一种提取清香型白酒发酵酒醅总RNA的方法与流程

本发明涉及生物学技术领域，尤其涉及一种提取清香型白酒发酵酒醅微生物总RNA的方法。

背景技术：

清香型白酒是我们白酒中主要香型之一，拥有悠久的历史。目前，人们对清香型白酒微生物的研究还只停留在分离鉴定等初期阶段，还无法解析出众多微生物在清香型白酒发酵中的作用。而通过提取清香型白酒发酵过程中酒醅总RNA，对RNA进行转录组分析，可以了解微生物群落基因的动态表达与代谢调控等，从而获得微生物在清香型白酒发酵过程中的作用。因此，获得高质量的清香型白酒发酵酒醅总RNA是解析微生物在清香型白酒发酵过程中作用的前提和关键点。

清香型白酒酿造原料主要由高粱组成，并含有少量豌豆、大麦、小麦、稻壳等，这些酿造原料中含有大量淀粉、酚类、糖类以及次级代谢产物等物质。同时，在发酵过程中微生物作用下，发酵环境中会生成一定量的腐殖酸和腐殖质以及由微生物代谢生成的酚类物质、糖类物质，这些都是影响发酵酒醅高质量总RNA提取的因素。因此，在提取发酵酒醅中微生物总RNA过程中，尽量去除这些干扰因素是获得高质量RNA的关键。目前提取RNA的主要方法有酸酚法、CTAB法、热酚法、冷酚法、SDS酸酚法、异硫氢酸胍法和Trizol法等。这些方法在提取清香型白酒发酵酒醅微生物总RNA中，提取效果均不太理想。因此，开发一种适用于清香型白酒发酵酒醅微生物总RNA提取的高质量方法对于解析清香型白酒发酵微生物作用非常重要。

技术实现要素：

本发明的第一个目的提供一种RNA提取试剂，该提取试剂由月桂酸钠缓冲液、Trizol提取液和β-巯基乙醇按20：20：1的体积比混合而成，其中月桂酸钠缓冲液通过如下方式配置：

步骤S101,准备0.5M EDTA溶液:称取18.61g Na2-EDTA·2H2O，加80ml DEPC水充分溶解后，加入约3.3g NaOH颗粒调节pH为8.0，用DEPC水定容至100ml，灭菌备用；

步骤S102,准备1.0M Tris-HCl,称取12.1g Tris碱溶于80ml DEPC水中，用4.2ml浓盐酸调节pH为8.0，用DEPC水定容至100ml，灭菌备用；

步骤S103,配置月桂酸钠缓冲液：准确称取Nacl 5.844g，月桂酸钠10g，加入100ml 1.0M Tris-Hcl，40ml 0.5M EDTA，800ml DEPC水充分溶解后，盐酸调节PH至8.0.，定容1000ml，灭菌备用。

本发明的第一个目的提供一种利用上述RNA提取试剂来提取清香型白酒发酵酒醅总RNA的方法，该方法包括：

步骤S201：取50g发酵酒醅混于200ml无菌水中振荡混匀，然后通过无菌双层纱布过滤，取4mL滤液于10000g以上、4℃离心1min，排空上清液后剩余部分放置在液氮中冷冻；

步骤S202：取RNA提取试剂4.1ml，放置冰上预冷；

步骤S203：将研钵用液氮预冷，将步骤S201样品倒入研钵中，倒入液氮，研磨至粉末；

步骤S204：取步骤S203得到的研磨好的粉末1g移入到准备好的RNA提取试剂并摇匀；

步骤S205：将步骤S204获得混合液在10000g以上、4℃离心10min后取出，吸取上清液；需要说明的是，保持4°是可以最大限度保护RNA。

步骤S206：向步骤S205得到的上清液中加入等体积的氯仿后混匀，冰上放置1min，在10000g以上、4℃离心10min后取出，吸取上清液；

步骤S207：向步骤S206得到的上清液中加入0.7倍体积的异丙醇后混匀，冰上放置15-25min，然后10000g以上、4℃离心10min，收集沉淀；

步骤S208：步骤S207沉淀中加入1ml 75％乙醇洗涤，在10000g以上、4℃离心3min，收集沉淀；

步骤S208：将步骤S208所获得沉淀在无菌台上风干，风干后加入DEPC水溶解低温保存，所得混合物为清香型白酒发酵酒醅总RNA。

本发明的提取清香型白酒发酵酒醅总RNA的提取方法，与传统Trizol法相比，本方法在提取发酵酒醅总RNA过程中，加入了月桂酸钠缓冲液和β-巯基乙醇，有效的抑制了酚类物质的氧化，解决了发酵酒醅中腐殖酸、腐殖质及糖类物质的影响。建立了清香型白酒发酵酒醅总RNA的提取方法，次方法获得的高质量RNA，可以满足转录组分析、生物信息学分析等实验要求。

附图说明：

图1是采用本发明提取清香型白酒发酵酒醅总RNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2是采用传统Trizol法提取清香型白酒发酵酒醅总RNA琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明清香型白酒发酵酒醅总RNA的提取方法，与传统Trizol法相比，在提取发酵酒醅总RNA过程中，采用了一种新的RNA提取试剂，试剂中加入了月桂酸钠缓冲液和β-巯基乙醇，有效的抑制了酚类物质的氧化，解决了发酵酒醅中腐殖酸、腐殖质及糖类物质的影响。建立了清香型白酒发酵酒醅总RNA的提取方法，此方法获得的高质量RNA，可以满足转录组分析、生物信息学分析等实验要求。

本发明中的RNA提取试剂由月桂酸钠缓冲液、Trizol提取液和β-巯基乙醇按20：20：1的体积比混合而成，比如2ml月桂酸钠缓冲液、2ml Trizol提取液和100ulβ-巯基乙醇混合而成得到4.1mlRNA提取试剂。其中月桂酸钠缓冲液通过如下方式配置：

步骤S101,准备0.5M EDTA溶液:称取18.61g Na2-EDTA·2H2O，加80ml DEPC水充分溶解后，加入约3.3g NaOH颗粒调节pH为8.0，用DEPC水定容至100ml，灭菌备用；

步骤S102,准备1.0M Tris-HCl,称取12.1g Tris碱溶于80ml DEPC水中，用4.2ml浓盐酸调节pH为8.0，用DEPC水定容至100ml，灭菌备用；

步骤S103,配置月桂酸钠缓冲液：准确称取Nacl 5.844g，月桂酸钠10g，加入100ml 1.0M Tris-Hcl，40ml 0.5M EDTA，800ml DEPC水充分溶解后，盐酸调节PH至8.0.，定容1000ml，灭菌备用。

下面，结合具体实施方式，采用本发明的RNA提取试剂来提取清香型白酒发酵酒醅总RNA:

步骤S201：取50g发酵酒醅混于200ml无菌水中振荡混匀，然后通过无菌双层纱布过滤，取4mL滤液于10000g以上(比如12000g)、4℃离心1min，排空上清液后剩余部分放置在液氮中冷冻；

步骤S202：取RNA提取试剂4.1ml，放置冰上预冷；

步骤S203：将研钵用液氮预冷，将步骤S201样品倒入研钵中，倒入液氮，研磨至粉末；

步骤S204：取步骤S203得到的研磨好的粉末1g移入到准备好的RNA提取试剂并摇匀；优选上下颠倒，每分钟60-70次，持续15-20分钟，如果摇得太剧烈会造成RNA断裂，15-20min能够确保RNA充分溶解，时间太长会造成RNA出现降解。

步骤S205：将步骤S204获得混合液在10000g以上(比如12000g)、4℃离心10min后取出，吸取上清液；需要说明的是，保持4°是可以最大限度保护RNA。

步骤S206：向步骤S205得到的上清液中加入等体积的氯仿后混匀，冰上放置1min，在10000g以上(比如12000g)、4℃离心10min后取出，吸取上清液；

步骤S207：向步骤S206得到的上清液中加入0.7倍体积的异丙醇后混匀，冰上放置15-25min，然后10000g以上(比如12000g)、4℃离心10min，收集沉淀；

步骤S208：步骤S207沉淀中加入1ml 75％乙醇洗涤，在10000g以上(比如12000g)、4℃离心3min，收集沉淀；

步骤S208：将步骤S208所获得沉淀在无菌台上风干，风干后加入DEPC水溶解低温保存，所得混合物为清香型白酒发酵酒醅总RNA。

优选，步骤S201、S205、S206、S207、S208中离心条件一致，这样有助于更好保护RNA。

图1是传统Trizol法提取发酵酒醅RNA电泳图，条带较弱甚至没有条带。图2是采用改良Trizol法提取发酵酒醅RNA电泳图，可以清晰看到28S、18S条带以及较弱的5S条带，说明成功的提取出了发酵酒醅RNA，且含量满足转录组和生物信息学分析。从效果可以看出，本发明方法适合提取清香型白酒发酵酒醅微生物总RNA，效果非常好。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。