多核苷酸的处理的制作方法

本申请要求2014年3月7日提交的美国临时申请61/949,464的权益，所述临时申请的全部内容通过参考并入本文。

技术领域

本文中的实施方式总的来说涉及用于多核苷酸处理的组合物和方法。更具体来说，某些实施方式总的来说涉及用于纯化和标记来自于生物样品的长的多核苷酸的方法和组合物。

发明概述

在某些实施方式中，提供了处理包含多核苷酸的样品的方法。所述方法可以包括将所述样品固定化在薄层多孔基质中。所述方法可以包括使所述薄层多孔基质适形于基材。所述方法可以包括从适形于基材的薄层多孔基质除去非多核苷酸分子，同时所述多核苷酸保持固定化在所述薄层多孔基质中。所述方法可以包括下列至少一者：(a)将所述多核苷酸用第一标记物标记；或(b)从所述薄层多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，将所述多核苷酸用所述第一标记物标记。在某些实施方式中，将所述多核苷酸在固定化在所述薄层多孔基质中的同时用所述第一标记物标记。在某些实施方式中，将所述多核苷酸用所述第一标记物酶法标记。在某些实施方式中，从所述薄层多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，通过至少一次洗涤从所述薄层多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，所述多核苷酸用所述第一标记物标记并从所述薄层多孔基质分离。在某些实施方式中，将所述多核苷酸在固定化在所述薄层多孔基质中的同时用所述第一标记物标记，并随后从所述薄层多孔基质分离。在某些实施方式中，在从所述薄层多孔基质除去非多核苷酸分子之后并在从所述基质分离所述多核苷酸之前，将所述多核苷酸用所述第一标记物标记。在某些实施方式中，将所述多核苷酸从所述薄层多孔基质分离，并随后用所述第一标记物标记。在某些实施方式中，通过至少一次洗涤从所述薄层多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，将所述多核苷酸用所述第一标记物酶法标记。在某些实施方式中，将所述样品固定化在薄层多孔基质中和使所述薄层多孔基质适形于基材同时地进行。在某些实施方式中，将所述样品固定化在薄层多孔基质中和使所述薄层多孔基质适形于基材分开地进行。在某些实施方式中，将所述样品固定化在薄层多孔基质中包括将所述样品与所述薄层多孔基质的前体相接触，并且形成所述薄层多孔基质是从包含所述样品的所述前体形成的。在某些实施方式中，在已从所述薄层多孔基质的前体形成所述薄层多孔基质之后，将所述样品固定化在所述薄层多孔基质中。在某些实施方式中，形成所述薄层多孔基质包括在所述基材上铺展所述薄层多孔基质的前体。在某些实施方式中，形成所述薄层多孔基质包括向所述薄层多孔基质的前体施加真空或来自于气体的压力。在某些实施方式中，形成所述薄层多孔基质包括向所述薄层多孔基质的前体施加离心力。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质在所述基材与另一个实体之间适形于所述基材，由此限定所述薄层多孔基质的厚度、直径或体积中的至少一者。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质适形于基材包括将所述基材包埋在所述薄层多孔基质中。在某些实施方式中，所述基材包含网。在某些实施方式中，所述网包含多个直径为0.1μm至10mm的开孔。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质适形于基材包括将所述薄层多孔基质布置在所述基材上方。在某些实施方式中，在从所述薄层多孔基质除去所述非多核苷酸分子时，所述薄层多孔基质保持基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质从所述基材脱离但仍保持紧密贴近于所述基材，使得所述薄层多孔基质在所述基材上方保持基本上平坦。在某些实施方式中，通过系链、支架、电磁相互作用、摩擦或压力中的至少一者维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述基材，使得所述薄层多孔基质保持基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些实施方式中，将所述薄层多孔基质置于从所述基材延伸的至少两个柱状物之间，以便维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述基材。在某些实施方式中，将所述薄层多孔基质置于所述基材与表面之间，使得所述薄层多孔基质基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些实施方式中，所述表面包含第一网。在某些实施方式中，所述基材包含第二网。在某些实施方式中，所述第一网包含多个开孔，所述开孔各自具有0.1μm至约10mm的直径。在某些实施方式中，所述第二网包含多个开孔，所述开孔各自具有0.1μm至约10mm的直径。在某些实施方式中，通过真空维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述基材。在某些实施方式中，通过来自于气体的压力维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述基材。在某些实施方式中，通过系链维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述表面。在某些实施方式中，所述系链包含多孔材料，所述多孔材料被配置成维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述表面，同时允许接近固定化在所述薄层中的所述样品。在某些实施方式中，所述基材是刚性的。在某些实施方式中，所述基材是柔性的。在某些实施方式中，所述基材包含载片、容器或片材的至少一部分。在某些实施方式中，将所述样品固定化在薄层多孔基质中包括形成所述薄层多孔基质，使得所述表面限定所述薄层多孔基质的至少一个侧面。在某些实施方式中，所述基材包含网。在某些实施方式中，所述网包含直径为0.1μm至约10mm例如约1μm至约10mm、10μm至约10mm、100μm至约10mm、约0.1μm至约1mm、约1μm至约1mm、约10μm至约1mm或约100μm至约1mm的多个开孔。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质具有约1至999微米的厚度。在某些实施方式中，所述薄层基质具有约80至200微米的厚度。在某些实施方式中，所述薄层基质在流体装置内形成。在某些实施方式中，所述薄层基质在微流体装置或纳米流体装置外部形成，并随后放置在所述流体装置内。在某些实施方式中，在流体装置内使所述薄层基质适形于所述基材。在某些实施方式中，在流体装置内从所述薄层多孔基质除去所述非多核苷酸分子。在某些实施方式中，所述流体装置被配置成在所述处理期间控制体积、温度或流体移动中的至少一者。在某些实施方式中，所述流体装置被配置成自动进行所述处理。在某些实施方式中，所述流体装置包含微流体装置。在某些实施方式中，所述流体装置包含纳米流体装置。

在某些实施方式中，提供了一种处理包含多核苷酸的样品的方法。所述方法可以包括将所述样品在水性环境中固定化在多孔基质中。所述方法可以包括破碎包含固定化的样品的多孔基质。所述方法可以包括从所述多孔基质除去非多核苷酸分子，同时所述多核苷酸保留在所述多孔基质中。所述方法可以包括从所述多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，在破碎所述多孔基质之后从所述多孔基质除去非多核苷酸分子。在某些实施方式中，在破碎所述多孔基质之前从所述多孔基质除去非多核苷酸分子。在某些实施方式中，所述方法还包括在破碎所述基质之后从所述多孔基质除去痕量的非多核苷酸分子，其中多核苷酸分子保留在所述多孔基质中，而所述痕量的非多核苷酸分子被去除。在某些实施方式中，所述方法还包括在从所述多孔基质除去非多核苷酸分子之后并在从所述基质分离所述多核苷酸之前，用第一标记物标记所述多核苷酸。在某些实施方式中，在流体装置内将所述样品固定化在所述多孔基质中。在某些实施方式中，所述多孔基质在微流体装置或纳米流体装置外部形成，并随后放置在所述流体装置内。在某些实施方式中，在流体装置内使所述多孔基质适形于所述基材。在某些实施方式中，在流体装置内从所述多孔基质除去所述非多核苷酸分子。在某些实施方式中，所述流体装置被配置成在所述处理期间控制体积、温度或流体移动中的至少一者。在某些实施方式中，所述流体装置被配置成自动进行所述处理。在某些实施方式中，所述流体装置包含微流体装置。在某些实施方式中，所述流体装置包含纳米流体装置。

在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多核苷酸包含至少约200千碱基，例如至少约200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、850kb、950kb或1000kb，包括任两个所列出的值之间的范围。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多核苷酸包含至少约1兆碱基。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述样品包含细胞悬液、核悬液、细胞器悬液、细胞匀浆物、组织匀浆物、全生物体匀浆物和生物流体中的至少一者。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述样品包含全细胞。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多核苷酸包含单链DNA、单链RNA、双链DNA或双链RNA。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多孔基质或薄层多孔基质包含合成聚合物、天然存在的聚合物或其组合。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多孔基质或薄层多孔基质包含基于多糖的基质。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多孔基质或薄层多孔基质包含琼脂糖基质、聚丙烯酰胺基质、明胶基质、胶原蛋白基质、纤维蛋白基质、壳聚糖基质、藻酸盐基质、透明质酸基质或其任何组合。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多孔基质或薄层多孔基质包含琼脂糖基质。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多孔基质或薄层多孔基质包含硅烷基团、带正电荷的基团、带负电荷的基团、两性离子基团、极性基团、亲水性基团、疏水性基团或其任何组合。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多孔基质或薄层多孔基质包含水性环境。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多孔基质或薄层多孔基质被布置在水性溶液中。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，非多核苷酸分子包含蛋白质、脂类、糖类、细胞器和细胞碎片中的至少一者。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，除去非多核苷酸分子包括将所述多孔基质或薄层多孔基质与蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、脂肪酶、糖水解酶、果胶酶、果胶溶解酶(pectolyase)、淀粉酶、RNA酶、透明质酸酶、几丁质酶、gluculase、溶壁酶、酵母裂解酶、溶菌酶、labiase、消色肽酶(achromopeptidase)或其组合相接触。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，除去非多核苷酸分子包括将所述多孔基质或薄层多孔基质与蛋白酶相接触。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，除去非多核苷酸分子包括将所述多孔基质或薄层多孔基质与去污剂、离液剂、缓冲剂、螯合剂、有机溶剂、聚合物、醇、盐、酸、碱、还原剂或其组合相接触。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述聚合物包含聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或乙二醇之一。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述有机溶剂在基于水的溶液中可混溶。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，除去非多核苷酸分子包括施加电场以除去至少一些非多核苷酸分子。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述方法还包括在除去非多核苷酸分子之前进行基质内核富集。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述标记包括非位点特异性标记。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述标记包括位点特异性标记。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述标记包括将所述多核苷酸与染料或染色剂相接触。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述标记包括非光学标记。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述多核苷酸是双链的，并且位点特异性标记包括在第一序列基序处切刻所述多核苷酸，由此形成至少一个切口，其中所述DNA在与所述至少一个切口相邻处保持双链；以及用所述第一标记物标记所述至少一个切口。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，将所述多核苷酸在被切刻时固定化在所述基质中。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述位点特异性标记包括将至少一个核苷酸掺入到所述至少一个切口中。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，至少一个核苷酸包含可逆终止子。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述至少一个核苷酸包含所述第一标记物。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述方法还包括在第二序列基序处切刻所述多核苷酸，由此形成至少一个第二切口，其中所述DNA在与所述至少一个第二切口相邻处保持双链；以及用第二标记物标记所述至少一个第二切口，其中所述第一标记物与所述第二标记物相同或不同。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述标记包括通过第一甲基转移酶将所述标记物转移到所述多核苷酸。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述位点特异性标记包括通过第一甲基转移酶将所述第一标记物转移到第一序列基序。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述位点特异性标记包括将第一反应性基团转移到所述第一序列基序；以及将所述第一标记物偶联到所述第一反应性基团。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述方法还包括通过第二甲基转移酶将第二标记物转移到第二序列基序，其中所述第二序列基序不同于所述第一序列基序，并且其中所述第二标记物与所述第一标记物相同或不同。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，位点特异性标记包括将固定化在所述基质中的所述多核苷酸的第一序列基序与特异性结合所述第一序列基序的第一结合组成部分相接触。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述第一结合组成部分包含以下一种：三螺旋寡核苷酸、肽、核酸、聚酰胺、锌指DNA结合结构域、转录激活物样(TAL)效应物DNA结合结构域、转录因子DNA结合结构域、限制性酶DNA结合结构域、抗体或其任何组合。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述第一标记物或第二标记物中的至少一者选自荧光团、量子点或非光学标记物。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述方法还包括用非序列特异性标记物标记所述多核苷酸，其中所述非序列特异性标记物不同于所述第一标记物和第二标记物。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，分离包括以下至少一者：融化所述多孔基质、消化所述多孔基质、降解所述多孔基质、溶解所述多孔基质、电洗脱、通过筛的离心、转印到膜上、透析步骤或其组合。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，分离包括向包含所述多核苷酸和所述基质的至少一种组分的混合物添加溶剂。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述方法还包括检测所述多核苷酸特征性的位点特异性标记的模式。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，检测包括将所述多核苷酸在流体通道中线性化。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述方法还包括将所述第一标记物、第二标记物或其任何组合的模式与参比DNA上的标记物模式进行比较。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述方法还包括在位点特异性标记的重叠模式的基础上组装多个模式，由此构建多核苷酸图谱。

在某些实施方式中，提供了一种多核苷酸制备物。所述制备物可以包含适形于基材的薄层多孔基质。所述制备物可以包含固定化在所述多孔基质中的多核苷酸，其中所述多核苷酸基本上与非多核苷酸细胞组分分离，并且其中所述多核苷酸当在所述基质中时已被位点特异性标记或酶法修饰。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些实施方式中，所述基材被包埋在所述薄层多孔基质中。在某些实施方式中，将所述基材放置在所述薄层多孔基质的第一侧面上，并且其中将表面放置在所述薄层多孔基质的第二侧面上。在某些实施方式中，所述基材包含网。在某些实施方式中，所述网包含多个开孔，每个开孔具有0.1μm至10mm的直径。在某些实施方式中，所述表面包含第二网。在某些实施方式中，所述第二网包含多个开孔，每个开孔具有0.1μm至10mm的直径。在某些实施方式中，所述多核苷酸当在所述基质中时与细胞组分分离。在某些实施方式中，所述多核苷酸在与细胞组分分离之前被标记。在某些实施方式中，所述多核苷酸在与细胞组分分离之后被标记。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含至少约200千碱基，例如至少约200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、850kb、950kb或1000kb，包括任两个所列出的值之间的范围。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含至少约1兆碱基。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含单链DNA、单链RNA、双链DNA或双链RNA。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质包含合成聚合物、天然存在的聚合物或其组合。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质包含聚丙烯酰胺基质、明胶基质、胶原蛋白基质、纤维蛋白基质、壳聚糖基质、藻酸盐基质、透明质酸基质或其任何组合。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质包含琼脂糖基质。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质包含基于多糖的基质。在某些实施方式中，所述多孔基质包含硅烷、带正电荷的基团、带负电荷的基团、两性离子基团、极性基团、亲水性基团、疏水性基团或其任何组合。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质以延伸的构型布置在所述表面上方。在某些实施方式中，所述薄层基质具有约1至999微米的厚度。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质具有约80至200微米的厚度。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被固定化在所述表面上。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质从所述表面脱离但仍保持紧密贴近于所述表面，使得所述层在整个所述处理中保持基本上延伸。在某些实施方式中，所述表面是刚性的。在某些实施方式中，所述表面是柔性的。在某些实施方式中，所述表面是载片、容器或片材的表面。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质基本上不含非多核苷酸细胞组分。在某些实施方式中，所述非多核苷酸细胞组分包含蛋白质、脂类、糖类、细胞器和细胞碎片中的至少一者。在某些实施方式中，所述位点特异性标记或酶法修饰包括至少用与第一序列基序结合的第一标记物进行标记。在某些实施方式中，所述位点特异性标记或酶法修饰还包括用与第二序列基序结合的第二标记物进行标记，其中所述第二标记物与所述第一标记物相同或不同。在某些实施方式中，所述位点特异性标记包括至少用掺入到双链DNA或RNA中的切口内的标记的寡核苷酸进行标记。在某些实施方式中，所述制备物还包含结合到所述第一基序的至少一种结合组成部分，其中所述结合组成部分包含以下至少一者：三螺旋寡核苷酸、肽核酸、聚酰胺、锌指DNA结合结构域、转录激活物样(TAL)效应物DNA结合结构域、转录因子DNA结合结构域、限制性酶DNA结合结构域、抗体或其组合。在某些实施方式中，所述位点特异性标记包括用选自荧光团、量子点和非光学标记物的标记物进行标记。

根据本文中的某些实施方式，提供了一种处理样品的方法。所述方法可以包括将所述样品固定化在布置在基材上方的薄层多孔基质中。所述方法可以包括处理捕获在基材结合层中的所述样品以除去不想要的组分，同时至少一种所需组分保持固定化在所述样品中。所述方法可以包括从所述多孔基质分离所述至少一种所需组分。所述方法可以包括表征所述至少一种所需组分。在某些实施方式中，所述所需组分包含以下至少一者：核酸、蛋白质、糖类、脂类、多糖、代谢物、小分子、抗体或其组合。在某些实施方式中，所述所需组分是DNA，并且其中所述表征包括确定浓度、质量度量、物理图谱、序列含量、表观遗传信息、SNP、单体型、RFLP、尺寸、拷贝数变体或其任何组合。在某些实施方式中，所述所需组分是RNA，并且其中所述表征包括确定浓度、质量度量、序列含量、表达水平、稳定性、剪接事件或其任何组合。在某些实施方式中，所述所需组分是蛋白质，并且其中所述表征包括确定浓度、纯度、序列含量、结构性质、抗体反应性、酶活性、抑制活性、翻译后修饰、毒性效应或其任何组合。在某些实施方式中，所述方法还包括在所述多核苷酸处于所述基质中时标记所述多核苷酸或共价修饰所述多核苷酸。

在某些实施方式中，提供了一种用于处理含有至少一种多核苷酸的样品的系统。所述系统可以包含多孔基质，其被配置成形成包含所述样品的薄层多孔基质。所述系统可以包含用于形成所述薄层多孔基质的基材。所述系统可以包含用于维持所述薄层多孔基质适形于基材的工具。在某些实施方式中，所述系统还包含用于在基本上布置在所述基材上方的所述薄层多孔基质周围形成孔的工具。在某些实施方式中，所述系统还包含用于将所述薄层多孔基质维持在所需温度下的工具。在某些实施方式中，所述系统还包含用于除去所述至少一种多核苷酸之外的样品组分的纯化试剂，用于用第一标记物标记所述至少一种多核苷酸的序列基序的第一标记试剂，以及用于从所述薄层多孔基质分离标记的多核苷酸的分离试剂，其中分离的多核苷酸的序列基序标记的模式能够被表征。在某些实施方式中，所述基材包含第一网，并且用于维持所述薄层多孔基质适形于基材的工具包含第二网。在某些实施方式中，所述第一网和第二网各自包含多个开孔，其中每个开孔具有0.1μm至10mm的直径。在某些实施方式中，所述系统包含流体系统。在某些实施方式中，所述系统被配置成自动形成所述薄层多孔基质。在某些实施方式中，所述系统被配置成接收预先形成的薄层多孔基质。在某些实施方式中，所述系统被配置成自动从所述薄层多孔基质分离标记的多核苷酸。在某些实施方式中，所述系统包含微流体系统。在某些实施方式中，所述多孔基质与纳米通道流体连通。

在某些实施方式中，提供了一种用于形成薄层多孔基质的试剂盒。所述试剂盒可以包含基材；以及包含一个或多个开孔的形成孔的装置，所述一个或多个开孔被配置成当紧靠所述基材放置时，限定垂直或基本上垂直于所述基材的一个或多个表面。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含薄层多孔基质前体。在某些实施方式中，所述形成孔的装置包含密封元件，所述密封元件被配置成针对所述基材形成密封。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含加压板，所述加压板被配置成将所述形成孔的装置紧靠所述基材固定。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含加热元件，所述加热元件被配置成加热所述基材和所述形成孔的装置。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含网。在某些实施方式中，所述基材包含PTFE涂层，所述涂层形成多个特征，所述特征被配置成维持薄层多孔基质布置在所述基材上方。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含流体装置。

在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述基材包括松或紧的网，由此将所述前体材料形成为插入在所述网的纤维的一个或多个表面之间或之上的薄层，从而将所述样品固定化在薄层多孔基质中。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，将所述薄层多孔基质固定化成插入在网的纤维的一个或多个表面之间或所述网的纤维的一个或多个表面上的薄层，以便于洗涤或标记来自于所述网的第一和第二表面的多核苷酸。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述基材包含特征，由此将所述前体材料形成为插入在所述特征之间的薄层，从而将所述样品固定化在薄层多孔基质中。在某些实施方式中，所述特征包含柱状物。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述薄层多孔基质通过与空气压力变化例如压缩空气或真空的接触来形成，由此将所述前体材料形成为薄层，从而将所述样品固定化在薄层多孔基质中。在某些实施方式中，与空气压力变化的接触包括压缩空气或真空。在某些实施方式中，对于任何上述方法来说，所述薄层多孔基质通过与离心力例如来自于离心机的离心力的接触来形成，由此将所述薄层多孔基质的前体形成为薄层，从而将所述样品固定化在薄层多孔基质中。在某些实施方式中，与离心力的接触包括来自于离心机的力。

附图简述

图1是示出了根据本文中的某些实施方式，处理包含多核苷酸的样品的方法的流程图。

图2是示出了根据本文中的某些实施方式，处理包含多核苷酸的样品的方法的流程图。

图3A和3B是示出了根据本文中的某些实施方式，载片上的薄层多孔基质的照片。如图3A中所示，将20ul琼脂糖-大肠杆菌(E.coli)混合物沉积在载片上，并通过用另一个载片在存在80um间隔物的情况下进行夹心来铺展。如图3B中所示，在由载片上的PTFE涂层所限定的直径为14mm且高度为100um的孔中，产生薄层多孔基质中的琼脂糖-哺乳动物培养细胞(黑色)。

图4A和4B是示出了根据本文中的某些实施方式，沉积在培养板中的琼脂糖-大肠杆菌混合物的照片。如图3A中所示，将20ul琼脂糖-大肠杆菌混合物沉积在6孔培养板的孔中。如图3B中所示，将900ul琼脂糖-大肠杆菌混合物沉积在10cm培养板中。在每个图3A和3B中，将琼脂糖-大肠杆菌混合物用移液管头铺展，以获得附着于其容器底部的薄层。添加尼龙网以保持所述层系留到所述表面。

图5A是示出了根据本文中的某些实施方式，在纳米通道(Irys^TM平台，BioNano Genomics)中伸展的标记的DNA分子的照片。骨架(非序列特异性)染色示出在(I)中。(I)中的两种分子的红色(位点特异性)标记模式示出在(II)中，而绿色(位点特异性)标记模式示出在(III)中。

图5B是示出了图5A的标记的DNA的标记度量的表。薄层多孔基质DNA纯化在载片上进行，随后用一种颜色进行基质内序列特异性标记或用两种颜色进行连续标记(G：绿色标记物；R：红色标记物；FP：假阳性；FN：假阴性)。

图6是示出了根据本文中的某些实施方式，在孔中进行系留的薄层DNA纯化，然后在薄层中进行序列特异性标记的标记度量的表(FP：假阳性；FN：假阴性)。

图7是示出了根据本文中的某些实施方式，进行微层/薄层DNA纯化，然后在溶液中进行序列特异性标记的标记度量的表(FP：假阳性；FN：假阴性)。

图8是示出了根据本文中的某些实施方式，在板中进行大规模薄层DNA纯化，然后在溶液中进行序列特异性标记的标记度量的表(FP：假阳性；FN：假阴性)。

图9是示出了根据本文中的某些实施方式，进行柱塞/多孔单元DNA纯化，然后在多孔单元中进行序列特异性标记的标记度量的表(FP：假阳性；FN：假阴性)。

图10A、10B、10C和10D是示出了符合本文中的某些实施方式的样品处理装置的照片。图10A示出了用于固持载片的金属底座10，其安装有用于温度控制的加热块。图10B示出了载片，其包含用放置在金属底座10上的网12系留的薄层多孔基质。图10C示出了孔形成单元14，其包括反应孔16和o型环18。图10D示出了在载片上组装的孔形成单元14，所述载片包含用尼龙网12系留的薄层多孔基质，并示出了反应孔16。还示出了用于封闭反应孔的盖子20。

图11是示出了在图10中所示的载片处理装置中用于薄层多孔基质DNA纯化和序列特异性标记的标记度量的表(FP：假阳性；FN：假阴性)。

图12A是示出了使用薄层多孔基质纯化的人类基因组材料的重新作图结果的表。

图12B是示出了来自于图12A中描述的重新作图的组装的基因组图谱的图。

图13A、13B和13C是示出了符合本文中的某些实施方式的样品处理装置的照片。图13A示出了所述装置的侧视图。图13B示出了所述装置的顶视图(不存在顶盖)。图13C示出了所述装置在存在顶盖的情况下的顶视图。

图14是示出了符合本文中的某些实施方式的2#样品处理装置的照片。图14示出了用于固持载片的金属底座140，其安装有用于温度控制的加热炉。

图15是示出了符合本文中的某些实施方式的2#样品处理装置的照片。图15示出了放置在金属底座145上的载片，其包含在用网144系留的聚四氟乙烯(PTFE)环143内铺展的薄层多孔基质。

图16A-G是示出了符合本文中的某些实施方式的2#样品处理装置的一系列照片。图16A示出了孔形成单元165。图16B示出了孔形成单元165，其包括反应孔167和o型环166。图16C示出了波形垫圈168。图16D示出了放置在载片上并包含用尼龙网164系留的薄层多孔基质的孔形成单元165，并示出了波形垫圈168位于每个反应孔167上方。图16E示出了金属加压板169。图16F示出了在载片上组装的孔形成单元165，其包含用尼龙网164系留的薄层多孔基质，并示出了加压板169位于孔形成单元165上方。图16G示出了用于产生顶部空气密封的胶黏密封薄膜170的放置。

图17A和17B是示出了根据本文中的某些实施方式，载片上的PTFE涂层环的特征的示意图。所述PTFE特征可以包含用于薄层多孔基质的持留柱状物。图17A示出了在涂层在载片162上的PTFE环163的内径周围的PTFE特征171，其用于在处理期间将薄层多孔基质保持在位。图17B示出了在涂层在载片172上的PTFE环173内部的整个孔上方均匀放置的PTFE特征171，其用于在处理期间将薄层多孔基质保持在位。

图18A和18B是示出了按照本文中的某些实施方式形成的薄层多孔基质的照片。图18A示出了载片上的薄层多孔基质。图18A示出了在向前体材料施加压缩空气后，薄层多孔基质172在载片162上的形成。图18B示出了多孔网基材上的薄层多孔基质。图18B示出了在将前体材料在两个载片之间压缩后，薄层多孔基质172在网164上的形成。

图19的表示出了根据本文中的某些实施方式的流程，完成薄层多孔基质(例如微层)流程的时间缩减，以及根据本文中的某些实施方式，使用2#样品制备装置进行微层/薄层DNA纯化，然后在基质(第1行)或溶液(第2行)中进行序列特异性标记的度量(FP：假阳性；FN：假阴性)。

图20的表示出了在根据本文中的某些实施方式进行薄层多孔基质(例如微层)DNA纯化，然后根据本文中的某些实施方式，使用2#样品制备装置在基质(第1行)或溶液(第2行)中进行序列特异性标记之后的DNA得率和DNA浓度。

图21的图示出了在根据本文中的某些实施方式使用2#样品制备装置进行的载片处理上，柱塞方法与符合本文中的某些实施方式的薄层多孔基质(例如微层)方法相比，获得≥1Mb n50重叠群尺寸所需的人类基因组深度(x覆盖度)。

图22的表示出了对于从基因组变体数据库(Database of GenomicVariants)(DGV)收集的并入到hg19中的一组187个已知倒位来说，DNA纯化和标记的符合本文中的某些实施方式的薄层多孔基质(例如微层)方法相对于柱塞方法的倒位(基因组结构变异)检测灵敏度。

图23的表示出了DNA纯化和标记的符合本文中的某些实施方式的薄层多孔基质(例如微层)方法相对于柱塞方法，在较高基因组深度下增加的n50重叠群尺寸(Mb)。

图24的表示出了DNA纯化和标记的符合本文中的某些实施方式的薄层多孔基质(例如微层)方法相对于柱塞方法，脆弱位点距离(bp)的减小。

图25的表示出了DNA纯化和标记的符合本文中的某些实施方式的薄层多孔基质(例如微层)方法相对于柱塞方法，DNA尺寸(kb)的增加。值得注意的是，尽管柱塞可以纯化高达350kb至400kb的DNA，但符合本文中的某些实施方式的薄层多孔基质方法可以纯化至少1000kb的DNA(除了小于1000kb的DNA之外)。

详细描述

单分子水平上的基因组作图可以包括多核苷酸的纯化和标记，某些所述多核苷酸含有至少1兆碱基的材料。根据本文中的某些实施方式，提供了用于纯化和任选地标记多核苷酸的方法和结构。在某些实施方式中，将多核苷酸固定化在多孔基质中。在某些实施方式中，所述多孔基质相对于其体积具有高的表面积。高的表面积可以便于除去非多核苷酸分子和其他操作，同时所述多核苷酸仍保持固定化在所述多孔基质中。在某些实施方式中，所述多核苷酸在被固定化在所述多孔基质中的同时被标记。在某些实施方式中，将所述多核苷酸从所述基质除去，然后进行标记。

根据本文中的某些实施方式，用于处理多核苷酸的方法和组合物可以产生高纯度的含有兆碱基的多核苷酸分子，并且可以便于标记和除去非多核苷酸分子。传统上，处理大的多核苷酸分子包括将生物样品包埋在琼脂糖柱塞中并纯化。然而，在这种柱塞中用于产生纯化的多核苷酸的典型的机械操作可以限制柱塞的可接近表面积，并且可以使含有多核苷酸的柱塞变成基质内反应的不良候选者。尽管可以将生物样品包埋在琼脂糖微珠或纤维中以增加用于基质内反应的表面积，但这种配置可能限制用于纯化和/或顺序酶法处理的机械处理。此外，微珠难以生产和操纵。例如，微珠可能粘着到试管侧壁和移液管头内部，并容易变得透明且难以观察。此外，制造微珠的方法可能产生不一致的结果。也被称为“琼脂糖线虫”的琼脂糖纤维可能引起与微珠相似的挑战。在本文中认识到，符合本文中的某些实施方式的多核苷酸的处理，在将多核苷酸以可接近的方式固定化在多孔基质中的同时，可以从样品污染物中纯化多核苷酸(包括大的多核苷酸例如含有兆碱基的多核苷酸)，并且便于高效的多核苷酸操作。如实施例1-6中所示(也参见图5B、图6-9和图11的标记度量)，本文中的实施方式可以以高的标记速率和低的假阳性(FP)和假阴性(FN)率得到纯化的多核苷酸。所述多核苷酸可以在随后被回收和分析。

多孔基质

根据某些实施方式，提供了一种多孔基质。所述多孔基质可以包含孔眼以允许分子例如标记物和非多核苷酸分子(例如将要从样品中除去的分子)进、出所述基质和在所述基质内的移动。在某些实施方式中，多孔基质从前体材料形成。例如，液体琼脂糖溶液可以在冷却后形成基质。因此，在某些实施方式中，通过将多核苷酸与所述前体材料相接触，然后形成基质以使所述多核苷酸被包埋在其中，将所述多核苷酸包埋在所述多孔基质中。

在某些实施方式中，所述多孔基质包含合成聚合物、天然存在的聚合物或两者的组合。在某些实施方式中，所述多孔基质包含琼脂糖基质、聚丙烯酰胺基质、明胶基质、胶原蛋白基质、纤维蛋白基质、壳聚糖基质、藻酸盐基质、透明质酸基质或所列出的条目的两者或更多者，例如所列出的条目的2、3、4、5、6、7或8者的组合。在某些实施方式中，将两种或更多种列出的材料的前体的组合合并，并形成为多孔基质。在某些实施方式中，形成由两种或更多种列出的材料形成的多孔基质，然后合并。在某些实施方式中，所述多孔基质是琼脂糖基质。在某些实施方式中，所述多孔基质是基于多糖的基质。作为一些实例，例如核酸，可以在水性环境中溶解。在某些实施方式中，所述多孔基质包含水性环境。在某些实施方式中，所述基质本身被布置在水性环境例如水性缓冲液中。

对于多孔基质来说，取决于多孔基质的所需功能，包含一个或多个官能团可能是有用的。例如，不受任何特定理论限制，通过在基质中包含亲水官能团，可以便于从基质中除去疏水性材料。例如，不受任何特定理论限制，通过基质中带正电荷的官能团，可以便于多核苷酸在所述基质中的固定化。因此，在某些实施方式中，所述多孔基质包含硅烷、带正电荷的基团、带负电荷的基团、两性离子基团、极性基团、亲水性基团、疏水性基团，或所列出的条目的两者或更多者，例如所列出的条目的2、3、4、5、6或7者的组合。

薄层多孔基质

当在本文中使用时，薄层多孔基质是指厚度小于其宽度或长度的多孔基质材料，其中所述厚度不超过999微米。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质具有不超过999微米的厚度，例如约1微米、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、960、970、980、990、991、992、993、994、995、996、997、998或999微米，包括任两个所列出的值之间的范围。在某些实施方式中，所述薄层具有约1微米至约999微米、1微米至800微米、1微米至600微米、1微米至400微米、1微米至200微米、1微米至150微米、1微米至100微米、10微米至800微米、10微米至600微米、10微米至400微米、10微米至200微米、10微米至150微米、10微米至100微米、20微米至800微米、20微米至600微米、20微米至400微米、20微米至200微米、20微米至100微米、20微米至150微米、50微米至800微米、50微米至600微米、50微米至400微米、50微米至200微米、50微米至100微米、50微米至150微米、100微米至800微米、100微米至600微米、100微米至400微米或100微米至200微米的厚度。

在某些实施方式中，薄层多孔基质从前体材料形成。在某些实施方式中，所述多孔基质从含有包含至少一种多核苷酸的生物样品的前体材料形成。例如，可以将生物样品添加到所述多孔基质的液体前体，使得当将所述液体前形成为多孔基质时，所述生物样品可以固定化在其中。

在某些实施方式中，所述薄层多孔基质在所述基质形成时不含所述生物样品或多核苷酸。可以例如通过施加电场，将所述生物样品或多核苷酸添加到所述薄层多孔基质。在某些实施方式中，在所述多孔基质形成的同时添加所述生物样品或多核苷酸。

在某些实施方式中，所述多孔基质与基材结合。广泛的各种基材可以与本文中的实施方式联合使用。在某些实施方式中，所述基材是刚性的。在某些实施方式中，所述基材是柔性的。在某些实施方式中，所述基材包含载片、容器或片材的表面。在某些实施方式中，形成所述薄层多孔基质以使所述基材限定了所述薄层多孔基质的至少一个侧面。在某些实施方式中，薄层多孔基质被形成在所述基材与另一个表面或一组表面之间，由此限定了所述薄层多孔基质的厚度、直径或体积中的至少一者。例如，可以将液体基质前体例如琼脂糖在模具中冷却以形成薄层多孔基质。例如，较厚的多孔基质可以被机械或化学操作，例如通过剃除、切除、磨除或溶解掉一部分基质以便将它形成为薄层。在某些实施方式中，将前体材料放置在基材上并铺展成薄层，其形成所述多孔基质。在某些实施方式中，将所述基材包埋在所述薄层多孔基质中。任选地，所述基材包含如本文中所述包含多个纳米或微米尺度的开孔的网。

“适形于”基材的薄层多孔基质是指所述薄层多孔基质的主表面(即具有最大表面积的两个表面之一)被放置成平行或基本上平行于所述基材的主表面。如果当在侧视图中观察(以便将两个直径的表述合并在单一平面内)时，所述薄层多孔基质的主表面的最长直径平行于所述基材的主表面的最长直径或以小于15°的角与所述基材的主表面相交，则所述薄层多孔基质的主表面被认为基本上平行于所述基材的主表面。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质适形于所述基材，使得所述基材被包埋在所述薄层多孔基质中。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质适形于所述基材，使得它以基本上平坦的构型被布置在所述基材上方。当在本文中使用时，“基本上平坦”以及该根术语的变化形式是指所述薄层多孔基质不具有相接触的两个不相邻的边，并且最长的直径和与其垂直的直径各自分别为当所述薄层多孔基质以完全平坦但不形变的构型铺展时的最长直径和与其垂直的直径的至少80％。在某些实施方式中，在从所述多孔基质除去非多核苷酸的整个过程中，薄层多孔基质保持以基本上平坦的构型布置在所述基材上方。在某些实施方式中，在所述多核苷酸被标记时，薄层多孔基质保持以基本上平坦的构型布置在所述基材上方。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被固定化在所述基材上。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被共价结合到所述基材。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被脱离但仍紧密贴近于所述表面，使得所述层在整个处理期间保持基本上平坦地延伸。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质采取基本上平坦的构型，并且所述薄层多孔基质的最长直径上的所有点距所述基材不超过100微米，例如距所述基材不超过100微米、99、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、5、6、5、4、3、2或1微米。

在某些实施方式中，薄层多孔基质被维持在基本上平坦的构型。所述薄层多孔基质可以在所述样品处理的整个过程中被维持在基本上平坦的构型。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质通过例如网或织带被系留到所述基材，所述网或织带被配置成将所述薄层多孔基质维持在基本上平坦的构型并紧密贴近于所述基材。在某些实施方式中，通过压力、摩擦或电磁力中的至少一者将所述薄层多孔基质维持在基本上平坦的构型并紧密贴近于所述基材。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被放置在从所述基材突出的两个或更多个特征例如柱状物之间，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500个特征，包括任两个所列出的值之间的范围。适合于本文中的某些实施方式的特征的实例包括在所述基材上由聚合物涂层例如PTFE形成的柱状物(参见例如图17A-B)。在某些实施方式中，通过包含螺纹、缝合、织带、网、夹子或织物中的至少一者的附连，将所述薄层多孔基质维持在基本上平坦的构型并紧密贴近于所述表面。任选地，所述基材包含第一网，并且将包含第二网的表面放置在所述薄层多孔基质的与所述基材相反的侧面上(即所述薄层多孔基质被夹在两个网之间)，以维持所述层在布置在所述基材上方的位置中。不受任何理论限制，据设想将薄层多孔基质置于网基材和第二网表面之间，可以便于固定化在所述薄层多孔基质中的多核苷酸的洗涤和/或标记。在某些实施方式中，所述附连允许接近所述薄层多孔基质。在某些实施方式中，所述附连允许所述薄层多孔基质的水性相与水性溶液流体连通。可以将所述薄层多孔基质浸泡在所述水性溶液中。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质未附连到所述表面或者被可逆地附连到所述表面。在本文中设想了当从所述薄层多孔基质回收核酸时，脱离的基质可能便于所述回收。

基材

根据本文中的某些实施方式，可以使用各种不同的基材。

在某些实施方式中，所述基材包含载片。任选地，将所述载片用聚合物例如PTFE涂层。任选地，所述聚合物形成所述基材的可以将薄层多孔基质在所述基材上保持在位的特征，例如两个或更多个柱状物，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、90、100、120、150、200、250、300、400、500或1000个柱状物，包括任两个所列出的值之间的范围。图17A和17B是示出了根据本文中的某些实施方式，载片上的PTFE涂层的环的PTFE特征的示意图。所述PTFE特征可以包含用于薄层多孔基质的持留柱状物。图17A示出了涂层在载片162上的PTFE环163的内径周围的PTFE特征171，其用于在处理期间将薄层多孔基质保持在位。图17B示出了在涂层在载片172上的PTFE环173内部的整个孔上方均匀放置的PTFE特征171，其用于在处理期间将薄层多孔基质保持在位。

在某些实施方式中，所述基材是刚性的。在某些实施方式中，所述基材是柔性的。在某些实施方式中，所述基材包含载片、容器或片材。

在某些实施方式中，所述基材包含网，例如尼龙网或金属网或聚合物网例如PTFE网。所述网可以包含多个开孔。所述多个开孔可以具有至少0.1nm的直径，例如0.1nm、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、700、900、1000、2000、3000、5000、9000或10000nm，包括任两个列出的值之间的范围，例如0.1nm至10mm、0.1nm至1mm、0.1nm至500nm、0.1nm至100nm、0.1nm至10nm、1nm至10mm、1nm至1mm、1nm至500nm、1nm至100nm、1nm至10nm、10nm至1mm、10nm至500nm、10nm至100nm、100nm至10mm或100nm至1mm。在某些实施方式中，所述网的开孔具有近似相同尺寸的直径。在某些实施方式中，所述网的开孔具有不同尺寸的直径。

多核苷酸

根据本文中的实施方式，可以处理各种不同的多核苷酸。基因组多核苷酸可以包括DNA、RNA或DNA与RNA的组合。因此，在某些实施方式中，所述多核苷酸包含DNA。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含RNA。在某些实施方式中，所述多核苷酸是双链的。在某些实施方式中，所述多核苷酸是单链的。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含DNA-RNA杂合体。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含至少约100千碱基(kb)，例如至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、15,000、20,000、30,000或40,000千碱基，包括任两个所列出的值之间的范围。

基因组多核苷酸可以包含各种不同的修饰，例如表观遗传修饰例如甲基化。因此，在某些实施方式中，所述多核苷酸包含对多核苷酸骨架的一种或多种修饰，例如甲基化。在某些实施方式中，一种或多种修饰已从所述多核苷酸移除。

生物样品

根据本文中的实施方式，可以提供各种不同的包含多核苷酸的生物样品。在某些实施方式中，所述样品包含一个或多个全细胞。在某些实施方式中，所述样品包含一个或多个单细胞生物体。在某些实施方式中，所述样品包含多细胞生物体的一个或多个细胞。在某些实施方式中，所述样品包含多细胞生物体的组织。在某些实施方式中，所述样品包含两种或更多种细胞类型的组合。

在某些实施方式中，所述样品包含至少一个细胞的至少一部分。在某些实施方式中，所述样品包含与其他部分分离的细胞的含有核酸的部分。例如，可以在沉降速率的基础上(例如通过离心)将核与细胞的其他部分分离。

在某些实施方式中，所述样品包含细胞悬液、核悬液、细胞器悬液、细胞匀浆物、组织匀浆物、全生物体匀浆物和生物流体中的至少一者。

非多核苷酸及其去除

当在本文中使用时，“非多核苷酸”包括该根术语的变化形式，是指来自于生物样品的不是多核苷酸的任何分子、复合物或结构。示例性的非多核苷酸包括细胞中存在的生物分子(除了多核苷酸之外)，包括但不限于多肽、氨基酸、单核苷酸、糖类、脂类、辅因子、无机分子、细胞器及其组分、细胞碎片等。在某些实施方式中，所述被除去的非多核苷酸包含蛋白质、脂类、糖类、细胞器和细胞碎片中的至少一者。

由于非多核苷酸分子的存在可以干扰多核苷酸的操作、处理和分析，因此在某些实施方式中，将非多核苷酸分子与所述多核苷酸分离。在某些实施方式中，将非多核苷酸分子从所述多孔基质除去，而此时所述多核苷酸仍保持在所述多孔基质中。在某些实施方式中，在从所述多孔基质除去之前，非多核苷酸经历修饰、处理和/或降解。

在某些实施方式中，当所述非多核苷酸被除去时，多核苷酸保持固定化在所述多孔基质中。在某些实施方式中，当所述非多核苷酸被除去时，所述多核苷酸保持在所述基质中，但不必定被固定化。

不受任何特定理论限制，所述多孔基质中的非多核苷酸分子可以被修饰或降解，以便于它们从所述多孔基质离开。因此，在某些实施方式中，除去所述非多核苷酸分子包括将所述多孔基质与弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、脂肪酶、糖水解酶、果胶酶、果胶溶解酶、淀粉酶、RNA酶、透明质酸酶、几丁质酶、gluculase、溶壁酶、酵母裂解酶、溶菌酶、labiase、消色肽酶或其组合相接触。在某些实施方式中，除去所述非多核苷酸分子包括将所述多孔基质与蛋白酶相接触。在某些实施方式中，除去非多核苷酸包括施加电场以除去至少一些所述非多核苷酸。

所述多核苷酸的纯化可以包括将非多核苷酸包括修饰或降解的非多核苷酸从所述多孔基质洗出去。因此，在某些实施方式中，除去非多核苷酸分子包括将所述多孔基质与去污剂、离液剂、缓冲剂、螯合剂、水溶性有机溶剂、聚合物(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙二醇)、盐、酸、碱、还原剂或其组合相接触。在某些实施方式中，除去所述非多核苷酸分子包括用包含缓冲剂、去污剂、离液剂、螯合剂、醇、酸、碱、还原剂、聚合物或其组合的溶液洗涤所述多孔基质。在某些实施方式中，除去非多核苷酸分子包括施加电场以除去至少一些非多核苷酸分子。

在某些实施方式中，从所述多孔基质纯化所述多核苷酸，其在所述基质中没有进行任何标记或表征。然后可以将所述多核苷酸用于专业技术人员已知的各种下游应用中的任一种。设想了使用本文中所描述的方法，可以纯化特别粗的起始原料(例如全细胞提取物)，并提供比使用标准柱塞的纯化更干净的核酸，这是因为符合本文中的某些实施方式的方法提供了增强的酶和化学洗涤动力学。

在除去非多核苷酸分子之前在所述多孔基质中进行所述样品的一些处理，可能是有用的。例如，在除去其他组分之前将所述样品的含有核酸的组分集中到特定区域，可能是有用的。在某些实施方式中，在除去非多核苷酸分子之前进行基质内核富集。

标记

根据本文中的某些实施方式，可以使用各种不同的方法和组合物来标记多核苷酸。在某些实施方式中，多核苷酸经历位点特异性标记，以例如标记一个或多个序列基序。在某些实施方式中，多核苷酸经历非位点特异性标记，以例如标记骨架。在某些实施方式中，所述多核苷酸经历位点特异性标记和非位点特异性标记。

标记可以在固定化在本文中描述的多孔基质中的多核苷酸上进行，和/或可以在从所述基质分离所述多核苷酸之后进行。在某些实施方式中，所述多核苷酸在所述基质中进行标记。在某些实施方式中，将所述多核苷酸从所述基质分离，然后进行标记。某些实施方式中，所述多核苷酸在所述基质中经历至少一个标记事件，并且在从所述基质分离后经历至少一个标记事件。例如，在某些实施方式中，所述多核苷酸在所述基质内经历位点特异性标记，并在与所述基质分离后经历非位点特异性标记。

在某些实施方式中，所述多核苷酸被两个或更多个标记物例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个标记物标记。在某些实施方式中，两个或更多个标记物是不同的。在某些实施方式中，两个或更多个标记物是相同的。在某些实施方式中，将所述多核苷酸用至少一种位点特异性标记物和至少一种不同于所述位点特异性标记物的非序列特异性标记物标记。在某些实施方式中，将所述多核苷酸用两种或更多种位点特异性标记物标记，并且所述非序列特异性标记物不同于所述位点特异性标记物。

在某些实施方式中，将第一多核苷酸用第一标记物标记，并且将第二多核苷酸用第二标记物标记。在某些实施方式中，所述第一和第二标记物是相同的。在某些实施方式中，所述第一和第二标记物是不同的。在某些实施方式中，将第三多核苷酸用第三标记物标记。所述第三标记物可以与所述第一和第二标记物中的任一者或两者相同或不同。

根据本文中的实施方式，可以使用各种不同的用于位点特异性标记的方法。在某些实施方式中，将所述多核苷酸与序列特异性探针相接触。在某些实施方式中，所述多核苷酸是双链的，并且位点特异性标记包括在第一序列基序处切刻所述多核苷酸从而形成至少一个切口，使得所述多核苷酸在与所述一个或多个切口相邻处保持双链，并且用所述第一标记物标记所述一个或多个切口。在某些实施方式中，至少一个核苷酸被并入到所述切口中。所述并入的核苷酸可以包含便于标记的组成部分，例如可逆终止子、反应性基团或标记物本身。

适合情况下，探针是包含本文中所描述的标记物的核酸(单个或多个)。在某些实施方式中，探针是序列特异性的(例如AGGCT或一些其他特定碱基序列)。在某些实施方式中，探针被随机产生。如本文中所述，探针可以在用户愿望的基础上选择或构建，以使所述探针结合于目标序列，或者在一种可选方案中结合于特定DNA聚合物上目标序列或其他区域上游或下游的序列(即探针结合以便位于目标区域两侧或将目标区域夹在其中)。探针可以与悬垂片一样长(即最多约1000碱基)。适合情况下，探针长度在1至约500碱基或约1至100碱基或约3至50碱基范围内，或者长度甚至在约5至约20碱基范围内。

在某些实施方式中，多核苷酸例如RNA或DNA，通过将探针杂交到所述多核苷酸的单链来标记。所述探针可以与所述RNA或DNA的链或其一部分互补。在某些实施方式中，所述探针与特定序列基序互补。在某些实施方式中，提供多个探针以便与多个特异性序列基序互补，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5,000或10,000个探针，包括任两个所列出的值之间的范围。在某些实施方式中，所述探针具有随机序列。在某些实施方式中，提供具有多个随机序列的探针。

在某些实施方式中，双链DNA可以如下标记：首先通过提高温度或使用有机溶剂操作来解开某些基因组区域的双链之间的氢键以打开所谓的D-环，然后与对单链区具有相等或更高亲和性的至少一种特异性探针杂交，随后退火回到相对稳定的形式。因此，在某些实施方式中，双链DNA可以如本文中所述用探针标记，而不用在任一条链上形成切口。在某些实施方式中，可以在单一链上打开多个D-环。因此，可以将多个探针退火到特定双链DNA。

在某些实施方式中，标记包括将标记物通过甲基转移酶转移到所述多核苷酸。在某些实施方式中，所述甲基转移酶特异性地甲基化序列基序。因此，标记可以包括通过甲基转移酶将标记物转移到序列基序。示例性的适合的DNA甲基转移酶(MTase)包括但不限于M.BseCI(在N6处甲基化5'-ATCGAT-3'序列内的腺嘌呤)、M.Taql(在N6处甲基化5'-TCGA-3'序列内的腺嘌呤)和M.Hhal(在C5处甲基化5'-GCGC-3'序列内的第一个胞嘧啶)。在某些实施方式中，两种或更多种甲基转移酶提供两种或更多种标记物，其可以是相同或不同的。

在某些实施方式中，所述位点特异性标记包括将反应性基团转移到所述第一序列基序；以及将标记物偶联到所述第一反应性基团。

在某些实施方式中，双链多核苷酸如下进行标记：首先在双链多核苷酸的第一链产生切口。适合情况下，这种切口的形成在一个或多个序列特异性位置处进行，尽管所述切口形成也可以在一个或多个非特异性位置、包括随机或非特异性位置处进行。适合情况下，切口形成可以通过将所述双链多核苷酸暴露于形成切口的内切核酸酶或切口酶来实现。适合情况下，切口酶是高度序列特异性的，意味着它们以高度特异性结合特定碱基序列(基序)。切口酶可以例如从New EnglandBioLabs获得(可登陆万维网址www.neb.com)。示例性的切口酶包括但不限于Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII及其组合。切口形成也可以通过在多核苷酸链中进行断裂或切割的其他酶来实现。这种断裂或切口也可以通过暴露于电磁辐射(例如UV光)、一种或多种自由基等来实现。切口可以通过这些技术中的一种或多种来实现。在某些实施方式中，适合情况下，将替换碱基掺入到双链多核苷酸的第一链(即有切口的链)中，包括将所述多核苷酸与聚合酶、一种或多种核苷酸、连接酶或其任何组合相接触。在某些实施方式中，在标记有切口的多核苷酸之后用连接酶处理，可以恢复所述双链多核苷酸的完整性并显著提高得到的链的强度。

在某些实施方式中，靶向相同序列基序但在相反链处产生切口的切口酶，被用于靶向特定DNA链以最小化脆弱位点的形成。在某些实施方式中，切口酶已被修饰，以仅仅结合到双链DNA的一条链。在某些实施方式中，切口酶被用于靶向来自于第一DNA分子的单链和来自于第二DNA分子的单链。在某些这些实施方式中，来自于所述第一DNA的单链被第一切口酶靶向，并且来自于所述第二DNA分子的互补链被识别与所述第一切口酶相同的序列基序的第二切口酶靶向。在某些实施方式中，对于所述链之一来说，延伸方向被逆转。例如，在某些实施方式中，从切口形成位点的延伸对于第一DNA分子来说以一个方向进行，而对于第二DNA分子来说以相反方向进行。在某些实施方式中，从切口形成位点的延伸对于DNA分子的上链来说以一个方向进行，并且对于同一DNA分子的下链来说以相反方向进行。

在某些实施方式中，对包含第一多核苷酸链和第二多核苷酸链的双链多核苷酸进行处理，以产生所述第一多核苷酸链的未杂交的悬垂片和所述第二多核苷酸链上的对应区域，所述未杂交的悬垂片包含约1至约1000个碱基；沿着所述第二多核苷酸链的对应区域延伸所述第一多核苷酸链；以及至少标记所述未杂交的悬垂片的一部分、所述延伸的第一多核苷酸链的一部分。适合情况下，标记可以如下实现：(a)将至少一个互补的探针结合到未杂交的悬垂片的至少一部分，所述探针包含一种或多种标记物；(b)利用包含一种或多种标记物的核苷酸作为替换碱基，所述替换碱基是沿着所述第二多核苷酸链的对应区域延伸的所述第一多核苷酸链的一部分；或(a)与(b)的任何组合。通过这种方式，悬垂片、填充到间隙中的碱基或两者，可以被标记。

各种不同物质可以充当可以在本文中提供的方法中使用的标记物。标记物可以包括例如荧光团、量子点、树枝状聚合物、纳米丝、珠子、半抗原、链亲和素、亲和素、中性亲和素、生物素和反应性基团、肽、蛋白质、磁珠、放射性标记物或非光学标记物。在某些实施方式中，所选的标记物是荧光团或量子点。

在某些实施方式中，本文中描述的至少一种标记物包含非光学标记物。各种不同的非光学标记物可以与本文中的实施方式联合使用。在某些实施方式中，非光学标记物包含电子标记物。示例性的电子标记物包括但不限于具有强电荷的分子，例如离子如金属离子、带电荷的氨基酸侧链或其他阳离子或阴离子。电子标记物可以例如通过当所述标记物被布置在检测器中时的电导率(或电阻率)来检测。在某些实施方式中，纳米通道包含电极，其被配置成通过确定布置在所述通道中的物质的电导率或电阻率来确定电子标记物的存在或不存在。在某些实施方式中，所述非光学标记物包含金属、金属氧化物或氧化硅组成部分。在某些实施方式中，所述非光学标记物包含含有金属、金属氧化物或其他氧化物的组成部分(例如纳米粒子)。特定金属或氧化物组成部分的存在可以例如通过核磁共振来检测。在某些实施方式中，所述标记物被配置成在某些条件(例如pH的改变)下释放组成部分例如质子或阴离子，并检测释放的组成部分的存在或不存在。

在某些实施方式中，位点特异性标记包括将所述多核苷酸的序列基序与特异性结合所述序列基序的结合组成部分相接触。各种不同的结合组成部分可以与本文中的实施方式联合使用。示例性的结合组成部分包括但不限于三螺旋寡核苷酸、肽、核酸、糖类、聚酰胺、锌指DNA结合结构域、转录激活物样(TAL)效应物DNA结合结构域、转录因子DNA结合结构域、限制性酶DNA结合结构域、抗体，以及两种或更多种所列出的结合组成部分的组合。

在某些实施方式中，探针包括下列一者或多者：有机荧光团，量子点，树枝状聚合物，纳米丝，珠子，Au珠，顺磁性珠子，磁珠，放射性标记物，聚苯乙烯珠，聚乙烯珠，肽，蛋白质，半抗原，抗体，抗原，链亲和素，亲和素，中性亲和素，生物素，核苷酸，寡核苷酸，序列特异性结合因子例如工程化改造的限制性酶、甲基转移酶、锌指结合蛋白等。在某些实施方式中，所述探针包括荧光团-淬灭剂对。探针的一种配置可以包括将荧光团附连到探针的第一末端，并将适合的淬灭剂连接到探针的第二末端。因此，当所述探针未杂交时，所述淬灭剂可以阻止荧光团产生荧光，而当所述探针杂交到靶序列时，探针被线性化，因此淬灭剂远离荧光团并允许荧光团在被适合波长的电磁辐射激发时产生荧光。在某些实施方式中，第一探针包括FRET对的第一荧光团，并且第二探针包括FRET对的第二荧光团。因此，所述第一探针和第二探针与彼此的FRET半径内的单一悬垂片或一对悬垂片的杂交，可以允许通过FRET进行能量转移。在某些实施方式中，第一探针包括FRET对的第一荧光团，并且在被并入以填补相应间隙的核苷酸上的标记物可以包括FRET对的第二荧光团。因此，所述第一探针与悬垂片的杂交和相应间隙内的标记的核苷酸，可以允许通过FRET进行能量转移。

在某些实施方式中，所述标记包括将所述多核苷酸与染料或染色剂相接触。在某些实施方式中，所述染料或染色剂是非序列特异性标记物例如嵌入剂。可以根据本文中的实施方式使用的示例性的非序列特异性标记物包括YOYO、POPO、TOTO、SYBR Green I(Molecular Probes)、PicoGreen(Molecular Probes)、碘化丙啶、溴化乙锭等。

从多孔基质分离多核苷酸

在多核苷酸已在多孔基质中经历所需处理后，从所述多孔基质分离所述多核苷酸可能是有用的，以例如分析或表征所述多核苷酸。

在某些实施方式中，在非多核苷酸已被除去之后，从所述多孔基质分离所述多核苷酸。

根据本文中的实施方式，可以使用各种不同的方法从所述多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，分离包括以下至少一者：融化所述多孔基质、消化所述多孔基质、降解所述多孔基质、溶解所述多孔基质、电洗脱、通过筛的离心、转印到膜上、透析步骤或两种或更多种所列出的方法的组合。在某些实施方式中，例如在所述多孔基质包含琼脂糖的实施方式中，将所述多孔基质融化并与琼脂糖酶接触，以从所述多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，在基质中以序列特异性方式纯化和标记DNA之后，通过融化/消化(例如对于琼脂糖来说)、透析以及随后与流动缓冲液混合，将它回收。在某些实施方式中，所述流动缓冲液包含非特异性多核苷酸标记物，例如DNA骨架染色染料(例如YOYO或POPO)。所述非特异性标记可便于随后在例如流体通道如Irys^TM系统(Bionano genomics)中的分析。

在某些实施方式中，在从所述多孔基质分离所述多核苷酸之后，对所述多核苷酸进行分析和/或表征。如果所述多核苷酸已用至少一种位点特异性标记物标记，则可以检测所述多核苷酸特征性的位点特异性标记的模式。在某些实施方式中，检测两种或更多种位点特异性标记物的模式。在某些实施方式中，参照所述多核苷酸的非特异性标记物来检测位点特异性标记的模式。

根据本文中的实施方式，用于检测标记模式的方法可以包括将所述多核苷酸线性化。将多核苷酸线性化的手段可以包括使用液体流动、毛细管流动、对流流动的剪切力、电场、介电场、热梯度、磁场或其组合(例如使用物理约束和电场)，或本领域技术人员已知的任何其他方法。在某些实施方式中，将所述多核苷酸在流体通道例如微通道或纳米通道例如Irys^TM系统(Bionano Genomics)中线性化并进行分析。纳米通道和涉及纳米通道使用的方法的实例，提供在美国公开号2011/0171634和2012/0237936中，其全部内容通过参考并入本文。

在某些实施方式中，所述流体通道包含微通道。在某些实施方式中，所述流体通道包含纳米通道。适合的流体纳米通道区段具有小于约1000nm、小于约500nm、或小于约200nm、或小于约100nm、或甚至小于约50nm、约10nm、约5nm、约2nm或甚至小于约0.5nm的特征性横截面维度。适合情况下，流体纳米通道区段具有小于分子的回转半径的约2倍的特征性横截面维度。在某些实施方式中，所述纳米通道具有至少约所述分子的持续长度的特征性横截面维度。适合于本发明的流体纳米通道区段具有至少约100nm、至少约500nm、至少约1000nm、至少约2微米、至少约5微米、至少约10微米、至少约1mm或甚至至少约10mm的长度。在某些实施方式中，流体纳米通道区段以每立方厘米至少1个流体纳米通道区段的密度存在。

分析可以包括将所述多核苷酸上的位点特异性标记模式与参比多核苷酸的进行比较。这种比较可以指示所述多核苷酸的尺寸，突变、遗传标志物和/或基因组重排事件例如缺失、重复、倒位等的存在或不存在。在某些实施方式中，将第一标记物、第二标记物或所述第一与第二标记物的组合的模式与参比DNA上标记物的模式进行比较。在某些实施方式中，所述参比DNA的模式通过实验确定。在某些实施方式中，所述参比DNA的模式在计算机中确定。

在某些实施方式中，在位点特异性标记的重叠模式的基础上组装多个模式，由此构建多核苷酸图谱。

处理包含多核苷酸的样品的方法

根据某些实施方式，提供了处理包含多核苷酸的样品的方法。所述方法可以包括将所述样品固定化在多孔基质中。所述方法可以包括从所述多孔基质除去非多核苷酸分子，而同时所述多核苷酸保留在所述基质中。在某些实施方式中，从薄层多孔基质除去所述非多核苷酸分子。在某些实施方式中，从所述多孔基质除去所述非多核苷酸分子，并将所述多孔基质破碎以便形成多个多孔单元。在某些实施方式中，在破碎之前从所述基质除去非多核苷酸分子。在某些实施方式中，在破碎之前从所述基质除去非多核苷酸分子。在某些实施方式中，在破碎之前和破碎之后从所述基质除去非多核苷酸分子。不受任何理论限制，已发现当去除在破碎之后进行时，除去非多核苷酸分子的效率通常更高。在某些实施方式中，在除去所述非多核苷酸分子之后收集破碎的多孔单元。例如，所述多孔单元可以通过离心来收集。在某些实施方式中，在破碎之前和破碎之后从所述基质除去非多核苷酸分子，以便优化去除所述非多核苷酸分子的动力学。在某些实施方式中，所述多核苷酸被标记。在某些实施方式中，从所述基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，检测位点特异性标记的模式。

不受任何特定理论限制，增加所述多孔基质的相对表面积可以提高从所述多核苷酸除去非多核苷酸分子的有效性和效率，和/或可以提高在其中标记多核苷酸的有效性和效率。因此，在某些实施方式中，所述多孔基质处于具有相对高的表面积的构型中，例如作为薄层或作为多个多孔单元。在某些实施方式中，将所述样品包埋在前体材料，然后使所述多孔基质形成所需形状或构型。例如，所述前体材料可以是液体，并且可以被倾倒在模具或仓室中，以便在所述液体形成多孔基质时使多孔基质形成所需形状。在某些实施方式中，将所述多孔基质成型为具有高表面积的构型(例如薄层或多孔单元)，然后例如通过电磁场或通过扩散将所述样品添加到所述基质。

图1示出了根据本文中的某些实施方式，处理包含多核苷酸的样品的方法。在某些实施方式中，在110中将样品固定化在前体材料中。在120中，可以使所述前体材料形成薄层多孔基质。在125中，可以使所述薄层多孔基质适形于基材。任选地，可以在所述薄层多孔基质形成时使所述薄层多孔基质适形于所述基材。任选地，可以在薄层多孔基质形成后使所述薄层多孔基质适形于所述基材。在某些实施方式中，在130中，形成薄层多孔基质。在135中，可以使所述薄层多孔基质适形于基材。任选地，可以在所述薄层多孔基质形成时使所述薄层多孔基质适形于所述基材。任选地，可以在薄层多孔基质形成后使所述薄层多孔基质适形于所述基材。在140中，可以将所述样品固定化在所述薄层多孔基质中。由此在150中，可以将所述样品固定化在薄层多孔基质中，其中使所述薄层基质适形于基材。在160中，可以将所述非多核苷酸分子从布置在所述表面上方的薄层多孔基质除去，而所述多核苷酸仍保持固定化在所述薄层多孔基质中。在170中，任选地可以从所述基质分离所述多核苷酸。在180中，可以将所述多核苷酸标记。在190中，任选地，可以检测所述多核苷酸特征性的标记模式。在某些实施方式中，所述多核苷酸在从所述基质分离之后被标记。本领域技术人员将会认识到，对于本文中公开的这种和其他过程和方法来说，在所述过程和方法中执行的功能可以以不同顺序实施。此外，所概括的步骤和操作仅仅作为实例提供，并且一些所述步骤和操作可以是任选的，合并成较少的步骤和操作，或者扩展成其他步骤和操作，而不背离所公开的实施方式的本质。

在某些实施方式中，如本文中所述，当所述多核苷酸被固定化在布置在基材上方的薄层多孔基质中时，除去所述非多核苷酸分子。任选地，在不存在施加到薄层多孔基质的电场的情况下(例如在不存在电泳的情况下)除去所述非多核苷酸分子。任选地，通过洗涤除去所述非多核苷酸分子，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50次洗涤，包括任两个所列出的值之间的范围。在某些实施方式中，当所述非多核苷酸分子被去除时，所述薄层多孔基质处于基本上平坦的构型中。

在某些实施方式中，当所述多核苷酸被固定化在所述薄层多孔基质中时，当所述基材被包埋在所述薄层多孔基质中时，除去所述非多核苷酸分子。任选地，所述薄层基材包含含有多个开孔的网，所述开孔具有至少0.1nm的直径，例如0.1nm、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、700、900、1000、2000、3000、5000、9000或10000nm，包括任两个所列出的值之间的范围，例如0.1nm至10mm、0.1nm至1mm、0.1nm至500nm、0.1nm至100nm、0.1nm至10nm、1nm至10mm、1nm至1mm、1nm至500nm、1nm至100nm、1nm至10nm 10nm至1mm、10nm至500nm、10nm至100nm、100nm至10mm或100nm至1mm。不受任何理论限制，据设想，根据本文中的某些实施方式，所述被包埋的网可以为所述薄层多孔基质提供刚性以维持在伸张模式中，以保持所述薄层多孔基质的多个侧面暴露于流体环境，以获得更好的反应动力学。不受任何理论限制，据设想根据本文中的某些实施方式，所述被包埋的网可以便于薄层多孔基质内多核苷酸的标记和/或洗涤。任选地，在不存在任何施加到所述薄层多孔基质的电场的情况下(例如在不存在电泳的情况下)除去所述非多核苷酸分子。任选地，通过洗涤除去所述非多核苷酸分子，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50次洗涤，包括任两个所列出的值之间的范围。

在某些实施方式中，如本文中所述，至少一些标记在所述多核苷酸被固定化在布置在基材上方的薄层多孔基质中时进行。在某些实施方式中，在所述标记进行时所述薄层多孔基质处于基本上平坦的构型中。

在某些实施方式中，将所述多核苷酸从所述多孔基质分离，然后进行标记。在某些实施方式中，将所述多核苷酸标记，然后从所述多孔基质分离。在某些实施方式中，将所述多核苷酸在所述多孔基质中用第一标记物标记，从所述多孔基质移除，然后用第二标记物标记。在某些实施方式中，所述第一标记物是位点特异性的，并且所述第二标记物是非序列特异性的。在某些实施方式中，所述第一标记物是非序列特异性的，并且所述第二标记物是位点特异性的。

图2示出了根据本文中的某些实施方式，处理包含多核苷酸的样品的方法。在某些实施方式中，将样品固定化在前体材料中210。可以使所述前体材料形成多孔基质220。在某些实施方式中，形成多孔基质230。可以将所述样品固定化在所述多孔基质中240。在某些实施方式中，将所述非多核苷酸材料从所述多孔基质去除，而所述多核苷酸仍保留在所述多孔基质中250。在某些实施方式中，在去除所述非多核苷酸材料时，所述多核苷酸保持固定化在所述多孔基质中。在某些实施方式中，所述多孔基质包含所述固定化的样品，从而形成包含所述固定化的样品的多个多孔单元260。在某些实施方式中，将所述多核苷酸标记270。任选地，可以从所述基质分离所述多核苷酸280。任选地，可以检测所述多核苷酸特征性的标记模式290。

当在本文中使用时，“多孔单元”和该根术语的变化形式是指多孔基质的片段，其体积不超过约1000纳升，例如不超过约1000纳升、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、40、30、20、10、5或1纳升，包括任两个所列出的值之间的范围。

可以将多孔基质破碎成通过各种不同方法形成的多孔单元。在某些实施方式中，将所述多孔基质研磨或匀浆成多孔单元，例如通过使用研杵的匀浆。在某些实施方式中，将所述多孔基质切碎成多孔单元。在某些实施方式中，将所述多孔基质捣碎成多孔单元。在某些实施方式中，将所述多孔基质用酶部分消化，由此形成多孔单元。

流体装置

在某些实施方式中，本文中所描述的处理多核苷酸的方法，部分或完全在流体装置中进行。流体装置可用于自动或部分自动地执行本文中描述的处理多核苷酸的方法，例如控制待添加和/或移除的反应物的量和顺序，进行相继反应和/或洗涤，调节温度，调节压力，调节流体移动等。任选地，所述流体装置包含微流体装置。任选地，所述流体装置包含纳米流体装置。适合的流体装置的实例包括微型反应器，其描述在Mollova等，(2009)“使用微型反应器分离和处理细菌DNA的亚兆碱基片段的自动样品制备系统”(An automated sample preparation system with mini-reactor to isolate and process submegabase fragments of bacterial DNA)，Analytical Biochemistry 391(2):135-43中，所述文献的全部内容通过参考并入本文。在某些实施方式中，所述整个方法(例如图1和/或图2的方法)在所述流体装置中进行。在某些实施方式中，所述方法的一部分在所述流体装置中进行，例如非多核苷酸分子的去除、多核苷酸的标记和/或从所述多孔基质(例如薄层多孔基质或多孔单元)分离核苷酸。

在某些实施方式中，在所述流体装置外部制备包含样品和多孔基质(例如薄层多孔基质或多孔单元)前体的混合物，在所述流体装置中形成多孔基质(例如薄层多孔基质或多孔单元)，并在所述流体装置中处理所述多核苷酸。任选地，将包含样品和多孔基质(例如薄层多孔基质或多孔单元)前体的混合物添加到所述流体装置(例如通过注射)，在所述流体装置中形成所述薄层多孔基质或多孔单元以便在所述装置内进行所述样品在薄层多孔基质或多孔单元中的固定化。例如，所述薄层多孔基质可以通过向所述流体装置施加真空或轻柔压力来形成。所述固定化的多核苷酸可以任选地在所述流体装置中自动处理。任选地，非多核苷酸分子的去除、多核苷酸的标记和/或所述多核苷酸从所述薄层多孔基质的移除，可以在所述流体装置内自动进行。任选地，所述非多核苷酸分子的去除可以在不存在任何向所述薄层多孔基质施加的电场(例如不存在电泳)的情况下进行。任选地，所述非多核苷酸分子可以通过洗涤去除，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50次洗涤，包括任两个所列出的值之间的范围。

在某些实施方式中，包含样品和多孔基质(例如薄层多孔基质或多孔单元)前体的混合物在所述流体装置的内部制备，多孔基质(例如薄层多孔基质或多孔单元)在所述流体装置中形成，并且所述多核苷酸在所述流体装置中处理。任选地，将样品添加到所述流体装置(例如通过注射)，并在所述流体装置内与所述多孔基质或多孔基质前体合并，由此在所述装置中进行所述样品在薄层多孔基质(多孔单元)中的固定化。例如，所述薄层多孔基质可以通过向所述流体装置施加真空或轻柔压力来形成。任选地，非多核苷酸分子的去除、多核苷酸的标记和/或所述多核苷酸从所述多孔基质(例如薄层多孔基质或多孔单元)的移除，可以在所述流体装置内自动进行。

在某些实施方式中，多孔基质(例如薄层多孔基质或多孔单元)在如本文中所述的流体装置的外部形成，并放置到所述流体装置内部。任选地，将样品固定化在所述薄层多孔基质或多孔单元中，然后将它放置到所述流体装置内部。例如，可以通过将样品与薄层多孔基质的前体相接触，将样品固定化在所述薄层多孔基质或多孔单元中。所述固定化在所述薄层多孔基质或多孔单元中的样品，可以在所述流体装置中自动处理。任选地，非多核苷酸分子的去除、多核苷酸的标记和/或所述多核苷酸从所述薄层多孔基质的移除，可以在所述流体装置内自动进行。

制备物

根据本文中的某些实施方式，提供了多核苷酸制备物。所述制备物可以包括固定化在本文中所描述的多孔基质中的处理或部分处理过的多核苷酸。

在某些实施方式中，所述制备物包含被布置在基材上方的薄层多孔基质和固定化在所述多孔基质中的多核苷酸，其中所述多核苷酸与非多核苷酸细胞组分基本上分离，并且其中所述多核苷酸在所述基质中时已被标记或酶法修饰。

在某些实施方式中，所述多核苷酸包含与第一序列基序结合的第一标记物。在某些实施方式中，所述多核苷酸还包含与第二序列基序结合的第二标记物，其中所述第二基序不同于所述第一基序，并且所述第二标记物与所述第一标记物相同或不同。在某些实施方式中，所述多核苷酸的标记物包括掺入到双链DNA或RNA中的切口中的至少一个标记的寡核苷酸。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含本文中所描述的至少一个结合组成部分。

处理样品的方法

根据某些实施方式，提供了一种处理样品的方法。所述方法可以包括如本文中所述将所述样品固定化在布置在基材上方的薄层多孔基质中。所述方法可以包括处理固定化在所述基材结合层中的样品以除去不想要的组合，而至少一种所需组分仍保留在所述样品中。所述方法可以包括从所述多孔基质分离至少一种所需组分。所述方法可以包括表征所述至少一种所需组分。在某些实施方式中，所述样品是生物样品。在某些实施方式中，所述所需组分包括至少一种生物分子或其复合物，例如多核苷酸、多肽、脂类、糖类或细胞器。在某些实施方式中，所述不想要的组分包括一种或多种所述所需组分之外的任何细胞组分或产物。

系统

根据某些实施方式，提供了用于处理含有至少一个多核苷酸的样品的系统。所述系统可以包括多孔基质或前体材料，其被配置成形成包含所述样品的薄层多孔基质。所述系统可以包括用于形成所述薄层多孔基质的基材。所述系统可以包括用于维持所述薄层多孔基质基本上布置在所述基材上方的工具。用于维持所述薄层多孔基质的布置的示例性的机械工具包括网例如尼龙网、夹具、托架、垫圈、螺纹、网眼布、凝胶、胶黏剂、桩子、螺钉、支柱、支架等。

在图10A-10D中示出了样品处理系统的一些实施方式。所述系统可以包括用于固持载片的金属底座10，其安装有用于温度控制的加热块。所述系统可以包括基材，其包含薄层多孔基质，例如使用放置在底座10上方的尼龙网12系留的薄层多孔基质。所述系统可以包括形成孔的装置14，其包括反应孔16和o型环18。孔形成单元14可以组装在包含使用尼龙网12系留的薄层多孔基质的基材(例如载片)上方，并且显示出反应孔16。所述系统可以包括盖子20，以封闭反应孔。符合本文中的某些实施方式的系统以及这些系统的组件，也示出在图16A-16G和图17A-17B中。

在某些实施方式中，所述系统包含用于在所述薄层多孔基质周围形成孔的机械工具。在某些实施方式中，所述机械工具包含通过所述系统的顶板的孔，其中将所述系统的顶板和底板之间的间隙收紧，以使所述薄层多孔基质被包含在所述孔内。在某些实施方式中，在所述孔的靠近所述薄层多孔基质的末端处的垫圈，使基质材料的泄露最小化，例如在所述基质材料已被融化或消化后。

在某些实施方式中，所述系统包含用于如本文中所述除去至少一种非多核苷酸的纯化试剂。

在某些实施方式中，所述系统包括用于如本文中所述标记所述多核苷酸的序列基序的第一标记试剂。

在某些实施方式中，所述系统包括用于如本文中所述从多孔层分离所述标记的多核苷酸的分离试剂。因此，可以表征所述分离的多核苷酸的序列基序标记模式。

在图13A-13C中示出了样品处理系统的一些实施方式。将所述薄层多孔基质维持在特定温度下可能是有用的，以例如融化所述薄层多孔基质。因此，所述系统可以包含用于加热所述薄层多孔基质并在同时提供所述薄层多孔基质的入口的装置。所述系统可以包含金属顶板20。所述系统可以包含金属底板22。在某些实施方式中，金属顶板20被放置在金属底板22上方。在某些实施方式中，金属顶板20与金属底板22整体成形，例如作为单件金属材料。在某些实施方式中，金属顶板20与金属底板22分开。

在某些实施方式中，金属顶板20被放置在金属底板22上方，其间具有间隙24。可以将布置在基材上的薄层多孔基质布置在间隙24中。在某些实施方式中，间隙24包含金属顶板20与金属底板22之间的狭缝。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质可以布置在载片25上，所述载片可以被放置在间隙24中。在某些实施方式中，载片25包含聚合物涂层例如聚四氟乙烯涂层。通过将所述薄层多孔基质放置在间隙24中，所述薄层多孔基质的每个侧面可以与金属板相接触，由此最小化或消除了所述薄层多孔基质的各个不同侧面之间的任何温度梯度。因此，与将所述多孔基质放置在开放基材上相比，可以提高加热的均匀性和温度的均匀性。此外，与开放面排布方式相比，将所述多孔基质放置在所述间隙内可以最小化液体的蒸发。在某些实施方式中，间隙24的宽度是可调的。在某些实施方式中，所述系统包含至少一个拉紧器26，例如螺钉或螺栓，其可以被调节以根据需要增加或减小间隙24的宽度。在某些实施方式中，间隙26的厚度被调整到接近所述载片的厚度。

在某些实施方式中，金属底板22包含加热元件或通过导热材料连接到加热元件。为了提高所述薄层多孔基质的加热均匀性，金属顶板20的至少一部分可以直接接触金属底板22的至少一部分。在某些实施方式中，金属顶板20包含加热元件。在某些实施方式中，金属顶板20和金属底板22各自包含加热元件。在某些实施方式中，金属顶板20可以从金属底板22拆下。在某些实施方式中，金属顶板20通过铰链附连到金属底板22。在某些实施方式中，金属顶板20通过轨道连接到金属底板22，所述轨道被配置成使得金属顶板20可以在金属底板22上来回滑动。

为了接近放置在间隙24中的薄层多孔基质，金属顶板20可以包含至少一个孔27。孔27可以包含通过金属顶板20的开口，由此提供对间隙23的接近，并因此提供对间隙24内的多孔基质的接近。多个孔27可以通过允许同时处理两个或更多个多孔基质来增加通量。在某些实施方式中，可以在每个孔27中布置不同的薄层多孔基质。在某些实施方式中，金属顶板20包含至少2个孔，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个孔，包括任两个所列出的值之间的范围。在某些实施方式中，每个孔包含O型环，例如图13B中所示。在某些实施方式中，所述孔具有基本上圆形形状。在某些实施方式中，所述孔具有非圆形形状，例如椭圆形、三角形、正方形或多种多边形中的任一者。在某些实施方式中，孔27的接近间隙24的开口包含密封件。在某些实施方式中，可以将载片25或其他基材插入到间隙24中并放置在孔下方，以便通过所述孔提供对所述多孔基质的接近。在将载片25或其他基材插入到间隙24中之后，可以调节间隙24的宽度以便将金属底板22和金属顶板20拉紧到在载片25或其他基材周围。可以对宽度进行选择以便最小化孔27的泄露(孔开口上的密封件也可以最小化泄露)，以最小化载片25或其他基材上的压力以便防止破裂。

在某些实施方式中，所述系统包含顶盖28。置于孔27上方的顶盖28可以保留孔27内的热量，由此提高加热的均匀性。此外，顶盖28可以进一步防止从放置在孔27的底部处的薄层多孔基质的蒸发，并且可以保护所述薄层多孔基质中的标记的分子免于光漂白。

在某些实施方式中，多个系统包含可互换的部件，以便例如聚四氟乙烯载片和持留板底座以及所述载片上的密封件，可以在各种不同系统之间互换(例如图10A-10D的系统、图13A-13C的系统、图16A-16G和图17A-17B的系统)。

用于形成薄层多孔基质的方法和试剂盒

符合本文中的某些实施方式的薄层多孔基质，可以通过各种不同方法来形成。

在某些实施方式中，所述薄层多孔基质的前体以液体状态被提供(例如处于足以融化所述前体的温度下，所述温度通常高于环境温度)。可以将样品与所述前体相接触。任选地，可以将所述前体与样品混合。可以将所述前体布置在表面上方并冷却，由此形成薄层多孔基质。任选地，将所述前体直接布置在基材上方并冷却。任选地，将所述前体直接布置在加热的基材上方并随后将所述基材冷却。例如，所述基材可以包含网。任选地，所述基材包含一个或多个特征例如柱状物，其在所述薄层多孔基质被布置在所述基材上方之后可以将薄层多孔基质保持在位。任选地，所述前体在所述基材之外的表面上形成，冷却，随后被移动到所述基材。任选地，将所述液体前体铺展在网基材上，以便将所述网基材包埋在所述薄层多孔基质中。

在某些实施方式中，提供所述薄层多孔基质的前体并向所述前体施加离心力，以形成薄层多孔基质。不受任何理论限制，据设想离心力可以使前体扁平以形成薄层多孔基质。离心力可以例如通过离心机提供。任选地，所述前体可以在离心之前包含样品。任选地，样品可以在离心后添加到所述薄层多孔基质。

在某些实施方式中，提供了所述薄层多孔基质的前体并且向所述前体施加真空或气体压力，以形成薄层多孔基质。例如，可以向所述前体施加压缩气体以使它扁平成为薄层多孔基质。适合的气体的实例包括空气、氮气或惰性气体例如氩气或氦气。

在某些实施方式中，多孔基质以薄层之外的构型提供，并随后形成薄层，例如通过压缩、切除、剃除、磨除或溶解掉一部分所述多孔基质，或通过将所述多孔基质离心。任选地，所述多孔基质在被形成为薄层多孔基质之前包含固定化的样品。任选地，在所述多孔基质被造型成薄层多孔基质之后将样品固定化在所述多孔基质中。

在某些实施方式中，提供了形成孔的装置(参见例如图10A-D中的14或图16A-G中的165)，并将其放置成与基材(参见例如图16A-G中的162)相接触。所述形成孔的装置可以包含多个开孔，例如至少2、3、4、5、5、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100个开孔，包括任两个所列出的值之间的范围。所述形成孔的装置的一个或多个开孔可以限定与所述基材垂直的表面。在某些实施方式中，所述形成孔的装置针对所述基材形成密封。任选地，所述形成孔的装置包含密封元件例如o型环，其限定了所述形成孔的装置的开孔。任选地，所述形成孔的装置被布置在底座上，所述底座被配置成控制所述形成孔的装置的温度，例如被配置成安装在加热元件(参见例如图16D中的161)上方的金属底座。可以将所述薄层多孔基质的液体前体放置在所述形成孔的装置的开孔内部，以便将液体前体布置在所述基材上方。任选地，所述液体前体包含样品。任选地，在所述液体前体已被放置在所述形成孔的装置的开孔内部后，将样品与所述液体前体相接触。可以将所述薄层多孔基质的前体在所述基材上冷却。

图16A-G是示出了根据本文中的某些实施方式的#2样品处理装置的一系列照片。图16A示出了孔形成单元165。图16B示出了孔形成单元165，其包括反应孔167和o型环166。图16C示出了波形垫圈168。图16D示出了放置在载片上的孔形成单元165，其包含使用尼龙网164系留的薄层多孔基质，并显示出放置在每个反应孔167上方的波形垫圈168。图16E示出了金属加压板169。图16F示出了在载片上组装的孔形成单元165，其包含使用尼龙网164系留的薄层多孔基质，并示出了放置在孔形成单元165上方的加压板169。图16G示出了胶黏密封薄膜170的放置，以产生顶部空气密封。

图18A和18B是示出了根据本文中的某些实施方式形成的薄层多孔基质的照片。图18A示出了载片上的薄层多孔基质。图18A示出了在向前体材料施加压缩空气后，薄层多孔基质172在载片162上的形成。图18B示出了多孔网基材上的薄层多孔基质。图18B示出了在将前体材料压缩在两个载片之间后，薄层多孔基质172在网164上的形成。

在某些实施方式中，提供了用于形成薄层多孔基质的试剂盒。所述试剂盒可以包含本文中所描述的基材。所述试剂盒可以包含形成孔的装置，其中所述形成孔的装置包含一个或多个开孔，所述一个或多个开孔被配置成当紧靠所述基材放置时限定垂直或基本上垂直于所述基材的一个或多个表面。任选地，所述形成孔的装置包含密封元件例如o型环，其被配置成针对所述基材形成密封。任选地，所述试剂盒还包含薄层多孔基质前体。任选地，所述试剂盒还包含加压板。所述加压板可以被配置成将所述形成孔的装置紧靠所述基材固定。所述加压板还可以被配置成将所述形成孔的装置和/或基材直接或间接紧靠所述加热元件固定。任选地，所述试剂盒还包含加热元件，所述加热元件被配置成加热所述基材和所述形成孔的装置。任选地，所述试剂盒还包含网，例如尼龙网。任选地，所述试剂盒还包含流体装置，例如微流体装置或纳米流体装置。根据本文中的某些实施方式，所述流体装置可用于自动处理多核苷酸。任选地，所述试剂盒可用于执行本文中所描述的一种或多种形成薄层多孔基质的方法。任选地，所述试剂盒还包含包装和/或用于形成薄层多孔基质的说明书。符合本文中的某些实施方式的试剂盒的组件的实例，示出在图13A-C、14、15、16A-G、17和18中。

其他实施方式

根据本文中的某些实施方式，提供了处理包含多核苷酸的样品的方法。所述方法可以包括将所述样品固定化在薄层多孔基质中，其中所述薄层基质被布置在基材上方。所述方法可以包括从布置在所述基材上方的所述薄层基质除去非多核苷酸分子，而所述多核苷酸仍保持固定化在所述基质中。所述方法可以包括用第一标记物标记所述多核苷酸或从所述薄层多孔基质分离所述多核苷酸中的至少一者。在某些实施方式中，用第一标记物标记所述多核苷酸。在某些实施方式中，从所述薄层多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，将所述多核苷酸用第一标记物标记并从所述薄层多孔基质分离。在某些实施方式中，将所述多核苷酸用第一标记物标记，并随后从所述薄层多孔基质分离。在某些实施方式中，将所述多核苷酸从所述薄层多孔基质分离，并随后用第一标记物标记。在某些实施方式中，在除去非多核苷酸分子之后并在从所述基质分离所述多核苷酸之前，将所述多核苷酸用所述第一标记物标记。在某些实施方式中，将所述多核苷酸用所述第一标记物标记，并在所述多核苷酸仍在所述基质中时检测所述标记物。在某些实施方式中，将所述样品固定化在薄层多孔基质中包括将所述样品与前体材料相接触，并随后使所述前体材料形成薄层，由此将所述样品固定化在薄层多孔基质中。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质保持基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些实施方式中，所述薄层基质具有约1至999微米的厚度。在某些实施方式中，所述薄层基质具有约80至200微米的厚度。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被附连到所述基材。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质从所述基材脱离，但仍保持紧密贴近于所述基材，使得在整个所述处理过程中所述层保持基本上平坦。在某些实施方式中，通过系链、支架、电磁相互作用、摩擦或压力中的至少一者维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述基材。在某些实施方式中，通过系链维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述基材。在某些实施方式中，所述系链包含多孔材料，其被配置成维持所述薄层多孔基质紧密贴近于所述基材，并同时允许接近固定化在所述薄层中的样品。在某些实施方式中，所述基材是刚性的。在某些实施方式中，所述基材是柔性的。在某些实施方式中，所述基材是载片、容器或片材的基材。在某些实施方式中，将所述样品固定化在薄层多孔基质中包括形成所述薄层多孔基质，使得所述基材限定所述薄层多孔基质的至少一个侧面。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被形成在所述基材与另一个实体之间，由此限定所述薄层多孔基质的厚度、直径或体积中的至少一者。

在某些实施方式中，提供了处理包含多核苷酸的样品的方法。所述方法可以包括将所述样品固定化在多孔基质中。所述方法可以包括破碎所述多孔基质。所述方法可以包括从所述多孔基质除去非多核苷酸分子，同时所述多核苷酸仍保留在所述多孔基质中。所述方法可以包括从所述多孔基质分离所述多核苷酸。在某些实施方式中，在破碎所述多孔基质后从所述多孔基质除去非多核苷酸分子。在某些实施方式中，在破碎所述多孔基质之前从所述多孔基质除去非多核苷酸分子。在某些实施方式中，所述方法还包括在破碎所述基质后从所述多孔基质除去痕量的非多核苷酸分子，其中多核苷酸分子仍保留在所述多孔基质中，而所述痕量的非多核苷酸分子被除去。在某些实施方式中，所述方法还包括在从所述多孔基质除去非多核苷酸分子之后并在从所述基质分离所述多核苷酸之前，用第一标记物标记所述多核苷酸。

在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多核苷酸包含至少约200千碱基，例如至少约200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、850kb、950kb或1000kb，包括任两个所列出的值之间的范围。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多核苷酸包含至少约1兆碱基。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述样品包含细胞悬液、核悬液、细胞器悬液、细胞匀浆物、组织匀浆物、全生物体匀浆物和生物流体中的至少一者。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述样品包含全细胞。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多核苷酸包含单链DNA、单链RNA、双链DNA或双链RNA。在某些实施方式中，所述多孔基质包含合成聚合物、天然存在的聚合物或其组合。

在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多孔基质包含基于多糖的基质。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多孔基质包含琼脂糖基质、聚丙烯酰胺基质、明胶基质、胶原蛋白基质、纤维蛋白基质、壳聚糖基质、藻酸盐基质、透明质酸基质或其任何组合。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多孔基质包含琼脂糖基质。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多孔基质包含硅烷基团、带正电荷的基团、带负电荷的基团、两性离子基团、极性基团、亲水性基团、疏水性基团或其任何组合。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多孔基质包含水性环境。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多孔基质被布置在水性溶液中。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，非多核苷酸分子包含蛋白质、脂类、糖类、细胞器和细胞碎片中的至少一者。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，除去非多核苷酸分子包括将所述多孔基质与蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、脂肪酶、糖水解酶、果胶酶、果胶溶解酶、淀粉酶、RNA酶、透明质酸酶、几丁质酶、gluculase、溶壁酶、酵母裂解酶、溶菌酶、labiase、消色肽酶或其组合相接触。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，除去非多核苷酸分子包括将所述多孔基质与蛋白酶相接触。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，除去非多核苷酸分子包括将所述多孔基质与去污剂、离液剂、缓冲剂、螯合剂、有机溶剂、聚合物(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙二醇)、盐、酸、碱、还原剂或其组合相接触。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，除去非多核苷酸分子包括用包含缓冲剂、去污剂、离液剂、螯合剂、有机溶剂、醇、盐、酸、碱、还原剂、聚合物或其组合的溶液洗涤所述多孔基质。在某些实施方式中，所述有机溶剂在基于水的溶液中可混溶。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，除去非多核苷酸分子包括施加电场以除去至少一些非多核苷酸分子。在某些实施方式中，本文中描述的任一方法还包括在除去非多核苷酸分子之前进行基质内核富集。

在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述标记包括非位点特异性标记，例如使用YOYO或POPO染料。

在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述标记包括位点特异性标记。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，标记包括将所述多核苷酸与染料或染色剂相接触。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述标记包括非光学标记。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述多核苷酸是双链的，并且位点特异性标记包括在第一序列基序处切刻所述多核苷酸以便形成至少一个切口，其中所述DNA在与所述至少一个切口相邻处保持双链，以及用所述第一标记物标记所述至少一个切口。在某些实施方式中，在切刻时将所述多核苷酸固定化在所述基质中。在某些实施方式中，所述位点特异性标记包括将至少一个核苷酸掺入到所述至少一个切口中。在某些实施方式中，所述至少一个核苷酸包含可逆终止子。在某些实施方式中，所述至少一个核苷酸包含所述第一标记物。在某些实施方式中，所述位点特异性标记还包括在第二序列基序处切刻所述多核苷酸，由此形成至少一个第二切口，其中所述DNA在与所述至少一个第二切口相邻处保持双链，以及用第二标记物标记所述至少一个第二切口，其中所述第一标记物与所述第二标记物相同或不同。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述标记包括通过第一甲基转移酶将所述标记物转移到所述多核苷酸。在某些实施方式中，位点特异性标记包括通过第一甲基转移酶将所述第一标记物转移到第一序列基序。在某些实施方式中，位点特异性标记包括将第一反应性基团转移到所述第一序列基序，并将所述第一标记物偶联到所述第一反应性基团。在某些实施方式中，位点特异性标记还包括通过第二甲基转移酶将第二标记物转移到第二序列基序，其中所述第二序列基序不同于所述第一序列基序，并且其中所述第二标记物与所述第一标记物相同或不同。在某些实施方式中，位点特异性标记包括将固定化在所述基质中的所述多核苷酸的第一序列基序与特异性结合于所述第一序列基序的第一结合组成部分相接触。在某些实施方式中，所述第一结合组成部分包含以下一种：三螺旋寡核苷酸、肽、核酸、聚酰胺、锌指DNA结合结构域、转录激活物样(TAL)效应物DNA结合结构域、转录因子DNA结合结构域、限制性酶DNA结合结构域、抗体或其任何组合。在某些实施方式中，所述第一标记物或第二标记物中的至少一者选自荧光团、量子点或非光学标记物。在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，所述方法还包括用非序列特异性标记物标记所述多核苷酸，其中所述非序列特异性标记物不同于所述第一标记物和第二标记物。

在某些实施方式中，对于本文中描述的任一方法来说，分离包括以下至少一者：融化所述多孔基质、消化所述多孔基质、降解所述多孔基质、溶解所述多孔基质、电洗脱、通过筛的离心、转印到膜上、透析步骤或其组合。在某些实施方式中，分离包括向包含所述多核苷酸和所述基质的至少一种组分的混合物添加溶剂。

在某些实施方式中，本文中描述的任一方法还包括检测所述多核苷酸特征性的位点特异性标记模式。在某些实施方式中，检测包括将所述多核苷酸在流体通道中线性化。在某些实施方式中，检测包括将所述第一标记物、第二标记物或其任何组合的模式与参比DNA上标记物的模式进行比较。在某些实施方式中，检测包括在位点特异性标记的重叠模式的基础上组装多个模式，由此构建多核苷酸图谱。

根据本文中的某些实施方式，提供了一种多核苷酸制备物。所述制备物可以包含布置在基材上方的薄层多孔基质。所述制备物可以包含固定化在所述多孔基质中的多核苷酸，其中所述多核苷酸与非多核苷酸细胞组分基本上分离，并且其中所述多核苷酸当在所述基质中时已被位点特异性标记或酶法修饰。在某些实施方式中，所述多核苷酸当在所述基质中时与细胞组分分离。在某些实施方式中，所述多核苷酸在与细胞组分分离之前被标记。在某些实施方式中，所述多核苷酸在与细胞组分分离之后被标记。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含至少约200千碱基，例如至少约200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、850kb、950kb或1000kb，包括任两个所列出的值之间的范围。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含至少约1兆碱基。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含单链DNA、单链RNA、双链DNA或双链RNA。在某些实施方式中，所述多孔基质包含合成聚合物、天然存在的聚合物或其组合。在某些实施方式中，所述多孔基质包含聚丙烯酰胺基质、明胶基质、胶原蛋白基质、纤维蛋白基质、壳聚糖基质、藻酸盐基质、透明质酸基质或其任何组合。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质包含琼脂糖基质。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质包含基于多糖的基质。在某些实施方式中，所述多孔基质包含硅烷、带正电荷的基团、带负电荷的基团、两性离子基团、极性基团、亲水性基团、疏水性基团或其任何组合。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质以伸展的构型被布置在所述基材上方。在某些实施方式中，所述薄层基质具有约1至999微米的厚度。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质具有约80至200微米的厚度。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质被固定化在所述基材上。在某些实施方式中，使所述薄层多孔基质从所述基材脱离但仍保持紧密贴近于所述基材，使得所述层在整个所述处理期间保持基本上伸展。在某些实施方式中，所述基材是刚性的。在某些实施方式中，所述基材是柔性的。在某些实施方式中，所述基材是载片、容器或片材的基材。在某些实施方式中，所述薄层多孔基质基本上不含非多核苷酸细胞组分。在某些实施方式中，所述非多核苷酸细胞组分包含蛋白质、脂类、糖类、细胞器和细胞碎片中的至少一者。在某些实施方式中，所述位点特异性标记或酶法修饰包括至少用与第一序列基序结合的第一标记物进行标记。在某些实施方式中，所述位点特异性标记或酶法修饰还包括用与第二序列基序结合的第二标记物进行标记，其中所述第二标记物与所述第一标记物相同或不同。在某些实施方式中，所述位点特异性标记包括至少用掺入到双链DNA或RNA中的切口中的标记的寡核苷酸进行标记。在某些实施方式中，所述制备物还包含结合到所述第一基序的至少一种结合组成部分，其中所述结合组成部分包含以下至少一者：三螺旋寡核苷酸、肽核酸、聚酰胺、锌指DNA结合结构域、转录激活物样(TAL)效应物DNA结合结构域、转录因子DNA结合结构域、限制性酶DNA结合结构域、抗体或这些物质的任何组合。在某些实施方式中，所述位点特异性标记包括用选自荧光团、量子点和非光学标记物的标记物进行标记。

根据本文中的某些实施方式，提供了一种用于处理包含至少一种多核苷酸的样品的系统。所述系统可以包含多孔基质，其被配置成形成包含所述样品的薄层多孔基质。所述系统可以包含用于形成所述薄层多孔基质的基材。所述系统可以包含用于维持所述薄层多孔基质基本上布置在所述基材上方的工具。在某些实施方式中，所述系统还包含用于在基本上布置在所述基材上方的所述薄层多孔基质周围形成孔的机械工具。在某些实施方式中，所述系统还包含用于将所述薄层多孔基质维持在所需温度下的工具。在某些实施方式中，所述系统还包含用于除去所述至少一种多核苷酸之外的样品组分的纯化试剂，用于用第一标记物标记所述至少一种多核苷酸的序列基序的第一标记试剂，以及用于从所述薄层多孔基质分离所述标记的多核苷酸的分离试剂，其中所述分离的多核苷酸的序列基序标记的模式可以被表征。

实施例1：在载片上基于薄层的DNA纯化和随后的基质内单色或双色标记

将大肠杆菌细胞与琼脂糖溶液混合，并通过在80um间隔物存在下用另一个载片进行夹心，铺展在玻璃载片上。在所述琼脂糖-大肠杆菌基质在4℃下固化后，移除顶部夹心载片，留下附着于底部载片的多孔微层(图3)。将所述附着的微层用溶菌酶和蛋白酶K处理，然后进行几次洗涤以除去污染物，留下干净的DNA。将保留在所述微层中的DNA用Nt.BspQI产生切口，洗涤，并使用taq聚合酶在偶联到dUTP的绿色荧光染料存在下通过切口平移进行标记。在另一个洗涤步骤后，通过用PreCR(New England BioLabs)进行处理来修复标记的切口。对于双色标记来说，对保留在所述微层中的切刻、标记和修复过的DNA进行另一轮使用不同切口酶(Nb.BbvCI)的切刻，用偶联到dUTP的红色荧光染料进行标记并用PreCR进行修复，在其间进行洗涤。通过融化琼脂糖并将它用琼脂糖酶处理，将所述含有DNA的微层液化，以释放所述DNA，将所述DNA用YOYO染色并在Irys^TM系统(BioNano Genomics)上处理。简单来说，将DNA在大规模平行纳米通道中线性化，用适合的激光激发以备骨架和标记物检测，并任选地成像以揭示DNA分子上的标记物模式(图5A)。向参比基因组的作图和覆盖所质询的分子质量的中心、假阳性(FP)和假阴性(FN)的基本度量，使用nanoStudio数据分析软件(BioNano Genomics)来进行。结果示出在图5B中。由此，可以在薄层多孔基质中纯化和标记核酸并根据本文中的某些实施方式标记。

实施例2：在系留孔中基于薄层的DNA纯化和随后的基质内单色标记

将大肠杆菌细胞与琼脂糖溶液混合，并用移液管头在6孔板的孔的表面上手动铺展以产生薄层。在所述琼脂糖-大肠杆菌基质在4℃下固化后，将尼龙网放置在所述薄层顶上，以保持它在随后的处理步骤期间系留到所述表面(图4A)。将所述系留的琼脂糖-大肠杆菌层用溶菌酶和蛋白酶K处理，随后进行几次洗涤以除去污染物，留下干净的DNA。将保留在所述薄层中的DNA用Nt.BspQI产生切口，洗涤，并使用taq聚合酶在偶联到dUTP的绿色荧光染料存在下通过切口平移进行标记。在另一个洗涤步骤后，通过用PreCR(New England BioLabs)进行处理来修复标记的切口。通过融化琼脂糖并用琼脂糖酶处理，将所述含有DNA的薄层液化，以释放所述DNA，将所述DNA用YOYO染色并在Irys^TM系统(BioNano Genomics)上如实施例1中所概述的进行处理。结果示出在图6中。由此，可以根据本文中的某些实施方式在薄层多孔基质中纯化和标记核酸。

实施例3：载片上基于微层的DNA纯化/孔中的薄层DNA纯化以及随后在溶液中的DNA回收和单色标记

将20ul大肠杆菌-琼脂糖混合物如实施例1和2中所述铺展在玻璃载片或孔上。将所述附着层用溶菌酶和蛋白酶K处理，随后进行几次洗涤以除去污染物，留下干净的DNA。通过融化琼脂糖并用琼脂糖酶处理，将所述琼脂糖-DNA复合物液化。在液滴透析后，将纯化的DNA用Nt.BspQI产生切口，并使用taq聚合酶在偶联到dUTP的绿色荧光染料存在下通过切口平移进行标记。通过用PreCR(New England BioLabs)进行处理来修复标记的切口。如实施例1中所述将得到的DNA用YOYO染色并在Irys^TM系统(BioNano Genomics)上进行处理。结果示出在图7中。由此，可以根据本文中的某些实施方式在薄层多孔基质中纯化核酸并对其进行标记。

实施例4：在系留板中基于薄层的DNA纯化和随后在溶液中的DNA回收和单色标记——较大规模

将900ul大肠杆菌-琼脂糖混合物用移液管头铺展在10cm培养板的底面上。在4℃下固化后，将尼龙网放置在附着于所述板的底面的所述薄层的顶上，以保持它在随后的处理期间系留到所述板的表面(图4B)。将所述系留的琼脂糖-大肠杆菌薄层用溶菌酶和蛋白酶K处理，随后进行几次洗涤以除去污染物，留下干净的DNA。通过融化琼脂糖并用琼脂糖酶处理，将所述琼脂糖-DNA复合物液化。在液滴透析后，将纯化的DNA用Nt.BspQI产生切口，并使用taq聚合酶在偶联到dUTP的绿色荧光染料存在下通过切口平移进行标记。通过用PreCR(New England BioLabs)进行处理来修复标记的切口。如实施例1中所述将得到的DNA用YOYO I染色并在Irys^TM系统(BioNano Genomics)上进行处理。结果示出在图8中。由此，可以根据本文中的某些实施方式在薄层多孔基质中纯化核酸并对其进行标记。

实施例5：基于柱塞的DNA纯化和随后在多孔单元中的破碎和单色标记

如BioRad(CHEF细菌基因组DNA柱塞试剂盒#170-3592)所述产生大肠杆菌-琼脂糖柱塞。将含有细菌细胞的柱塞用溶菌酶处理，然后用蛋白酶K和RNA酶处理，留下干净的DNA。通过在微量离心管中使用蓝色研杵(Sigma)进行匀浆，将所述柱塞分解成小碎片。将保留在所述多孔单元中的DNA用Nt.BspQI产生切口，洗涤，并使用taq聚合酶在偶联到dUTP的绿色荧光染料存在下通过切口平移进行标记。在另一个洗涤步骤后，通过用PreCR(New England BioLabs)进行处理来修复标记的切口。在每次洗涤后，将所述多孔单元离心以集中在管的底部处。通过融化琼脂糖并用琼脂糖酶进行处理，将多孔单元中标记的DNA液化。在液滴透析后，如实施例1中所述，将所述DNA用YOYO I染色并在Irys^TM系统(BioNano Genomics)上进行处理。结果示出在图9中。由此，可以根据本文中的某些实施方式在多孔单元中纯化和标记核酸。

实施例6：基于微层的DNA纯化和随后在图8的装置中的基质内单色标记

将大肠杆菌细胞与琼脂糖溶液混合，并通过用无粘性载片夹心所述琼脂糖-细胞混合物，铺展在玻璃载片上由PTFE涂层限定的100um厚的孔中。在将所述琼脂糖-大肠杆菌基质在4℃下固化后，移除所述非粘性载片，留下占据所述PTFE涂层的载片的孔的100um厚的微层(图3B)。将所述载片组装到图10D中所描述的处理装置中。在反应孔中进行蛋白酶K消化，随后进行几次洗涤以除去污染物，留下捕获在微层中的干净的DNA。标记和修复也在所述处理装置中进行。将捕获在所述微层中的DNA用Nt.BspQI产生切口，洗涤，并使用taq聚合酶在偶联到dUTP的绿色荧光染料存在下通过切口平移进行标记。在另一个洗涤步骤后，通过用PreCR(New England BioLabs)进行处理来修复标记的切口。从图10D中所示的装置移除载片。将含有DNA的微层收获在微量离心管中，并通过融化琼脂糖进行液化并用琼脂糖酶处理以释放所述DNA，将所述DNA如实施例1中所述用YOYO染色并在Irys^TM系统(BioNano Genomics)上进行处理。结果示出在图11中。由此，可以根据本文中的某些实施方式在薄层多孔基质中纯化和标记核酸。

实施例7：重新组装和作图

提供来自于人类细胞系的细胞(Coriell，目录ID GM12878)。将所述细胞与琼脂糖溶液混合并铺展在PTFE涂层的玻璃载片上，以形成包含所述细胞的薄层多孔基质。将所述载片和薄层多孔基质放置在图13A-13C中示出的系统的间隙25中，使得所述薄层多孔基质可以被系统加热，通过反应孔27接近。在反应孔27中进行蛋白酶K消化，随后进行几次洗涤以除去污染物，留下捕获在所述薄层多孔基质中的干净的DNA。当所述DNA在所述薄层多孔基质中时对其进行标记：将DNA用Nt.BspQI产生切口，并使用taq聚合酶在偶联到dUTP的绿色荧光染料存在下通过切口平移进行标记。通过用PreCR(New England BioLabs)处理或如IrysPrep^TMLabeling-NLRS流程(BioNano Genomics)中所述对标记的切口进行修复。将所述包含标记的DNA的多孔基质收获在微量离心管中，并通过融化琼脂糖进行液化并用琼脂糖酶处理以释放所述DNA，将所述DNA如实施例1中所述用YOYO染色并在Irys^TM系统(BioNano Genomics)上线性化。将标记的DNA分子以迭代方式对齐，以产生代表了重新组装的人类基因组图谱的重叠群。将重新产生的重叠群与所述参比人类图谱(HG19)对齐，并图形示出在图12B中。数字度量显示在图12A中。因此，本文中所描述的薄层多孔基质和处理系统可用于可靠地分离和标记核酸，用于在流体微通道系统中进行分析。

尽管本文中已公开了各种不同方面和实施方式，但其他方面和实施方式对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文公开的各种不同方面和实施方式是出于说明的目的而不打算是限制性的，其中真正的范围和精神由权利要求书指明。

本领域技术人员将会认识到，对于本文中公开的这种和其他过程和方法来说，在所述过程和方法中执行的功能可以以不同顺序实施。

此外，概括的步骤和操作仅仅作为实例提供，并且某些步骤和操作可以是任选的，合并在更少的步骤和操作中，或扩充成附加的步骤和操作，而不损害所公开的实施方式的本质。

对于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用来说，本领域技术人员可以在适合于语境和/或应用的情况下将复数转换成单数和/或将单数转换成复数。为清晰起见，在本文中可能明确陈述各种不同的单数/复数排列。

本领域技术人员应该理解，一般来说，在本文中、特别是权利要求书(例如权利要求书的主体)中使用的术语，通常打算作为“开放性”术语(例如术语“包括”应该被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应该被解释为“至少具有”等)。本领域技术人员还应该理解，如果意图指示介绍的权利要求项叙述的特定数目，这种意图应该在所述权利要求项中明确叙述，并且在缺少这种叙述的情况下不存在这种意图。例如，为了帮助理解，权利要求书可能含有使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”来介绍权利要求项叙述。然而，这种短语的使用不应被解释为暗示着由不定冠词介绍的权利要求项叙述将含有这种介绍的权利要求项叙述的任何特定权利要求项限制于只含有一个这种叙述的实施方式，即使在同一权利要求项包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词的情况下(例如，不定冠词应该被解释为意味着“至少一个”或“一个或多个”)；这同样适用于使用定冠词来介绍权利要求项叙述的情况。此外，即使介绍的权利要求项叙述的特定数目被明确叙述，本领域技术人员也应该认识到，这种叙述应该被解释为意味着至少所述叙述的数目(例如，没有其他修饰语的仅仅“两个叙述”的叙述，意味着至少两个叙述或两个或更多个叙述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一者”的常用语的情况下，一般来说这种结构意指本领域技术人员应该理解的所述常用语的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一者的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一者”的常用语的情况下，一般来说这种结构意指本领域技术人员应该理解的所述常用语的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一者的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员还应该理解，事实上任何提出两个或更多个可选项的反意连接(disjunctive)的词和/或短语，不论是在说明书、权利要求书还是附图中，都应该被理解为设想了包含所述项中的一项、所述项的任一项或两个所述项的可能性。例如，短语“A或B”应该被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，当本公开的特点或情况按照马库什(Markush)组进行描述时，本领域技术人员将会认识到，本公开因此也按照所述马库什组的任一单个成员或成员的亚组进行描述。

正如本领域技术人员将会理解的，出于任何和所有目的，例如就提供书面描述而言，本文中公开的所有范围也涵盖了其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。可以容易地认识到，任何列出的范围充分描述并能够将同一范围分解成至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性实例，本文中讨论的每个范围可以被容易地分解成较小的三分之一、中间的三分之一和较大的三分之一等。正如本领域技术人员也将理解的，诸如“至多”、“至少”等的所有措词包括了所叙述的数目，并且是指可以随后分解成如上所讨论的子范围的范围。最后，正如本领域技术人员将会理解的，范围包括每个个体成员。因此，例如具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。同样地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，以此类推。

从上述内容可以认识到，在本文中出于说明的目的已描述了本公开的各种不同实施方式，并且可以做出各种不同修改而不背离本公开的范围和精神。因此，本文中公开的各种不同实施方式不打算是限制性的，并且真正的范围和精神由权利要求书指明。