本发明涉及[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Ile-Phe-氨基葡萄糖，涉及它的制备方法，涉及它的抗肿瘤作用和抗炎作用，因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物和抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
技术背景
肿瘤是局部组织的细胞异常增生而形成的新生物。所有的恶性肿瘤总称为癌症。恶性肿瘤严重威胁着人类健康。在临床肿瘤的手术治疗、放疗和化疗中，化疗应用最广泛，发明疗效好和毒副作用低的抗肿瘤新药一直是药物研究的热点。在抗肿瘤新药研究中，发明人曾公开下面结构的化合物(式中AA为氨基酸残基)按1μmol/kg剂量腹腔单次给药，每天一次，连续给药7天具有抗肿瘤作用。发明人并不满意这种疗效。
经过5年研究，发明人发现上面构中的AA-OBzl用Ile-Phe-氨基葡萄糖代替，不仅可以增强抗肿瘤活性，而且可以获得额外的抗炎活性。根据这些研究结果，发明人提出了本发明。
技术实现要素：
本发明的第一个内容是提供下式的[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Ile-Phe-氨基葡萄糖。
本发明的第二个内容是提供[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Ile-Phe-氨基葡萄糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将L-色氨酸在硫酸的催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合得到2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸；
(2)冰浴下向2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸与N，N-二甲基甲酰胺，DMF，的溶液中加入二碳酸二叔丁酯，Boc2O，N-甲基吗啉催化得到N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸；
(3)在二环己基碳二亚胺，DCC，和N-羟基苯并三唑，HOBt，存在下N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在无水THF(四氢呋喃)中与L-Leu-OMe缩合为N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe；
(4)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe脱去Boc生成2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe；
(5)三乙胺催化下2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe在甲醇和丙酮溶液中避光反应得到2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰甲酯；
(6)在甲醇溶液中2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰甲酯在2N NaOH溶液中水解生成2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酸；
(7)在DCC和HOBt存在下2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酸在无水DMF中与Ile-OBzl缩合为2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-Ile-OBzl；
(8)在Pd/C催化下2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-Ile-OBzl氢解为2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-Ile；
(9)在DCC和HOBt存在下，Boc-Phe在无水DMF中与氨基葡萄糖缩合为Boc-Phe-氨基葡萄糖；
(10)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Phe-氨基葡萄糖脱去Boc生成Phe-氨基葡萄糖；
(11)在DCC和HOBt存在下2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-Ile在无水DMF中与Phe-氨基葡萄糖缩合为2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-Ile-Phe-氨基葡萄糖。
本发明的第三个内容是评价2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-Ile-Phe-氨基葡萄糖抑制S180肿瘤小鼠肿瘤生长作用。
本发明的第四个内容是评价2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-Ile-Phe-氨基葡萄糖对ICR小鼠炎症的抑制作用。
附图说明
图1[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰 -Ile-Phe-氨基葡萄糖的合成路线.i)稀硫酸，40％甲醛；ii)Boc2O，DMF，三乙胺；iii)DCC，HOBt，NMM，无水THF；iv)4N氯化氢，甲醇，丙酮，三乙胺；v)2N NaOH；vi)Pd/C，氢气。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1 制备(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)
将2500mL蒸馏水置于2500mL反应瓶中，缓慢加入1.3mL浓硫酸，搅拌2min，再向得到的稀硫酸中加入32.6g(159mmol)L-色氨酸，超声至完全溶解，再加入65mL 40％甲醛溶液，室温搅拌7hTLC(CH2Cl2∶CH3OH，5∶1)监测终止反应。向反应液中缓慢滴加浓氨水，调pH至6，静置半小时，过滤，滤饼分别用蒸馏水，丙酮洗涤3次，收集滤饼转移至表面皿中晾干，最后得到31.5g(91％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)215[M-H]-。
实施例2 制备N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)
将41.9g(193.9mmol)(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸加到300mL DMF中，冰浴搅拌下向悬浮液中加50.8g(233mmol)(Boc)2O，然后滴加三乙胺调反应液pH至10，室温反应48h，每8h水泵抽气1次，TLC(CH2Cl2∶CH3OH，5∶1)显示原料点消失，终止反应。减压浓缩，残留物用300mL乙酸乙酯溶解，用5％KHSO4溶液洗3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩。残留物加入少量CH2Cl2超声为悬浮液后过滤，收集滤饼。滤液浓缩后重复上述步骤，直至溶液内无悬浮物终止。收集滤饼得33.94g(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)315[M-H]-。
实施例3 制备N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯(3)
冰浴下将31.35g(99.7mmol)N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸溶解于250mL无水THF并加13.39g(99.7mmol)HOBt，然后加24.51g(119.6mmol)DCC与150mL无水THF的溶液，反应30min；再加19.87g(99.7mmol)L-亮氨酸甲酯，用NMM调反应液pH至9，室温反应24h。TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)显示原料点消失，终止反应。过滤，滤液减压浓缩。残留物用250mL乙酸乙酯溶解，依次用饱和NaHCO3溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％KHSO4溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％NaHCO3溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩得43.42g(99％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)444[M+H]+。
实施例4 制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸甲酯(4)
冰浴搅拌下向21.0g(48.4mmol)N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯滴入220mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)，冰浴下反应4h TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失。抽干溶剂，残留物用110mL CH3OH溶解，加入110mL丙酮，用三乙胺调反应液pH至9，室温避光反应2周。TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)显示原料点消失，终止反应。反应液过滤，滤液减压浓缩有沉淀析出。再过滤，滤液减压浓缩又有沉淀析出。重复此步骤，直至无沉淀析出。收集滤饼。滤液浓缩后用400mL乙酸乙酯溶解，用饱和NaCl溶液洗8次，合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h后过滤，滤液减压浓缩，残留物用少量CH3OH悬浮，过滤，收集滤饼。滤液重复此步骤，直至无沉淀析出。合并收集的所有滤饼，晾干得11.75g(65％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)384[M+H]+。
实施例5 制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸(5)
向10.32g(26.9mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸甲酯加入300mL THF和100mL CH3OH。冰浴搅拌下用2N NaOH调反应液的pH至12。冰浴反应48h TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失，终止反应。冰浴下用饱和KHSO4溶液将反应液pH调至7。减压浓缩去除THF和CH3OH后，冰浴下用5％KHSO4溶液将残留物液的pH调至2，使析出大量无色沉淀。过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼晾干得9.45g(95％)标题化合物，为浅黄色固体。ESI-MS(m/e)368[M-H]-。
实施例6 制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Ile-OBzl(6)
冰浴和搅拌下向1.0g(2.74mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸与350mL无水THF的溶液中加0.37g(2.74mmol)HOBt及0.62g(3.28mmol)DCC，反应30min。之后，加入1.17g(2.74mmol)L-Ile-OBzl并用NMM将反应液的pH调至9，反应13h TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失，终止反应。反应液过滤，滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用饱和NaHCO3溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％KHSO4溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％NaHCO3溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱层析纯化得1.19g(44.02％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)573[M+H]+。
实施例7 制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Ile(7)
向608mg(1.06mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Ile-OBzl和40mL CH3OH的溶液中加60mg Pd/C，搅拌均匀，通入氢气，反应48h，TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失，终止反应。反应液过滤，滤液减压浓缩，得560mg(100％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)481[M-H]-。
实施例8 制备Boc-Phe-氨基葡萄糖
冰浴和搅拌下向10.0g(37.7mmol)Boc-Phe与300mL无水DMF的溶液中加入5.0g(37.7mmol)HOBt及9.3g(45.2mmol)DCC，反应30min。之后，加入12.0g(56.6mmol)盐酸氨基葡葡糖并用NMM将反应液的pH调至9，室温反应36h，TLC(CH2Cl2∶CH3OH∶CH3CO2H，15∶1∶1.5)监测原料点消失，终止反应。反应液过滤，滤液减压浓缩得6.0g(38％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)425[M-H]-。
实施例9 制备Phe-氨基葡萄糖
冰浴和搅拌下6.0g(14.08mmol)Boc-Phe-氨基葡萄糖与120mL 4N氯化氢-乙酸乙酯溶液反应4h，TLC(CH2Cl2∶CH3OH∶CH3CO2H，15∶1∶1.5)监测原料点消失，终止反应。反应液减压浓缩，残留物加无水乙醚减压浓缩除去游离氯化氢，得5.7g(100％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)326[M+H]+。
实施例10 制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Ile-Phe-氨基葡萄糖(8)
冰浴和搅拌下向100mg(0.21mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Ile和20mL无水DMF溶液中加29mg(0.21mmol)HOBt及94mg(0.45mmol)DCC，反应30min。之后，加91mg(0.25mmol)Phe酰-氨基葡萄糖，然后用NMM将反应液的pH调至9，室温避光反应。24h后点TLC(CH2Cl2∶CH3OH∶CH3CO2H，15∶1∶1.5)监测原料点消失，终止反应。过滤，滤液减压浓缩，残留物用10mL CH3OH和10mL蒸馏水的混合溶剂溶解，用MILLEX GP 0.22μm滤膜过滤，滤液用HPLC纯化，冻干后得12mg(7％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)789[M-H]-；Mp＝194-196℃；(c＝0.04，CH3OH)；1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ/ppm：10.867(s，1H)，7.958(d，J＝8.4Hz，1H)，7.731(d，J＝8.4Hz，1H)，7.437(d，J＝7.5Hz，1H)，7.190(m，9H)，6.444(d，J＝5.7Hz，1H)，4.868(t，J＝5.1Hz，2H)，4.390(m，3H)，4.210(m，1H)，3.950(m，1H)，3.776(m，2H)，3.445(m，5H)，2.943(m，3H)，2.751(m，2H)，2.111(m，2H)，1.912(m，1H)，1.643(m，4H)，1.295(s，3H)，1.271(s，3H)，0.923(d，J＝6.6Hz，6H)，0.777(m，6H)。
实验例1 评价8抑制S180小鼠肿瘤生长的活性
测定前将本发明衍生物用生理盐水将样品溶解；将阿霉素溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为1×107个/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2mL本发明衍生物的水溶液，连续给药9天，剂量为0.01μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第10天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，结果列入表1。数据表明，化合物8治疗小鼠的瘤重明显小于生理盐水治疗小鼠的瘤重。说明化合物8具有好的抗肿瘤活性。与发明背景中提到的已经公开的化合物相比，有效剂量降低了100倍，获得了意想不到的技术效果。
表1 化合物对8对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
n＝15；a)与生理盐水比p＜0.01。
实验例2 评价化合物8的抗炎活性
20±2g ICR雄性小鼠随机分为空白对照组、阳性用药组及给药组，小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次口服生理盐水(剂量为0.2mL/20g)或阿司匹林的生理盐水溶液(剂量为1.11mmol/kg)或化合物8的生理盐水溶液给(剂量为1μmol/kg)30分钟后，往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.045mL)，1小时后将小鼠麻醉，颈椎脱臼处死。将小鼠的左和右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度，以mg表示。本实验数据统计均采用t检验和方差分析。结果见表2。可以看出化合物8治疗组的鼠耳肿胀度与生理盐水组相比具有显著性差异，表明化合物8在发挥体内抗肿瘤作用下，还具有抗炎作用。与发明背景中提到的已经公开的化合物相比，抗炎症活性是意想不到的技术效果。
表2 化合物8的抗炎活性
n＝10；a)与生理盐水比p＜0.01。