一种吸附重金属镉、铜的细菌及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域或者环境治理技术领域，涉及微生物的发现、诱变以及利用该微生物进行重金属的脱除。

背景技术：

随着染料、电镀等工业的发展，以及人们对金属矿藏的不合理开采，越来越多的重金属进入水体。重金属具有致畸、致癌、致突变作用，由于重金属不易被生物体降解，且能通过食物链传递并富集，可经多种途径进入人体，严重危害人体健康。在我国，镉与铜是两种常见的污染生态环境的重金属。

镉可在生物体内富集，通过食物链进入人体引起慢性中毒。镉的生物半衰期为10-30年，且生物富集作用显著，即使停止接触，大部分既往蓄积的镉仍继续停留在人体内。肾脏是镉最重要的蓄积部位和靶器官，镉会在肾脏中累积，早期毒性主要在肾脏近曲小管，严重的可导致肾衰竭；对骨骼的影响则是骨软化和骨质疏松。

铜是动植物的一种必需元素，人体缺乏铜会引起贫血，毛发异常，骨和动脉异常，以至脑障碍。尽管铜是重要的必需微量元素，但应用不当，也易引起中毒反应。摄入过量的铜，可导致肝细胞及红细胞的损伤，进一步引起肝硬化、腹泻、呕吐、运动障碍和知觉神经障碍。

目前，重金属污染的治理方法主要包括三大类：物理法、化学法和生物法。物理法和化学法见效相对较快，但成本偏高，易产生二次污染。生物法主要是利用植物和微生物对重金属的吸附和钝化作用。其中微生物治理重金属污染，具有成本低、高效率、对环境破坏小、无二次污染、适合于大面积修复等优势而备受青睐，具有良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的技术目的在于提供一株新型的耐受并吸附重金属的细菌，用于重金属污染的水体、土壤的治理。

具体的，本发明的技术方案如下：

一株吸附重金属镉、铜的细菌，该细菌菌株分类命名为巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：gdmccno：60094。

该细菌的培养方法为将菌株接种到发酵培养基，25℃、转速225rpm条件下震荡培养6-7d。所述发酵培养基的组成为牛肉浸膏8g，蛋白胨8g，nacl5g和蒸馏水1000ml，ph7.2。其中，本发明的原始细菌菌株是通过从重金属污染的土壤中分离、筛选获得；然后通过离子注入物理诱变得到巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26。该细菌菌株的分离和培养方法，包括以下步骤：

（1）将来自重金属污染区的土壤10g装入90ml含10mg/lcdcl2和100mg/lcucl2的分离培养基中富集培养，24h后取富集培养液做10^-2、10^-3、10^-4梯度稀释，各取0.1ml分别涂布于含重金属镉、铜的分离培养基平板上，每个梯度3个重复，置25℃培养3天。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。随后将获得的纯化菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放入4℃冰箱中保存备用。

（2）经培养筛选后确定的xj06菌株于25℃培养6-7d，随后进行鉴定。参照《伯杰氏系统细菌学手册》，依据菌体的个体、群体形态和生理、生化试验及16srdna序列进行测定。

（3）通过pcr获得xj06菌株的16srdna序列，经序列测定及blast同源性对比与进化分析，结果表明xj06与bacillusmegateriumqmb155116srdna的同源性为98.1%，与bacillusmegateriumdsm31916srdna的同源性为97.2%，确定xj06为bacillusmegaterium属的一个新种。

诱变菌株巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26获得的具体操作步骤为：

(1)将出发菌株bacillusmegateriumxj06进行离子注入物理诱变，得到突变株。离子注入条件是采用15kevn⁺注入诱变，注量为50~200*10¹³/cm²，靶室真空度为10^-3pa。

（2）将步骤（1）所得的突变菌株涂布于分别含有高浓度重金属镉、铜的选择性固体培养基平面，培养，得到耐受重金属的诱变细菌。

（3）对步骤（2）所得的耐受重金属的菌株的抗性稳定性进行考察，最终选定一株抗性稳定的菌株，命名为巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26。

本发明菌株对重金属镉、铜的最高耐受浓度分别为40mg/l、300mg/l。

本发明的菌株对重金属镉与铜的吸附率可以分别达到91%、52%。

相比于未接种土样、接种出发菌株土样，接种本发明的诱变菌株可使土壤中可交换态镉含量分别降低56%和34%。

本发明所述的菌株在水体和土壤重金属污染治理中的应用。

具体的，耐重金属菌株巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26在吸附含有重金属镉、铜的污染水的应用过程为：

将巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26接种于发酵培养基中，在25℃、转速225rpm条件下震荡培养6-7d，得到发酵液。将发酵液离心，去除培养基，获得菌体。将菌体置于分别含有镉、铜的重金属污染水中，吸附1h。

耐重金属菌株巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26在降低土壤可交换镉含量方面的应用过程为：

将出发菌株及诱变菌株分别接种于液体发酵培养基中培养2d。向风干过筛的土壤中加入cdcl2溶液，在室温下保持两个月后，风干过2mm筛，制成镉污染土壤样品。将液体发酵液中的菌液接种到所制得的镉污染土壤样品中，置于25℃恒温培养箱中分别培养待测。以同样方法制备的相同镉污染浓度的土壤样品为对照组，进行同样的检测。检测方法参考文献“刘丽娟等.不同改良剂对污染土壤中cd形态影响的研究，农业环境科学学报，2013，32（9）：1778-1785”中公布的方法。

本发明的有益效果在于：

本发明筛选到一株耐重金属的巨大芽孢杆菌xj06，并对其进行离子注入物理诱变，获得突变株xj06-26，命名为巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26。巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26比原始菌株的耐受、吸附重金属能力更强，可用于重金属污染的土壤、水体的治理中。本发明所述的生物材料，其分类命名为巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：gdmccno：60094，保藏日期为2016年10月17日，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

附图说明

图1吸附时间对镉的吸附率的影响；

图2吸附时间对铜的吸附率的影响；

图3温度对镉离子吸附率的影响；

图4温度对铜离子吸附率的影响；

图5未接种土样、接种出发菌株土样及接种诱变菌株土样中可交换态镉的含量变化；

图6未接种土样、接种出发菌株土样及接种诱变菌株土样中碳酸盐结合态镉的含量变化；

图7未接种土样、接种出发菌株土样及接种诱变菌株土样中铁锰氧化物结合态镉的含量变化；

图8未接种土样、接种出发菌株土样及接种诱变菌株土样中有机质结合态结合态镉的含量变化；

图9未接种土样、接种出发菌株土样及接种诱变菌株土样中残渣态镉的含量变化。

本发明所述的生物材料，其分类命名为巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：gdmccno：60094，保藏日期为2016年10月17日，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

具体实施方式

实施例1：本实施例说明本发明使用到的培养基

分离培养基：牛肉浸膏8g，蛋白胨8g，nacl5g，蒸馏水1000ml，ph7.2，cdcl2（10mg/l）、cucl2（100mg/l）。

发酵培养基：牛肉浸膏8g，蛋白胨8g，nacl5g，蒸馏水1000ml，ph7.2。

实施例2：细菌bacillusmegateriumxj06的分离、筛选、鉴定

将来自重金属污染区的土壤10g装入90ml含10mg/lcdcl2和100mg/lcucl2的液体牛肉膏蛋白胨中富集培养，24h后取富集培养液做10^-2、10^-3、10^-4梯度稀释，各取0.1ml分别涂布于含重金属镉、铜的分离培养基平板上，每个梯度3个重复，置25℃培养3天。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落，获得纯化菌株，将纯化的菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放人4℃冰箱中保存备用。

经培养筛选后确定的xj06菌株于25℃培养6-7d，随后进行鉴定。参照《伯杰氏系统细菌学手册》，依据菌体的个体、群体形态和生理、生化试验及16srdna序列进行测定。

通过pcr获得xj06菌株的16srdna序列，经序列测定及blast同源性对比与进化分析，结果表明xj06与bacillusmegateriumqmb155116srdna的同源性为98.1%，与bacillusmegateriumdsm31916srdna的同源性为97.2%，确定xj06为bacillusmegaterium属的一个新种。

实施例3：菌株xj06的诱变、筛选

取长满出发菌株的斜面一支，装于无菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，25℃、160rpm充分震荡30min，使菌体均匀分散，过滤，制成悬浮液，并稀释至浓度为10⁷个/ml。取0.1ml稀释好的细菌悬浮液均匀涂布、风干，放入离子注入机内，采用15kevn⁺，注量为50~200*10¹³/cm²，靶室真空度为10^-3pa对出发菌株进行处理。

用生理盐水洗脱诱变后的菌体，制成10⁷个/ml的菌体悬浮液，取200ul涂布于高浓度的含有不同浓度的重金属离子的分离培养基上，25℃培养6-7天。期间，观察平板上的菌落形态，并统计菌落总数，挑取耐受镉、铜浓度最高的菌落，最终挑选到菌株xj06-26。

将菌株xj06-26命名为巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26，于2016年10月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：gdmccno：60094。

实施例4：菌株巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26的耐重金属性能

将xj06及巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26菌株分别涂布于含有镉5、10、20、30、40、50、60mg/l及含有铜100、200、300、400、500、600、700mg/l的分离培养基平板上，25℃培养6-7天。xj06菌株在含有镉浓度高于30mg/l及含有铜浓度高于200mg/l的平板上无菌落生长；巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26菌株在含有镉浓度高于40mg/l及含有铜浓度高于300mg/l的平板上无菌落生长，其对镉与铜的耐受性分别为原始菌株的121.1%、148%。

实施例5：菌株巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26对镉、铜的吸附性能

（1）吸附时间对吸附效果的影响

将出发菌株及诱变菌株分别接种于液体发酵培养基中，25℃225rpm摇床培养2d。离心收集菌体，用灭菌的双蒸水洗涤2遍。将收集洗净的菌体称取一定重量，分别放入装有50ml含镉（30mg/l）或铜离子（200mg/l）的生理盐水溶液中，摇瓶摇床培养（25℃，225rpm）。同时以不加菌体的含有相同浓度镉离子或铜离子浓度的生理盐水溶液做对照，在吸附时间分别为1、3、10、30、60、120、180、240、480、720、1440min依次取样后离心。取上清测定吸附前后溶液中镉或铜离子浓度的变化。

吸附率（r）的计算方法：

r（%）=（c0-ct）/c0*100%

其中，c0为溶液中金属离子的初始浓度，ct加入菌体吸附t小时是溶液中的金属离子的浓度。

如图1所示，两种菌株对镉离子的吸附在120min时达到平衡，诱变菌株的吸附率显著高于原始菌株，最大吸附率达91%，而原始菌株的最大吸附率仅为71%。如图2所示，诱变菌株与原始菌株对铜离子的吸附分别在30min与60min时达到平衡，诱变菌株的吸附率显著高于原始菌株，最大吸附率达52%，而原始菌株的最大吸附率仅为39%。

（2）温度对吸附率的影响

取20ml的菌悬液置于分别含10mg/l镉离子或200mg/l铜离子的100ml溶液中，控制菌质量浓度为2.0g/l，分别调节温度为20、25、30、35℃，以不加菌的体系为对照，225rpm条件下恒温振荡，吸附60min后取样。在6000rpm离心机上离心10min后收集上清液，用原子吸收分光光度计测定上清液中镉或铜离子浓度，通过吸附前后镉或铜离子浓度的变化计算吸附率。

如图3-4所示，温度在20-35℃时，对诱变菌株的镉或铜离子吸附效果的影响不显著，吸附率基本维持在85%和50%左右。然而，温度在20-35℃之间变化时，对原始菌株的吸附效果影响显著。由此可见，诱变菌株能在较大的温度范围内对镉或铜离子进行有效吸附。

实施例6：菌株巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）xj06-26对土壤中镉的价态转变性能

将出发菌株及诱变菌株分别接种于液体发酵培养基中，25℃225rpm摇床培养2d。向风干过筛的土壤中加入cdcl2溶液，喷施去离子水保持其含水量为田间土壤持水量的70%，在室温下保持两个月后，风干过2mm筛，制成镉污染浓度为15mg/kg的土壤样品。随后将液体发酵液中的菌液以2.5%体积的接种量加入50g所制得的镉污染土壤样品中，置于25℃恒温培养箱中分别培养待测。以同样方法制备的相同镉污染浓度的土壤样品为对照组，进行同样的检测。

每间隔1周取上述三种土样（未接种土样、接种出发菌株土样、接种诱变菌种土样）测定其不同形态镉的含量。检测方法参考文献“刘丽娟等.不同改良剂对污染土壤中cd形态影响的研究。农业环境科学学报，2013，32（9）：1778-1785”中公布的方法。上述三种土样中可交换态镉（ec）、碳酸盐结合态镉（cc）、铁锰氧化物结合态镉（fm）、有机质结合态镉（of）、残渣态（rs）的含量如图5-9所示。从图5-9可以看出，通过接种的诱变菌株经4周（28天）的菌种繁殖，土壤中可交换态镉含量显著降低，与未接种土样及接种出发菌株土样相比，接种诱变菌株的土样中可交换态镉分别降低56%和34%，同时接种诱变菌株土样中碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机质结合态等非活性形态的镉含量显著上升，说明该诱变菌株能有效降低土壤中可交换态等有效态镉的含量。