一种实时荧光定量PCR仪的制作方法

本发明涉及生化设备领域，具体是一种实时荧光定量pcr仪。

背景技术：

pcr(聚合酶链式反应)是指利用dna在体外95℃的高温时会变性成单链、低温60℃左右时该单链会与引物按碱基互补配对的原则结合、在调温度至dna聚合酶最适反应温度72℃左右时dna聚合酶会沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链的性质，实现放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术。而pcr仪则是在变性温度、复性温度、延伸温度之间实现很好的控制，使特定dna的扩增得以实现的设备。为了能够实时监控反应过程，进而及时调整温度，需要pcr仪在温控的同时监测靶基因。

传统的pcr检测方法是通过将扩增产物进行凝胶电泳来判断靶基因是否存在，但是该方法存在诸多不足：由于pcr扩增的效率很高，靶基因从极少量扩增至大量并最终达到饱和的时间较短，电泳检测只能得到特定基因是否存在的定性结果，而无法区分上述过程，也无法对其数量或浓度定量检测，同时，该方法操作过程复杂，检测时间长，无法满足实时监控反应过程的要求，另外，由于在操作过程中需要将检测样本转移，因此样品容易受环境的污染，进而造成检测结果不准确。

为了解决上述问题，出现了实时荧光定量pcr技术，例如，中国专利文献cn101699271a公开了一种实时荧光定量pcr激发检测系统，该系统基于可调谐滤光片实现全波长荧光激发及检测，该系统包括由光源、聚光装置和第一可调滤光片组成的荧光激发模块；由第二可调滤光片、光检测器和光电转换装置组成的荧光检测模块；由波长调谐设备及主控计算机组成的控制单元；有反应试管、金属温块及恒温热盖组成的热循环系统。上述系统在dna扩增反应中，通过荧光信号对pcr进行实时检测，并经数据处理对靶基因进行定量分析，操作简单，能够自动、快速的完成对靶基因的定量检测，并且在检测过程中不受环境污染，检测结果较为准确。但是，上述实时荧光定量pcr激发检测系统以及目前其他的实时荧光定量pcr仪均在温度控制方面还存在缺陷：一方面，在反应的某一阶段，保持在某一特定的温度状态时，需要pcr仪具有良好的温度均一性；另一方面，在实时监控反应过程中，需要在适当时机及时调整温度，这进一步要求pcr仪可以迅速调整温度，并在较短的时间内达到温度的均一性；上述实时荧光定量pcr激发检测系统以及目前其他的实时荧光定量pcr仪的温度均一性最优仅能达到±0.1℃，即虽然能够实时检测反应过程，却不能很好的实现温度控制，而对于pcr来说，反应是一个动态竞争的过程，反应温度和时间决定了哪个产物能够胜出，因此，上述缺陷导致了其不能实现检测样品多位点突变、单核苷酸多态性-snp、基因分型等多种分析功能。

技术实现要素：

为此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的实时荧光定量pcr检测系统不能很好的实现检测样品多位点突变、单核苷酸多态性-snp、基因分型等多种分析功能的缺陷，本发明专利提供一种实时荧光定量pcr仪，包括基本pcr部件、荧光检测部件和上位机，所述基本pcr部件包括电源系统和温度控制系统；所述电源系统包括电源和电源部件，所述电源提供整个实时荧光定量pcr仪的电能；所述电源部件为组合型电源转换插头连接器，保护电路；所述温度控制系统包括加热模块、热盖部件和温度调节模块，所述温度调节模块设置于样品基座的周边；所述加热模块为制冷片te模块，所述制冷片te模块设置于所述样品基座的底部，进行加热和降温；所述热盖部件设置于所述样品基座的上方，与样品试管口接触，避免高温产生的水蒸气凝结在pcr管盖上；所述样品基座为超导材料制成；所述上位机对实时荧光变化的检测数据进行分析处理；所述上位机电连接于所述控制单元；所述控制单元分别电连接于te温度传感器、热盖温度传感器和环境温度传感器；所述te温度传感器设置于所述样品基座的底部和和制冷片te模块之间，检测所述制冷片te模块的温度；所述热盖温度传感器设置于所述热盖部件上，检测所述热盖部件的温度；所述环境温度传感器安装于所述实时荧光定量pcr仪的腔体内部，检测所述实时荧光定量pcr仪的腔体温度；所述温度调节模块包括辅助加热模块和散热模块，通过控制单元监控所述te温度传感器、热盖温度传感器和环境温度传感器调整pcr反应温度的均一性小于±0.1℃，升降温度平均速率大于3℃/秒，温度精度控制在小于±0.15℃；所述荧光检测部件包括：光电系统，对样本进行实时荧光变化的检测；所 述光电系统由包括激发光系统和检测系统；所述激发光系统包括卤素灯和光学过滤器；所述检测系统包括光纤、发射滤波器、镜头和ccd相机；荧光信号通过所述光纤，发射滤波器和镜头，到达所述ccd相机。

进一步地，所述控制单元包括主控制板和副控制板；所述主控制版的端口连接有所述电源系统、温度控制系统、光电系统；所述主控制板控制有所述制冷片te模块的温度、热盖部件的温度，辅助加热模块的温度以及散热模块对实时荧光定量pcr仪腔体的温度；所述主控制板的端口连接有控制滤光片的第一选择电机和第二选择电机；所述副控制板的端口连接有控制仪器顶盖的上下运动第一直流电机和第二直流电机，以及四组控制信号灯开关的限位开关。

进一步地，所述散热模块为两个智能散热器风扇。

进一步地，所述辅助加热模块和散热模块，通过所述上位机的应用软件调整pcr反应温度的均一性为±0.06℃。

进一步地，所述辅助加热模块为电加热管或伴热带。

进一步地，所加热模块为六组独立控制制冷片te模块，分别与六组te温度传感器连接。

进一步地，所述热盖部件的温度为105℃。

进一步地，所述散热模块为两个智能散热器风扇，控制所述实时荧光定量pcr仪的腔体内部温度在45℃以下。

进一步地，所述的激发光系统通过光纤96孔同时激发；所述检测系统包括一套光纤、四个发射滤光片轮、一组镜片和冷却ccd相机；荧光检测的波长范围为380nm至780nm，激发波长通道数设置为1至8个，发射波长相应的设置为1至5种。

有益效果：

本发明提供的一种荧光定量pcr仪利用控制电路在控制热循环装置对靶基因扩增的同时对被测反应物的荧光信号强度进行检测，由于荧光信号强度与靶基因的浓度是成比例关系的，因此检测荧光强度就能知道特定基因的数量和浓度。因此大大缩短了临床致病菌的检测时间。另外，该荧光定量pcr通过辅助加热模块、散热模块和由超导材料制成的样品基座使得温度均一性快速达到和长时间保持在±0.06℃，实现了扩增子序列分析(asa，ampliconsequenceanalysis)功能，asa不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在pcr结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-snp、甲基化、hla配型等的分析。

同时，本发明将pcr热循环、荧光检测和装有各种应用分析软件的计算机结合在一起，可以动态观察pcr每一循环各反应管中pcr扩增产物逐渐增加的情况，操作简单，反应速度快。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明一种实时荧光定量pcr仪的各部件连接关系示意图；

图2为本发明一种实时荧光定量pcr仪的温度控制系统的结构示意图；

图3为本发明一种实时荧光定量pcr仪的电器线路示意图；

图中附图标记表示为：10-主控制板；11-热盖部件；12-热盖温度传感器；13-散热模块；14-环境温度传感器；15-第一选择电机；16-第二选择电机；20-样品基座；21-制冷片te模块；22-te温度传感器；23-伴热带；30-副控制板；31-第一直流电机；32-第二直流电机；33-限位开关。

具体实施方式

下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

如图1所示，

一种实时荧光定量pcr仪，包括电源，电源部件，加热模块，热盖部件，温度调节模块，光电系统、控制单元和上位机。

上位机通过应用软件对实时荧光变化的检测数据进行分析处理；控制单元对加热模块，热盖部件，温度调节模块和光电系统智能监控。

如图2所示，

温度调节模块包括辅助加热模块，辅助加热模块为伴热带23，为导电塑料材质，设置于样品基座20的周边，提供补偿温度；加热模块为制冷片te模块21，所述制冷片te模块21的一面可以加热，一面可以冷却，具有加热和冷却的作用，设置于所述样品基座20的底部，用于对样品进行加热和降温；te温度传感器22设置于样品基座20和加热模块为制冷片te模块21之间；样品基座20为超导材料。

如图3所示，

实时荧光定量pcr仪的电器线路图由主控制板10和副控制板30组成；主控制版的端口连接有所述电源系统、温度控制系统、光电系统；主控制板10控制有所述六组制冷片te模块21的温度、热盖部件的温度，辅助加热模块的温度以及两个智能散热器风扇对实时荧光定量pcr仪腔体的温度；主控制板10的端口连接有控制滤光片第一选择电机15和第二选择电机16；副控制板30的端口连接有控制仪器顶盖的上下运动第一直流电机31和第二直流电机32，以及四组控制信号灯开关的限位开关33。

本实施例所述的一种实时荧光定量pcr仪的使用方法如下：

如图1-3所示，

一种实时荧光定量pcr仪包括基本pcr部件、荧光检测部件和上位机。基本pcr部件是该仪器的基础，包括电源、加热模块、温度采集与处理等部分，它必须具有精确控温、快速升降温、温度场均一等pcr仪的基本要求，保证pcr过程的顺利完成。荧光检测部件包括光源、光电倍增管、信号采集与处理等部分。上位机包括数据采集和系统分析软件，主要负责从下位机采集数据，形成实时图形，并进行数据处理和图形分析，得到目标dna片段的含量和其它检测报告信息等。工作时，主计算机首先投入运行，同时工作人员把所测样品放入pcr反映腔体的样品架上，工作人员根据所测样品的pcr反应条件设置相应的温度参数、控温时间以及循环次数等，接着工作人员点击相应的按钮控件，系统就进入快速升温、恒温、快速降温、恒温等pcr循环过程，直至所有的循环结柬，同时在每一循环的低温段恒温结柬前系统进行样品的荧光信号实时采集，主计算机根据采集到的信号形成实时图形，并进行数据处理和图形分析，得到目标dna片段的含量和其它检测报告信息等。

本发明的应用软件已安装在上位机，在windows操作系统下运行，实现实验设置、数据管理和其他功能。应用软件的自检将会检查温度控制系统和光电系统，主控制板10通过te温度传感器22、热盖温度传感器12和环境温度传感器14分别对制冷片te模块21、热盖部件11和实时荧光定量pcr仪腔体的温度进行监控。

主控制板10可以控制加热模块、辅助加热模块的加热及冷却，主控制板10接收te温度传感器22、热盖温度传感器12和环境温度传感器14检测到的温度信号，由于所述te温度传感器22设置于所述样品基座的底部和和制冷片te模块21之间，可以检测所述制冷片te模块21的温度；所述热盖温度传感器12设置于所述热盖部件11上，检测所述热盖部件11的温度；所述环境温度传感器14安装于所述实时荧光定量pcr仪的腔体内部，检测所述实时荧光定量pcr仪的腔体温度。这样，主控制板10就可以获得制冷片te模块21的温度、热盖部件11的温度、pcr仪的腔体温度，根据检测到的当前温度和需要达到的温度进行比较，对加热模块、辅助加热模块进行控制

主控制板10与te温度传感器22连接，调整实时荧光定量pcr仪的在变性阶段、复性阶段和延伸阶段等各个阶段的温度转换，加快升降温。

在变性阶段，制冷片te模块21和伴热带23对样品机座20进行加热。由于，样品基座20为超导材料，能够迅速将热能传递给样品试管，使其迅速至95℃左右，从而达到快速升温的效果。待温度过高或过低时，te温度传感器22将信号传递给主控制板10，从而调整制冷片te模块21和伴热带23加热或降温。

在复性阶段，需要退火至50～60℃，制冷片te模块21和伴热带23停止加热，同时，散热模块13的两个智能散热器风扇开始工作；待温度至规定温度后，te温度传感器22将信号传递给主控制板10，控制制冷片te模块21和伴热带23保持相同温度，停止两个智能散热器风扇工作。

在延伸阶段，需要加热至75℃，制冷片te模块21和伴热带23对样品机座20进行加热，待温度过高或过低时，te温度传感器22将信号传递给主控制板10，从而调整制冷片te模块21和伴热带23加热或降温。

所以在各个阶段特定温度反应时，通过伴热带23的补偿加热，使得反应温度的均一性长时间保持在±0.06℃，升降温度平均速率为3℃/秒。

另外，主控制板10通过热盖温度传感器12控制热盖部件11的温度为105℃，在温度变化时，能够及时通过电信号进行校正。以及通过环境温度传感器14控制实时荧光定量pcr仪的腔体温度保持在35℃。同时，主控制板10端口连接控制滤光片第一选择电机15和第二选择电机16来选择不同滤光片。

荧光检测部件所用的光源为卤素灯，通过光纤96孔同时激发；检测系统包括一套光纤、四个发射滤光片轮、一组镜片和冷却ccd相机；荧光检测的波长范围为380nm至780nm，激发波长通道数为8个，发射波长5种。

副控制板30端口连接有控制仪器顶盖的上下运动第一直流电机31和第二直流电机32，以及四组控制信号灯开关的限位开关33，从而实现该仪器的外在物理运动和各功能开关控制。

以上所述仅为说明本发明的实施方式，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。