一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器及其制备方法和使用方法与流程

本发明涉及一种人工皮肤组织培养的气液界面生物反应器及其制备方法和使用方法。

背景技术：
皮肤是人体最大的器官，是人体阻碍水流失、紫外、机械伤害、毒性及细菌病毒伤害的一道重要防线。若大面积烧伤病人不能及时进行治疗，伤口就会发炎，导致死亡。针对大面积(直径大于1cm2)的皮肤缺失，治疗的黄金准则是“自体皮肤移植”。然而，大面积皮肤缺失者自体皮肤远不足以供应伤者所需。异体移植(如他人、尸体皮肤)不但数量少、价格昂贵，而且引入新的病毒而造成安全隐患。组织工程被誉为“再生”之科学，随着其发展，人工皮肤的问世能部分解决上述问题。其价格虽然不足以匹敌真人皮肤，但其昂贵的价格使许多伤者无法负担而选择放弃治疗。造成人工皮肤成本较高的主要因素是人工皮肤培养周期长(4～6周)且需要气液界面(Air-LiquidInterface,ALI)复杂的培养模式。现今大多数公司采用悬挂式培养小室(Transwell)进行培养，这种培养方式需要大量操作员频繁更换培养液，且在更换过程中会因部分样品染菌导致实验失败。

技术实现要素：
本发明的目的是为了解决常用的悬挂式培养小室需要大量操作员频繁更换培养液且在更换过程中部分样品会染菌的问题，提供了一种基于注射泵的闭合式连续灌注式生物反应器及其制备方法和使用方法。本发明用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器包括上盖、下托盖、进气管、出气管、进液管、出液管、注气注射器、注液注射器和收集装置；所述上盖的下表面有一个槽，槽的一端有一个通孔，槽的另一端有一个通孔；所述的下托盖中间有一个盲孔，下托盖内部垂直于盲孔开有左侧通道和右侧通道，左侧通道的左端有一个通向上盖上表面的孔，右侧通道的右端有一个通向上盖上表面的孔；所述的盲孔的下半部设置有一个圆筒体，所述的圆筒体的侧壁均匀分布有多个通孔，圆筒体里面放置海绵，海绵上平面与左侧通道和右侧通道上平面及圆筒体的上开口水平；所述的通孔与进气管连接、通孔与出气管连接、孔与进液管连接和孔与出液管连接；其中通孔通过进气管连接注气注射器，注气注射器通入CO2和空气；孔通过进液管连接注液注射器，注液注射器通入分化培养液；通孔通过出气管排出废气，孔通过出液管连接收集装置，收集装置收集废液；所述上盖的下表面与下托盖的上表面之间为密封连接。本发明用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器的制备方法按以下步骤进行：一、PDMS模型的浇铸将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用胶粘在玻璃片上，再将固化剂(SYLGARD184)与PDMS的预聚物(SYLGARD184)按质量比为1：10充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脱气10min～30min，至没有气泡为止，浇铸成PDMS和PMMA的组合模具；二、PDMS模型的固化将组合模具放入80℃～100℃恒温箱中固化1.5h～2.5h；三、对PDMS模型打孔将固化后的PDMS从PMMA模具上小心取下，利用直径为0.4mm～0.6mm的打孔针对PDMS模型打孔；四、PDMS模型的键合利用等离子清洗机对中层PDMS模型和下层PDMS模型进行键合。五、气液界面灌注式生物反应器的组合将通孔分别与进气管、出气管、进液管和出液管连接，将上盖与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型组成的下托盖密封；将进气管与注气注射器连接、出气管置于装置外以排出废气、进液管与注液注射器连接并将出液管连接收集器；组成气液界面灌注式生物反应器。本发明用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器的使用方法是按以下步骤进行：一、将整个PDMS生物反应器装置中的不同组成部分均进行三次不同方式灭菌；二、三次灭菌后将海绵放置于盲孔下半部的圆筒体内，保持海绵上平面与左侧通道和右侧通道上平面及圆筒体的上开口水平，主要目的是使皮肤组织与水凝胶的上表面与通入的CO2和空气接触、下表面与通入的分化培养液接触；将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上，海绵的主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶；三、将通孔分别与进气管、出气管、进液管和出液管连接，对上盖与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型组成的下托盖进行密封，将进气管与注气注射器连接、出气管置于装置外以排出废气、进液管与注液注射器连接和出液管连接收集器；四、向注液注射器通入分化培养液；向注气注射器通入CO2和空气。本发明的原理在于：浇铸的PDMS模型含有两个封闭式灌注通道，通道两侧有孔用于连接软管；下层封闭式灌注通道通过软管通入分化培养液，下层封闭式灌注通道过软管通入含有CO2的空气，实现了人体皮肤细胞外侧与空气接触且内侧与营养液体接触的环境。本发明相对于现有技术其优点在于：1.本发明基于注射泵的闭合式连续灌注式生物反应器，实现了气液界面复杂的培养模式。相比于传统培养皿中的静态培养，一方面减少因频繁更换培养液带来的染菌风险，提高培养成功率；另一方面实现了模拟人体生理环境的灌注式培养，不仅为细胞提供了充足的营养，而且流体可冲走细胞有害代谢物，从而实现细胞高效培养。利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞在1、4、7天的存活率分别可达84％～90％、90％～96％和90％～95％，而通常静态培养的在1、4、7天的存活率分别为73％～77％、70％～74％和77％～83％。相比之下本发明培养细胞的存活率较静态培养的总体提高了10％以上。细胞增殖方面也存在差异，本发明培养的人体皮肤细胞在1、4、7天细胞生长占总面积的20％～24％、72％～76％和94％～98％。在相同条件下比静态培养的分别提高了1％～2％、5％～10％和11％～15％。2.利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞在培养分化过程中较传统培养皿中静态培养的差别在于：本发明培养的细胞培养分化14、21、28及35天人工表皮厚度分别可达：22μm～26μm、40μm～46μm、48μm～52μm和56μm～60μm。相比之下本发明培养细胞的人工表皮厚度较静态培养的总体提高了2μm以上。14、21、28及35天人工表皮层数分别可达：2层～4层、4层～6层、6层～8层和7层～9层，较静态培养的总体提高了0.5层～1层。3.本发明提供的制备气液界面灌注式生物反应器的方法，其换用不同的模具再与聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板经螺栓固定就可以实现适用于不同孔道或者可以进行大规模细胞组织培养，可操作性强。4.本发明使用的材料如：注射器、海绵等无毒且海绵吸水性好、不容易降解是放置种有皮肤细胞的水凝胶的最好方法，材料价格低更利于节约成本。附图说明图1为本发明气液界面灌注式生物反应器灌注系统的侧视截面图。图2为本发明气液界面灌注式生物反应器灌注系统的局部放大图。图3为本发明向PMMA模具浇铸成的PDMS和PMMA组合模具的示意图。图4为对PDMS模型打孔的示意图。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式的一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：该生物反应器包括上盖1、下托盖2、进气管4-2、出气管4-3、进液管4-1、出液管4-4、注气注射器10-1、注液注射器10-2和收集装置8；所述上盖1的下表面有一个槽1-3，槽1-3的一端有一个通孔1-1，槽1-3的另一端有一个通孔1-2；所述的下托盖2中间有一个盲孔3，下托盖2内部垂直于盲孔3开有左侧通道2-3和右侧通道2-4，左侧通道2-3的左端有一个通向上盖1上表面的孔2-1，右侧通道2-4的右端有一个通向上盖1上表面的孔2-2；所述的盲孔3的下半部设置有一个圆筒体5-1，所述的圆筒体5-1的侧壁均匀分布有多个通孔5-2，圆筒体5-1里面放置海绵5-3，海绵5-3上平面与左侧通道2-3和右侧通道2-4上平面及圆筒体5-1的上开口水平；所述的通孔1-1与进气管4-2连接、通孔1-2与出气管4-3连接、孔2-1与进液管4-1连接和孔2-2与出液管4-4连接；其中通孔1-1通过进气管4-2连接注气注射器10-1，注气注射器10-1通入CO2和空气；孔2-1通过进液管4-1连接注液注射器10-2，注液注射器10-2通入分化培养液；通孔1-2通过出气管4-3排出废气，孔2-2通过出液管4-4连接收集装置8，收集装置8收集废液；所述上盖1的下表面与下托盖2的上表面之间为密封连接。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，进气管4-2与注气注射器10-1之间连接过滤器9-1；进液管4-1与注液注射器10-2之间连接过滤器9-2；出气管4-3连接过滤器9-3；出液管4-4与收集装置8之间连接过滤器9-4；进一步防止外界细菌进入系统中污染系统内环境。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的通孔1-1、通孔1-2、孔2-1和孔2-2的直径均为0.4mm～0.6mm。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的进气管4-2、出气管4-3、进液管4-1和出液管4-4均为聚四氟乙烯，其其外径为0.75mm，内径为0.03mm。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述CO2的体积分数占CO2和空气总体系的4％～6％。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的盲孔3直径为5mm～7mm，高度为7mm～9mm，左侧通道2-3和右侧通道2-4截面宽×高为(0.75mm～1.25mm)×(1.0mm～1.5mm)。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的圆筒体5-1是可拆卸的，其直径为5mm～7mm，高度为2mm～4mm，用于放置海绵。其他步骤与参数与具体实施方式七相同。具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的上盖1的下表面与下托盖2的上表面之间是由密封装置6密封的。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是，所述的密封装置6是由两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1和4套螺栓6-2组成，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1有四个圆形通孔7。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是，所述的两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1的厚度为3mm～4mm。其他步骤与参数与具体实施方式十一相同。具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式九不同的是，所述的通孔7的直径为3mm～5mm。其他步骤与参数与具体实施方式十一相同。具体实施方式十二：本实施方式的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器的制备方法按以下步骤进行：一、PDMS模型的浇铸将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用胶粘在玻璃片14上，再将固化剂与PDMS的预聚物充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脱气，至没有气泡为止，浇铸成PDMS和PMMA的组合模具；二、PDMS模型的固化将将组合模具放入恒温箱中固化；三、对PDMS模型打孔将固化后的PDMS从聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上取下，利用打孔针对PDMS打孔；四、PDMS模型的键合利用等离子清洗机对中层PDMS模型12和下层PDMS模型13进行键合；五、气液界面灌注式生物反应器的组合将通孔1-1与进气管4-2连接、通孔1-2与出气管4-3连接、孔2-1与进液管4-1连接和孔2-2与出液管4-4连接；将上盖1与键合好的中层PDMS模型12和下层PDMS模型13组成的下托盖2密封；将进气管4-2与注气注射器10-1连接、出气管4-3置于装置外以排出废气、进液管4-1与注液注射器10-2连接并将出液管4-4连接收集器8；组成气液界面灌注式生物反应器。具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤一中所述的固化剂和PDMS的预聚物为灌封胶(DC184)。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤一中所述的固化剂(SYLGARD184)与PDMS的预聚物(SYLGARD184)按质量比为1：10混合。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤一中所述的PMMA模具的厚度为1.0mm～2.0mm。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤一中所述的真空干燥箱脱气时间为10min～30min。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤二中恒温箱的温度设置为80℃～100℃。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤二中固化时间为1.5h～2.5h。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤三中所述的打孔针的直径为0.4mm～0.6mm。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，进气管4-2与注气注射器10-1之间连接过滤器9-1；进液管4-1与注液注射器10-2之间连接过滤器9-2；出气管4-3连接过滤器9-3；出液管4-4与收集装置8之间连接过滤器9-4；防止外界细菌进入系统中污染系统内环境。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤五所述的上盖1的下表面与下托盖2的上表面之间是由密封装置6密封的。其他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式二十不同的是，所述的密封装置6是由两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1和4套螺栓6-2组成，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1有四个圆形通孔7。其他步骤与参数与具体实施方式二十相同。具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式二十二不同的是，所述的两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1的厚度为3mm～4mm。其他步骤与参数与具体实施方式二十二相同。具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式二十二不同的是，所述的通孔7的直径为3mm～5mm。其他步骤与参数与具体实施方式二十二相同。具体实施方式二十五：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤五所述的通孔(1-1)、通孔(1-2)、孔(2-1)和孔(2-2)的直径均为0.4mm～0.6mm。他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式二十六：本实施方式与具体实施方式十二不同的是，步骤五所述的进气管(4-2)、出气管(4-3)、进液管(4-1)和出液管(4-4)均为聚四氟乙烯，其其外径为0.75mm，内径为0.03mm。他步骤与参数与具体实施方式十二相同。具体实施方式二十七：本实施方式的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器的使用方法是按以下步骤进行：一、将整个PDMS生物反应器装置中的不同组成部分均进行三次不同方式灭菌；二、三次灭菌后将海绵5-3放置于盲孔3下半部的圆筒体5-1内，保持海绵5-3上平面与左侧通道2-3和右侧通道2-4上平面及圆筒体5-1的上开口水平，主要目的是使皮肤组织与水凝胶的上表面与通入的CO2和空气接触、下表面与通入的分化培养液接触；将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵5-3上，海绵5-3的主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶；三、将通孔1-1与进气管4-2连接、通孔1-2与出气管4-3连接、孔2-1与进液管4-1连接和孔2-2与出液管4-4连接；将上盖1与键合好的中层PDMS模型12和下层PDMS模型13组成的下托盖2密封；将进气管4-2与注气注射器10-1连接、出气管4-3置于装置外以排出废气、进液管4-1与注液注射器10-2连接并将出液管4-4连接收集器8；四、向注液注射器10-2通入分化培养液；向注气注射器10-1通入CO2和空气。具体实施方式二十八：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，步骤一中第一次灭菌按以下方法进行：将整套设备浸入体积分数为70％～80％的乙醇水溶液中灭菌1h～1.5h。其他步骤与参数与具体实施方式二十七相同。具体实施方式二十九：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，步骤一中第二次灭菌按以下方法进行：将整套设备至于无菌的细胞操作台，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为45min～1h。其他步骤与参数与具体实施方式二十七相同。具体实施方式三十：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，步骤一中第三次灭菌按以下方法进行：用含有质量分数为1％～2％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗PTFE管4、圆柱形支架3、下封闭式灌注通道1-1、上封闭式灌注通道1-2和封闭式灌注室1-7。其他步骤与参数与具体实施方式二十七相同。具体实施方式三十一：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，步骤二中所述种有皮肤细胞的水凝胶是按以下方法种出来的：一、将皮肤细胞种植于水凝胶上，静止45min～1h后放入24孔板中静置培养18h～24h；二、将水凝胶连同皮肤细胞放入生物反应器中圆筒体5-1的海绵5-3上进行生长期培养，培养6d～8d，气液界面分化期培养35d～40d；三、取出人工皮肤与水凝胶，经处理后植入人体。具体实施方式三十二：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，步骤三中进气管4-2与注气注射器10-1之间连接过滤器9-1；进液管4-1与注液注射器10-2之间连接过滤器9-2；出气管4-3连接过滤器9-3；出液管4-4与收集装置8之间连接过滤器9-4；防止外界细菌进入系统中污染系统内环境。其他步骤与参数与具体实施方式二十七相同。具体实施方式三十三：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，所述的通孔1-1、通孔1-2、孔2-1和孔2-2的直径均为0.4mm～0.6mm。其他步骤与参数与具体实施方式二十七相同。具体实施方式三十四：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，步骤三中所述的进气管4-2、出气管4-3、进液管4-1和出液管4-4均为聚四氟乙烯，其其外径为0.75mm，内径为0.03mm。其他步骤与参数与具体实施方式二十七相同。具体实施方式三十五：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，步骤三中所述的上盖1的下表面与下托盖2的上表面之间是由密封装置6密封的。其他步骤与参数与具体实施方式二十七相同。具体实施方式三十六：本实施方式与具体实施方式三十五不同的是，所述的密封装置6是由两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1和4套螺栓6-2组成，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1有四个圆形通孔7。其他步骤与参数与具体实施方式三十五相同。具体实施方式三十七：本实施方式与具体实施方式三十六不同的是，所述的两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1的厚度为3mm～4mm。其他步骤与参数与具体实施方式三十六相同。具体实施方式三十八：本实施方式与具体实施方式三十六不同的是，所述的通孔7的直径为3mm～5mm。其他步骤与参数与具体实施方式三十六相同。具体实施方式三十九：本实施方式与具体实施方式二十七不同的是，步骤四中所述CO2的体积分数占CO2和空气总体系的4％～6％。其他步骤与参数与具体实施方式二十七相同。用以下试验验证本发明：实施例1：本发明制备的气液界面灌注式生物反应器按以下步骤制备：一、PDMS模型的浇铸将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用胶粘在玻璃片上，再将固化剂(SYLGARD184)与PDMS的预聚物(SYLGARD184)按质量比为1：10充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脱气10min，至没有气泡为止，浇铸成PDMS和PMMA的组合模具；二、PDMS模型的固化将组合模具放入80℃恒温箱中固化1.5h；三、对PDMS模型打孔将固化后的PDMS从PMMA模具上小心取下，利用直径为0.4mm的打孔针对PDMS模型打孔；四、PDMS模型的键合利用等离子清洗机对中层PDMS模型和下层PDMS模型进行键合。五、气液界面灌注式生物反应器的组合利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；使用时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为70％的乙醇水溶液中灭菌1h；：再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为45min；然后用含有质量分数为1％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入CO2的体积分数为5％的CO2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。为验证连续灌注组织培养的优势及水凝胶的毒性与粘附性，在生长期灌注培养1天以后取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为85％、细胞生长占总生长面积的22％，静态培养的存活率75％、细胞生长占总生长面积的20％；经过分化期养殖14天后，用4％的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30％的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长×宽×高为10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷却。带OCT完全凝固后，用冰冻切片机(LeicaCM3050)将皮肤组织切成5μm后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为24μm、人工表皮层数为3层而静态培养的人工表皮厚度为22μm、人工表皮层数为2.5层。实施例2：本发明制备的气液界面灌注式生物反应器按以下步骤制备：一、PDMS模型的浇铸将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用胶粘在玻璃片上，再将固化剂(SYLGARD184)与PDMS的预聚物(SYLGARD184)按质量比为1：10充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脱气10min，至没有气泡为止，浇铸成PDMS和PMMA的组合模具；二、PDMS模型的固化将组合模具放入80℃恒温箱中固化1.5h；三、对PDMS模型打孔将固化后的PDMS从PMMA模具上小心取下，利用直径为0.4mm的打孔针对PDMS模型打孔；四、PDMS模型的键合利用等离子清洗机对中层PDMS模型和下层PDMS模型进行键合。五、气液界面灌注式生物反应器的组合利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；使用时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为70％的乙醇水溶液中灭菌1h；：再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为45min；然后用含有质量分数为1％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入CO2的体积分数为5％的CO2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。将人体皮肤细胞在生长期灌注培养4天以后，取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为90％、细胞生长占总生长面积的74％，而静态培养的存活率76％、细胞生长占总生长面积的67％；经过分化期养殖21天后，用4％的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30％的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长×宽×高为10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷却。带OCT完全凝固后，用冰冻切片机(LeicaCM3050)将皮肤组织切成5μm后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为42μm、人工表皮层数为5层而静态培养的人工表皮厚度为38μm、人工表皮层数为4.5层。实施例3：本发明制备的气液界面灌注式生物反应器按以下步骤制备：一、PDMS模型的浇铸将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用胶粘在玻璃片上，再将固化剂(SYLGARD184)与PDMS的预聚物(SYLGARD184)按质量比为1：10充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脱气30min，至没有气泡为止，浇铸成PDMS和PMMA的组合模具；二、PDMS模型的固化将组合模具放入90℃恒温箱中固化2.0h；三、对PDMS模型打孔将固化后的PDMS从PMMA模具上小心取下，利用直径为0.5mm的打孔针对PDMS模型打孔；四、PDMS模型的键合利用等离子清洗机对中层PDMS模型和下层PDMS模型进行键合。五、气液界面灌注式生物反应器的组合利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；使用时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为75％的乙醇水溶液中灭菌1.5h；：再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为50min；然后用含有质量分数为1.5％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入CO2的体积分数为6％的CO2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。将人体皮肤细胞在生长期灌注培养7天以后，取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为91％、细胞生长占总生长面积的96％，而静态培养的存活率80％、细胞生长占总生长面积的67％；经过分化期养殖28天后，用4％的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30％的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长×宽×高为10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷却。带OCT完全凝固后，用冰冻切片机(LeicaCM3050)将皮肤组织切成5μm后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为50μm、人工表皮层数为6层而静态培养的人工表皮厚度为45μm、人工表皮层数为5层。实施例4：本发明制备的气液界面灌注式生物反应器按以下步骤制备：一、PDMS模型的浇铸将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用胶粘在玻璃片上，再将固化剂(SYLGARD184)与PDMS的预聚物(SYLGARD184)按质量比为1：10充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脱气30min，至没有气泡为止，浇铸成PDMS和PMMA的组合模具；二、PDMS模型的固化将组合模具放入90℃恒温箱中固化2.0h；三、对PDMS模型打孔将固化后的PDMS从PMMA模具上小心取下，利用直径为0.5mm的打孔针对PDMS模型打孔；四、PDMS模型的键合利用等离子清洗机对中层PDMS模型和下层PDMS模型进行键合。五、气液界面灌注式生物反应器的组合利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；使用时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为75％的乙醇水溶液中灭菌1.5h；：再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为50min；然后用含有质量分数为1.5％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入CO2的体积分数为6％的CO2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。将人体皮肤细胞在生长期灌注培养7天以后，取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为91％、细胞生长占总生长面积的96％，而静态培养的存活率80％、细胞生长占总生长面积的67％；经过分化期养殖35天后，用4％的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30％的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长×宽×高为10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷却。带OCT完全凝固后，用冰冻切片机(LeicaCM3050)将皮肤组织切成5μm后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为58μm、人工表皮层数为7层而静态培养的人工表皮厚度为52μm、人工表皮层数为6层。本发明使用的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)(8560K171，McMasterCarr公司，新泽西州，美国)经激光切割机切制而成。本发明选用惰性的PTFE管，其外径为0.75mm，内径为0.03mm。