干涉片段及其应用的制作方法

本发明涉及免疫生物学
技术领域：
，具体涉及干涉片段及其应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是人类主要的致死性疾病类型，死亡率居高不下。卫生部最新统计数据表明恶性肿瘤居我国居民前十位死因首位。2010年中国恶性肿瘤发病患者268万人，死亡197万人；目前全国共有恶性肿瘤患者600余万人。每年用于恶性肿瘤病人的医疗费用约占卫生总费用的20％，是全社会最大的医疗负担。目前的治疗手段对于达到治愈、延长恶性肿瘤患者生存期以及改善生活质量等目标的作用仍然十分有限，尤其对于某些类型的恶性肿瘤即使是早期诊断也难以获得满意的疗效，至于转移性、全身性或进展期的恶性肿瘤则更难以治愈。目前的肿瘤治疗策略中，手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤有较好的疗效，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗或免疫疗法进行系统性治疗。肿瘤发病是多步骤、多基因作用的结果，肿瘤细胞表现出生长、分化与凋亡的失控。临床上病人症状的多样性和个体遗传异质性，以及肿瘤远处转移病灶的出现，使肿瘤治疗必须以全身性疾病的观点，采用个体化的综合治疗方案。即根据每个肿瘤病人的特点，采用局部治疗结合全身治疗；不仅要消除局部病灶的肿瘤，还要控制肿瘤的复发、转移生长及肿瘤对重要脏器的侵袭，才能真正有效地提高肿瘤病人的治愈率和生存期。通常肿瘤局部病灶的治疗可采取手术和物理治疗(包括射频消融、热疗、放疗、冷冻、超声波及激光治疗等)方法消除，然而对于影像学不能发现的肿瘤微小病灶(如转移复发灶、局部治疗后的残留病灶、血液中的癌细胞)，以上局部治疗手段则无能为力，必须通过全身性治疗手段加以解决。由于肿瘤的转移、复发、扩散更为致命，因此全身性治疗显得尤为重要和紧迫。目前全身性治疗有传统化学治疗、分子靶向药物治疗、生物治疗(包括干细胞移植治疗和免疫细胞治疗)以及基因治疗等。传统化疗虽然在某些肿瘤治疗方面取得了一些进展，但对延长肿瘤病人生存期方面仍然贡献不大。而且肿瘤细胞对化疗药的天然耐药和获得性多药耐药以及化疗毒性，使化学治疗的发展受到了严重的妨碍。多年来的临床实践证明它并非是全身治疗的优势项目。免疫细胞治疗是近二十年发展起来的，由于它治疗范围广(可用于实体肿瘤及白血病)，特别对肿瘤微小病灶(包括转移、复发灶、血液中的癌细胞)更为有效，无毒副作用，而且适用于肿瘤各阶段(如晚期放、化疗不能使用)，因此它是全身治疗的一个优势项目。免疫细胞治疗对提高生命质量、延长生存期有显著的效果，倍受国内外推崇，是目前全身治疗的最佳手段之一，临床潜力巨大。程序性死亡因子1(programmedcelldeath-1,PD-1)是属于共刺激分子28(costimulatory molecule28,CD28)/细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxiclymphocyteassociatedantigen,CTLA-4)家族的抑制性受体。PD-1不但是程序性死亡细胞的标记，同时表达于B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞以及巨噬细胞表面。近年来研究更是发现，被抗原激活的T淋巴细胞表面会短暂地表达PD-1，而PD-1的持续表达可能会导致T细胞功能紊乱。PD-1表达的广泛性和免疫抑制功能，使其成为近年来免疫治疗的焦点。在癌症、自身免疫病、慢性病毒感染等疾病的治疗中，PD-1均起到了重要的作用。目前，主要PD-1的应用主要表现为开发特异性封闭PD-1信号的抗体，然后将此类抗体药物用于晚期癌症及转移性癌症的治疗，虽然治疗效果尚可，但也经常会有药物相关的不良事件发生。因而，目前PD-1在免疫治疗方面的应用仍有待改进。技术实现要素：首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：将特异性封闭PD-1信号的抗体药物用于晚期癌症及转移性癌症的治疗，虽然治疗效果尚可，但药物相关的不良事件(adverseevents,AEs)总发生率为41％，3/4级的严重药物AEs为5％，主要包括：皮肤(16％)、胃肠道反应(12％)、肺部(7％)。药物相关的肺炎发生率为(6％)，3级/4级肺炎发生率为2％(2/129)，试验早期有2例患者因肺炎死亡。并且，部分病人对于抗体治疗有应答，也有部分病人在接受抗体治疗后其各项指标无明显变化。有的病人在接受抗体治疗后应答不完全，例如一位72岁多器官癌变的男性病患，在经过一个疗程的治疗后，胰脏的癌变转移性明显降低，但是其他位点癌变无明显变化。有的病人对于抗体治疗应答完全，发生肿瘤退化。此外，有的病例对于此抗体治疗应答情况复杂，例如一位52岁的多处淋巴结核肝脏癌变的女性患者，在接受了抗体治疗后，多处癌变衰退但是有一处淋巴结癌变增强。封闭PD-1信号通路的抗体不是直接作用于肿瘤组织而是通过激活抗肿瘤免疫发挥作用。由于免疫应答的复杂性以及个体差异，这些抗体的治疗效果在不同类型的癌症患者以及不同个体之间差异较大。如前所述，PD-1抑制剂(抗体)经过静脉回输后产生的副作用是存在的，同时系统性免疫疾病的病人不宜用该药，因为PD-1抑制剂可以增强免疫细胞的杀伤能力，增加免疫反应，病情加重。也有部分病人抗体治疗后应答不完全。本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效抑制免疫细胞PD-1表达的手段，由此，通过抑制免疫细胞中PD-1的表达，进而将获得的PD-1表达抑制的免疫细胞用于制备免疫治疗药物，并将该药物用于肿瘤的免疫治疗，从而能够有效解决上述问题，提高PD-1在免疫治疗中的应用范围和应用效果。具体地，为了解决上述问题，本发明利用基因工程技术，成功构建了针对PD-1的shRNA的慢病毒载体，并筛选获得了干扰效率超过90％的靶点序列；然后，基于筛选获得的干扰靶点序列，通过携带相应干涉片段的pd-1shRNA慢病毒载体，将筛选的相应干涉片段转入免疫细胞——T淋巴细胞(包括：CTL，TIL，CD8+T，NKT细胞等)，使其PD-1的表达受到长期抑制，得到PD-1表达抑制的免疫细胞，其中该细胞进入人体后获得的增殖细胞PD1的 表达也被抑制；进而，发明人将该类经过修饰的T细胞回输人体或肿瘤局部，结果发现，能够有效提高免疫治疗效果，最大程度上降低了副作用。因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种干涉片段。根据本发明的实施例，该干涉片段的作用靶点为如下所示的核苷酸序列：5′-GCCACCATTGTCTTTCCTAGC-3′(SEQIDNO：10)。发明人惊奇地发现，本发明的干涉片段针对上述靶点靶向性好，对PD-1的干涉抑制效果突出。并且，根据本发明的实施例，将上述干涉片段转入免疫细胞——T淋巴细胞(例如CTL，TIL，CD8+T，NKT细胞等)，能够使该免疫细胞PD-1的表达受到长期抑制，得到PD-1表达抑制的免疫细胞，并且该细胞进入人体后获得的增殖细胞PD1的表达也被抑制，从而，该获得的PD-1表达抑制的免疫细胞能够有效用于制备免疫治疗药物，进而用于肿瘤的免疫治疗，有效提高免疫治疗效果，最大程度上降低了副作用。另外，根据本发明上述实施例的干涉片段还可以具有如下附加的技术特征：根据本发明的实施例，所述干涉片段由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：正义链：5′-GATCCGCCACCATTGTCTTTCCTAGCTTCAAGAGAGCTAGGAAAGACAATGGTGGCTTTTTTG-3′(SEQIDNO：11)，反义链：5′-AATTCAAAAAAGCCACCATTGTCTTTCCTAGCTCTCTTGAAGCTAGGAAAGACAATGGTGGCG-3′(SEQIDNO：12)。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种抑制免疫细胞中PD-1表达的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的干涉片段转入所述免疫细胞。发明人发现，利用该方法能够有效抑制免疫细胞中PD-1的表达，获得PD-1表达抑制的免疫细胞。并且，获得的PD-1表达抑制的免疫细胞能够有效用于免疫治疗药物的制备，进而能够获得治疗效果好，副作用低的免疫治疗药物；此外，该PD-1表达抑制的免疫细胞也可以直接被用于回输人体或肿瘤局部，从而能够有效治疗或预防肿瘤。根据本发明的实施例，在本发明的方法中，将干涉片段转入免疫细胞的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，利用慢病毒载体系统将所述干涉片段转入所述免疫细胞。由此，干涉片段易于转入免疫细胞，从而能够有效提高干涉效率，实现对免疫细胞PD-1表达的抑制。根据本发明的实施例，所述免疫细胞为淋巴细胞，优选T细胞、B细胞、NK细胞，NKT细胞，更优选肿瘤浸润T淋巴细胞或CTL细胞。由此，能够有效获得PD-1表达抑制的免疫细胞，进而，将获得的PD-1表达抑制的免疫细胞用于免疫治疗药物的制备，能够有效获得治疗效果好，副作用低的免疫治疗药物。能够直接用于；该PD-1表达抑制的免疫细胞也可以直接被用于回输人体或肿瘤局部，从而能够有效治疗或预防肿瘤。其中，需要说明的是，在本文中所采用的术语“免疫细胞”主要是指人体血液里的淋巴细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞，NKT淋巴细胞。其中，T淋巴细胞可以为肿瘤浸润T淋巴细胞，以及经过体外培养或诱导的各种T细胞，例如CTL细胞。术语“CTL细胞”在本文中是指由DC细胞负载肿瘤抗原并与自体的淋巴细胞混合，刺激自体淋 巴细胞产生的细胞毒性T淋巴细胞。根据本发明的又一方面，本发明还提供了前面所述的干涉片段在制备免疫治疗药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物中包含PD-1表达抑制的免疫细胞。由此，对肿瘤患者给予该药物，能够有效抑制患者肿瘤细胞中PD-1的表达，从而有效治疗肿瘤；此外该药物还可以有效用于肿瘤的预防，且治疗或预防肿瘤的效果好，副作用低。根据本发明的实施例，所述PD-1表达抑制的免疫细胞是通过以下步骤获得的：将前面所述的干涉片段转入所述免疫细胞，以便获得PD-1表达抑制的免疫细胞。由此，能够高效地获得PD-1表达抑制的免疫细胞。根据本发明的实施例，利用慢病毒载体系统将所述干涉片段转入所述免疫细胞。由此，干涉片段易于转入免疫细胞，干涉效率高，对免疫细胞PD-1表达的抑制效果好。根据本发明的实施例，所述免疫细胞为淋巴细胞，优选T细胞、B细胞、NK细胞，NKT细胞，更优选肿瘤浸润T淋巴细胞或CTL细胞。由此，能够有效获得PD-1表达抑制的免疫细胞，进而，该PD-1表达抑制的免疫细胞能够用于免疫治疗药物的制备。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种免疫治疗药物。根据本发明的实施例，该免疫治疗药物包含PD-1表达抑制的免疫细胞，所述PD-1表达抑制的免疫细胞是通过前面所述的抑制免疫细胞中PD-1表达的方法抑制免疫细胞中PD-1表达获得的。由此，对肿瘤患者给予本发明的免疫治疗药物，能够有效抑制患者肿瘤细胞中PD-1的表达，从而有效治疗肿瘤；此外该药物还可以有效用于肿瘤的预防，且治疗或预防肿瘤的效果好，副作用低。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例，LV3载体的结构示意图；图2显示了根据本发明一个实施例，各shRNA慢病毒载体转染的目的细胞的PD-1蛋白western检测结果；以及图3显示了根据本发明一个实施例，各shRNA慢病毒载体转染的目的细胞中PD-1阳性细胞数量的流式细胞仪检测结果。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。实施例1一、质粒构建：设置对照NC(阴性对照)，按照以下方法，构建三种PD-1的shRNA慢病毒载体：(一)、实验材料1、DNAoligo使用Designer3.0(Genepharma)软件进行设计，合成引物由上海吉玛制药技术有限公司完成2、实验中使用的仪器列表：3、实验中使用的试剂列表：(二)、构建流程1、OligoDesigner3.0发明人设计模板时，LV3-shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号；正义链模板的5’端添加了GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补，具体如下：正义链：5’-GATCC-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTG-3’；反义链：3’-G(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAACTTAA-5’。其中，对照shNC以及三种PD-1的shRNA慢病毒载体的具体信息如下：(1)、对照shNC的具体信息为：靶点序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQIDNO：1)；正义链序列：GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAACTTTTTTG(SEQIDNO：2)；反义链序列：AATTCAAAAAAGTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAACG(SEQIDNO：3)；转录产物序列：GTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAACTT(SEQIDNO：4)。(2)三种PD-1的shRNA慢病毒载体：PDCD1-Homo-694、PDCD1-Homo-791和PDCD1-Homo-238的质粒信息分别如表1-3所示。2、LV3-shDNA模板的退火将DNAoligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μM。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系：组分体积(μl)10XshDNA退火缓冲液5正义链(100μM)5反义链(100μM)5ddH2O35总体积50在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火处理后得到浓度为10μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200nM，用于连接反应。3、LV3载体的线性化取10μgLV3载体，按照如下体系进行酶切处理：组分体积(μl)2×BufferTango10BamHI5EcoRI5LV310μgddH2O补至100总体积10037℃酶切1小时，琼脂糖电泳，使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/μl。4、LV3-shRNA载体的构建按照如下体系进行载体的连接反应：组分体积(μl)10×T4连接缓冲液2LV3(BamHI+EcoRI)1shDNA模板(100nM)1T4DNA连接酶(5weissU/μl)1ddH2O15总体积2022℃1小时，转化至大肠杆菌Top10(transformtoTop10competentcells)5、感受态细胞的制备：(氯化钙法)利用氯化钙法制备感受态细胞，具体步骤如下：5.1从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。5.2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。5.3于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。5.4倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。5.5以10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。5.6于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。5.7倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。5.8每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2(含20％甘油)重悬每份细胞沉淀。5.9将细胞分装成小份(100μl/支)，放于-70℃冻存。6、连接产物的转化按照以下步骤进行连接产物的转化：6.1从-70℃中取出感受态细胞，将装有感受态细胞的离心管冰上放置4分钟，待感受态细胞解冻后，加入10μl连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30分钟。6.2将离心管放到预加温到42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置90秒，不要摇动离心管。6.3快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟。6.4向每支离心管加入800μlLB培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏。6.5取200μl培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mlAmpicillinLB平板上。6.6等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。7、阳性克隆的鉴定与测序按照以下步骤鉴定筛选阳性克隆，并对其进行测序验证：7.1从每块平板上挑取5个菌落，接种到含50μg/mlAmpicillin(氨苄西林)的LB培养基中，37℃培养16小时。7.2使用碱裂解法抽提质粒。7.3所得质粒用EcoRI进行单酶切鉴定。酶切结果表明，被EcoRI切开的可能是阳性克隆，将每组克隆进行测序鉴定。测序结果见表1-3。7.4将测序正确的菌株采用高纯度质粒中量抽提试剂盒抽提，所得质粒可以用于常规的分子生物学实验和细胞学实验。如果在用于细胞转染时细胞毒性较大，请重新转化至大肠杆菌Top10中，然后用试剂盒或CsCl超速离心法制备更高纯度质粒。表1、PDCD1-Homo-694质粒信息表2、PDCD1-Homo-791质粒信息表3、PDCD1-Homo-238的质粒信息二、靶点筛选(一)慢病毒载体准备：按照以下步骤进行慢病毒载体准备：1、慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，铺到6孔板中，37℃，50mL/LCO2培养箱内培养，细胞密度达60％～70％时转染.转染前用PBS清洗细胞2遍。2、制备慢病毒包装系统中3种质粒DNA溶液(VSVG2μg，P8.7.4μg，目的基因10μg)。3、无菌水定容至25μL，再加入CaCl2(2.5mol/L)溶液25μL，混匀，4度冰上放置20min。4、逐滴加入2×HBS缓冲盐溶液50μL，常温放置30min。5、将DNA磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养16h后弃去含有转染混和物的培养液，用新鲜的培养液替代。6、转染后的48小时收取细胞上清液(1.5ml)。(二)目的细胞制备：1、外周血单个核细胞的分离将从1例AFP阳性的肝癌患者采集的100ml外周血中分离获得的细胞，转移到50ml离心管中离心(1800rpm，10min)，吸去上清，取上清后的液体缓慢加在淋巴细胞分离液Ficoll液(GE)上，体积比为1:1，离心(2000rpm，20min)；接着，收集界面的白色絮状细胞加入PBS，轻轻吹打混匀，离心(1500rpm，10min)；接下来，重复离心洗涤共3遍；然后，收取细胞轻轻吹打混匀，加入基础培养基20ml吹打均匀，转移至75cm2培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱培养2h。2、淋巴细胞和单核细胞的分离取出75cm2培养瓶，轻轻将75cm2培养瓶放直立，吸取18ml培养液于新的175cm2瓶中，以便用于淋巴细胞的活化培养；针对原瓶(75cm2培养瓶)中剩余的2ml残液，将用于将单核细胞诱导分化为DC细胞。3、淋巴细胞的培养在用于培养淋巴细胞的175cm2瓶中，加入20mlCTL1细胞培养基，24h后再加入20mlCTL2培养基培养，然后每隔2～3d用CTL3培养基等量补液。其中，CTL1培养基、CTL2培养基和CTL3培养基的配制方法为：CTL1培养基：将1管CTL1因子从-20度取出，常温融化，加到20ml基础培养基中， 并添加10％的客户的血清，其中将0.22um针头滤器过滤后使用。CTL2培养基：将1管CTL2因子从-20度取出，常温融化，加到20ml基础培养基中，其中将0.22um针头滤器过滤后使用。CTL3培养基：将1管CTL3因子从-20度取出，常温融化，加到500ml基础培养基中，其中将0.22um针头滤器过滤后使用，整个培养过程用3管。CTL1因子(包括γ干扰素，1000U/ml)：1ml，-20℃长期保存，4℃保存2周。CTL2因子(包括IL-1，1000U/ml；IL-2，1000U/ml；CD3抗体，100ng/ml；CD28抗体，100ng/ml)：1ml，-20℃长期保存，4℃保存2周。CTL3因子(包括IL-2，1000U/ml；IL-7，20ng/ml；IL-15，20ng/ml)：1ml，-20℃长期保存，4℃保存2周。由此，获得目的细胞。然后，将目的细胞分在6孔板中，每孔106细胞，备用。(三)病毒载体感染：1、将收集的病毒上清液加入上述制备获得的目的细胞中，同时加入同等体积的新鲜培养基(CTL3培养基)进行培养目的细胞(共3ml)。2、24小时后换液，正常培养。3、感染96小时后收取细胞，提蛋白。(四)PD-1蛋白western鉴定：1、试剂1)0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。2)蛋白酶抑制剂：ProteaseInhibitorCocktail：Calbiochem公司，货号5391343)RIPA：137mMNaCl,1.4mMKH2PO4,1.7mMKCl,5.0mMEDTA,5.0mMEGTA,4.3mMNa2HPO4.0.1％SDS,1％TritonX-100,1mMNaVO4,50mMNaF。4)Bio-Rad公司Bradford染液，货号500－0006。5)10％SDS-PAGE分离胶，浓缩胶，其中，按照如下配方配制10ml分离胶：ddH2O4.0ml；30％丙烯酰胺3.3ml；1.5MTris(pH8.8)2.5ml；10％SDS0.1ml；10％过硫酸铵0.1ml；TEMED0.004ml。按照如下配方配制浓缩胶2ml：ddH2O1.4ml；30％丙烯酰胺0.33ml；1MTris(pH6.8)0.25ml；10％SDS0.02ml；10％过硫酸铵0.02ml；TEMED0.002ml。6)2XSDS－PAGELoadingBuffer：7)蛋白marker，Bio-Rad公司，货号161－0324。8)电泳液：配5XTris－GlycineBuffer储液，使用时稀释。储液：0.125MTris，1.25MGlycine，0.5％(W/V)SDS，其配制方法如下：称取Tris15.1g；Glycine94g；SDS5.0g，置于1L的烧杯中，然后加入约800ml的去离子水，搅拌溶解，加入去离子水定容至1L后，室温保存。9)PVDF膜，Millipore公司，货号IPVH00010。10)转膜缓冲液(transferbuffer)：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。11)TBST配制方法：称NaCl8g；KCl0.2g；Tris3g，溶于800ml蒸馏水中，加HCl调pH到7.4，定容到1升。然后加1mlTween20，混匀。12)封阻液：含有5％脱脂奶粉的TBST。13)ECL反应底物，Pierce公司，supersignalwestpicochemilumiscentsunstrate，货号prod#34080。2、仪器1)测定蛋白浓度，Eppendorf公司Biophotometer；2)电泳及转膜用Bio-Radpowerpac3000；3、主要步骤1)样品准备PBS清洗细胞。去PBS后加含蛋白酶抑制剂(1:200)的总蛋白抽提试剂RIPA，冰上裂解30min。用细胞刮刮下细胞，吸取到1.5mlEP管中，然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。Bradford比色法测定蛋白质浓度。2)电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。预先配制PAGE胶。取相同质量的蛋白样品，加等体积的2×loadingbuffer，沸水浴中5min。上样，以及蛋白marker，多余空用1×loadingbuffer补平。90V，20min,直至所有样品压成一线；120V，100min。3)转膜A、裁适当大小之PVDF膜，甲醇活化数秒，浸入transferbuffer中备用。其余相关器材，如海绵、滤纸、夹板等，事先也浸入transferbuffer中。B、铺好夹板下层的海绵和滤纸，试管来回滚动去除气泡。C、小心剥离电泳玻片上的PAGE胶，放置到滤纸上。将PVDF膜覆盖胶上，再覆以滤纸和海绵，用试管滚动去除气泡。D、将此海绵/滤纸/凝胶按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。E、将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满transferbuffer以淹没凝胶。F、按照厂家所示接通电源，在冰盒开始转膜，100V，2hr。4)免疫反应：A、用TBST洗膜，5min。B、加入封阻液，平稳摇动，室温1hr。C、TBST洗膜，5min。D、加入PDCD1人源一抗(用含3％脱脂奶粉的TBST稀释)，室温1hr或4℃放置12hr。E、弃一抗，TBST洗膜，15min×3次。F、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(鼠抗人)(用TBST稀释)，平稳摇动，室温2hr。G、弃二抗，TBST洗膜，15min×3次。5)ECL曝光准备好曝光所需：底片，曝光，显影、定影液等。按照ECL产品说明书，等体积混合两组分，总体积1ml可供一张膜使用。暗室中曝光X光底片1～2min(视反应后光线强弱而定)，水洗后放入定影液中，直至底片完全透明。水洗后烘干底片。各shRNA慢病毒载体转染的目的细胞的PD-1蛋白western检测结果见图2。然后，基于western检测结果，计算三种shRNA慢病毒载体的干扰效率，结果如下：PDCD1-Homo-791(靶点序列SEQIDNO：10：GCCACCATTGTCTTTCCTAGC)的干扰效率：78％；PDCD1-Homo-238(靶点序列SEQIDNO：15：GCTAAACTGGTACCGCATGAG)的干扰效率：8％；PDCD1-Homo-694(靶点序列SEQIDNO：5：GCCTGTGTTCTCTGTGGACTA)的干扰效率：88％。6)PD1阳性细胞的数量检测同时对各shRNA慢病毒载体转染的目的细胞进行流氏细胞仪分析，检测PD1阳性细胞的数量，结果见图3。由此，综合western和流式细胞仪检测结果，可知高效果干扰PD1的靶点为：PD791：GCCACCATTGTCTTTCCTAGC(SEQIDNO：10)，PD694：GCCTGTGTTCTCTGTGGACTA(SEQIDNO：5)，而PD238则对PD1没有任何干扰效果。本发明中获得两个重要的PD1干扰靶点。实施例2以实施例1获得的PD791慢病毒载体为例，利用PD791慢病毒载体，将其携带的干涉 片段转入免疫细胞，制备获得PD-1表达抑制的免疫细胞，具体步骤如下：1外周血单个核细胞的分离将从1例AFP阳性的肝癌患者采集的100ml外周血中分离获得的细胞，转移到50ml离心管中离心(1800rpm，10min)，吸去上清，取上清后的液体缓慢加在淋巴细胞分离液Ficoll液(GE)上，体积比为1:1，离心(2000rpm，20min)；接着，收集界面的白色絮状细胞加入PBS，轻轻吹打混匀，离心(1500rpm，10min)；接下来，重复离心洗涤共3遍；然后，收取细胞轻轻吹打混匀，加入基础培养基20ml吹打均匀，转移至75cm2培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱培养2h。2淋巴细胞和单核细胞的分离取出75cm2培养瓶，轻轻将75cm2培养瓶放直立，吸取18ml培养液于新的175cm2瓶中，以便用于淋巴细胞的活化培养；针对原瓶(75cm2培养瓶)中剩余的2ml残液，将用于将单核细胞诱导分化为DC细胞。3淋巴细胞的培养在用于培养淋巴细胞的175cm2瓶中，加入20mlCTL1细胞培养基，24h后再加入20mlCTL2培养基培养，然后每隔2～3d用CTL3培养基等量补液，进行活性活率检测验证是否合格。吸出细胞培养基，用PBS清洗一遍后，换新鲜15mlCTL3培养基，并加入5*108PD791慢病毒载体至培养瓶中混合，24小时后换液。4.单核细胞的处理a、在剩有2ml残液的原瓶(75cm2培养瓶)中加入15mlDC培养基继续培养4天，每2～3天半换液一次，以便将单核细胞诱导分化为未成熟的DC细胞。b、PEI转染法进行抗原基因mRNA转染：第5天，用50ml离心管收集未成熟的DC细胞(离心1500rpm，10min)，弃掉上清后，将下层细胞转移到1.5ml离心管，然后直接加入100ul的试剂A(即AFPmRNA与PEI按照质量比1：3混合后获得的混合物)充分混匀底部细胞，盖好离心管，置于细胞培养箱中孵育30分钟，每隔10分钟取出上下倒置几次。其中，AFPmRNA的制备方法请参见申请日为2015年5月5日，申请号为201510225512.2的专利申请的实施例1。PEI(1μg/μl)Polysciences(CAT#23966-2配制成储液)是按照以下步骤配制获得的：首先，将无内毒素的无菌水加热至80℃左右溶解PEI，冷却到室温；然后，调整pH值至7.0，用0.22μm的滤器过滤消毒，分装后储存在-20℃，工作液可于4℃下保存备用。c、取出离心管，用移液枪将细胞悬液取出加到培养瓶(75cm2)中，并加入DC培养基，继续培养3天，以便获得成熟的DC细胞。5.共培养第8天后，将成熟的DC细胞与前述经过活化培养的淋巴细胞按照体积比1:20混合，用CTL3培养基共培养七天，诱导CTL细胞及其他杀伤性细胞的产生。共培养七天后，对细胞进行流式检测，结果发现：本实施例制备获得的免疫细胞群(PD791-CTL细胞)中不仅含有大量的CTL细胞，而且还有NK及CIK细胞等多种免疫细胞：CTL细胞(CD8+，CD3+CD8+CD28+)、CIK细胞(CD3+CD56+)、NK细胞(CD3-CD56+)，即该免疫细胞群不仅具有强大杀伤特定肿瘤细胞的CTL细胞，还有CIK、NK等免疫细胞。由此，发明人发现，本发明不仅在体外制备了AFP特异性CTL细胞(PD791-CTL细胞)，同时还有NKT细胞。这些淋巴细胞在接受抗原刺激之前已经过PD791的慢病毒载体的修饰，其PD1已经被抑制高达90％以上。实施例3：临床实验将实施例1制备获得的PD791-CTL细胞回输患者，并观察回输效果，具体如下：将AFP阳性的肝癌患者20名分为2组(A组10名和B组10名)，其中，针对A组，按照实施例1中的方法在第14天和第15天获得足量CTL细胞后，给患者回输，每次回输细胞量为1～2*109；B组不回输细胞。采血一次连续回输2次为一个疗程。3个疗程结束后，进行观察。结果发现：治疗三个疗程后，A组和B组有明显的区别。A组所有患者在回输后均感觉身体疲惫感减轻，食欲增加，疼痛减轻，体重增加，其中有8名患者AFP指标都有所下降；一名患者通过CT发现肝上3处原发兆消失，一名患者指标无进展。而B组所有患者各项症状均未改善，10名患者AFP指标均有所增加。可以明显看出，经过回输PD791-CTL细胞后，患者症状得到明显缓解。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页1 2 3