重组核酸片段RecCR020325及其检测方法与流程

文档序号:12167209阅读:来源:国知局

技术特征:

1.重组核酸片段,其选自:

i)包含SEQ ID NO:1所示序列216-663位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列;

ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列;

iii)包含SEQ ID NO:2所示序列636-888位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列;

iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列;以及

以上片段的组合。

2.检测权利要求1所述片段的引物,其中所述引物选自:

(I)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列1-216位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列663-854位核苷酸的序列的反向引物;

(II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合,其包含

(a)第一组引物对:特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-216位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第217-662位核苷酸的序列的反向引物;和

(b)第二组引物对:特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第217-662位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第663-854位核苷酸的序列的反向引物;

(III)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第216-217位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第662-663位核苷酸的序列的反向引物;

(IV)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第216-217位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第663-854位核苷酸的序列的反向引物;

(V)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-216位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第662-663位核苷酸的序列的反向引物;和/或任选地,

(VI)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列1-636位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列888-1050位核苷酸的序列的反向引物;

(VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合,其包含

(c)第三组引物对:特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-636位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第637-887位核苷酸的序列的反向引物;和

(d)第四组引物对:特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第637-887位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第888-1050位核苷酸的序列的反向引物;

(VIII)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第636-637位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第887-888位核苷酸的序列的反向引物;

(IX)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第636-637位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第888-1050位核苷酸的序列的反向引物;

(X)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-636位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第887-888位核苷酸的序列的反向引物。

3.检测权利要求1所述片段的引物,其中所述引物选自:

(I)扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对

5’-ATGATTATGTTCGTCTGCCTGATG-3’,

5’-TCAACGTACCGCGTAGACACTACA-3’;以及

(II)测序SEQ ID NO:1所示序列的引物

5’-CGAGGGCGTATGAGGAGGAA-3’;

5’-TCAACGTACCGCGTAGACACTACA-3’;和/或任选地,

(III)扩增SEQ ID NO:2所示序列的引物对

5’-GCCATCAGCCTGTCCAATAC-3’,

5’-CAAGGCCAACGGAACTAACT-3’;

(IV)测序SEQ ID NO:2所示序列的引物

5’-GCCATCAGCCTGTCCAATAC-3’;

5’-GAGATGCCGACATGAGTGGT-3’;

5’-CACTACTAAGGTCCCGTTCT-3’。

4.选育含有权利要求1所述的重组核酸片段的水稻植株的方法,其包括以不含目的基因组片段的水稻受体植物亲本作为轮回亲本,将其与含有目的基因组片段的水稻供体植物进行杂交,然后将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交,再将所得到的回交种进行自交的步骤,其中利用分子标记对重组植株进行前景选择和背景选择。

5.如权利要求4所述的方法,其中用于所述前景选择的分子标记选自BphC04ID06、RM6659和BphC04S08中的一种或多种;和/或

任选地,利用水稻全基因组育种芯片进行所述背景选择。

6.如权利要求4或5所述的方法,其中所述重组核酸片段含有抗褐飞虱基因,并且所述方法包括以下步骤:

1)将轮回亲本与供体植物进行杂交,将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交,获得回交一代,利用正向选择标记BphC04ID06和负向选择标记RM6659、BphC04S08对其进行抗褐飞虱基因组片段的单侧同源重组片段筛选,并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择;

2)选择背景回复较好的重组单株与轮回亲本再次进行回交,获得回交二代,利用正向选择标记BphC04ID06对其进行检测,选择含有抗褐飞虱基因组片段的重组单株,然后利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择;

3)选择背景回复好的重组单株与轮回亲本又一次进行回交,获得回交三代,利用正向选择标记BphC04ID06和负向选择标记RM6659、BphC04S08对其进行抗褐飞虱基因组片段的另一侧同源重组片段筛 选,并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择;以及

4)选择导入片段小,且背景回复好的重组单株,将选中的重组单株自交一次,获得自交种,利用正向选择标记BphC04ID06对其进行检测,并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择,最终获得含纯合抗褐飞虱基因组重核酸片段且背景回复的水稻植株。

7.如权利要求4至6中任一项所述的方法,其中利用分子标记对重组植株进行前景选择时采用的扩增引物如下:

扩增分子标记BphC04ID06的引物对,其包括:

正向引物:5’-CCTAGCCGTCAGGTTAATAGATCAT-3’,

反向引物:5’-ACCAGGTCTACTAGCTTTTACGGAG-3’;

扩增分子标记RM6659的引物对,其包括:

正向引物:5’-TGTGGAGGCTTAGGAAATTCTGG-3’,

反向引物:5’-TGTGAAACATGCCACGATACTGC-3’;以及

扩增分子标记BphC04S08的引物对,其包括:

正向引物:5’-GAGCGATCCATTAGCACGTGACT-3’,

反向引物:5’-GTTTCTAGGTGTTCCCAACTCTCCC-3’。

8.检测权利要求1所述的重组核酸片段的方法,其包括采用权利要求2或3所述的引物,以待测基因组为模板进行PCR反应,并分析PCR产物的步骤。

9.检测权利要求1所述的重组核酸片段的试剂盒,其包括权利要求2或3所述的引物。

10.筛选含有权利要求1所述的重组核酸片段的水稻植株或种子的方法,其包括检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段的步骤;

优选地,采用权利要求2或3所述的引物,或者采用权利要求8所述的方法,或者采用权利要求9所述的试剂盒来进行检测。

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