大培养并制成生理盐水菌悬液。在多支试管中分别加入4.5mL含适量葡萄糖的灭菌牛乳，用生理盐水对菌种液进行10¹～10⁴倍稀释，稀释后的菌液浓度分别为10⁶～10¹⁰cfu/mL，将不同梯度的菌种液取0.5mL分别加至上述试管中混匀，于37±1℃下振荡培养，分别按对应时间(0min，90min，120min，150min，180min)将试管取出，用PGM测定牛乳中葡萄糖含量。为进一步确定菌液的最佳工作浓度，选择合适的几个菌液浓度的菌种液0.5mL分别加至4.5mL含适量葡萄糖的有抗灭菌牛乳中，混匀，于37±1℃下振荡培养，分别按对应时间(0min，90min，120min，150min，180min)将试管取出，用PGM测定牛乳中葡萄糖含量。

对于抗生素残留检测追求快速，当指示菌浓度大、活性高时，如图3a中，在90min时，PGM检测到牛乳中葡萄糖浓度相对于初始值就有明显的变化，但是菌液浓度太高，对低浓度抗生素的敏感度低，抗生素检出限就会变高，检测方法的灵敏度就会变低；但也不能为追求灵敏度，而过度减小菌液浓度，延长检测时间，时间过长不符合目前对乳制品中抗生素残留检测的需求。以国标TTC法为基准，最适的检测时间确定为2.5h～3.0h。

从图3a中可看出，菌液浓度为1×10¹⁰cfu/mL时，葡萄糖消耗太快，容易造成假阴性；菌液浓度为1×10⁶cfu/mL至1×10⁷cfu/mL时，在3.0h时葡萄糖还没有明显的消耗，要适当的延长时间，但导致检测时间太长。所以选择菌液浓度为1×10⁹cfu/mL和1×10⁸cfu/mL的菌种液做进一步试验确定最佳工作浓度，将菌液浓度为1×10⁹cfu/mL和1×10⁸cfu/mL的菌种液分别置于无抗牛乳和有抗牛乳中做对比，通过抑制率情况来选择最佳的菌液工作浓度，从图3b中可看出，a和b分别是菌液浓度为1×10⁸cfu/mL菌种液在有抗牛乳和无抗牛乳中的所测数据，c和d分别是菌液浓度为1×10⁹cfu/mL菌种液在有抗牛乳和无抗牛乳中的所测数据，可以判断出菌液浓度为1×10⁸cfu/mL时，在有抗牛奶中所受到的抑制比在菌液浓度为1×10⁹cfu/mL中受到的大，即菌液浓度为1×10⁸cfu/mL对抗生素更敏感，因此选择菌液浓度为1×10⁸cfu/mL为最佳工作浓度。

葡萄糖浓度对嗜热链球菌消耗葡萄糖的影响：分别配制葡萄糖浓度为0mmol/L，5.00mmol/L，15.00mmol/L，10.00mmol/L，20.00mmol/L的水溶液各50mL于锥形瓶中，加热至80℃，加入适量乳粉混合均匀，经高压灭菌后，分别从每个锥形瓶移取450μL培养液于试管中，加入500μL菌液，于37±1℃下振荡培养，分别按对应时间(0min，30min，60min，90min，120min，150min，180min)将试管取出，用PGM测定脱脂乳中葡萄糖含量。

由图2可知，在不加葡萄糖的灭菌牛乳中仍可测出葡萄糖说明乳粉中含有少量葡萄糖，而在加入菌液(1×10¹⁰cfu/mL)之后，PGM读数几乎没变化，推测嗜热链球菌在过低的葡萄糖浓度下消耗乳糖，不消耗葡萄糖。在加入葡萄糖5.0mmol/L时，在0-120min内S.thermophilus葡萄糖消耗量明显，但是PGM读数过低，不宜采取；15.0mmol/L，20.0mmol/L时，在0-60min内高浓度的葡萄糖影响了S.thermophilus对葡萄糖的消耗，其消耗量变化幅度不大，会对抗生素检测造成额外的误差，因此在之后的测定中均选用10mmol/L。

牛乳中4种抗生素检测限的确定：

抗生素在牛乳中对S.thermophilus葡萄糖发酵抑制率测定：用含适量葡萄糖的灭菌牛奶配制这4种抗生素的标准品，浓度梯度按照牛奶中的这4种抗生素的最大允许残留限量(MRL)的n倍来配制(MRL×n)，n＝0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0。取各梯度抗生素的牛乳4.5mL，加入适量浓度的菌液500μL，对照组加入4.5mL无抗牛乳，500μL菌液，空白组为4.5mL无抗牛乳，不加菌液，各试管在80℃加热5min。在对应时间(0min，120min，150min，180min)将试管取出，用PGM测定牛乳中葡萄糖含量，计算各试管中葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2,C1为0h牛乳中葡萄糖浓度，C2为180min牛乳中葡萄糖浓度。

抑制率计算：抑制率＝(对照ΔC-样品ΔC-空白ΔC)/对照ΔC。

确定本方法对这4种抗生素的检测限(最低抑菌浓度)。

选定青霉素浓度梯度1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、16μg/L、32μg/L，链霉素、庆大霉素和卡那霉素浓度梯度50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、800μg/L、1600μg/L，在对应时间(0min，120min，150min，180min)测定一次，对照样品为无抗牛乳4.5mL加500μL菌液，，空白样品为无抗牛乳4.5mL。测定结果如下。

表1不同浓度青霉素对牛乳中葡萄糖浓度变化的影响

表2不同浓度链霉素对牛乳中葡萄糖浓度变化的影响

表3不同浓度庆大霉素对牛乳中葡萄糖浓度变化的影响

表4不同浓度卡那霉素对牛乳中葡萄糖浓度变化的影响

从以上表中可看出，与对照组相比，对添加有抗生素的牛乳对S.thermophilus发酵葡萄糖都有抑制作用，而对于在180min时抑制率大于等于50％作为对牛乳中S.thermophilus有明显抑制作用的判断依据。由此可说明当青霉素浓度大于4μg/L、链霉素浓度大于50μg/L、庆大霉素浓度大于100μg/L、卡那霉素浓度大于50μg/L时，对牛乳中的S.thermophilus有明显的抑制作用，而我国对牛奶中这四种抗生素的最高残留量(MRL)分别为青霉素4μg/L，链霉素、庆大霉素和卡那霉素均为200μg/L，因此，该方法的检测限能达到我国对牛乳中这四种抗生素的最高残留限量(MRL)的要求。

实施例2：鸡组织中2种抗生素检测

抗生素在鸡组织中对S.thermophilus葡萄糖发酵抑制率测定：农业部235号公告规定了部分药物在动物可食组织中的最高残留限量(MRL)，其中青霉素、庆大霉素在鸡组织中的MRL为50μg/kg、100μg/kg。采用空白肌肉添加抗生素标准品的方法，以鸡组织中的抗生素最大允许残留限量(MRL)的n倍制成一系列浓度梯度(MRL×n)，n＝0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0。取匀浆后的各梯度抗生素的鸡组织5.0g，加入10mL含适量葡萄糖的灭菌无抗牛乳，再加入适量浓度的菌液1mL，对照组加入匀浆后的无抗鸡组织5.0g，10mL含适量葡萄糖的灭菌无抗牛乳，菌液1mL，空白组为匀浆后的无抗鸡组织5.0g，10mL含适量葡萄糖的灭菌无抗牛乳，不加菌液，各试管在80℃灭菌20min。在对应时间(0min，120min，150min，180min)将试管取出，用PGM测定牛乳中葡萄糖含量，计算各试管中葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2,C1为0h时的葡萄糖浓度，C2为180min时的葡萄糖浓度。

抑制率计算：抑制率＝(对照ΔC-样品ΔC-空白ΔC)/对照ΔC。

确定本方法对这2种抗生素的检测(最低抑菌浓度)。

选定青霉素浓度梯度12.5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg的鸡组织，庆大霉素浓度梯度25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、400μg/kg、400μg/kg、800μg/kg，在对应时间(0min，120min，150min，180min)测定一次，对照组为匀浆后的无抗鸡组织5.0g加10mL葡萄糖浓度为15.0mmol/L的灭菌无抗牛乳，菌液1mL，空白组为匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加10mL含葡萄糖浓度为15.0mmol/L的灭菌无抗牛乳，不加菌液。测定结果如下。

表5不同浓度青霉素对鸡组织中葡萄糖浓度变化的影响

表6不同浓度庆大霉素对鸡组织中葡萄糖浓度变化的影响

从以上表中可看出，与对照组相比，对添加有抗生素的牛乳对S.thermophilus都有抑制作用，而对于在180min时抑制率大于等于50％作为对S.thermophilus有明显抑制作用判断依据。由此可说明当青霉素浓度大于12.5μg/kg、庆大霉素浓度大于50μg/kg时，对牛乳中的S.thermophilus有明显的抑制作用，而我国对鸡组织中这两种抗生素的最高残留量(MRL)分别为青霉素50μg/kg，庆大霉素为100μg/kg，因此，该方法的检测限能达到我国对鸡组织中这两种抗生素的最高残留限量(MRL)的要求。

实施例3：准确性试验

将市售的牛乳和鸡肝样品各自随机分成30份，样品总数为60份，分别随机加入抗生素制备人工模拟试验样品，采用PGM进行检测，并将检测结果与国标法进行对比。

为验证该方法的准确性，将2个人工制备的模拟样品分别随机分成30份，在最佳条件下，分别用该方法与国标法对各样品进行检测，检测结果如表7所示。由表7可知，与国标法相比，该方法具有较高的准确率，结果表明PGM可用于实际样品中抗生素残留的检测。

表7国标法与PGM方法检测结果对照

本发明以葡萄糖为信号转换分子，利用S.thermophilus发酵葡萄糖原理，用PGM对抗生素残留进行了检测，研制了一种新颖的、简便、经济的方法用于抗生素残留的检测。其检测限能达到我国对牛乳和鸡肉组织中对应抗生素的最高残留限量(MRL)的要求，与理化分析法相比，该方法简便经济，易于推广；与TTC法相比，更加灵敏准确，并且还可以用于动物性食品中抗生素残留的检测。虽然不能定性检测某一抗生素，但用来初步筛选检测牛乳和鸡组织中的抗生素残留，仍然是一种简便、快速、效果明显的方法。该方法检测成本低廉，不需要昂贵的仪器，更适合基层检测单位的常规检测。