本发明涉及一种厌氧发酵的方法、发酵产物以及包含该产物的动物饲料。利用了生物技术改进发酵产品的饲用价值，属于饲料生产领域。
背景技术：
我国是世界上最大的养殖生产国之一，同时也是世界上饲料原料，特别是蛋白质原料的需求大国，我国饲料工业生产中蛋白质饲料资源严重不足，鱼粉、肉骨粉以及血浆蛋白粉等高品质动物蛋白原料主要依赖国际进口，而动物性蛋白原料也面临资源匮乏和饲料产品的安全性问题。
豆粕，又称“大豆粕”，是大豆提取豆油后得到的一种副产品，其蛋白质含量高达43-48％。按照提取的方法不同，可以分为一浸豆粕和二浸豆粕两种，同时由于一浸豆粕的蛋白质的含量更高，因此，其用途更广。同时，豆粕作为一种质量稳定的植物蛋白原料，成为一种取代动物蛋白的优质植物蛋白资源。我国有着丰富的豆粕资源，价格便宜，在中国豆粕年产约1000万吨。
但由于豆粕中的抗营养因子如抗原蛋白、植酸、脲酶等的存在，尤其是胰蛋白酶抑制因子，它能阻碍猪体内胰蛋白酶对豆类蛋白的消化吸收造成腹泻，影响生长，适口性差，难于消化，饲料利用率低等，严重限制了豆粕的应用范围和应用价值。目前，应用发酵技术处理豆粕，可有效降解豆粕中抗营养因子，提高其营养价值。
发酵指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。豆类植物原料的发酵过程通常可以分为有氧发酵以及无氧发酵两种，发酵豆粕的制备包括厌氧发酵和好氧发酵，由于耗氧发酵耗能大产能低等缺点，将逐渐被淘汰。
通常的厌氧发酵，利用蛋白酶对豆粕的大分子蛋白进行降解，而得到小 分子的肽，因为发酵豆粕的生产需要控制成本，所以蛋白酶的添加需控制在合理的范围内，这就需要延长发酵时间以使酶有足够的作用时间来降解大分子蛋白，故厌氧发酵生产发酵豆粕需要72h左右，或者时间更长。
文献[1]中公开了一种利用微生物发酵生产高蛋白豆粕的方法，以豆粕为主要原料，辅以玉米和麦麸，粉碎混合后接入酿酒酵母和枯草芽孢杆菌进行固态发酵。该发酵过程使用混合菌类之间的协同作用，但增加了不同菌液培养和混合工序。
文献[2]公开了一种发酵豆粕的生产工艺：经过粉碎过35目筛的豆粕与经过粉碎过30目筛的甘草、野菊花、银杏叶和青皮混合后，与发酵菌液按照一定的比例混合，混合后于发酵罐中密封发酵66-72h。其发酵工艺的原料、菌液的组成和制备工艺复杂，且发酵时间长。
文献[3]公开了菌酶协同作用发酵豆粕用于取代鱼粉，其中发酵豆粕的生产工艺为：使用菌株和菠萝蛋白酶菌酶协同作用进行发酵豆粕的生产。
文献[4]公开了一种分解特定β-伴大豆球蛋白成分的方法，其使用正己烷为提取溶剂预先提取获得低变性脱脂大豆。
文献[5]公开了一种水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺，使用乙醇和正己烷进行油脂萃取。
以上文献[1]-[3]中豆粕发酵过程工艺较为复杂，或者对于发酵时间的缩短也不能说是充分。对于文献[4]和[5]，过程中使用了大量的正己烷作为有机溶剂提取相关组分，且正己烷并没有参与发酵过程。
文献[6]公开了利用发酵性丝孢酵母制备脂肪酶，对脂肪酶的部分发酵条件和性质，以及同源蛋白酶对脂肪酶合成的影响进行研究，以提高脂肪酶的生成能力和催化活性，研究结果表明，正己烷对脂肪酶具有明显的激活作用，但完全抑制蛋白酶。
参考文献
文献[1]：cn101692867b
文献[2]：cn103385360a
文献[3]：livestockscience163(2014)94-101
文献[4]：cn1183915a
文献[5]：cn101870915a
文献[6]：大连工业大学硕士论文，2012，发酵性丝孢酵母脂肪酶与蛋白酶发酵及性质的比较
可见，目前对于源自于豆类植物原料的发酵，其工艺控制的节省，发酵时间的缩短并不能说是充分的。
技术实现要素：
发明要解决的问题
鉴于以上的技术问题，本发明的目的在于提供一种厌氧发酵的方法，对源自于植物粕类，特别是豆粕的原料进行发酵，简化目前的发酵工艺，并有效地缩短发酵工艺的时间，有效降低植物粕类原料中的抗营养因子，提高其营养价值。
进一步，本发明提供一种经较短时间发酵后所得到的发酵植物粕类产品，特别是通过本发明的发酵方法得到的发酵豆粕产品。
继而，本发明也提供一种包含本发明发酵植物粕类，特别是发酵豆粕的动物饲料，特别是适用于幼小动物的饲料产品。
用于解决问题的方案
如前所述，本领域中一般认为烃类化合物，尤其是正己烷，如文献[6]中所公开的那样，将会对蛋白酶的活性起到抑制作用。由于在植物粕类发酵时使用蛋白酶，因此，对于烃类化合物，特别是正己烷应当尽可能避免在发酵组分中出现或使用。
然而根据本发明的发明人研究，出人意料地发现了，如果在植物粕类的发酵过程中添加微量的烃类化合物，特别是正己烷，能够促进发酵的过程， 提高发酵的效率，从而节省发酵的时间，更加经济地获得所需高营养价值的发酵产品。更直接的说，经过本发明人的研究，意外地发现原本认为将阻碍发酵过程中蛋白酶活化的烃类化合物，在特定的用量范围以内，实际上能够促进发酵的进行。
具体而言，本发明以源自植物粕类作为发酵植物原料，尤其是以豆粕为发酵原料，通过将其与微量的烃类化合物，特别是正己烷，进行均匀混合，然后将得到的混合体系进行发酵处理，能够有效的缩短厌氧发酵的发酵时间。
更具体而言，本发明的技术方案为：
[1].一种厌氧发酵的方法，其特征在于，所述方法包括：a)形成包含发酵植物原料与烃类化合物的混合物的步骤，以及b)将包含发酵植物原料与烃类化合物的混合物的混合体系发酵的步骤，所述烃类化合物为c4-c8的烷烃。
[2].根据[1]所述的方法，其特征在于，所述发酵植物原料源自于粕类，优选源自豆粕，和/或烃类化合物为c5-c6的烷烃，特别优选正己烷。
[3].根据[1]或[2]所述的方法，其特征在于，所述a)步骤中的混合物还包括酶，所述酶的用量为发酵植物原料的至少100u/g，优选至少200u/g，特别优选至少300u/g，最优选至少400u/g。
[4].根据[3]所述的方法，其特征在于，所述a)步骤包括：(i)将发酵植物原料与酶进行混合的步骤以及再加入烃类化合物进行混合的步骤；或者，(ii)将发酵植物原料与烃类化合物进行混合的步骤以及再加入酶进行混合的步骤。
[5].根据[4]所述的方法，其特征在于，在所述(ii)步骤中，将发酵植物原料与烃类化合物进行混合后，进行加热处理，然后再加入酶，所述加热温度为40℃-65℃，优选为50℃-65℃，更优选为55℃-65℃，所述加热时间为5-20min，优选为10-15min。
[6].根据[1]-[5]任意一项所述的方法，其特征在于，所述烃类化合物的 用量为发酵植物原料的0.1-0.8重量‰，优选0.1-0.4重量‰，更优选0.2-0.3重量‰。
[7].根据[1]-[6]任意一项所述的方法，其特征在于，所述b)步骤之前还包括向a)步骤所得到的混合物加入水的步骤，所述水的用量为发酵植物原料的至少10重量％，优选为25重量％，特别优选为至少30重量％。
[8].根据[1]-[7]任意一项所述的方法，其特征在于，所述b)步骤中所述发酵的温度为20℃-60℃，优选为30℃-55℃，和/或所述发酵的时间为18-72h，优选为24-60h，更优选为40-50h。
[9].根据[1]-[8]中任意一项所述的方法，其特征在于，还包括c)烘干的步骤以得到最终产物，所述烘干步骤在烘箱中进行，烘干温度为40℃-80℃，优选为45℃-75℃，烘干时间为2-10h，优选为3-8h。
此外，本发明通过以上厌氧发酵的方法，得到了发酵植物粕类产品，特别是发酵豆粕产品，以及以该产品为成分的动物饲料。
具体而言：
一种发酵豆粕，其特征在于使用根据[1]-[9]中任意一项所述的厌氧发酵的方法制备。
以及：
一种动物饲料，其特征在于包括以上所述的发酵豆粕。
附图说明
图1：正己烷含量与发酵产物中小肽含量的关系
具体实施方式
本发明所采用的为厌氧发酵的方式。对于厌氧发酵的设备没有限制，可以采用本领域通常使用的发酵罐进行发酵，发酵方式可以采用间歇发酵、半连续发酵、分隔半连续发酵或连续发酵等。
对于本发明所使用的植物粕类原料，没有特殊的限制。植物粕类的品种很多，可以为豆粕、菜粕、棉籽粕、米糠粕、花生粕、葵粕等。出于对营养价值的要求，一般优选为蛋白质含量较高的植物粕类，如大豆等。同时，从有利于蛋白质的分离角度来说，本发明的发酵原料优选豆粕，特别优选粉碎的豆粕。
对于豆粕的粉碎方式，可以采用本领域中通常的粉碎方法，例如，可以为机械粉碎或者超声波粉碎。对于粉粹程度，没有特别的限定，可以使块状，也可以是颗粒状，或者是粉末状。此外，出于提高发酵效率的考虑，优选颗粒状或粉末状的粉碎的豆粕。
对于本发明所使用的烃类化合物，优选为烷烃类化合物，更优选为c4-c8的烷烃，特别优选为c5-c6的烷烃，最优选为正己烷。对于其用量，相对于发酵植物原料或发酵粕类植物原料的量为微量，优选为0.1-0.8‰，更优选为0.1-0.4‰，特别优选为0.2-0.3‰。当正己烷的用量少于0.1‰时，其对于发酵的促进作用并不明显，如在48h小时内其对于抗原蛋白的分解并不能说是十分充分的。当正己烷的用量大于0.8‰时，一方面在规定的时间内其对于抗原蛋白的分解产生边界效应，即，单位正己烷对于小肽含量的增加量出现降低的趋势，另一方面，如果过度增加正己烷用量，可能会导致抑制蛋白酶的活性的情况的出现，同时由于过量正己烷的使用，也将无谓地增加生产成本，且不利于环境保护。
对于本发明所使用的酶，只要是催化蛋白质水解的酶类，就没有特别的限制，主要使用各种蛋白酶，蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、低聚糖、凝集素、植酸、脲酶等抗营养因子，发酵过程中通过微生物、酶及发酵产生的有机酸的作用，使得抗营养因子被降解或者钝化，从而得到破坏。豆粕发酵，无机氮的生物转化，蛋白质含量提高，且大部分蛋白已被降解为小肽，吸收速度快，消化率高，能提高饲料营养价值。
本发明使用的酶的量，以发酵植物原料或植物粕类原料计，为至少100u/g，优选为至少200u/g、至少300u/g、至少400u/g，特别优选为500u/g。对于本发明所使用的酶，可以为碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及酸性蛋白酶。
对于本发明的发酵植物原料或者植物粕类与烃类化合物、酶的混合方法，只要是能够充分混合本发明各组分，对于具体方法并没有特殊限制。但出于使得本领域技术人员能够更容易的获得本发明的发明效果的考虑。本发明优选采用分步混合的方式，即(i)先将植物粕类原料与酶进行混合均匀，然后再加入烃类化合物进行混合，或者(ii)先将植物粕类原料与烃类化合物进行混合均匀，然后再加入酶进行混合。对于混合的手段没有限制，可以使用本领域常规的共混设备，比如搅拌机等。以上优选的两种混合的方法的目的在于，使三种物质更加易于充分的混合。特别是，有效的避免了酶与正己烷过早的接触所引起的可能由于局部的浓度不均或者浓度梯度的产生，可能会导致在局部产生短时间内过量正己烷与酶的接触，使得酶活性得到抑制。进一步，发明人认为使用酶先与植物粕类原料接触是更为有利的，即，(i)中的混合方式是最为优选的方式，其原因可能是，(i)中酶直接与植物粕类原料接触，而(ii)中首先加入的烃类化合物可能存在于部分植物粕类的表面，从而使得酶与原料的接触需要一定时间。
此外，出于更好地提高发酵效率的考虑，在(ii)的混合方式中，先将豆类植物原料与正己烷进行混合后，对该体系进行加热处理。所述加热处理的方式没有限制，例如可以使用烘箱，加热温度优选为40℃-65℃，更优选为50℃-65℃，特别优选为55℃-65℃，最优选为60℃，加热时间为5-20min，优选为10-15min，更优选为10min。
对于本发明以上所得到的植物粕类原料与烃类化合物、酶的混合物，在发酵之前，优选加入一定量的水，水对于植物粕类原料中抗原蛋白的酶解起到促进作用。本发明中水的用量，为至少10％，优选至少25％，特别优选为至少30％，最优选为40％，基于发酵植物原料或植物粕类原料的重量。
对于本发明的发酵过程，优选在一定温度下进行，例如20℃-60℃，优 选为25℃-60℃，更优选为30℃-55℃，特别优选为40℃。所述发酵的时间，如前所述，就现有技术中的发酵时间而言，其基本上在72h以上才能较好的得到抗原蛋白充分降解的产品，而本发明技术方案能够促进发酵的过程，提高发酵的效率，从而节省发酵的时间。因此，本发明的发酵时间一般为18-72h即可，优选24-60h，更优选40-50h，出于综合考虑生产效率以及产品质量(营养价值)的考虑特别优选48小时。经本发明发明人的发现，当微量烃类化合物存在的情况下，低于18h，抗氧蛋白的降解程度，或者小肽的获得量不能说是充分的，同时，当发酵时间超过72h时，再继续延长发酵时间也不能明显的提高产品中小肽的含量，从经济以及效率上考虑也是不优选的。特别说明的而是，本发明的发酵过程在微量烃类化合物的存在下，其40-50h或48h的发酵产品的发酵程度实际上已经达到或超过传统发酵手段发酵72小时的程度。
对于发酵产品，优选进行烘干处理，并粉碎过筛。所述烘干处理优选在烘箱中进行，烘干温度为40℃-80℃，优选为45℃-75℃，更优选为50℃-70℃，特别优选为55℃-65℃。所述烘干的时间为2-10h,优选为3-8h，更优选为4-7h。对于粉碎过筛处理，可以使用40-80目筛，优选为50-70目筛，更优选为55-65目筛。
更加具体而言，本发明的技术方案可以为：
①发酵原料的预混合的步骤；
②按照一定的比例加水在①混合好的混合物中，再次混合均匀；
③将②中混合好的样品，放于恒温培养箱中进行发酵；
④取出③中培养好的样品，烘箱中烘焙；
⑤将④中烘干后样品粉碎过筛，待检测。
所述①的步骤包括；
(ⅰ)称取一定量的商品豆粕；
(ⅱ)将酶按一定的酶活单位与豆粕进行混合；
(ⅲ)取适量正己烷加入到(ⅱ)中混合好的样品中，再次混合均匀。
或者
(ⅰ’)称取一定量的商品豆粕，按照一定的比例添加正己烷，在烘箱中烘干若干分钟后，按照一定的酶活单位添加酶，并混合均匀。
本发明通过以上方法得到植物粕类为原料的发酵产物，这些产品由于其中的抗原蛋白被快速、充分的降解为小分子肽，其口感和营养价值均较好。适合作为动物饲料，特别是幼小动物养殖用饲料。
发明的效果
如前所述，厌氧发酵中蛋白酶的添加需控制在合理的范围内，在一定条件下，这需延长发酵时间以便酶有足够的时间降解大分子蛋白，故厌氧发酵生产发酵粕类植物一般需要72h或者更长时间，本发明在厌氧发酵过程中添加一定量的烃类化合物，尤其是正己烷，可有效缩短发酵时间。发酵豆粕品质的优劣、营养价值的高低，除粗蛋白指标外，小肽含量也是业内人士普遍关注的重要指标，肽含量与酸溶蛋白质含量是正相关，所以在发酵豆粕中可使用酸溶蛋白质含量评价发酵豆粕品质，既可以反映豆粕中抗原蛋白和其它抗营养因子蛋白被水解的程度，同时又可一定程度上反映肽含量。
具体的说本发明的技术方案相对于现有技术具有如下优异的效果：
发酵工艺简单、有效的缩短了厌氧发酵的时间，从而更加经济、高效的获得了发酵产品。此外，通过本发明发酵方法的到的动物饲料也具有较高的营养价值，特别适用于幼小动物的饲养。
实施例
以下本发明具体的实施例，能够对本发明进行更为详细的说明，但本发明不应受到以下具体实施例的限制。
发酵豆粕品质的优劣、营养价值的高低，除粗蛋白指标外，小肽含量也是业内人士普遍关注的重要指标，肽含量与酸溶蛋白质含量是正相关，所以 在发酵豆粕中可使用酸溶蛋白质含量评价发酵豆粕品质，既可以反映豆粕中抗原蛋白和其它抗营养因子蛋白被水解的程度，同时又可一定程度上反映肽含量。实施例中用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1
不同添加量的正己烷对发酵豆粕的影响
取50g商品豆粕放于自封袋中，按照500u/g豆粕添加蛋白酶，混合均匀，加入一定量的正己烷，混合均匀后加水23g，再次混合均匀，将混合好的样品放于40℃恒温培养中培养48h后，于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白的检测。其中酸溶蛋白含量检测采用三氯乙酸(tca)法(gb/t22492-2008)。
表1实施例1试验结果
通过表1，可以看出，使用微量的正己烷参与发酵过程，能够在更短的时间内，即48小时，使得发酵产品中小肽含量超过与传统方法(即正己烷用量为0‰的情况)经48小时发酵后小肽含量的水平。印证了微量的正己烷的使用提高了厌氧发酵的效率。
此外，随着正己烷在一定范围内用量的增加，在48小时内，其小肽含量出现峰值，如正己烷含量为豆粕的0.2‰时，经48小时发酵，小肽含量出现峰 值为8.69％。
实施例2
发酵时间对发酵豆粕品质的影响
取50g商品豆粕放于自封袋中，按照500u/g豆粕添加蛋白酶，混合均匀，加入豆粕重量0‰或0.2‰的正己烷，混合均匀后加水23g，再次混合均匀，将混合好的样品放于40℃恒温培养箱中培养48h、72h后，于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白的检测。其中酸溶蛋白含量检测采用三氯乙酸(tca)法(gb/t22492-2008)。
表2实施例2试验结果
根据表2所得到的实验数据，可以看出，当采用0.2‰的正己烷参与发酵反应时，除了在发酵时间48h时发酵效果已经超过传统发酵方式48h的发酵效果外，其48h小时的发酵效果亦接近于传统发酵方式72h的发酵效果；且72h的发酵效果已经明显超过传统发酵方式72h的发酵效果。
实施例3
不同处理方式对发酵豆粕品质的影响
取50g商品豆粕于自封袋中，按照500u/g豆粕添加蛋白酶混合均匀后，加水23g，第二次混合均匀后封口，此样品为空白样；或取50g商品豆粕于自封袋中，按照重量比加入0.2‰的正己烷，混合均匀，混合物后放于60℃烘箱烘10min或不进行此步骤(对应下表3中的“不烘”)，而后按照500u/g豆粕添加蛋白酶混合均匀，加水23g混合均匀，将混合好的样品放于40℃恒温培养 中培养24h后于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白的检测。其中酸溶蛋白含量检测采用三氯乙酸(tca)法(gb/t22492-2008)。
表3实施例3试验结果
通过表3中数据可以看出，总体上，在分步混合发酵原料时，实施例3中使用正己烷时的发酵效果好于不使用正己烷时的发酵效果。
此外，将实施例3与实施例1和2进行比较，可以看出，实施例3中(先混合豆粕和正己烷，再加入酶)的混合方式与实施例1和2中(先混合豆粕和酶，再加入正己烷)的混合方式相比，在48h的发酵时间内，实施例1和2的发酵效果更优良。
产业上的可利用性
本发明的厌氧发酵方法，可以在工业生产中进行实施，具有工业实用性。