来源于水稻的蛋白质OsGIF1及其相关生物材料在调控植物器官大小中的应用的制作方法

本发明涉及来源于水稻的蛋白质osgif1及其相关生物材料在调控植物器官大小中的应用。
背景技术：
：水稻是世界上重要的粮食作物之一。随着耕地面积的减少和人口的快速增长，提高水稻产量对保证我国粮食安全具有十分重要的意义。水稻产量是由有效分蘖数、穗粒数和粒型所决定。水稻粒型包括籽粒的长度、宽度和厚度。通过增加水稻籽粒的长度和宽度可以有效的提高水稻产量。研究植物体如何调控器官大小的机制已经成为提高作物产量的重要策略之一。技术实现要素：本发明的目的是提供一种来源于水稻的蛋白质osgif1及其相关生物材料在调控植物器官大小中的应用。本发明提供的蛋白质，获自水稻，命名osgif1蛋白，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物的种子大小和/或种子长度和/或种子粒重相关的由序列1衍生的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物器官大小相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述osgif1蛋白的基因(osgif1基因)也属于本发明的保护范围。所述osgif1基因具体可为如下1)或2)或3)或4)或5)的dna分子：1)序列表中序列2所示的dna分子；2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码植物的种子大小和/或种子长度和/或种子粒重相关蛋白的dna分子；3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码植物的种子大小和/或种子长度和/或种子粒重相关蛋白的dna分子；4)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码植物器官大小相关蛋白的dna分子；5)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码植物器官大小相关蛋白的dna分子。上述严格条件可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗。上述严格条件也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1％sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次。含有所述osgif1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体可为将所述osgif1基因插入表达载体得到的重组质粒。所述表达载体具体可为载体pmdc43。所述重组表达载体的制备方法具体如下：(1)将所述osgif1基因与载体pcr8/gw/topo连接，得到重组质粒topo-osgif1；(2)重组质粒topo-osgif1与载体pmdc43进行lr重组反应，得到含有所述osgif1基因的重组质粒，将其命名为重组质粒pmdc43-osgif1。扩增所述osgif1基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述osgif1基因导入目的植物中，得到种子和/或种子粒重和/或种子长度大于所述目的植物的转基因植物。所述osgif1基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述osgif1基因具体可通过重组质粒pmdc43-osgif1导入所述目的植物。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为水稻，例如水稻品种中花11号。本发明还保护所述osgif1蛋白、所述osgif1基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法，在培育种子大和/或种子长度大和/或种子粒重大的植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为水稻，例如水稻品种中花11号。本发明还保护所述osgif1蛋白在调控植物的种子大小和/或种子长度和/或种子粒重中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为水稻，例如水稻品种中花11号。以上任一所述种子也可称为籽粒。以上任一所述粒重具体可为千粒重或百粒重。本发明的发明人从水稻品种中花11中克隆到了一个新蛋白及其编码基因，将osgif1基因导入中花11，可以使中花11的种子显著增大。本发明可用于增加植物种子产量，对于植物育种，特别是水稻育种，具有重大价值。附图说明图1为载体pcr8/gw/topo的结构示意图。图2为载体pmdc43的结构示意图。图3为pcr鉴定的部分结果。图4为osgif1基因表达量分析的结果。图5为种子照片。图6为种子长度的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体pcr8/gw/topo：invitrogen。载体pcr8/gw/topo的结构示意图见图1。提及“载体pmdc43”的参考文献：curtismd,grossniklausu(2003)agatewaycloningvectorsetforhigh-throughputfunctionalanalysisofgenesinplanta.plantphysiol.133:462-469)；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。载体pmdc43的结构示意图见图2。提及“根癌农杆菌gv3101”的参考文献：li,y.,zheng,l.,corke,f.,smith,c.,andbevan,m.w.(2008)controloffinalseedandorgansizebytheda1genefamilyinarabidopsisthaliana.genesdev22,1331-1336；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。水稻品种“中花11号”(简称中花11)：朱旭东,陈红旗,罗达,张建军,方红民,闵绍楷；水稻中花11辐射突变体的分离与鉴定；中国水稻科学，2003，17(3)：205-210.。诱导培养基：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+2,4-d2.5mg/l+proline500mg/l+glutamine500mg/l+ch300mg/l+蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l，ph5.8。继代培养基：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+2,4-d2.0mg/l+proline500mg/l+glutamine500mg/l+ch300mg/l+蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l，ph5.8。共培养培养基(固体)：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+2,4-d2.0mg/l+ch500mg/l+肌醇2000mg/l+as100μm+蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l，ph5.5。共培养培养基(液体)：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+2,4-d2.0mg/l+ch500mg/l+肌醇2000mg/l+as100μm+蔗糖30g/l，ph5.5。筛选培养基：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+2,4-d2.0mg/l+proline500mg/l+glutamine500mg/l+ch300mg/l+蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l+cef250mg/l+hyg50mg/l，ph5.8。分化培养基：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+naa0.1mg/l+kt4mg/l+proline500mg/l+glutamine500mg/l+ch300mg/l+蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l+cef250mg/l+hyg50mg/l，ph5.8。生根培养基：1/2n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+蔗糖30g/l+agar0.8％(质量百分含量)，ph5.8。实施例1、osgif1蛋白及其编码基因的发现1、提取中花11的总rna并反转录为cdna。2、以步骤1得到的cdna为模板，采用osgif1-s和osgif1-a组成的引物对进行pcr扩增。osgif1-s:5'-atgcagcagcaacacctgatgc-3’；osgif1-a:5'-ctagctgccttcctcctcgg-3’。3、将步骤2得到的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收约684bp的条带。pcr扩增产物中具有序列表的序列2所示的开放阅读框，该开放阅读框编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为osgif1蛋白，将编码osgif1蛋白的基因命名为osgif1基因。实施例2、转基因植物的获得和鉴定一、重组质粒的制备1、合成序列表的序列2所示的双链dna分子。2、以步骤1得到的双链dna分子为模板，采用osgif1-s和osgif1-a组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。osgif1-s:5'-atgcagcagcaacacctgatgc-3’；osgif1-a:5'-ctagctgccttcctcctcgg-3’。3、将步骤2得到的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收约684bp的片段。4、将步骤3回收的片段与载体pcr8/gw/topo连接，得到重组质粒topo-osgif1。根据测序结果，对重组质粒topo-osgif1进行结构描述如下：在载体pcr8/gw/topo的attl1和attl2之间插入了序列表的序列2所示的osgif1基因。5、重组质粒topo-osgif1与载体pmdc43进行lr重组反应，得到含有序列表的序列2所示的osgif1基因的重组质粒，将其命名为重组质粒pmdc43-osgif1。根据测序结果，对重组质粒pmdc43-osgif1进行结构描述如下：将载体pmdc43的attr1和attr1之间的小片段取代为了重组质粒topo-osgif1的attl1和attl2之间的小片段。二、转osgif1基因植物的获得1、将重组质粒pmdc43-osgif1导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。2、将步骤1得到的重组农杆菌转化中花11，具体操作如下：(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养①取去壳的中花11成熟种子，进行表面灭菌(先用70％乙醇浸泡1-2min，然后用0.1％升汞浸泡10min)，然后无菌水冲洗3-4次，然后将种子放在无菌滤纸上吸干水分。②完成步骤①后，将种子置于诱导培养基平板上，26℃暗培养10-15天。③完成步骤②后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，置于继代培养基平板上进行继代培养(每两周继代培养一次；26℃暗培养)，挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织进行步骤(3)。(2)制备菌悬液将步骤1得到的重组农杆菌悬浮于液体共培养培养基中，调整菌浓度为od600nm＝0.3-0.5，然后加入乙酰丁香酮并使其浓度为100mm。(3)将步骤(1)得到的愈伤组织置于步骤(2)得到的菌悬液中，室温放置20min并不时晃动，然后取出愈伤组织并放在无菌滤纸上以吸去多余菌液,然后将愈伤组织转移到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基平板上，26℃暗培养2-3天。(4)完成步骤(3)后，将愈伤组织置于筛选培养基平板上并26℃暗培养14天，然后将愈伤组织转移到新的筛选培养基平板上26℃暗培养14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。(5)完成步骤(4)后，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织，置于分化培养基平板上，先暗培养3天，然后转移至15h/d光照条件下培养。培养15-25天左右,有绿点出现，培养30-40天后进一步分化出小苗。(6)步骤(5)中，当小苗芽长约2cm时，将其转移至生根培养基上培养两周，选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，移栽至田间，即为t0代拟转osgif1基因植株。得到52株t0代拟转osgif1基因植株。3、转osgif1基因植株的鉴定(1)将步骤2得到的52株t0代拟转osgif1基因的植株进行pcr鉴定。提取植株的新鲜叶片的基因组dna并作为模板，用g1s-f和g1s-r组成的引物对进行pcr扩增。g1s-f：5'-gtccacacaatctgcccttt-3'；g1s-r：5'-ttcgacggatactgggacat-3'。部分检测结果见图3。转osgif1基因的植株可以扩增出大小为383bp的条带。中花11中不存在载体pmdc43，因此不能扩增出条带。图1中，泳道1为重组质粒pmdc43-osgif1，泳道2为中花11，泳道3-10为t0代拟转osgif1基因植株。52株t0代拟转osgif1基因植株中，47株为转osgif1基因植株。(2)将t0代转osgif1基因植株进行osgif1基因表达量分析。提取植株的新鲜叶片的总rna并反转录为cdna，然后通过real-timepcr(lightcycler480，roche)检测植株中osgif1基因的表达量。荧光染料为lightcycler480sybrgreenimaster(roche)。内参为actin1。用于检测osgif1基因的引物对由g1rt-f和g1rt-r组成。用于检测actin1的引物由actin1f和actin1r组成。real-timepcr引物如下：g1rt-f：5'-accaccgtcaccactgatct-3'；g1rt-r：5'-ttcgacggatactgggacat-3'。actin1f：5'-tgctatgtacgtcgccatccag-3'；actin1r：5'-aatgagtaaccacgctccgtca-3'。osgif1基因的相对表达量见图4(1为中花11,2为转osgif1基因植株)。三、转空载体植物的获得用载体pmdc43代替重组质粒pmdc43-osgif1进行步骤二，得到转空载体植株。四、表型鉴定t0代转osgif1基因植株在田间自然条件下生长，成熟后收取种子，观察并拍照，测量种子长度(47株t0代转osgif1基因植株，每株随机测量100粒种子的长度，结果取平均值)，统计千粒重(47株t0代转osgif1基因植株，每株随机测量100粒种子的粒重并换算为千粒重，结果取平均值)。t0代转空载体植株在田间自然条件下生长，成熟后收取种子，观察并拍照，测量种子长度(10株t0代转空载体基因植株，每株随机测量100粒种子的长度，结果取平均值)，统计千粒重(10株t0代转空载体植株，每株随机测量100粒种子的粒重并换算为千粒重，结果取平均值)。中花11在田间自然条件下生长，成熟后收取种子，观察并拍照，测量种子长度(10株中花11，每株随机测量100粒种子的长度，结果取平均值)，统计千粒重(10株中花11，每株随机测量100粒种子的粒重并换算为千粒重，结果取平均值)。上述各个植株进行平行试验，即在完全相同的条件下培养。采用体式镜(leicas8apo,德国)观察并拍照(leicadfc420，德国)。利用imagej1.41软件测量种子长度。利用excel进行统计分析。照片见图5，左边两粒是中花11的种子，右边两粒是t0代转osgif1基因植株的种子，标尺为1mm。种子长度的结果见图6，1为中花11的种子,2为t0代转osgif1基因植株的种子。种子长度的结果和千粒重的结果见表2(平均值±标准差)。表2转基因植物的表型统计结果中花11的种子转osgif1基因植株的种子转空载体基因植株的种子种子长度(mm)6.72±0.038.89±0.03**6.65±0.02千粒重(g)25.61±0.1733.45±0.21**25.21±0.34注：**代表p＜0.01水平差异显著。与中花11相比，转osgif1基因植株的种子长度和千粒重均显著增加。与转空载体植株相比，转osgif1基因植株的种子长度和千粒重均显著增加。上述结果表明，osgif1基因与植物的器官大小正相关，将osgif1基因转入目的植物中表达后，可增加植物的器官大小。当前第1页1 2 3