假单胞菌中新型重组系统及其应用的制作方法

文档序号：12816873阅读：495来源：国知局

本发明涉及一种革兰氏阴性杆菌中的重组系统及其构建与应用，尤其一种假单胞菌(铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌或/和恶臭假单胞菌)中的重组系统及其构建与应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术：

噬菌体编码的重组系统在修饰原核基因组和构建真核转基因物种时，能够有非常广泛的应用。它仅仅需要35个核苷酸作为同源臂，应用主要包括构建突变体-点突变、删除、插入和替换。较短的同源臂是这个技术的主要优势，这种技术被命名为重组工程。

在大肠杆菌中，应用最广泛的重组系统是λred系统和racrecet系统。λred系统利用来自于λ噬菌体的red操纵子(redα，redβ和redγ)来介导线状和环状dna分子进行同源重组。racrecet系统利用rac前噬菌体的rece和rect蛋白在大肠杆菌中介导两个线状dna分子发生同源重组。redα和rece是5’-3’双链dna核酸外切酶，redβ和rect是单链退火蛋白。文献报道redα/redβ和rece/rect通过蛋白-蛋白相互作用来促进双链dna的同源重组。

redγ可以抑制recbcd的外切酶活性，recbcd是一个多功能酶复合物，它能加工处理由双链断裂产生的dna末端。redγ可以形成一个二聚体的dna类似物，与recbcd系统中核酸外切酶和解旋酶相互并且抑制这些酶的活性。文献报道在rece/rect或者redα/redβ系统中加入redγ可以提高dna重组效率。来自发光杆菌(photorhabdusluminescens)的pluγ也可以模仿双螺旋dna的形状和构造，抑制宿主体内核酸外切酶复合体plu0632/plu0630/plu0633，从而在体内能够有效的提高同源重组的效率。

类似λred系统和racrecet系统的构建，在其它细菌的噬菌体或者原噬菌体基因组中搜寻并克隆含有核酸外切酶和单链退火蛋白的操纵子，在这个操纵子中插入能够提高重组效率的redγ或者pluγ蛋白基因，构建成一个完整的dna重组系统，在大肠杆菌中构建完成后把这套重组系统通过电击转化或者接合转移导入操纵子来源的宿主进行遗传修饰。许多文献报道通过使用噬菌体重组功能操纵子构建的重组系统，例如发光杆菌、致病杆菌(xenorhabdus)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、梭菌(clostridium)、丁香假单胞菌(p.syringae)、结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)等等，但是宿主专一性导致这些重组系统的应用范围很窄。

假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，需氧条件生长，属于假单胞菌科，研究最多的几种假单胞菌是人类条件致病菌铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，植物条件致病菌丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)，植物促生菌荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)，还有在生物修复和生物防治过程中经常使用的恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)。传统的基因操作技术是通过限制性内切酶、dna连接酶与pcr扩增等技术在体外实现目的基因的插入、敲除和点突变等修饰，但操作繁琐而且效率较低，由于限制性酶切位点的限制和操作繁琐和效率低下等缺点限制了对假单胞菌基因组的研究和改造。有关假单胞菌(铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌)中的重组系统及其构建与应用的研究及专利鲜见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种假单胞菌(铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌或/和恶臭假单胞菌)中的重组系统及其构建与应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

本发明所述的假单胞菌中新型重组系统由一系列同源重组系统表达质粒构成，其特征在于：所述表达质粒在可诱导启动子下，表达一个操纵子，该操纵子除包含宿主特异性核酸外切酶以及单链dna退火蛋白两个基因外，第三个基因是来源于大肠杆菌lambda噬菌体的redγ，或是来源于发光杆菌(photorhabdusluminescens)前噬菌体的pluγ(plu2934)，或是其它外源的核酸外切酶recbcd抑制蛋白；或者，该操纵子除包含宿主特异性核酸外切酶，单链dna退火蛋白以及外源或内源核酸外切酶recbcd抑制蛋白三个基因外，第四个基因是来源于细菌染色体的单链dna结合蛋白ssb，或是来源于细菌质粒上的ssb，或是来源于细菌噬菌体的ssb，或是来源于细菌前噬菌体的ssb。

上述假单胞菌中新型重组系统中，进一步优化的技术方案是：所述重组系统中的系列同源重组系统表达质粒包括pbbr1复制起点、卡那霉素抗性基因和鼠李糖诱导型启动子的重组系统；其命名分别是pbbr1-rha-red_gba-kan，核苷酸序列如seqidno.23所示；pbbr1-rha-plu_gba-kan，核苷酸序列如seqidno.24所示；pbbr1-rha-tepsy-kan，核苷酸序列如seqidno.25所示；pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，核苷酸序列如seqidno.26所示；pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，核苷酸序列如seqidno.27所示；pbbr1-rha-bas-kan，核苷酸序列如seqidno.28所示；pbbr1-rha-plugam-bas-kan，核苷酸序列如seqidno.29所示；pbbr1-rha-redgam-bas-kan，核苷酸序列如seqidno.30所示；其中，rectepsy是来源于丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)的前噬菌体中的rectepsy，b是单链dna退火蛋白或称为重组酶，a是5’－3’双链dna核酸外切酶，s是来源于铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)噬菌体vb_paep_tr60_ab31的单链dna结合蛋白(ssb)，redγ是来源于lambda噬菌体的大肠杆菌核酸外切酶recbcd的抑制蛋白，pluγ是来源于发光杆菌(photorhabdusluminescens)前噬菌体的核酸外切酶recbcd的抑制蛋白。

上述假单胞菌中新型重组系统中，最优化的技术方案是：所述重组系统中的系列同源重组系统表达质粒是：pbbr1-rha-bas-kan，pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-bas-kan或pbbr1-rha-plugam-bas-kan。

上述假单胞菌中新型重组系统中，所述假单胞菌优选是铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌或/和恶臭假单胞菌。

本发明所述假单胞菌中新型重组系统在假单胞菌属不同种中介导短同源臂和长同源臂之间的同源重组进行基因组dna或质粒遗传修饰中的应用。其中，所述短同源臂是指50bp-150bp的同源臂，所述长同源臂是指大于150bp的同源臂。

各种菌株中最佳的重组系统是不同的，最佳的重组条件也不相同，进行条件优化例如感受态细胞制备方法优化，dna转化量优化，抗生素选择浓度优化，同源臂长度优化等可以提高重组效率，进一步利用不同菌株最佳的重组系统进行高效的基因修饰。

上述介导短同源臂和长同源臂之间的同源重组进行基因组dna或质粒遗传修饰时，在铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)中优选pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒，在丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)中优选pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan质粒或pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒，在恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)中优选pbbr1-rha-bas-kan质粒，在荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)优选pbbr1-rha-bas-kan质粒或pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒。

本发明报道了一系列可以应用于假单胞菌的重组系统，尤其是在铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌中构建最佳的重组系统，这些重组系统是来自于铜绿假单胞菌噬菌体ab31和丁香假单胞菌原噬菌体的两个宿主特异性具有重组功能的操纵子。blast分析显示orf38，orf37和orf36分别是redβ，redα和单链dna结合蛋白(ssb)的同源蛋白。重组实验结果显示带有redγ/pluγ的杂合系统能够在一些假单胞菌中很好的工作，同时发现ssb蛋白可以显著提高重组效率。利用这些重组系统，我们成功的对假单胞菌进行了高效简洁的质粒修饰和点突变、插入删除的基因组修饰，应用前景广阔。

附图说明

图1：在假单胞菌中不同重组酶组合的重组效率比较。

(a)假单胞菌中线环重组的示意图。pcr产物是两端带有100bp的同源臂(蓝色)，中间为庆大霉素抗性基因(genta)，替换掉表达质粒中重组相关的基因形成新的质粒。

(b)铜绿假单胞菌在30℃条件下表达pbbr1-rha-red_gba-kan，pbbr1-rha-plu_gba-kan，pbbr1-rha-tepsy-kan，pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，pbbr1-rha-bas-kan，pbbr1-rha-plugam-bas-kan，pbbr1-rha-redgam-bas-kan进行线环重组效率比较的结果。

(c)铜绿假单胞菌在37℃条件下表达(b)中一系列重组系统进行线环重组效率比较的结果。

(d)荧光假单胞菌在30℃条件下表达(b)中一系列重组系统进行线环重组效率比较的结果。

(e)丁香假单胞菌在30℃条件下表达(b)中一系列重组系统进行线环重组效率比较的结果。

(f)恶臭假单胞菌在30℃条件下表达pbbr1-rha-red_gba-kan，pbbr1-rha-plu_gba-kan，pbbr1-rha-tepsy-kan，pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，pbbr1-rha-bas-kan，pbbr1-rha-plugam-bas-kan，pbbr1-rha-redgam-bas-kan进行线环重组效率比较的结果。

图2：假单胞菌电转条件的优化。

(a)、(b)、(c)和(d)是铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌和荧光假单胞菌的生长曲线。初始的菌液浓度od600是0.085。

(e)、(f)、(g)和(h)分别是铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌和荧光假单胞菌不同时间的转化效率。

图3：假单胞菌中重组时转化dna量和同源臂长度的优化。

铜绿假单胞菌携带pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan(a)，恶臭假单胞菌携带pbbr1-rha-bas-kan系统(b)，丁香假单胞菌携带pbbr1-rha-bas-kan(c)，荧光假单胞菌携带pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan(d)中转化不同浓度dna对重组效率的影响。

铜绿假单胞菌携带pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan(e)，恶臭假单胞菌携带pbbr1-rha-bas-kan(f)，丁香假单胞菌携带pbbr1-rha-bas-kan(g)，荧光假单胞菌携带pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan(h)中转化不同长度同源臂的pcr产物对重组效率的影响。

图4：在铜绿假单胞菌中通过同源重组进行基因组修饰后的菌落pcr鉴定。

(a)铜绿假单胞菌中基因组修饰的示意图和菌落pcr的示意图。

(b)通过插入庆大霉素筛选标记来敲除phnab基因，克隆1和2都是正确的。

(c)在敲除phnab基因后使用cre酶的位点特异性重组删除庆大霉素抗性筛选标记，六个克隆都是正确的。

(d)通过插入庆大霉素筛选标记来敲除lasb基因，克隆1和2都是正确的。

(e)在敲除lasb基因后使用cre酶的位点特异性重组删除庆大霉素抗性筛选标记，克隆都是正确的。

(f)通过插入庆大霉素筛选标记来敲除mdoh基因，克隆是正确的。

(g)在敲除mdoh基因后使用cre酶的位点特异性重组删除庆大霉素抗性筛选标记，四个克隆都是正确的。

图5：在铜绿假单胞菌中使用新型重组系统进行点突变。

(a)在铜绿假单胞菌中进行点突变的示意图和菌落pcr鉴定的示意图。

(b)在toxa靶位点插入sacb-庆大霉素组件，泳道c是野生型菌株作为阴性对照，泳道m是takaradl5000，泳道1和2是重组子，克隆1和2都是正确的。

(c)通过单链核苷酸配对插入点突变，三个克隆都是正确的。

(d)突变体的测序验证。

图6：sacb的功能验证，在含有10％蔗糖的lb(左边平板)和lb(右边平板)。

1.铜绿假单胞菌的野生型菌株；2-8.pao1插入sacb-庆大霉素组件后的不同突变克隆。

图7：在丁香假单胞菌和荧光假单胞菌中进行基因修饰后的菌落pcr验证。pcr产物跨过完整的插入片段。

(a)在丁香假单胞菌预测的生物合成基因前插入启动子(pgenta)。

(b)对荧光假单胞菌pf5的rets基因进行敲除，泳道1是插入庆大霉素-sacb组件(pf5-δrets-genta-loxm)，泳道2,3是利用cre酶进行位点特异性重组后的最终突变菌株(pf5-δrets)。

图8：ssb对pbbr1-rha-ba-kan和pbbr1-rha-redgam-ba-kan系统重组功能的影响。

在大肠杆菌(a)，在铜绿假单胞菌(b)和在丁香假单胞菌(c)中研究ssb对pbbr1-rha-ba-kan和pbbr1-rha-redgam-ba-kan重组功能的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。

试剂与仪器：

本实施例中试剂主要为分子生物学实验试剂，单链核苷酸是从上海生工生物技术有限公司合成，限制性内切酶、dna聚合酶和dna标记来自新英格兰生物公司(newenglandbiolabs)，抗生素从英杰公司(invitrogen)购买。

进行重组的电转化细胞的制备：

各种表达质粒要分别转化到大肠杆菌gb05购于德国genebridges公司、铜绿假单胞菌pao1购于德国dsmz(保藏号：dsm1707)、荧光假单胞菌pf5购于美国美国典型培养物保藏中心atcc(保藏号：baa-477^tm)、丁香假单胞菌dc3000购于美国美国典型培养物保藏中心atcc(保藏号：baa-871^tm)、恶臭假单胞菌kt2440购于德国dsmz(保藏号：dsm6125)。大肠杆菌感受态细胞按照之前文献报道流程进行制备。铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、恶臭假单胞菌，带有表达质粒的菌株首先进行过夜培养，然后稀释到1.3ml的lb培养基(丁香假单胞菌在kb培养基培养)中，初始的od600的值大约是0.085。根据每株菌最适的生长温度进行培养，950rpm培养到对数期开始，然后加入诱导剂l-鼠李糖至终浓度为2.5gl^-1，细胞在30℃或37℃温度下950rpm培养40分钟。进行感受态细胞制备时，先将菌液9500rpm室温离心30秒，弃掉上清液，加入1ml的ddh2o进行重悬并离心，重复此步骤一次。下一步将细胞重悬在30μlddh2o中并加入dna，进行质粒修饰时加入1500ngpcr产物，对于铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌和恶臭假单胞菌进行基因组修饰时加入2.5μgpcr产物。电转杯使用1mm的规格，电转化仪(eppendorf2510electroporator)电压设定为1250v。电转完成后将细胞在30℃复苏100分钟或者是37℃复苏60分钟，最后涂布在适当抗生素浓度的上，铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌第二天再平板上可以计数，丁香假单胞菌需要第三或四天可以计数。

实施例1：构建一系列同源重组表达质粒

以λbeta或者racrect的氨基酸序列作为参考，blast分析来自假单胞菌和假单胞菌噬菌体的基因组，寻找潜在的具有重组功能的蛋白。从假单胞菌和假单胞菌噬菌体中发现了两个包含成对核酸外切酶-重组酶的操纵子，一个操纵子是来自丁香假单胞菌的rectepsy，这个操纵子已经成功用于构建重组系统；第二个操纵子来自于假单胞菌噬菌体vb_paep_tr60_ab31，这个操纵子编码三个蛋白:orf38(b)含有177个氨基酸，序列与redβ有62％的同源性；orf37(a)含有195个氨基酸，序列与redα有32％的同源性；orf36(s)含有148个氨基酸，序列与大肠杆菌的单链dna结合蛋白ssb有54％的同源性。

一系列重组功能质粒以广宿主的复制子pbbr1为基础进行构建，重组功能蛋白利用鼠李糖启动子进行诱导表达。

pbbr1-rha-red_gba-kan质粒的构建方法：从大肠杆菌中提取pbbr1-rha-gfp-kan质粒，取40ul质粒用ndei酶切3h，琼脂糖凝胶电泳90v进行跑胶，直至片段跑至凝胶底部后进行线性载体的凝胶回收，以psc101-bad-gba-tet质粒为模板，gba-3/gba-5为引物扩增red_gba片段，将gb-dir细菌过夜培养并30℃转接1.3ml培养2h，加入20ul阿拉伯糖诱导剂37℃诱导40min，将pbbr1-rha-kan线性载体与red_gba片段1350v电击共转化入诱导的gb05-dir中，37℃复苏1h，10000rpm离心菌体并划线涂布至卡那霉素15的抗性平板，37℃过夜培养并挑单克隆进行鉴定，正确的克隆进行菌保。

其它质粒的构建方法类似：pbbr1-rha-plu_gba-kan质粒由pbbr1-rha-kan线性载体与plu_gba片段电击共转化入gb05-dir中，阿拉伯糖诱导进行线线重组得到；pbbr1-rha-tepsy-kan质粒由pbbr1-rha-kan线性载体与tepsy片段电击共转化入gb05-dir中，阿拉伯糖诱导进行线线重组得到；pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒由pbbr1-rha-tepsy-kan线性载体与plugam片段电击共转化入gb05-dir中，阿拉伯糖诱导进行线线重组得到；pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan质粒由pbbr1-rha-tepsy-kan线性载体与redgam片段电击共转化入gb05-dir中，阿拉伯糖诱导进行线线重组得到；pbbr1-rha-bas-kan质粒由pbbr1-rha-kan线性载体与bas片段电击共转化入gb05-dir中，阿拉伯糖诱导进行线线重组得到；pbbr1-rha-plugam-bas-kan质粒由pbbr1-rha-bas-kan线性载体与plugam片段电击共转化入gb05-dir中，阿拉伯糖诱导进行线线重组得到；pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒由pbbr1-rha-bas-kan线性载体与redgam片段电击共转化入gb05-dir中，阿拉伯糖诱导进行线线重组得到。

在宿主特异性核酸外切酶以及单链dna退火蛋白两个基因外，或者在宿主特异性核酸外切酶，单链dna退火蛋白以及外源或内源核酸外切酶recbcd抑制蛋白三个基因外，第三个基因或者第四个基因也可以是来源于细菌染色体的单链dna结合蛋白ssb，或者来源于细菌质粒上的ssb，或者来源于细菌噬菌体的ssb，或者来源于细菌前噬菌体的ssb。

实施例2：假单胞菌中不同重组系统的效率比较

将pbbr1-rha-red_gba-kan，pbbr1-rha-plu_gba-kan，pbbr1-rha-tepsy-kan，pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，pbbr1-rha-bas-kan，pbbr1-rha-plugam-bas-kan，pbbr1-rha-redgam-bas-kan通过电击转化导入到四种假单胞菌(铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌)。图1a是重组系统效率比较的示意图。铜绿假单胞菌在37℃和30℃都有良好的生长状况，因此需要在这两种温度下进行效率比较。铜绿假单胞菌本身具有多种抗药性并且很容易获得更强的耐药机制，所以在铜绿假单胞菌中进行重组效率比较之后要计算正确率。

在铜绿假单胞菌中，redγ和pluγ蛋白加入到bas重组系统中能够显著提高同源重组的正确率，但是对于pbbr1-rha-tepsy-kan质粒，只有在30℃培养下加入pluγ蛋白才会提高正确率(图1b)。在37℃培养时，pbbr1-rha-bas-kan质粒可以工作，加入redγ蛋白后可以显著提高基因重组的正确率(图1c)。因此我们在铜绿假单胞菌中进行遗传修饰时，30℃条件下使用pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒，37℃条件下使用pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒。与铜绿假单胞菌的情况相似，在荧光假单胞菌中把redγ和pluγ蛋白加到pbbr1-rha-tepsy-kan和pbbr1-rha-bas-kan质粒上时，也可以显著提高重组效率(图1d)。然而在丁香假单胞菌和恶臭假单胞菌中，把redγ和pluγ蛋白加入到pbbr1-rha-bas-kan质粒上时会降低重组效率(图1e，1f)。

最终确定假单胞菌(铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌)中高效率的重组表达质粒为pbbr1-rha-bas-kan质粒、pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan质粒、pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒、pbbr1-rha-plugam-bas-kan质粒和pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒。其中s是来源于噬菌体vb_paep_tr60_ab31的单链dna结合蛋白(ssb)，redγ是来源于lambda噬菌体的大肠杆菌核酸外切酶recbcd的抑制蛋白，pluγ是来源于发光杆菌(photorhabdusluminescens)前噬菌体的核酸外切酶recbcd的抑制蛋白。

实施例3：假单胞菌中重组系统工作条件的优化从而提高重组效率

根据实施例2所述，每种假单胞菌的最佳重组系统不同，这几种重组系统在不同的假单胞菌中，在感受态细胞制备方法优化，dna转化量优化，抗生素选择浓度优化，同源臂长度优化的基础之上，可以提高重组效率。

外源dna电击转化进入细胞的能力与dna分子发生同源重组的效率有很大关系，外源dna电击转化进入细胞的最佳时期是指数生长期。本发明测定了铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌和荧光假单胞菌的生长曲线(图2abcd)。数据显示铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌和荧光假单胞菌的指数生长期分别开始于2h，2h，3h和1h。根据测定的生长曲线，可以分析转化的最佳时间。结果显示铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌和荧光假单胞菌最佳的转化时间分别是2.5h，2.5h，4h和1.5h(图2efgh)。

本发明同时检测转化dna的浓度是否会影响基因重组效率。铜绿假单胞菌携带pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒，恶臭假单胞菌携带pbbr1-rha-bas-kan质粒，丁香假单胞菌携带pbbr1-rha-bas-kan质粒，荧光假单胞菌携带pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan质粒，分别转化定量同体积的pcr产物(庆大霉素抗性基因)，其中dna量是100ng，250ng，500ng，1000ng，1500ng和2000ng的梯度，然后统计重组效率。通过这个梯度dna浓度的检测显示假单胞菌进行重组时的饱和dna量是1500ng(图3abcd)。

本发明还研究了同源臂长度对同源重组效率的影响。铜绿假单胞菌携带pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒，恶臭假单胞菌携带pbbr1-rha-bas-kan质粒，丁香假单胞菌携带pbbr1-rha-bas-kan质粒，荧光假单胞菌携带pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan质粒分别电击转入不同长度同源臂的pcr产物(庆大霉素抗性基因)。在铜绿假单胞菌中可以归结为两种类型，一种类型是同源臂长度小于50bp，基本没有重组功能(图3e)；第二种类型是同源臂长度从75bp到150bp，在这个长度范围内，重组效率有显著提高(图3e)。对于恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌和荧光假单胞菌最短的同源臂长度分别是75bp(图3f)，50bp(图3g)，100bp(图3h)。

实施例4：在不同的假单胞菌中利用各自最佳的新型重组系统进行基因组的遗传修饰

本发明已经成功建立了不同假单胞菌的最佳重组系统并对这一系列的重组系统的工作条件进行了优化，下一步利用这一系列最佳的重组系统对不同假单胞菌进行基因组的遗传修饰。在假单胞菌属不同种中介导短同源臂(50bp-150bp)和长同源臂(大于150bp)之间的同源重组，进行基因组dna遗传修饰。在铜绿假单胞菌中优选pbbr1-rha-plugam-bas-kan质粒，在丁香假单胞菌中优选pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan质粒或pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒，在恶臭假单胞菌中优选pbbr1-rha-bas-kan质粒，在荧光假单胞菌优选pbbr1-rha-bas-kan质粒或pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒。

铜绿假单胞菌pao1的基因组修饰包括基因敲除和基因敲入。图4a显示的是基因敲除过程示意图，首先通过同源重组将一段pcr产物插入到靶基因，这段pcr产物包括庆大霉素的抗性基因，同源臂(75bp)和位点特异性重组酶识别位点loxm(lox71-lox66)，靶基因分别是：；phnab基因，它是绿脓菌素生物合成的必需基因；lasb基因，它编码弹性蛋白酶b；mdoh基因，它编码一个蛋白涉及周质葡聚糖的生物合成。基因重组后，利用5’-3’端的菌落pcr进行验证(图4bcd)。使用pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒进行一次电转化大约能得到100个左右正确的庆大霉素抗性克隆。但是使用pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒进行遗传修饰时，正确率就会下降。为了得到铜绿假单胞菌pao1的无痕修饰突变体，通过cre酶的位点特异性重组将抗性基因敲除，最后对各种突变体进行菌落pcr鉴定(图4efg)。

toxa有三个结构域：氨基末端结构域i包括一个真核细胞的识别位点，中间的结构域ii包括蛋白转移功能，羧基末端结构域iii有一个生物酶的结合位点。结构域iii上的578位谷氨酸是活性位点，把这个氨基酸替换可以构建一株减毒的菌株。toxa的点突变(把578位的密码子由gag变为gac，把谷氨酸变为天冬氨酸)可以通过简捷的两步重组获得(图5a)。第一步重组中，通过表达pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒或者pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒，将带有庆大霉素抗性基因和一个反向筛选标记(sacb)的pcr产物转化进铜绿假单胞菌细胞，与靶基因进行同源重组。随机选择重组克隆进行3’端和5’端的菌落pcr鉴定(图5b)，正确克隆随后进行sacb的功能验证(图6)。第二步的重组中，通过表pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan质粒或者pbbr1-rha-redgam-bas-kan质粒，将包含点突变(把578位的密码子由gag变为gac，把谷氨酸变为天冬氨酸)的单链dna转化到之前构建的突变体中，重组后将得到点突变的菌株。最终的突变菌种通过菌落pcr验证(图5c)和测序验证(图5d)。

为了扩展新型重组系统的应用范围，本发明还可以通过插入启动子(papra)的方式来激活次级代谢产物的生物合成途径。通过表达pbbr1-rha-bas-kan质粒，将启动子(pgenta)插入到丁香假单胞菌番茄变种dc3000(pseudomonassyringaepv.tomatostr.dc3000)(图7a)。但是在hplc-ms分析中均没有获得相应的化合物。

在荧光假单胞菌中，一种叫做rets的混合传感激酶能够抑制一些抗生素的产生，包括2,4-二乙酰基间苯三酚、吡咯硝基和黄绿脓菌素。在荧光假单胞菌中对rets进行基因失活，可能会提高这株菌的生防能力。在荧光假单胞菌中通过表达pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan质粒，可以将rets基因进行敲除，突变菌株通过菌落pcr进行验证(图7b)。

实施例5：ssb蛋白的表达可以提高铜绿假单胞菌和大肠杆菌的重组效率

在大肠杆菌中，ssb蛋白的表达可以显著提高pbbr1-rha-redgam-ba-kan质粒的重组效率，但是ssb蛋白却不能提高pbbr1-rha-ba-kan质粒的重组效率(图8a)，在铜绿假单胞菌中也得到了类似的结果(图8b)。在丁香假单胞菌中，ssb蛋白可以显著提高pbbr1-rha-ba-kan质粒的重组效率，但是加入了redγ蛋白后重组效率反而降低了，而且ssb也不会提高重组效率(图8c)。结果表明ssb提高重组效率可能与宿主蛋白有关系。

序列表

<110>山东大学

<120>假单胞菌中新型重组系统及其应用

<141>2017-04-18

<160>30

<210>1

<211>84

<212>dna

<213>人工序列

<221>pluγ-te-3

<222>（1）…（84）

<400>1

acatgcaaattttgatcgtgcgatacggacgcaacgtttcttgcggacatatgatggcct60

ccttcatatatcctccatttttac84

<210>2

<211>73

<212>dna

<213>人工序列

<221>pluγ-te-5

<222>（1）…（73）

<400>2

gcgctttttagactggtcgtaatgaacaattcttaagaaggagatatacatatgaaccca60

tatgcagtttatg73

<210>3

<211>84

<212>dna

<213>人工序列

<221>redγ-te-3

<222>（1）…（84）

<400>3

acatgcaaattttgatcgtgcgatacggacgcaacgtttcttgcggacatatgatggcct60

cctttatacctctgaatcaatatc84

<210>4

<211>72

<212>dna

<213>人工序列

<221>redγ-te-5

<222>（1）…（72）

<400>4

gcgctttttagactggtcgtaatgaacaattcttaagaaggagatatacatatggatatt60

aatactgaaact72

<210>5

<211>84

<212>dna

<213>人工序列

<221>pluγ-bas-3

<222>（1）…（84）

<400>5

tcgtagcgcgtggcgaacttcgtcaggagcggtgttagtgcagttcccatcactagtcct60

ccttcatatatcctccatttttac84

<210>6

<211>73

<212>dna

<213>人工序列

<221>pluγ-bas-5

<222>（1）…（73）

<400>6

gcgctttttagactggtcgtaatgaacaattcttaagaaggagatatacatatgaaccca60

tatgcagtttatg73

<210>7

<211>84

<212>dna

<213>人工序列

<221>redγ-bas-3

<222>（1）…（84）

<400>7

tcgtagcgcgtggcgaacttcgtcaggagcggtgttagtgcagttcccatcactagtcct60

cctttatacctctgaatcaatatc84

<210>8

<211>72

<212>dna

<213>人工序列

<221>redγ-bas-5

<222>（1）…（72）

<400>8

gcgctttttagactggtcgtaatgaacaattcttaagaaggagatatacatatggatatt60

aatactgaaact72

<210>9

<211>85

<212>dna

<213>人工序列

<221>h-bas-3

<222>（1）…（85）

<400>9

tcgtagcgcgtggcgaacttcgtcaggagcggtgttagtgcagttcccatcactagtcct60

ccttcatttcgcccggctgctgctg85

<210>10

<211>72

<212>dna

<213>人工序列

<221>h-bas-5

<222>（1）…（72）

<400>10

gcgctttttagactggtcgtaatgaacaattcttaagaaggagatatacatatgatgact60

accgagctgagc72

<210>11

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<221>ab-genta-loxm-3

<222>（1）…（98）

<400>11

ttctccagcagacgctggccgtgggtggtgagaatcgactcgggatggaactgcaagccc60

agctgtcgattgcgccaacttaaatgtgaaagtgggtc98

<210>12

<211>97

<212>dna

<213>人工序列

<221>ab-genta-loxm-5

<222>（1）…（97）

<400>12

caattgggggaaaaggggggttaccgatgatgaacatgccgttgcgcgctagcgtcgcgc60

aggccagtcgcccatagctgaattacattcccaaccg97

<210>13

<211>96

<212>dna

<213>人工序列

<221>lasb-genta-loxm-3

<222>（1）…（96）

<400>13

gaaggccttgcgggtatcccagcccggcgaattggccaacaggtagaacgcacggttgta60

cacgccgctggagtgttaggtggcggtacttgggtc96

<210>14

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<221>lasb-genta-loxm-5

<222>（1）…（98）

<400>14

cgctacatggaccagcccagccgcgacgggcgatccatcgacaacgcgtcgcagtactac60

aacggcatcgacgtgatagaccagttgcaatccaaacg98

<210>15

<211>83

<212>dna

<213>人工序列

<221>mdoh-genta-loxm-3

<222>（1）…（83）

<400>15

cctcttcccagacccgcgtatgcaggcgcgaaagtgctaccgggtcactcaacagagcca60

caacttaaatgtgaaagtgggtc83

<210>16

<211>82

<212>dna

<213>人工序列

<221>mdoh-genta-loxm-5

<222>（1）…（82）

<400>16

gacgaggcgcagaagccactgagcgaaacctggagctatcagctgcctgccgatgaataa60

agctgaattacattcccaaccg82

<210>17

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<221>rets-genta-loxm-3

<222>（1）…（98）

<400>17

tggagcatggtgggagctcacgactaaaggagggcgagcgagagtttaacaggcgccgca60

gagcctgtcggctcacaacttaaatgtgaaagtgggtc98

<210>18

<211>97

<212>dna

<213>人工序列

<221>rets-genta-loxm-5

<222>（1）…（97）

<400>18

gcacacgcccttgccgtgcggtcattacgccgcgcatagttataatcaggcatcaaccaa60

cgaagggatttcgccagctgaattacattcccaaccg97

<210>19

<211>96

<212>dna

<213>人工序列

<221>toxa-sacb-genta-3

<222>（1）…（96）

<400>19

gccgacgttgcgcgggtcggtggggatcgccgagggaatcaccacggtgcgctcggccag60

cggccagccgagaatttaggtggcggtacttgggtc96

<210>20

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<221>toxa-sacb-genta-5

<222>（1）…（98）

<400>20

acggctgatcggccatccgctgccgctgcgcctggacgccatcaccggccccgaggagga60

aggcgggcgcctggaatagaccagttgcaatccaaacg98

<210>21

<211>96

<212>dna

<213>人工序列

<221>dc3000-bgc6-3

<222>（1）…（96）

<400>21

tcgctacaacaagctggccaaaacctacgcagccatggtcacgctggtctgcagcctacg60

ttgtagcggcgatacgaaggcacgaacccagttgac96

<210>22

<211>97

<212>dna

<213>人工序列

<221>dc3000-bgc6-5

<222>（1）…（97）

<400>22

tacagaggacagttcatacgagaaatttgagtttttcgatgctttttgatttgatggctt60

catgcgtaaacatcctcgaattgttaggtggcggtac97

<210>23

<211>8261

<212>dna

<213>人工序列

<221>pbbr1-rha-red_gba-kan

<222>（1）…（8261）

<400>23

accttcgggagcgcctgaagcccgttctggacgccctggggccgttgaatcgggatatgc60

aggccaaggccgccgcgatcatcaaggccgtgggcgaaaagctgctgacggaacagcggg120

aagtccagcgccagaaacaggcccagcgccagcaggaacgcgggcgcgcacatttccccg180

aaaagtgccacctgggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaag240

cgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggt300

tttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaa360

gccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatc420

aagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgca480

cgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagac540

aatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttt600

tgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatc660

gtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcggg720

aagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgc780

tcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatcc840

ggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggat900

ggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagc960

cgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgaccca1020

tggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcga1080

ctgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatat1140

tgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgc1200

tcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggact1260

ctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattcc1320

accgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatg1380

atcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacccccatgggcaaatatta1440

tacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtga1500

tggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtttttatgcattaatctttc1560

tgcgaattgagatgacgccactggctgggcgtcatcccggtttcccgggtaaacaccacc1620

gaaaaatagttactatcttcaaagccacattcggtcgaaatatcactgattaacaggcgg1680

ctatgctggagaagatattgcgcatgacacactctgacctgtcgcagatattgattgatg1740

gtcattccagtctgctggcgaaattgctgacgcaaaacgcgctcactgcacgatgcctca1800

tcacaaaatttatccagcgcaaagggacttttcaggctagccgccagccgggtaatcagc1860

ttatccagcaacgtttcgctggatgttggcggcaacgaatcactggtgtaacgatggcga1920

ttcagcaacatcaccaactgcccgaacagcaactcagccatttcgttagcaaacggcaca1980

tgctgactactttcatgctcaagctgaccgataacctgccgcgcctgcgccatccccatg2040

ctacctaagcgccagtgtggttgccctgcgctggcgttaaatcccggaatcgccccctgc2100

cagtcaagattcagcttcagacgctccgggcaataaataatattctgcaaaaccagatcg2160

ttaacggaagcgtaggagtgtttatcgtcagcatgaatgtaaaagagatcgccacgggta2220

atgcgataagggcgatcgttgagtacatgcaggccattaccgcgccagacaatcaccagc2280

tcacaaaaatcatgtgtatgttcagcaaagacatcttgcggataacggtcagccacagcg2340

actgcctgctggtcgctggcaaaaaaatcatctttgagaagttttaactgatgcgccacc2400

gtggctacctcggccagagaacgaagttgattattcgcaatatggcgtacaaatacgttg2460

agaagattcgcgttattgcagaaagccatcccgtccctggcgaatatcacgcggtgacca2520

gttaaactctcggcgaaaaagcgtcgaaaagtggttactgtcgctgaatccacagcgata2580

ggcgatgtcagtaacgctggcctcgctgtggcgtagcagatgtcgggctttcatcagtcg2640

caggcggttcaggtatcgctgaggcgtcagtcccgtttgctgcttaagctgccgatgtag2700

cgtacgcagtgaaagagaaaattgatccgccacggcatcccaattcacctcatcggcaaa2760

atggtcctccagccaggccagaagcaagttgagacgtgatgcgctgttttccaggttctc2820

ctgcaaactgcttttacgcagcaagagcagtaattgcataaacaagatctcgcgactggc2880

ggtcgagggtaaatcattttccccttcctgctgttccatctgtgcaaccagctgtcgcac2940

ctgctgcaatacgctgtggttaacgcgccagtgagacggatactgcccatccagctcttg3000

tggcagcaactgattcagcccggcgagaaactgaaatcgatccggcgagcgatacagcac3060

attggtcagacacagattatcggtatgttcatacagatgccgatcatgatcgcgtacgaa3120

acagaccgtgccaccggtgatggtatagggctgcccattaaacacatgaatacccgtgcc3180

atgttcgacaatcacaatttcatgaaaatcatgatgatgttcaggaaaatccgcctgcgg3240

gagccggggttctatcgccacggacgcgttaccagacggaaaaaaatccacactatgtaa3300

tacggtcatactggcctcctgatgtcgtcaacacggcgaaatagtaatcacgaggtcagg3360

ttcttaccttaaattttcgacggaaaaccacgtaaaaaacgtcgatttttcaagatacag3420

cgtgaattttcaggaaatgcggtgagcatcacatcaccacaattcagcaaattgtgaaca3480

tcatcacgttcatctttccctggttgccaatggcccattttcctgtcagtaacgagaagg3540

tcgcgaattcaggcgctttttagactggtcgtaatgaacaattcttaagaaggagatata3600

catatggatattaatactgaaactgagatcaagcaaaagcattcactaaccccctttcct3660

gttttcctaatcagcccggcatttcgcgggcgatattttcacagctatttcaggagttca3720

gccatgaacgcttattacattcaggatcgtcttgaggctcagagctgggcgcgtcactac3780

cagcagctcgcccgtgaagagaaagaggcagaactggcagacgacatggaaaaaggcctg3840

ccccagcacctgtttgaatcgctatgcatcgatcatttgcaacgccacggggccagcaaa3900

aaatccattacccgtgcgtttgatgacgatgttgagtttcaggagcgcatggcagaacac3960

atccggtacatggttgaaaccattgctcaccaccaggttgatattgattcagaggtataa4020

aacgaatgagtactgcactcgcaacgctggctgggaagctggctgaacgtgtcggcatgg4080

attctgtcgacccacaggaactgatcaccactcttcgccagacggcatttaaaggtgatg4140

ccagcgatgcgcagttcatcgcattactgatcgttgccaaccagtacggccttaatccgt4200

ggacgaaagaaatttacgcctttcctgataagcagaatggcatcgttccggtggtgggcg4260

ttgatggctggtcccgcatcatcaatgaaaaccagcagtttgatggcatggactttgagc4320

aggacaatgaatcctgtacatgccggatttaccgcaaggaccgtaatcatccgatctgcg4380

ttaccgaatggatggatgaatgccgccgcgaaccattcaaaactcgcgaaggcagagaaa4440

tcacggggccgtggcagtcgcatcccaaacggatgttacgtcataaagccatgattcagt4500

gtgcccgtctggccttcggatttgctggtatctatgacaaggatgaagccgagcgcattg4560

tcgaaaatactgcatacactgcagaacgtcagccggaacgcgacatcactccggttaacg4620

atgaaaccatgcaggagattaacactctgctgatcgccctggataaaacatgggatgacg4680

acttattgccgctctgttcccagatatttcgccgcgacattcgtgcatcgtcagaactga4740

cacaggccgaagcagtaaaagctcttggattcctgaaacagaaagccgcagagcagaagg4800

tggcagcatgacaccggacattatcctgcagcgtaccgggatcgatgtgagagctgtcga4860

acagggggatgatgcgtggcacaaattacggctcggcgtcatcaccgcttcagaagttca4920

caacgtgatagcaaaaccccgctccggaaagaagtggcctgacatgaaaatgtcctactt4980

ccacaccctgcttgctgaggtttgcaccggtgtggctccggaagttaacgctaaagcact5040

ggcctggggaaaacagtacgagaacgacgccagaaccctgtttgaattcacttccggcgt5100

gaatgttactgaatccccgatcatctatcgcgacgaaagtatgcgtaccgcctgctctcc5160

cgatggtttatgcagtgacggcaacggccttgaactgaaatgcccgtttacctcccggga5220

tttcatgaagttccggctcggtggtttcgaggccataaagtcagcttacatggcccaggt5280

gcagtacagcatgtgggtgacgcgaaaaaatgcctggtactttgccaactatgacccgcg5340

tatgaagcgtgaaggcctgcattatgtcgtgattgagcgggatgaaaagtacatggcgag5400

ttttgacgagatcgtgccggagttcatcgaaaaaatggacgaggcactggctgaaattgg5460

ttttgtatttggggagcaatggcgatagatgtacaagtaagcttaccggtttattgacta5520

ccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgaggccagtttgctcaggctctcc5580

ccgtggaggtaataattgacgatatgatcatttattctgcctcccagagcctgataaaaa5640

cggtgaatccgttagcgaggtgccgccggcttccattcaggtcgaggtggcccggctcca5700

tgcaccgcgacgcaacgcggggaggcagacaaggtatagggcggcgaggcggctacagcc5760

gatagtctggaacagcgcacttacgggttgctgcgcaacccaagtgctaccggcgcggca5820

gcgtgacccgtgtcggcggctccaacggctcgccatcgtccagaaaacacggctcatcgg5880

gcatcggcaggcgctgctgcccgcgccgttcccattcctccgtttcggtcaaggctggca5940

ggtctggttccatgcccggaatgccgggctggctgggcggctcctcgccggggccggtcg6000

gtagttgctgctcgcccggatacagggtcgggatgcggcgcaggtcgccatgccccaaca6060

gcgattcgtcctggtcgtcgtgatcaaccaccacggcggcactgaacaccgacaggcgca6120

actggtcgcggggctggccccacgccacgcggtcattgaccacgtaggccgacacggtgc6180

cggggccgttgagcttcacgacggagatccagcgctcggccaccaagtccttgactgcgt6240

attggaccgtccgcaaagaacgtccgatgagcttggaaagtgtcttctggctgaccacca6300

cggcgttctggtggcccatctgcgccacgaggtgatgcagcagcattgccgccgtgggtt6360

tcctcgcaataagcccggcccacgcctcatgcgctttgcgttccgtttgcacccagtgac6420

cgggcttgttcttggcttgaatgccgatttctctggactgcgtggccatgcttatctcca6480

tgcggtagggtgccgcacggttgcggcaccatgcgcaatcagctgcaacttttcggcagc6540

gcgacaacaattatgcgttgcgtaaaagtggcagtcaattacagattttctttaacctac6600

gcaatgagctattgcggggggtgccgcaatgagctgttgcgtaccccccttttttaagtt6660

gttgatttttaagtctttcgcatttcgccctatatctagttctttggtgcccaaagaagg6720

gcacccctgcggggttcccccacgccttcggcgcggctccccctccggcaaaaagtggcc6780

cctccggggcttgttgatcgactgcgcggccttcggccttgcccaaggtggcgctgcccc6840

cttggaacccccgcactcgccgccgtgaggctcggggggcaggcgggcgggcttcgcctt6900

cgactgcccccactcgcataggcttgggtcgttccaggcgcgtcaaggccaagccgctgc6960

gcggtcgctgcgcgagccttgacccgccttccacttggtgtccaaccggcaagcgaagcg7020

cgcaggccgcaggccggaggcttttccccagagaaaattaaaaaaattgatggggcaagg7080

ccgcaggccgcgcagttggagccggtgggtatgtggtcgaaggctgggtagccggtgggc7140

aatccctgtggtcaagctcgtgggcaggcgcagcctgtccatcagcttgtccagcagggt7200

tgtccacgggccgagcgaagcgagccagccggtggccgctcgcggccatcgtccacatat7260

ccacgggctggcaagggagcgcagcgaccgcgcagggcgaagcccggagagcaagcccgt7320

agggcgccgcagccgccgtaggcggtcacgactttgcgaagcaaagtctagtgagtatac7380

tcaagcattgagtggcccgccggaggcaccgccttgcgctgcccccgtcgagccggttgg7440

acaccaaaagggaggggcaggcatggcggcatacgcgatcatgcgatgcaagaagctggc7500

gaaaatgggcaacgtggcggccagtctcaagcacgcctaccgcgagcgcgagacgcccaa7560

cgctgacgccagcaggacgccagagaacgagcactgggcggccagcagcaccgatgaagc7620

gatgggccgactgcgcgagttgctgccagagaagcggcgcaaggacgctgtgttggcggt7680

cgagtacgtcatgacggccagcccggaatggtggaagtcggccagccaagaacagcaggc7740

ggcgttcttcgagaaggcgcacaagtggctggcggacaagtacggggcggatcgcatcgt7800

gacggccagcatccaccgtgacgaaaccagcccgcacatgaccgcgttcgtggtgccgct7860

gacgcaggacggcaggctgtcggccaaggagttcatcggcaacaaagcgcagatgacccg7920

cgaccagaccacgtttgcggccgctgtggccgatctagggctgcaacggggcatcgaggg7980

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