戊糖片球菌JQI-7菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物筛选技术领域，特别是涉及戊糖片球菌的新菌株筛选、功能验证及该菌株在调节血脂方面的应用。

背景技术：

高胆固醇血症也称高低密度脂蛋白胆固醇血症，是导致动脉粥样硬化性心血管病的首要危险因素。最新研究显示，各种心血管病风险人群低密度脂蛋白每降低1毫摩尔/升，主要血管事件可降低21％。据2013年的统计显示，我国约有2亿临界高胆固醇血症人群以及8800万高胆固醇血症患者。而我国成人中高胆固醇的知晓率、治疗率、控制率仅为11％、5.1％和2.8％。在第四届中国慢病管理大会心脑血管疾病防治论坛上，多位专家呼吁，政策制定者、医务人员以及公众都应认识到控制血脂在心脑血管疾病防治中的重要作用，真正做到危险因素的综合管理。

当前针对预防心血管疾病，提倡遵守低脂或低饱和脂肪食物的膳食原则。大量的实验证明，低脂食物能有效减少血清中胆固醇的含量，但低脂食物的口感和风味比较简单，这个膳食建议仍未被大众接受或长期坚持，因此人群血清胆固醇水平呈逐年增高趋势。由于低脂膳食主张的低接受性，人们愿望开发出其他可以降低血清胆固醇及血脂的膳食补充品。

最早发现乳酸菌能够降低机体内胆固醇含量源于上世纪七十年代Mann的发现，他发现饮用发酵乳制品人的体内具有较低的胆固醇含量，在1985年，研究者Gilliland等开展了嗜酸乳杆菌进行体外降胆固醇的研究，结果发现该菌能够降低发酵液中的胆固醇含量。Grill等给血清总胆固醇水平偏高的患者服用嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌制剂，8个月后发现被测人群血清胆固醇含量均显著下降。目前国内针对降胆固醇功能研究比较深入的两个菌株同属于植物乳杆菌，分别为L.plantarum P8和植物乳杆菌ST-III。L.plantarum P8来自内蒙古农业大学的张和平领导的团队，动物试验表明，L.plantarum P8具有显著的降血脂作用。曾任东北农业大学食品学院副院长，现任光明乳业股份有限公司总经理郭本恒领导的团队和江南大学合作研发的植物乳杆菌ST-III，在大量基础研究 的基础上，成功通过动物实验和人群临床试验的证实其降胆固醇的效果，并已产业化，成为光明公司的一个具有自主知识产权的益生菌产品。这也充分表明了具有降胆固醇的乳酸菌在发酵食品领域具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的就是为缓解国内高血脂人群日益增长的严峻趋势，提供一种具有降胆固醇、调节血脂功能的菌株和/或组合物，及其在制备食品、保健品、药品等方面的应用。

为实现上述目的，本发明采取以下方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种戊糖片球菌JQI-7，该戊糖片球菌JQI-7菌株于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.10511。根据本发明的实施例，本发明的戊糖片球菌JQI-7，是一种从发酵食品中分离的全新的菌株，该菌株在体内、体外均能够有效降低胆固醇及甘油三酯，且对酸和胆汁都有良好的耐受性。

在本发明的第二方面，本发明提供了所述戊糖片球菌JQI-7在调节血脂方面的用途，具体地，是在预防和改善高胆固醇及高甘油三酯症状方面的用途。根据本发明的实施例，本发明的戊糖片球菌JQI-7，在体内、体外均能够有效降低胆固醇及甘油三酯。因此，本发明的戊糖片球菌JQI-7能够用于调节血脂，具体地用于降低胆固醇及甘油三酯。

在本发明的第三方面，本发明提供了所述的戊糖片球菌JQI-7在制备用于调节血脂，具体用于降低胆固醇和甘油三酯的食品、保健品、食品添加剂、药物及其他组合物，所述的食品、保健品、食品添加剂、药物及其他组合物都含有上述的戊糖片球菌JQI-7。本发明的戊糖片球菌JQI-7，在体内、体外均能够有效降低胆固醇及甘油三酯。因而，所述的含有戊糖片球菌JQI-7菌株的食品、保健品、食品添加剂、药物及其他组合物能够用于调节血脂，具体地，用于降低胆固醇或降甘油三酯。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物。所述药物包含：前面所述的戊糖片球菌JQI-7；以及医药用无毒载体。发明人惊奇地发现，体内体外的胆固醇含量和甘油三酯的含量都明显降低，即本发明的药物能够有效发挥降低胆固醇、降低甘油三酯等功效。由此，所述药物用于降低胆固醇、降低甘油三酯，由 此，该药物用于调节血脂。

根据本发明的实施例，所述医药用无毒载体不受特别限制，只要能够使所述药物形成容易给药的剂型即可，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的一些具体示例，所述医药用无毒载体为选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理食盐水的至少一种。由此，本发明的药物能够有效形成容易给药的剂型，进而便于进行给药，利于后续实验步骤的进行。

根据本发明的实施例，所述药物的剂型呈选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少一种。由此，本发明的药物方便给药，便于后续实验步骤的进行。

根据本发明的实施例，本发明的药物进一步包括：稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少一种。

根据本发明的实施例，所述药物的给药剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据给药对象的健康状况灵活选择。根据本发明的一些实施例，任选地，该实施例所述的药物为复合益生菌片，将所述药物以2.0×10⁹CFU活菌/天的剂量对动物进行给药。由此，被给药动物的血中胆固醇含量、甘油三酯含量明显降低。

在本发明的第五方面，本发明还提供了一种食品。根据本发明的实施例，所述食品包含：前面所述的戊糖片球菌JQI-7；以及食品学上可接受的添加剂。发明人惊奇地发现，体内体外的胆固醇含量和甘油三酯的含量都明显降低，即本发明的食品能够有效发挥降低胆固醇、降低甘油三酯等功效。由此，所述药物用于降低胆固醇、降低甘油三酯，由此，该食品用于调节血脂。

需要说明的是，本文中所使用的术语“食品”应作广义理解，其可以是任何可被食用的形式，即除了常规的食品形式外，本发明的食品还可以为保健品、饮品、发酵食品等，并且，发酵食品也包括动物的饲料。

根据本发明的实施例，所述食品的摄取剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据实际状况灵活选择。根据本发明的一些实施例，任选地，实施例所述的食品为酸豆乳饮品，将所述食品以2.0×10⁹CFU活菌/天的剂量提供给动物。由此，服用过了本发明的食品的动物的血中胆固醇含量、甘油三酯含量明显降低。

另外，需要说明的是，本发明的植物乳杆菌可以与通常的食品中所使用的食品材料配合食用。例如，谷类及薯类：谷类包括米、面、杂粮，薯类包括马铃薯、红薯等；动物性食物，包括肉、禽、鱼、奶、蛋等；豆类及其制品，包括大豆及其他干豆类；蔬菜水果类，包括鲜豆、根茎、叶菜、茄果等；纯热能食物，包括动植物油、淀粉、食用糖和酒类等。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1戊糖片球菌JQI-7在光镜下的形态图。

图2戊糖片球菌JQI-7在10000倍电镜下的形态图。

图3显示了本发明实施例2戊糖片球菌JQI-7在体外降解胆固醇实验结果图，横坐标代表组别，纵坐标代表降解率。

图4显示了本发明实施例3戊糖片球菌JQI-7在体外抗酸实验的结果图，横坐标代表时间，纵坐标代表活菌数。

图5显示了本发明实施例3戊糖片球菌JQI-7在体外抗胆盐实验的生长曲线图。

图6显示了本发明实施例4戊糖片球菌JQI-7降解甘油三酯动物实验的结果图，横坐标代表组别，纵坐标代表甘油三脂的浓度。

图7显示了本发明实施例4戊糖片球菌JQI-7降解胆固醇动物实验的结果图，横坐标代表组别，纵坐标代表胆固醇的浓度。

具体实施方式

益生菌定植于人体肠道、生殖道内，能产生健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用。人体、动物体内的益生菌主要有：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种戊糖片球菌JQI-7，该戊糖片球菌JQI-7菌株于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.10511。根据本发明的实施例，本发明的戊糖片 球菌JQI-7，是一种从发酵食品中分离的全新的菌株，该菌株在体内、体外均能够有效降低胆固醇及甘油三酯，且对酸和胆汁都有良好的耐受性。

在本发明的第二方面，本发明提供了所述戊糖片球菌JQI-7在调节血脂方面的用途，具体地，是在预防和改善高胆固醇及高甘油三酯症状方面的用途。根据本发明的实施例，本发明的戊糖片球菌JQI-7，在体内、体外均能够有效降低胆固醇及甘油三酯。因此，本发明的戊糖片球菌JQI-7能够用于调节血脂，具体地用于降低胆固醇及甘油三酯。

在本发明的第三方面，本发明提供了所述的戊糖片球菌JQI-7在制备用于调节血脂，具体用于降低胆固醇和甘油三酯的食品、保健品、食品添加剂、药物及其他组合物，所述的食品、保健品、食品添加剂、药物及其他组合物都含有上述的戊糖片球菌JQI-7。本发明的戊糖片球菌JQI-7，在体内、体外均能够有效降低胆固醇及甘油三酯。因而，所述的含有戊糖片球菌JQI-7菌株的食品、保健品、食品添加剂、药物及其他组合物能够用于调节血脂，具体地，用于降低胆固醇或降甘油三酯。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物。所述药物包含：前面所述的戊糖片球菌JQI-7；以及医药用无毒载体。发明人惊奇地发现，体内体外的胆固醇含量和甘油三酯的含量都明显降低，即本发明的药物能够有效发挥降低胆固醇、降低甘油三酯等功效。由此，所述药物用于降低胆固醇、降低甘油三酯，由此，该药物用于调节血脂。

根据本发明的实施例，所述医药用无毒载体不受特别限制，只要能够使所述药物形成容易给药的剂型即可，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的一些具体示例，所述医药用无毒载体为选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理食盐水的至少一种。由此，本发明的药物能够有效形成容易给药的剂型，进而便于进行给药，利于后续实验步骤的进行。

根据本发明的实施例，所述药物的剂型呈选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少一种。由此，本发明的药物方便给药，便于后续实验步骤的进行。

根据本发明的实施例，本发明的药物进一步包括：稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少一种。

根据本发明的实施例，所述药物的给药剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据给药对象的健康状况灵活选择。根据本发明的一些实施例，任选地，该实施例所述的药物为复合益生菌片，将所述药物以2.0×10⁹CFU活菌/天的剂量对动物进行给药。由此，被给药动物的血中胆固醇含量、甘油三酯含量明显降低。

在本发明的第五方面，本发明还提供了一种食品。根据本发明的实施例，所述食品包含：前面所述的戊糖片球菌JQI-7；以及食品学上可接受的添加剂。发明人惊奇地发现，体内体外的胆固醇含量和甘油三酯的含量都明显降低，即本发明的食品能够有效发挥降低胆固醇、降低甘油三酯等功效。由此，所述药物用于降低胆固醇、降低甘油三酯，由此，该食品用于调节血脂。

需要说明的是，本文中所使用的术语“食品”应作广义理解，其可以是任何可被食用的形式，即除了常规的食品形式外，本发明的食品还可以为保健品、饮品、发酵食品等，并且，发酵食品也包括动物的饲料。

根据本发明的实施例，所述食品的摄取剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据实际状况灵活选择。根据本发明的一些实施例，任选地，实施例所述的食品为酸豆乳饮品，将所述食品以2.0×10⁹CFU活菌/天的剂量提供给动物。由此，服用过了本发明的食品的动物的血中胆固醇含量、甘油三酯含量明显降低。

另外，需要说明的是，本发明的植物乳杆菌可以与通常的食品中所使用的食品材料配合食用。例如，谷类及薯类：谷类包括米、面、杂粮，薯类包括马铃薯、红薯等；动物性食物，包括肉、禽、鱼、奶、蛋等；豆类及其制品，包括大豆及其他干豆类；蔬菜水果类，包括鲜豆、根茎、叶菜、茄果等；纯热能食物，包括动植物油、淀粉、食用糖和酒类等。

戊糖片球菌JQI-7在MRS培养基中在光学显微镜下呈球状形态。一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。直径约1μm，无芽孢，胞壁结构完整，胞质结构均匀，如图1、图2所示。不含质粒，代谢物不产生D-乳酸、吲哚等有毒物质，不表达硝基还原酶、也不具备产生物胺的能力，9种抗生素(Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol、Amplicilin、Vancomycin)MIC(最小抑菌浓度)均符合EFSA (欧洲食品药品监督局)规定。

戊糖片球菌JQI-7菌株体外降胆固醇试验显示，与对照相比，加入了戊糖片球菌JQI-7的高胆固醇溶液，在细菌培养24小时后，胆固醇的去除率达到68.76％，表明戊糖片球菌JQI-7体外确有降低胆固醇功能(图3)。

进一步将戊糖片球菌JQI-7菌株接种到pH为3.0的酸性环境与接种到pH6.8的中性环境中，2小时后进行活菌计数，发现pH3.0中，与pH6.8相比，活菌数保持在一个数量级(10⁹CFU/ml)；同时，戊糖片球菌JQI-7菌株在含0.3％的胆汁盐的MRS液体培养基的生长曲线稳定，表明戊糖片球菌JQI-7对酸和胆汁都有良好的耐受性(图4，5)。

动物实验中，将戊糖片球菌JQI-7喂食高胆固醇、高脂模型小鼠，在喂食28天以后，小鼠血液中甘油三酯及胆固醇含量与喂食生理盐水的模型组小鼠相比，分别降低了23.8％和32.5％(图6,7)，表明戊糖片球菌JQI-7能够有效改善小鼠的高胆固醇、高甘油三酯症状。

以上研究表明，戊糖片球菌JQI-7菌株对模拟胃液和人工肠液环境抗性良好，体外、体内可明显降低胆固醇及甘油三酯。表明本文发明的戊糖片球菌JQI-7菌株已经具备成为药用菌的必备条件，可用于开发成为新药、食品、保健品以及食品添加剂等。

下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细描述。

实施例1：戊糖片球菌JQI-7的分离鉴定

(1)培养基配方优化

分组进行优化培养基实验，最后得到乳酸菌培养基最佳配方：

MRS固体培养基1L配方：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温801.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂17.5g，德国Merck公司；

MRS肉汤培养基配方较MRS琼脂培养基仅无琼脂，德国Merck公司。

调整pH至6.5，121℃灭菌20min。培养基制备完成，4℃冷藏备用。

(2)戊糖片球菌JQI-7菌株的分离鉴定

以各种传统发酵食品为样品，用无菌生理盐水，10倍梯度稀释样品后至10^-3， 将其涂布于MRS固体培养基，置于37℃培养箱中培养24—48h，观察菌落形态特征，并挑取MRS固体培养基上乳酸菌的疑似菌落，分别转接到MRS液体培养基中进行纯培养。共分离出若干株菌，对每株菌进行编号。

对分离纯化得到的这若干株菌进行酸及胆盐耐受力及降胆固醇能力的测定，详细实验步骤见实施例2及3，从中筛选得到酸及胆盐耐受力较强，降胆固醇能力较强的JQI-7。JQI-7来源于农家自制酸奶。

对JQI-7抽提细菌总DNA，进行16s rDNA扩增，引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

跑胶回收，进行测序，根据16s DNA测序结果如SEQ ID NO：3所示。

用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，鉴定为戊糖片球菌，命名为JQI-7。

(3)菌落特征

JQI-7细胞革兰氏染色呈阳性，形态为球状。一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列，不运动，不产芽孢，无荚膜，过氧化氢酶实验阴性，是兼性厌氧的细菌。在MRS固体培养基上37℃培养18h，菌落直径为0.8～1.4mm，乳白色，有光泽，不透明，边缘整齐，扁平。(见图1,2)

(4)生化鉴定

对JQI-7进行API-50生化鉴定，鉴定方法参考API-50鉴定试剂盒中厂商(API 50CHL，法国生物梅里埃)配备的说明书。

用途及原理：API50CH采用50个生化试验用来对微生物的碳水化合物的代谢进行研究。API50CH试条由50个微量孔组成，用以研究碳水化合物及其衍生物底物的发酵。用API50CHL培养基接种试条，使底物水解，然后检测发酵试验。试条孵育过程中，试条上的小管内在厌氧环境下产酸，pH改变而使培养基中指示剂颜色变化，由此可观察到发酵作用。试条上第一孔中不含任何活性成分，以此作为阴性控制。结果见表1。

表1.：JQI-7API-50试剂盒检测结果(+表示阳性可利用此底物发酵，-表示阴性)

(5)细菌安全性

1)抗生素敏感性测试

采用微量稀释法检测JQI-7抗生素抗性。将测试抗菌药物作一系列2倍比稀释共12次并分别加入96孔板对应孔(Gentamicin,Kanamycin,Streptomycin,Tetracycline,Erythromycin,Clindamycin,Chloramphenicol,Amplicilin,起始浓度分别为256ug/ml，1024ug/ml，256ug/ml，64ug/ml，8ug/ml，16ug/ml，64ug/ml，16ug/ml)，然后对应孔加入适当稀释的试验菌液，经48h培养后观察，以抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)孔，即为试验菌株的敏感度。实验结果见表2，实验结果表明，抗生素MIC都在安全范围内。

并将菌株进行抽提质粒，未发现JQI-7携带任何质粒，表明其无基因水平转移可能性。

表2.：JQI-7对9种抗生素抗性测定结果

2)代谢物毒性检测

乳酸旋光性检测：使用爱尔兰Megazyme公司的D-/L-乳酸检测试剂盒进行检测。实验结果不产生D-乳酸。

硝酸盐还原酶活性检测：在无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到硝酸盐培养基中37℃培养5d后，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液各10滴， 观察实验结果。同时做空白实验。实验结果显示所有菌液均未变蓝，为阴性反应。

吲哚实验：无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中。37℃培养72h，加入吲哚试剂8～10滴，观察实验结果。同时做空白实验。实验结果未出现红色圆环，表明其代谢不产生吲哚。

氨基脱羧酶活性检测：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺(赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺)和二氧化碳，使培养基变碱性，滴加指示剂(溴甲酚紫)，呈黄色为阴性，呈紫色为阳性。实验结果显示

测定管呈黄色，为阴性。

3)细胞粘附能力的测定

将6孔板中的细胞单层培养物用不完全DMEM(不添加血清和双抗)液37℃恒温培养1h；将培养液吸出，用无菌PBS洗涤3次,将洗涤液吸干；取500μL10⁸cfu/mL的实验菌株与500μL不完全DMEM混匀后，加入到6孔培养板中，同时设无细胞仅有菌液的空白对照，37℃，恒温培养1.5h；取出培养板，将培养液吸干，用无菌PBS洗涤5次，吸干洗涤液；每孔加入10％甲醛,室温固定2h；吸干固定液，用无菌PBS洗涤3遍，吸干洗涤液，室温干燥；革兰氏染色后镜检，随机选取20个视野进行计数，并计算粘附指数：

粘附指数＝细菌/细胞数(即平均每个细胞粘附的细菌个数)

菌株随机选取20个视野，对视野中的细胞上粘附的细菌的总数和细胞数进行计数并测定粘附指数，实验结果JQI-7对人结肠癌细胞系HT-29粘附指数为5.4，与对照干酪乳杆菌334菌株相当，具有一定的细胞粘附能力。

实施例2：戊糖片球菌JQI-7降胆固醇体外功能验证试验

按照以下步骤检测菌株体外胆固醇去除率，具体如下：

将供试菌株转接于MRS液体培养基中，于37℃培养24h，以1％的接种量传代2次后，于37℃培养15h，待用。配制液体MRS培养基，灭菌待用；

配制含有胆固醇的MRS培养基(培养液MRSO-CHOL)：由MRS液体培养基、巯基乙酸钠、胆盐和胆固醇组成，其中，巯基乙酸钠在培养液MRSO-CHOL中的浓度为2g/L，胆盐在培养液MRSO-CHOL中的浓度为0.3％，胆固醇的浓度为120ug/ml。

实验组：活化菌液按1％接种量接种于10ml培养液MRSO-CHOL中。

对照组：10ml没有接种菌株的培养液MRSO-CHOL。

将这两组样品放置于37℃恒温培养箱培养24h后，取出摇匀，4000r/m离心15min，取上清液，用邻苯二甲醛显色剂测定上清中胆固醇含量，并计算胆固醇的去除率，其中，胆固醇去除率＝对照组胆固醇与实验组胆固醇的差值/对照组胆固醇含量。

实验结果见图3，戊糖片球菌JQI-7降胆固醇降低率为68.76％，表明戊糖片球菌JQI-7有较强体外降低胆固醇能力。

实施例3：戊糖片球菌JQI-7体外耐酸、耐胆汁试验

配制模拟胃液SGF(2.0g NaCl+3.2g胃蛋白酶(pepsin)+适量浓盐酸调PH值3.0)，用0.2μm微孔滤膜过滤后待用。挑取斜面菌种于MRS液体培养基中，37℃培养16～18h。将菌悬液4000r/min离心15min，去上清，称量菌体湿重，按照0.1g/ml的比列重新悬浮菌体于生理盐水中，在按照1：10的比列加入到SGF液中，充分混匀后置于37℃恒温培养箱中培养2h，进行细胞计数。实验结果见图4，活菌数保持在一个数量级，表明戊糖片球菌JQI-7体外有较强的耐酸能力。

将活化两次的菌液按1％量接入灭菌的含有0.3％胆盐的10mL MRS液体培养基中培养并进行生长曲线测定，实验结果见图5，表明戊糖片球菌JQI-7体外有较强的抗胆汁能力。

实施例4：戊糖片球菌JQI-7的体内有效性研究(动物实验)

1实验菌株的制备：

将活化两次的菌株接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18h，6000r/m离心10min，用灭菌生理盐水洗涤后收集菌体。然后，加入0.85％生理盐水，调整菌数约1.0×10⁹CFU/ml，然后将活菌按每日使用量分装于15ml离心管(服用剂量为每天2ml/只，每组10只，共4组，需灌胃28天。

2实验动物分组及饲养方式：

Sprague-Dawley系5周龄雄性大鼠，自由饲喂至第28天，平均分为4组，每组10只：

JQI-7组：灌胃活菌悬液，饲喂高脂饲料；

模型组：灌胃0.85％生理盐水，饲喂高脂饲料；

正常组：灌胃0.85％生理盐水，饲喂标准饲料；

血脂康组：灌胃标准剂量血脂康，饲喂高脂饲料。

每天每只2ml灌胃，持续28天，然后停止灌胃，各组饲料、水不变持续28天。

3样品采集与分析测试：

正式试验前、第28天以及时间段进行采血。采血方法为绝食一夜后，于大鼠股静脉采血，凝血后4000r/m离心10min分离血清，利用试剂盒(试剂盒名称：总胆固醇测定试剂盒，公司：浙江东瓯诊断产品有限公司)和)和变色酸显色法，酶标仪(公司：Molecular Devices，型号：Spectra MAX190)分别检测胆固醇及甘油三酯。

4实验结果

见图6,7。用含JQI-7菌株菌悬液喂养高脂小鼠28天后股静脉抽血检测，发现与对照相比小鼠血液中甘油三酯及胆固醇分别下降23.8％及32.5％，表明戊糖片球菌JQI-7在小鼠体内确有降低胆固醇及甘油三酯功效。

实施例5：药物及食品的制备

(1)戊糖片球菌片剂：

配方：戊糖片球菌JQI-7的乳酸菌冻干粉(采用冻干机将乳酸菌配制成的菌悬液在无菌环境下冷冻成固态，抽真空将水分升华干燥而成的粉状固体状态)、膳食纤维、山梨糖醇、微晶纤维素、硬脂酸镁。将其混合均匀后，压片制成片剂。

(2)戊糖片球菌发酵酸豆乳：

将豆粉和水进行混合，均质，以121℃超高温灭菌300s杀菌，冷却到42℃，接入活化好的发酵剂:保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌菌粉共0.4％。在42℃下发酵10h，冷却后加入无糖片球菌JQI-7，凝乳，灌装即可。

(3)以上药品及食品的药效试验

试验方案：同实施例4，其中灌胃的样品改为以上三种药品及食品捣碎后加无菌水制成的悬液，调整菌数约,1.0×10⁹CFU/ml

用含JQI-7菌株的药品或食品喂养高脂小鼠28天后股静脉抽血检测，发现与对照相比小鼠血液中甘油三酯及胆固醇都有明显下降的情况，戊糖片球菌JQI-7在小鼠体内定植并发挥了作用，表明灌胃活菌在小鼠体内确有降低胆固醇及甘油三酯功效。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。